Baskıda PDF Dosyasını İndir / In Press PDF File

Yorumlar

Transkript

Baskıda PDF Dosyasını İndir / In Press PDF File
Araştırma Makalesi / Research Article
291
TE
D
Doi: 10.4274/npa.y6987
(Nö­rop­si­ki­yat­ri Ar­fli­vi 2014; 51: XX)
(Arc­hi­ves of Neu­ropsy­chi­atry 2014; 51: XXX)
Nöro-Behçet Hastalarının Serumlarında Beyin Dokusu ve Beyin
Damarlarına Karşı Otoantikor Varlığı
EC
The Presence of Autoantibodies Against Vascular and Nervous Tissue in Sera From Patients
with Neuro-Behçet’s Disease
Ayşe İlksen ÇOLPAK1, Umut KALYONCU2, Yasemin GÜRSOY ÖZDEMİR1
1Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi, Nöroloji Anabilim Dalı, Ankara, Türkiye
2Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi, Ramatoloji Anabilim Dalı, Ankara, Türkiye
ABS­TRACT
Introduction: Behçet’s disease is a chronic inflammatory disease of unknown
aetiology that affects multiple organ systems. Since the diagnosis of this disease
mainly relies on clinical criteria, a diagnostic laboratory test is required especially
for neuro-Behçet’s patients without systemic involvement.
Met­hods: In this study, we searched for the presence of autoantibodies against
brain tissue, by means of indirect immunofluorescent staining technique in sera
obtained from patients with neuro-Behçet’s disease, based on reports that
humoral immune dysregulation may play a role in susceptibility to Behçet’s
disease. After pre-absorbtion of sera with guinea pig liver powder to reduce
nonspecific staining, serum samples were applied to mouse brain sections and
immunoreactivity was detected with fluorescein (FITC)-conjugated goat antibody
against human IgG.
Re­sults: Ten sera from neuro-Behçet’s patients and 10 age-matched control sera
were screened for immunoreactivity. We detected specific immunoreactivity to
both parenchymal and vascular brain structures in the patients’ sera. Parenchymal
vessel immunopositivity was detected in 8 of 10 patients, whereas only two
of control sera showed no significant parenchymal vascular immunoreactivity
(p=0.025). In addition to vascular immunoreactivity, filamentous and reticular
immunopositive structures were detected in brain sections of 5 out of 10
patients. No such immunoreactivity was detected in sections incubated with
control sera (p=0,016).
Conc­lu­si­on: We detected a specific immunoreactivity against vascular and
parenchymal filamentous structures in neuro-Behçet patients’ sera. Humoral
autoimmunity may play a role in the pathogenesis of neuro-Behçet’s disease
in addition to cellular immune response. Findings of this preliminary study
will be evaluated with a large number of patients and controls, to determine
whether it is the cause or the result and, further studies are underway to
disclose the nature of epitope to which the immunoreactivity was directed
against and to develop a diagnostic laboratory method for investigating
central nervous system involvement in Behçet’s patients. (Arc­hi­ves of
Neu­ropsy­chi­atry 2014; 51: XX)
Key words: Behçet’s Disease, Neuro-Behçet’s Disease, Autoimmunity,
Immunohistochemistry
U
N
C
O
R
R
ÖZET
Giriş: Behçet Hastalığı çoklu sistem tutulumu ile giden, etyolojisi ve fizyopatolojisi
bilinmeyen, kronik, inflamatuar bir hastalıktır. Hastalığın tanısının klinik bulgulara
dayanan kriterlere göre konulması ve özellikle diğer bulguların eşlik etmediği,
nörolojik tutulumla başlayan hastalarda tanının belirlenmesindeki güçlükler, özgül
bir laboratuvar testinin eksikliğine dikkati çekmektedir.
Yön­tem­: Bu çalışmada, immün sistem bozukluğuna bağlı geliştiği düşünülen
durumlarda uygulanan, indirekt immünfloresan boyama tekniği kullanarak, SSS
tutulumu olan Behçet hastalarının serumlarında, SSS’e karşı otoantikor varlığı
araştırılmıştır. Önce hasta ve kontrol serumları, özgül olmayan boyanmayı
önleyebilmek için kobay karaciğeri ile preabsorbsiyona tabi tutulmuşlardır.
Takiben fare beyin dokusu ile inkübe edilerek, floresan (FITC) ile konjuge, insan
IgG’sine karşı keçide hazırlanmış IgG ile işaretlenmiştir. Beyin kesitleri floresan
mikroskop ile değerlendirilmiştir.
Bul­gu­lar: On nöro-Behçet hastası ve 10 yaş uyumlu kontrol bireyin serumları
immünreaktivite açısından incelenmiştir. Hasta serumları ile fare beyin dokusunun
inkübasyonu sonucunda hem parankimal hem de vasküler yapılara karşı özgül
immünreaktivite tespit edilmiştir. 10 hastanın 8’inde parankimal vasküler boyanma
varken, kontrollerin sadece 2 tanesinde hastalarla karşılaştırıldığında çok belirgin
olmayan immünreaktivite görüldü (p=0,025). Vasküler immünreaktiviteye ek
olarak, 10 hastanın 5’inde filamentöz ve retiküler yapılarda immünreaktivite
gözlenirken, kontrollerin serumlarıyla yapılan inkübasyonlarda, hiçbirinde benzer
bir boyanma saptanmamıştır (p=0,016).
So­nuç: SSS tutulumu olan Behçet hastalarının serumlarında, hem
parankimal hem de vasküler yapılara karşı özgül immünreaktivite tespit
edilmiştir. Bu bulgular, Behçet hastalığı SSS patogenezinde hümoral
otoimmünitenin rolü olabileceğini düşündürmektedir. Daha çok sayıda
hasta ve kontrolün dahil edileceği bir çalışma ile, bu ön çalışmada tespit
edilen bulguların, bir sebep mi yoksa sonuç mu olduğu araştırılacaktır.
Bu tespit edilen özgün immünoreaktivitenin ne tür bir epitopa ait olduğu
incelenerek, Behçet Hastalığının SSS tutulumu için klinikte kullanılabilecek
bir laboratuvar yöntemi geliştirilmeye çalışılacaktır. (Nö­rop­si­ki­yat­ri
Ar­fli­vi 2014; 51: XX)
Anah­tar ke­li­me­ler: Behçet Hastalığı, Nöro-Behçet Hastalığı, Otoimmünite,
İmmunhistokimya
Çıkar çatışması: Yazarlar bu makale ile ilgili olarak herhangi bir çıkar
çatışması bildirmemişlerdir.
Conflict of interest: The authors reported no conflict of interest related to this
article.
Ya­z›fl­ma Ad­re­si/ Cor­res­pon­den­ce Ad­dress
Dr. Ayşe İlksen Çolpak, Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi, Nöroloji Anabilim Dalı, Ankara, Türkiye
Gsm: +90 532 694 59 96 E-mail: [email protected] Ge­liş ta­ri­hi/Re­cei­ve: 30.11.2012 Ka­bul ta­ri­hi/Ac­cep­ted: 01.01.2013
© Nö­rop­si­ki­yat­ri Ar­şi­vi Der­gi­si, Ga­le­nos Ya­yı­ne­vi ta­ra­f›n­dan ba­s›l­m›fl­t›r. / © Arc­hi­ves of Neu­ropsy­chi­atry, pub­lis­hed by Ga­le­nos Pub­lis­hing.
Çolpak ve ark.
Nöro-Behçet Hastalarının Serumlarında Beyin Dokusu ve Beyin Damarlarına Karşı Otoantikor Varlığı
Giriş
Yöntem
Hacettepe Üniversitesi Nöroloji ve Romatoloji A.D
polikliniklerinde takip edilen, Behçet hastalığı tanısı
uluslararası Behçet çalışma grubunun belirlediği kriterlere
göre konan ve SSS tutulumu olan 10 nöro-Behçet
hastasından, 10 sağlıklı bireyden ve 1 seropozitif nöromyelitis
optika (NMO) hastasından bildirilmiş yazılı olur alınarak,
10’ar ml kan elde edildi. Çalışma esnasında hastalardan
ve sağlıklı kontrollerden yazılı olur ile serum alınması ve
hayvan beyinlerinde yapılan deneysel işlemler Hacettepe
Üniversitesi Etik Kurulu tarafından FON 06/40 kayıt numarası
altında onaylandı. Alınan kan örnekleri 30dk oda sıcaklığında
bekletildikten sonra, 4000 rpm de santrifüj edilerek serumlar
ayrıştırılıp, immünfloresan boyamalar yapılana kadar -20
ºC’de saklandı.
Deneyler için, 22-34 gr ağırlığındaki Swiss albino
farelerin beyinleri kullanıldı. Fareler yüksek doz kloral hidrat
anestezisi ile uyutularak dekapite edildi. Beyinler özenle
çıkarılarak, beyin sapı ve korteksi birbirinden ayıracak şekilde
diensefalon altından ikiye bölündü. -26 0C’de dondurulan
beyinlerden kriyostat ile 10μm kalınlığında horizontal
kesitler alındı. Aynı lam üzerine birisi beyin sapından, diğeri
hemisferden geçen iki kesit yerleştirildi. Hazırlanan lamlar
immünfloresan boyamalar yapılana kadar -20 0C’de saklandı.
Boyamalar oda sıcaklığında (+23 0C ile +25 0C) yapıldı.
Denaturasyon; proteinlerin primer yapısının bozulmadan,
sıcaklık değişimi, pH değişimi gibi çevre koşullarındaki
değişimler sonucunda üç boyutlu yapılarını kaybetmesi olup,
denatürasyon varlığını test edebilmek için +37 0C’de ve
+4 0C’de deneyler tekrarlandı.
Preabsorpsiyon
Serum örnekleri özgül olmayan antikorlar içermektedirler.
Deneylerde kullanılan immünfloresan boyama tekniği
gerçekleştirilmeden önce, bu antikorlar nedeni ile ortaya
çıkabilecek özgül olmayan işaretlenmeleri önlemek amacı
ile kobay karaciğeri (KC) ile preabsopsiyon gerçekleştirildi.
Bu tür uygulamalar benzer inceleme yöntemlerinde yaygın
olarak kullanılarak, özgül olmayan boyanmanın ortadan
kaldırılmasını sağlamaktadır. Bu amaçla immünfloresan
boyamaların öncesinde hasta serumları, kobay karaciğerinden
elde edilen özüt ile literatürde tarif edildiği şekilde, muamele
edildi (28,29).
İmmünfloresan Boyamalar
Önceden alınmış kesitlerin çevreleri Pappen (Zymed)
adı verilen sıvı akışını engelleyen bir kalem ile çizildi ve
tüm boyamalar oda sıcaklığında gerçekleştirildi. PBS ile
hazırlanmış %10’luk formol solüsyonu ile 4 dk süreyle
dokuların fiksasyonu gerçekleştirildi. Kesitler PBS ile
yıkandıktan sonra, PBS ile hazırlanmış %1’lik CHAPS
solüsyonu (AppliChem) uygulandı. Yıkamayı takiben %10’luk
normal keçi serumunda 1 saat bekletildi. Ardından kesitler
hasta veya kontrol serumu ile inkübe edilerek bekletildi.
U
N
C
O
R
R
EC
Behçet Hastalığı, karakteristik olarak tekrarlayıcı oralgenital aftlar ve göz tutulumu ile seyreden sistemik
inflamatuar bir hastalıktır. Çoklu sistem tutulumu görülebildiği
gibi, en sık cilt, eklemler, göz, santral sinir sistemi (SSS) ve
gastrointestinal sistem (GİS) etkilenir. Küçük, orta ve büyük
çaptaki arter ve venleri etkileyebilir (1). Kesin olarak etyoloji
bilinmemekle birlikte, genetik yatkınlığı olan bireylerde
çevresel etmenler ile tetiklenen otoimmün bir hastalık olduğu
düşünülmektedir (2).
Hastalık her yaşta görülebilmesine rağmen sıklıkla 2035 yaş arasında ortaya çıkar. Erkeklerde ve hastalığın erken
yaşlarda başladığı kişilerde ciddi komplikasyonlar ve ölüm
daha sık görülmektedir (3,4,5). Behçet hastalığında nörolojik
tutulum sıklığı %2,2 ile %47 arasında değişmektedir (6,7,8).
Bir çalışmada yaşarken %10 oranında nöro-Behçet tanısı
almış olan 170 hastanın, otopsi serilerinde %34 oranında SSS
tutulumu olduğu görülmüştür. Bu değişkenlik muhtemelen
sadece etnik ve coğrafi farklılıkla değil, nörolojik tutulumun
nasıl tanımlandığı ile de ilişkilidir. Ayrıntılı sorgulanmayan
başağrısı, nörolojik tutulumun sıklığı konusunda karışıklığa
yol açabilmektedir (9). Türkiye’de prospektif bir çalışmada
nörolojik tutulum çoğu çalışmaya benzer şekilde % 5.3
olarak bulunmuştur (10,11,12).
Behçet hastalığının etiyolojisi ve patogenezini
araştırmaya yönelik yapılan çalışmalarda genetik yatkınlık,
infeksiyöz ajanlar, ısı şoku proteinleri, hümoral ve hücresel
immünite değişiklikleri, endotel fonksiyonlarında bozukluk,
koagülasyon ve fibrinolitik sistem bozuklukları gibi değişik
faktörlerin etkisi öne sürülmüş, ancak bu faktörlerden
hiçbirisinin hastalık gelişimindeki rolü tam olarak ortaya
konamamıştır (13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24).
Behçet hastalığının tanısı, uluslararası Behçet çalışma
grubunun belirlediği klinik bulgulara dayanan kriterlere göre
konulmaktadır (25). Ancak tanı için özgül bir laboratuvar
testi bulunmamaktadır. Hastalığın erken dönemlerinde henüz
klinik bulguların tanı kriterlerini tam olarak karşılayamadığı ya
da nörolojik tutulum ile başlayan olgularda (26), laboratuvar
desteğine ihtiyaç duyulmaktadır.
Behçet hastalığında, parankimal ve non-parankimal
olmak üzere ikiye ayrılan SSS tutulumu daha çok görülürken,
periferik sinir sistemi tutulumu oldukça nadir görülür ve
genellikle tedavide kullanılan ilaçlara bağlı olarak ortaya
çıkar. SSS tutulumu hastaların %80’inde, sinir sisteminin
tümünde yaygın ve hafif bir inflamasyon ile birlikte, daha
çok parankimal yapılarda hakim, fokal tutulum şeklindedir
(27). Beyin sapı, bazal ganglion, diensefalik yapılar, internal
kapsül en sık tutulan bölgelerdir.
Nöro-Behçet olan hastaların klinik ve görüntüleme
bulgularından elde edilen bilgiler hastalığın SSS’de bazı
bölgeleri tutma eğiliminde olduğunu göstermektedir. Bu
durum bize o bölgelere ait bir antijenik uyaranın söz konusu
olabileceğini düşündürmektedir.
Bu çalışmada; SSS tutulumu olan Behçet hastalarının
serumlarında, otoantikor varlığının gösterilmesi ve
hastalardan alınacak serum örneklerinin hayvan dokuları ile
etkileşimi (reaktivitesi) test edilerek olası hedef yapılar ve/
veya proteinlerin tespit edilmesi amaçlanmıştır.
TE
D
292
Çolpak ve ark.
Nöro-Behçet Hastalarının Serumlarında Beyin Dokusu ve Beyin Damarlarına Karşı Otoantikor Varlığı
(Hasta ve kontrol serumları konulmadan önce preabsorpsiyon
aşamasından geçirilmişti). Tekrar PBS ile muamele edilen
kesitler sekonder antikor olarak; insan IgG’sine karşı keçide
hazırlanmış, floresan (FITC) ile konjuge, Anti-Human IgG
(Jackson immunoresearch) (1:500) ile 70 dk inkübe edildi.
PBS yıkamalarının ardından kesitlere Hoechst solüsyonu
(Hoechst 33258, Molecular Probes, 10 mg/ml distile suda
çözünmüş şekilde) damlatılıp lamel ile kapatıldı. İşlemler
tamamlandıktan sonra kesitler floresan mikroskopta (Nikon
Eclipse E600) incelendi. Kesitler, hastaların ve kontrollerin
kimliklerini bilmeyen tek bir okuyucu tarafından (Y.G-Ö),
farklı zamanlarda olmak üzere 2’şer kez değerlendirildi.
Boyamalar, kantitatif olarak değil, immünreaktivite var
ya da yok olarak belirlendi. Hücre çekirdekleri floresan
mikroskopta 330-380 nm dalga boyunda, diğer ışımalar 450490 nm dalga boyunda değerlendirildi. Nikon ACT programı
ile immünfloresan görüntülemeler kaydedilip, incelemeler
yapılarak Adobe Photoshop 6.0 programı yardımı ile şekiller
oluşturuldu.
İstatistiksel Yöntem
İmmünfloresan görüntülemelerden elde edilen bulgular,
hasta ve kontroller için parankimal damar, parankimal
filament, non-parankimal damar ve non-parankimal
epandim tutulumu olmak üzere Tablo 2’deki gibi işaretlendi.
İstatistiksel işlemler için SPSS 11.0 programı kullanılarak,
beklenen frekansı 5’ten küçük göz olduğunda Fisher kesin
Ki-Kare, beklenen frekanslar 5’ten büyük olduğunda Yates
düzeltmeli Ki-Kare testi uygulandı. P <0.05 istatistiksel olarak
anlamlı kabul edildi.
293
O
R
R
EC
TE
D
6’sı erkek, 4’ü kadın ve ortalama yaşları 32.1 (±6.9)’idi.
Behçet hastalığı tanı süresinin ortalama 9,6 (±4.9) yıl,
nörolojik tutulum süresinin ise ortalama 3,9 (±3.4) yıl olduğu
ve hastaların yarısında beyin sapı tutulumuna ait bulguların
varlığı gözlendi. Non-parankimal tutulum 2 hastada
gözlenirken, 8 hastada parankimal tutulum olduğu saptandı
(Tablo 1). Sistemik bulgular açısından bakıldığında, hastaların
hepsinde tekrarlayan oral aft, genital aft, cilt tutulumu, üveit
öyküsü vardı ve serumların alındığı dönemde tüm hastalar
remisyon dönemindeydi.
Hastalardan ve kontrol bireylerden alınan serumlar, olası
immünolojik hedef tespiti için, fare beyin dokusu ile inkübe
Bulgular
N
C
Toplam 10 adet nöro-Behçet tanısı alan hasta, 10 adet
sağlıklı kontrol birey ve 1 adet NMO hastasından serumlar
alındı. NMO hastasının serumu, literatürde tarif edilen
yöntemin uygun şekilde tekrar edilebildiğini göstermek amacı
ile kullanıldı ve pozitif kontrol olarak kabul edildi (Şekil 1).
Behçet hastalarının 6 tanesi erkek, 4 tanesi kadın ve
ortalama yaşları 37.7 (±7.3), sağlıklı kontrol bireylerin ise
Şekil 1. Beyin sapından alınan kesitlerde, NMO hastasının serumu ile, yoğun
damarsal immünoreaktivite görülmektedir. Üst kolonda 100, alt kolonda ise
400 büyütme ile alınan resimler gösterilmiştir. Oklar 400 büyütmede görülen
damarlardan bazılarını ve bunların Hoechst boyamasındaki çekirdeklerini
işaret etmektedir. Literatürde NMO hastaları için tarif edildiği gibi, tüm
damarsal yapılarda immünfloresan işaretlenme mevcuttur ve AQP4’e karşı
immünoreaktivite paternine uygundur.
Tablo 1. Nöro-Behçet tanısı alarak çalışmaya dahil edilen hastaların klinik ve demografik özellikleri
Hasta
Yaş
Cins
Behçet Hastalığı
Süresi
Nörolojik Tutulum
Süresi
Nörolojik Tutulum
31
K
14 yıl
2 yıl
Subkortikal beyaz cevher
36
E
5 yıl
4 yıl
Beyin sapı
Hasta 3
34
E
10 yıl
2 yıl
Beyin sapı
Hasta 4
47
E
17 yıl
13 yıl
Subkortikal beyaz cevher -bazal ganglion
Hasta 5
28
K
13 yıl
3 yıl
Beyin sapı-talamus
Hasta 6
32
E
6 yıl
5 yıl
Spinal kord
Hasta 7
47
K
4 yıl
4 yıl
Beyin sapı
Hasta 8
48
E
15 yıl
2 yıl
Beyin sapı
Hasta 9
34
K
4 yıl
1 yıl
Sinüs ven trombozu
Hasta 10
40
E
8 yıl
3 yıl
Sinüs ven trombozu
U
Hasta 1
Hasta 2
294
Çolpak ve ark.
Nöro-Behçet Hastalarının Serumlarında Beyin Dokusu ve Beyin Damarlarına Karşı Otoantikor Varlığı
TE
D
immünoreaktivite dikkati çekti (Şekil 3 ve 4). Kontrol
hastalarının serumları ile yapılan inkübasyonlarda bu
filamentöz immünoreaktivite saptanmadı ve hastalar ile
kontroller karşılaştırıldığında fark Fisher kesin Ki-Kare testiyle
istatistiksel olarak anlamlı bulunarak (p=0,016), hastalık için
özgül olarak yorumlandı.
Non-parankimal damar tutulumu incelendiğinde ise,
arteriyal özellik gösteren yapılarda işaretlenme görüldü. Bu
tür işaretlenme hasta serumları ile inkübasyonu takiben 10
hastanın 7’sinde saptanırken, 3 kontrol serumunda da benzer
bulgular tespit edildi ve sonuçlara Yates düzeltmeli Ki-Kare
uygulandı. Epandimal immünreaktivite, 10 hastanın 4’ünde,
kontrollerin ise 1’inde saptandı. Fisher kesin Ki-Kare testiyle
sonuç değerlendirildi. Nonparankimal tutulum (damar ve
epandim tutulumu), hastalarda daha fazla görülmekle birlikte,
kontrollerden istatistiksel olarak anlamlı fark bulunmadı
(p=0,18, p=0,15).
Her boyama sırasında, hasta serumu ve/veya sekonder
antikor kullanılmadan yapılan işaretlemeler, tekniğin
spesifitesinin kontrolü oldu. Bu şekilde yapılan işaretlemelerde
herhangi bir immünoreaktivite tespit edilmedi.
Parankimal immünoreaktivite tüm hastalarda hem kortikal
(Şekil 3) hem de derin beyin yapılarında benzer boyanma
R
EC
edildi. Serumlarla inkübasyonu takiben, beyin kesitleri
parankimal tutulum (damar tutulumu ve filamentöz tutulum)
ile non-parankimal tutulum (büyük damar ve epandim
tutulumu) açısından incelenerek, immünreaktivite şiddetine
göre değerlendirildi (Tablo 2).
Parankimal damar tutulumu, beyin dokusu içerisinde yer
alan büyük ve küçük çaplı damarlar etrafındaki görsel olarak
saptanan yoğun floresan işaretlenme olarak kabul edildi. Beyin
dokusu içinde, damar dışında görülen, filamentöz yapıdaki
tüm diğer immünfloresan işaretlenmeler de parankimal
tutulum olarak değerlendirildi. Non-parankimal damar
tutulumu ise, beyin dokusu dışında yer alan, yüzeyel arter
ve venlerdeki pozitif immünfloresan işaretlenme olarak kabul
edildi. Beyin dokusunu ve ventrikülleri kaplayan ependimal
işaretlenmeler de non-parankimal olarak değerlendirildi.
Parankimal damarlar açısından bakıldığında; 10 hastanın
8’inde pozitif immünfloresan işaretlenme tespit edilirken,
kontrol grubunda sadece 2 bireyde hafif şiddette pozitif
işaretlenme görüldü ve gruplar arasında istatistiksel
olarak anlamlı fark Yates düzeltmeli Ki-Kare testiyle
saptandı (p=0,025). Tutulan damarlar çoğunlukla venöz
karakterdeydi (Şekil 2). Parankimde damar dışındaki
diğer yapılar değerlendirildiğinde, herhangi bir hücresel
boyanmaya rastlanmadı. Buna karşın 5 hastada beyin
dokusu içinde dendrit benzeri yapıları takip eden filamentöz
Tablo 2. Nöro-Behçet hastalarının ve sağlıklı kontrol bireylerin serumlarında
tespit edilen immünoreaktiviteler
Parankimal
Hasta 1
-
Hasta 2
-
Hasta 3
+
Hasta 4
+
Hasta 5
+
Filament
Damar
Epandim
+
+
+
-
+
-
+
+
-
-
-
+
-
+
+
O
R
Damar
N
C
Serum
kodu
Non-parankimal
+
+
+
-
Hasta 7
+
-
+
-
Hasta 8
+
-
+
-
Hasta 9
+
+
-
+
Hasta 10
+
+
-
-
U
Hasta 6
Kontrol 1
-
-
+
-
Kontrol 2
-
-
-
-
Kontrol 3
-
-
-
-
Kontrol 4
-
-
-
-
Kontrol 5
-
-
-
-
Kontrol 6
+
-
-
-
Kontrol 7
+
-
-
+
Kontrol 8
-
-
-
-
Kontrol 9
-
-
+
-
Kontrol 10
-
-
+
-
Şekil 2. Hasta serumları ile yapılan inkübasyonlarda parankim içinde
filamentöz ve noktasal paterne ek olarak vasküler yapıların etrafında yoğun
immünfloresan işaretlenmeler dikkati çekmektedir.Üst sırada kontrol
serumu ile yapılan işaretlemeler görülmektedir. Aynı floresans şiddeti ile
alınan görüntülerde, kontrol serumları ile yapılan inkübasyonlarda zeminde
ve damar etrafında çok hafif bir boyanma zaman zaman tespit edilmekle
birlikte, sol kolonda da görüldüğü gibi sıklıkla negatif bir immunoreaktivite
mevcuttu. Buna karşın, hasta serumları ile yapılan inkübasyonlar sonrasında
damar etrafında yoğun immünfloresan işaretlenme görülmüştür. Orta ve alt
sırada; sol kolonda hasta serumları ile yapılan işaretlemeler, sağ kolonda
ise çekirdek boyası Hoechst ile yapılan işaretlemeler yer almaktadır. Oklar
damarları işaret etmektedir, orta ve alt sıra sol kolonda ise damarların
Hoechst ile işaretli iğsi çekirdeklerini göstermektedir. 200 büyütme ile
alınan resimler.
295
TE
D
Çolpak ve ark.
Nöro-Behçet Hastalarının Serumlarında Beyin Dokusu ve Beyin Damarlarına Karşı Otoantikor Varlığı
EC
Şekil 4. Striatumdan alınan kesitlerde filamentöz ve/veya noktasal
immünoreaktivite görülmekle birlikte, kontrol serumları ile yapılan
inkübasyonlarda boyanma tespit edilmemektedir. Serumlar ile yapılan
işaretlemeler sol kolonda, çekirdek boyası Hoechst ile yapılan işaretlemeler
sağ kolonda yer almaktadır. 200 büyütme ile alınan resimler.
Şekil 6. Hasta serumu ile immün işaretlenme sonrası konfokal mikroskop
yardımı ile striatumdan alınan, ardı sıra 0.2 μm’lik kesitler görülmektedir.
Noktasal ve filamentöz yapı dikkat çekmektedir.
U
N
C
O
R
R
Şekil 3. Hasta ve kontrol serumları ile yapılan immünfloresan
görüntülemeler. Görüntüler hippokampusdan geçen kesitlerden alınmıştır.
Serumlar ile yapılan işaretlemeler sol kolonda, çekirdek boyası Hoechst ile
yapılan işaretlemeler sağ kolonda yer almaktadır. Sol kolondaki resimlerde,
hasta serumlarının noktasal ve/veya filamentöz immün işaretlemeler
gösterdiği, buna karşın kontrol serum ile yapılan incelemelerde pozitif
işaretlenme olmadığı izlenmektedir. Hücre gövdeleri ile çekirdeklerin, hasta
ve kontrollerde işaretlenmediği görülmektedir. Sağ kolonda ise Hoechst
boyaması ile kesitlerde yer alan hücre çekirdekleri görüntülenmiştir. Ok
başları hipokampal hücre tabakalarına işaret etmektedir. 100 büyütme ile
alınan resimler.
Şekil 5. Serebellumdan alınan kesitlerde, hasta serumları ile yapılan
inkübasyonlarda, diğer beyin bölgelerindeki işaretlenme paternine benzer
veriler tespit edildi. Parankim içerisinde filamentöz veya noktasal, dendritik
yapıları takip eden boyanmalar mevcuttu. 100 büyütme ile alınan resimler.
Şekil 7. A) Şekil 6’daki kesitlerin X ekseninde 3 boyutlu olarak üst üste
bindirilmesi ile elde edilen görüntülemede, filamentöz yapılar net bir
şekilde seçilmektedir. B) Şekil 6’daki kesitlerin Z ekseninde 3 boyutlu
olarak rekonstrüksiyonu. Görüntülenen beyin dokusu 2.2 um kalınlığında
olup, striatumdan geçen bir alandır. Filamentöz yapının ağ benzeri
yapılanmasının olduğu ve derine ilerlediği görülmektedir.
Çolpak ve ark.
Nöro-Behçet Hastalarının Serumlarında Beyin Dokusu ve Beyin Damarlarına Karşı Otoantikor Varlığı
aday antikorlar olarak daha önceki çalışmacılar tarafından
ortaya atılmış ancak hiçbiri özgül olmamış ve küçük gruplarda
gösterilebilmiştir (30,37,38,39). Mikroorganizmalarda ya da
hayvan dokularında bulunan immün reaktif proteinlerden
olan ısı şoku proteinleri-‘heat shock proteins’(HSP) ile ilgili
olarak da, uzun zamandır Behçet hastalarında çalışmalar
yapılmaktadır. HSP-60, HSP-65, HSP-70 ve alfa B-crystallin
daha önceki çalışmalarda bildirilmiş HSP’lerdir. Son yıllarda
yapılan çalışmalarla aday antijenik hedefler arasına HSP
ailesinin bir üyesi olan stresle indüklenen fosfoprotein-1 de
eklenmiştir. Ancak romatoid artrit hastalarında da bildirilmiş
olması nedeniyle Behçet hastalığı için özgüllüğü konusunda
soru işaretleri vardır (19,40,41,42,43,44).
NMO, SSS’de seçiciliği olan, immün sistem bozukluğuna
bağlı geliştiği düşünülen bir durumdur. Lennon ve arkadaşları
bu hastalığa özgül otoantikor varlığını, geliştirdikleri bir
yöntemle göstermişlerdir (28,45). Yöntemin esası, NMO
hastalarının serumlarının, fare beyin dokusu ile inkübasyonunu
takiben, floresan işaretlenmesine dayanmaktadır. Bu grup,
çalışmaları sonucunda NMO’da gelişen otoantikorun AQP4’e
karşı olduğunu tespit etmişlerdir.
Nöro-Behçet olan hastaların klinik ve görüntüleme
bulgularından elde edilen bilgiler de, hastalığın SSS’de
bazı bölgeleri tutma eğiliminde olduğunu göstermektedir.
Bu durum bize o bölgelere ait bir antijenik yapılanmanın
sözkonusu olabileceğini düşündürmektedir. Bu çalışmada,
Lennon ve arkadaşlarının kullandığı teknik kullanılarak,
nörolojik tutulumu olan Behçet hastalarının serumlarında
beyin dokusuna spesifik olası otoantikor varlığı araştırılmıştır.
Çalışmamızda, literatürde tarif edilen çeşitli preabsopsiyon
yöntemleri ile yapılan denemeler sonucunda, kontrol
serumlarıyla görülen özgül olmayan boyanmayı en aza
indiren yöntem seçilerek işlemlere devam edilmiştir.
Yöntemin güvenilirliğini test edebilmek için, serumların +37
0C’de veya +4 0C’de uygulandığı durumlarda tekrarlanan
deneylerde, oda sıcaklığında hasta serumlarıyla görülen
immünoreaktivitenin
gerçekleşmediği
görülmüştür.
Gözlediğimiz immünoreaktivitenin, sıcaklık değiştirerek
yaptığımız deneylerde kaybolması, hasta serumlarındaki özgül
IgG’lerin denatürasyonuna bağlı olduğunu düşündürmüştür.
Dolayısıyla, bu durum saptadığımız boyanmanın özgül
olduğunu telkin etmektedir. Preabsorbsiyon sonrası rezidüel
nonspesifik boyanmanın da, sekonder antikorun dilüsyonunun
artırılması ile ortadan kalktığı görülmektedir. Ayrıca pozitif
kontrol olarak, kullanılan yöntemin doğruluğunu test etmek
amacı ile klinik olarak NMO tanısı almış (optik nevrit,
transversmyelit ve NMO IgG antikoru pozitifliği) bir hastanın
serumu ile deneyler yapılarak, literatürde tarif edilene benzer
şekilde, yoğun damarsal immünoreaktivite elde edildi ve
yöntemin taklit edilebildiği gösterildi. Bu nedenlerle, uzun
çalışmalar ve tekrarlayan denemeler sonucunda elde edilen
immünfloresan işaretlemelerin özgüllüğünün güvenilir
olduğunu düşünüyoruz.
Yapılan immünfloresan işaretlemeler sonunda, kontrol
serumları ile inkübasyonlarda çok seyrek olarak parankimal
vasküler boyanma varken, hastalarda daha yoğun parankimal
vasküler boyanma görülmüştür. Filamentöz yapılardaki
EC
paterni göstermiştir (Şekil 4).
Damarsal tutulum paterni açısından, Behçet hastaları
ve NMO hastasının farklı özellikler taşıdığı saptandı. NMO
hastasında literatürdekine benzer ve Behçet hastalarındaki
immünoreaktivite ile karşilaştırıldığında, daha yoğun damar
tutulumu olduğu ve kapillerlerin de tutulduğu görülmektedir
(Şekil 1 ve 2). Bu tutulum literatürde tariflenen AQP4’e karşı
immünoreaktivite paternine uymaktadır.
Beyin sapı ve serebelluma ait kesitler incelendiğinde de
benzer bulgular elde edilmiştir (Şekil 5).
Boyanan filamentöz yapıları daha detaylı incelemek amacı
ile konfokal mikroskop yardımıyla görüntülemeler yapıldı.
Bu tür görüntüleme, boyanan yapıların bize 3 boyutlu yapısı
hakkında fikir verdi. Bu amaçla, 2,2 mikron kalınlığında bir
kesit 0,2 mikron aralıklarla tarandı. Şekil 6’da bu taramalar
tek tek kesitler halinde görülmektedir. Noktasal ve filamentöz
yapılar dikkat çekmektedir. Şekil 7A’da, Şekil 6‘da alınan ardı
sıra kesitlerin X eksenindeki, Şekil 7B’de ise Z eksenindeki 3
boyutlu rekonstrüksiyonu görülmektedir. Filamentöz yapının
büyük akson lif demetlerinde görülmediği, buna karşın diğer
alanlarda yaygın boyandığı ve zaman zaman birleşerek ağ
benzeri bir yapı oluşturduğu dikkati çekmektedir.
R
Tartışma
N
C
O
R
Bu çalışmada, SSS tutulumu olan Behçet hastalarının
serumları kullanılarak fare beyinlerinde yapılan indirekt
immünfloresan boyamalarda, hem parankimal hem de
vasküler yapılara karşı özgül immünreaktivite tespit edilmiştir.
Behçet hastaları için henüz dokuya özgül antikor veya biyolojik
belirteç tanımlanmasa da, bu çalışmanın sonuçları nöroBehçet hastalarında ortak bir epitopun varlığını ve hastalıktan
sorumlu bir antikorun gösterilebileceği düşüncesini akla
getirmektedir.
Uzun zamandır Behçet hastalığı üzerine çalışmalar
yapılmaktadır. Ancak halen etyolojisi ve patofizyolojisi
hakkında yeterli bilgiye ulaşılamamıştır. Hastalığın tanısının
klinik bulgulara dayanan kriterlere göre konulması ve özellikle
diğer bulguların eşlik etmediği, nörolojik tutulumla başlayan
hastalarda tanının konulmasındaki güçlükler, özgül bir
laboratuvar testinin eksikliğine dikkati çekmektedir.
Literatürde plazma değişiminden faydalanan hastaların
bildirilmiş olması, maternal transplasental antikor geçişi ve
sekonder neonatal Behçet hastalığının görülmesi, B hücrelerinin
fonksiyonlarında değişiklikler olması, hastaların serumlarında
dolaşan immünkomplekslerin gösterilmesi, lezyonların
histopatolojik incelemelerinde damar duvarında IgM ve C3
depolanmasının saptanması, Behçet hastalığında hücresel
immünitenin yanında hümoral immünitenin aktivasyonu ile de
giden bir immünolojik dengesizliğin olduğunu göstermektedir
(22,23,24,30,31,32,33,34,35,36). Farklı Behçet hastası
gruplarında otoantikor varlığını araştıran birçok çalışma
yapılmıştır. Bu çalışmalarda farklı yöntemler kullanılmıştır.
Anti-endotelyal
hücre
antikorları,
anti-Saccharomyces
cerevisiae antikoru, anti-alfa enolaz antikoru ve PTEN ile
indüklenen putative kinaz 1 antikorları Behçet hastalığı için
U
TE
D
296
Çolpak ve ark.
Nöro-Behçet Hastalarının Serumlarında Beyin Dokusu ve Beyin Damarlarına Karşı Otoantikor Varlığı
TE
D
of onset and patient’s sex on the prevelance and severity of
manifestations of Behçet’s Disease. Ann Rheum Dis 1984; 43:783789.
6. Gürler A, Boyvat A, Türsen Ü. Clinical manifestations of Behçet’s
Disease: An analysis of 2147 patients. Yonsei Med J 1997; 38:423427.
7. Krause I, Uziel Y, Guedj D, Mukamel M, Molad Y, Amit M, Weinberger
A. Mode of presentation and multisystem involvement in Behçet’s
disease: The influence of sex and age of disease onset. J Rheumatol
1998; 25:1566-1569.
8. Krause I, Uziel Y, Guedj D, Mukamel M, Harel L, Molad Y, Weinberger
A. Childhood Behçet’s disease: clinical features and comparison with
adult-onset disease. Rheumatology (Oxford) 1999; 38:457-462.
9. Aykutlu E, Baykan B, Akman-Demir G, Topcular B, Ertas M. Headache
in Behçet’s disease. Cephalalgia 2006; 26:180-186.
10.Serdaroğlu P, Yazıcı H, Özdemir C, Yurdakul S, Bahar S, Aktin E.
Neurologic involvement in Behçet’s syndrome: a prospective study.
Arch Neurol 1989; 46:265-269.
11. Siva A, Kantarci OH, Saip S, Altintas A, Hamuryudan V, Islak C, Koçer
N, Yazici H. Behçet’s disease: diagnostic and prognostic aspects of
neurological involvement. J Neurol 2001; 248:95-103.
12.Ashjazadeh N, Borhani Haghighi A, Samangooei Sh, Moosavi H.
Neuro-Behcet’s disease: a masquerader of multiple sclerosis. A
prospective study of neurologic manifestations of Behcet’s disease
in 96 Iranian patients. Exp Mol Pathol 2003; 73:17-22.
13.
Direskeneli H. Behcet’s disease: infectious aetiology, new
autoantigens, and HLA-B51. Ann Rheum Dis 2001; 60:996-1002.
14.Gül A. Behcet’s Disease: an update on the pathogenesis. Clin Exp
Rheumatol 2001; 19(Suppl 24):6-12.
15.Sohn S, Lee ES, Bang D, Lee S. Behcet’s disease-like symptoms
induced by the Herpes simplex virus in ICR mice. Eur J Dermatol
1998; 8:21-23.
16.The Behcet’s Disease Research Committee of Japan. Skin
hypersensitivity to streptococcal antigens and the induction of
systemic symptoms by the antigens in Behcet’s disease-a multicenter
study. J Rheumatol 1989; 16:506-511.
17. Çalgüneri M, Kiraz S, Ertenli I, Benekli M, Karaarslan Y, Celik I. The
effect of prophylactic penicillin treatment on the course of arthritis
episodes in patients with Behcet’s disease. A randomized clinical
trial. Arthritis Rheum 1996; 39:2062-2065.
18. Isogai E, Isogai H, Yokota K, Hayashi S, Fujii N, Oguma K, Yoshikawa
K, Sasamoto Y, Kotake S, Ohno S. Platelet aggregation induced by
uncommon serotypes of Streptococcus sanguis isolated from patients
with Behcet’s disease. Arch Oral Biol 1991; 36:425-9.
19. Imamura Y, Kurokawa MS, Yoshikawa H, Nara K, Takada E, Masuda C,
Tsukikawa S, Ozaki S, Matsuda T, Suzuki N. Involvement of Th1 cells
and heat shock protein 60 in the pathogenesis of intestinal Behcet’s
disease. Clin Exp Immunol 2005; 139:371-378.
20.Mege JL, Dilsen N, Sanguedolce V, Gul A, Bongrand P, Roux H, Ocal
L, Inanç M, Capo C. Overproduction of monocyte derived tumor
necrosis factor alpha, interleukin (IL) 6, IL-8 and increased neutrophil
superoxide generation in Behcet’s disease. A comparative study with
familial Mediterranean fever and healthy subjects. J Rheumatol 1993;
20:1544-1549.
21. Li B, Yang P, Zhou H, Zhang Z, Xie C, Lin X, Huang X, Kijlstra A. T-bet
expression is upregulated in active Behcet’s disease. Br J Ophthalmol
2003; 87:1264-1267.
22.Suzuki N, Sakane T, Ueda Y, Tsunematsu T. Abnormal B cell function
in patients with Behcet’s disease. Arthritis Rheum 1986; 29:212219.
23.Ekşioglu-Demiralp E, Kibaroglu A, Direskeneli H, Yavuz S, Karsli F,
Yurdakul S, Yazici H, Akoglu T. Phenotypic characteristics of B cells
in Behcet’s disease: increased activity in B cell subsets. J Rheumatol
1999; 26:826-832.
24.Lee KH, Chung HS, Kim HS, Oh SH, Ha MK, Baik JH, Lee S, Bang D.
Human alpha-enolase from endothelial cells as a target antigen of
anti-endothelial cell antibody in Behcet’s disease. Arthritis Rheum
N
C
O
R
R
EC
boyanma ise sadece hastalarda tespit edilmiş olup, kontrol
grubunda hiç gözlenmemiştir. Bu durum da boyanma
paterninin hastalığa özgün olduğunu telkin etmektedir. Tespit
edilen özgün boyanmanın ne tür bir yapıya ait olduğu ancak
daha ileri çalışmalarla yorumlanabilecektir. Ayrıca filamentöz
ve damarsal boyanmanın tek bir epitopa karşı monoklonal
bir cevap mı, yoksa farklı epitoplar nedeniyle poliklonal bir
reaksiyona mı bağlı olduğu konusu aydınlatılmalıdır.
Bulguların bazı yönlerinin ileri çalışmalarla değerlendirilmesi
gerekmektedir. Örneğin nöro-Behçet hastalarında klinikte
kortikal ve serebellar tutulum daha nadir bir bulgu iken, bizim
çalışmamızda bu bölgelerde de immünreaktivite saptanmıştır.
Bu durum, deneylerde serumların fare dokusuna uygulanmış
olması, rodent ile insan beyninde ifade edilen proteinlerin
ve bu proteinlerin dağılım şeklinin türler arasında farklı
olmasına bağlı olabilir. Yine NMO hastalarında optik nevrit
ve transvers miyelit gibi sınırlı bir klinik tutulum olmasına
rağmen, yapılan immünhistokimyasal incelemelerde yaygın
bir AQP4 ifadesi bulunmaktadır (45). Değerlendirilmesi
gereken bir diğer nokta da, deneylerde insan IgG yapısını
tanıyacak sekonder antikor kullanılmış olmasıdır. Oysa Behçet
hastalığında dokularda daha çok IgM depolanmasından
bahsedilmektedir. Çalışmanın, insan IgM’sine karşı sekonder
antikorla da tekrarlanması gerekmektedir. Bugün için nonparankimal ve parankimal tutulumun farklı mekanizmalarla
geliştiği düşünülmesine rağmen, bizim çalışmamızda belirgin
bir fark gözlenmemektedir. Ancak çalışmada sadece 2 tane
non-parankimal tutulumu olan hasta serumu olması nedeniyle
bu konuda ileri yorum yapmak zordur.
Gelecek deneylerde, öncelikle bulguların bir sebep mi
yoksa sonuç mu olduğunun aydınlatılması, bu testin duyarlılığı
ve özgünlüğünün tespitinin yapılabilmesi için, mevcut hasta
ve sağlıklı birey sayısı artırılacak ve otoimmün hastalığı olan
başka hasta grupları da kullanılacaktır.
Behçet hastalarında, beyin dokusuna spesifik bir
otoantikorun gösterilebilmesi ve hedef yapının tespiti
hastalığının patogenezini anlamaya yardımcı olacak ve
klinik kriterlere ek olarak, tanı için bir laboratuvar testinin
tanımlanmasını sağlayacaktır. Patofizyolojinin detaylı olarak
gösterilmesi ise, gen ve protein hedefli, daha az yan etkisi
olan ve etkisi daha güçlü olan tedavilerin gelişimine kapı
açılmasını sağlayabilecektir.
U
Kaynaklar
1. Ehrlich GE. Vasculitis in Behcet’s disease. Int Rev Immunol 1997;
14:81-88.
2. Davatchi F, Shahram F, Akbarian M, Gharibdoost F, Nadji A, Chams
H, Jamshidi AR. Behcet disease:analysis of 3443 cases. APLAR J
Rheumatol 1997; 1:2-5.
3. Yazici H, Başaran G, Hamuryudan V, Hizli N, Yurdakul S, Mat C, Tüzün
Y, Ozyazgan Y, Dimitriyadis I. The ten year mortality in Behçet’s
Syndrome. Br J Rheumatol 1996; 35:139-141.
4. Kural-Seyahi E, Fresko I, Seyahi N, Ozyazgan Y, Mat C, Hamuryudan V,
Yurdakul S, Yazici H. The long term mortality and morbidity of Behçet
syndrome: a 2-decade outcome survey of 387 patients followed at a
dedicated center. Medicine(Baltimore) 2003; 82:60-76.
5. Yazıcı H, Tüzün Y, Pazarlı H, Yurdakul S, Özyazgan Y, Özdoğan H,
Serdaroğlu S, Ersanlı M, Ülkü BY, Müftüoğlu AÜ. Influence of age
297
Çolpak ve ark.
Nöro-Behçet Hastalarının Serumlarında Beyin Dokusu ve Beyin Damarlarına Karşı Otoantikor Varlığı
33.Lewis MA, Priestley BL. Transient neonatal Behcet’s disease. Arch Dis
Child 1986; 61:805-806.
34.Fam A.G, Siminovitch K, Carette S, From L. Neonatal Behcet’s
syndrome in an infant of a mother with the disease. Ann Rheu
Disease 1981; 40:509-512.
35.Gupta RC, O’Duffy JD, McDuffie FC, Meurer M, Jordon RE. Circulating
immune complexes in active Behcet’s disease. Clin Exp Immunol
1978; 34:213-218.
36.Abdallah MA, Ragab N, Khalil R, Kamel N. Circulating immune
complexes in various forms of Behcet’s disease. Int J Dermatol 1995;
34:841-845.
37.Fresko I, Ugurlu S, Ozbakır F, Celik A, Yurdakul S, Hamuryudan V,
Yazici H. Anti-Saccharomyces cerevisiae antibodies (ASCA) in Behçet’s
syndrome. Clin Exp Rheumatol 2005; 23(Suppl 38):67-70.
38. Lee J.H, Cho S.B, Bang D, Oh S.H, Ahn K.J, Kim J, Park Y.B, Lee S.K, Lee
K.H. Human anti-alpha-enolase antibody in sera from patients with
Behçet’s disease and rheumatologic disorders. Clin Exp Rheumatol
2009; 27(Suppl 53):63-66.
39.Vural B, Demirkan A, Ugurel E, Kalaylioglu-Wheeler Z, Esen B.A, Gure
A.O, Gül A, Ozbek, U. Seroreactivity against PTEN-induced putative
kinase 1 (PINK1) in Turkish patients with Behçet’s disease. Clin Exp
Rheumatol 2009; 27(Suppl 53):67-72.
40.Birtas-Atesoglu E, Inanc N, Yavuz S, Ergun T, Direskeneli H. Serum
levels of free heat shock protein 70 and anti-HSP70 are elevated in
U
N
C
O
R
R
EC
2003; 48:2025-2035.
25.International Study Group for Behçet’s Disease. Criteria for diagnosis
of Behçet’s Disease. Lancet 1990; 335:1078-1080.
26. Akman-Demir G, Serdaroglu P, Tasci B. Clinical patterns of neurological
involvement in Behçet’s disease: evaluation of 200 patients. The
Neuro-Behçet Study Group. Brain 1999; 122:2171-2181.
27.Sugihara H, Mutoh Y, Tsuchiama Y. Neuro-Behçet’s disease: report of
two autopsy cases. Acta Pathol Jap 1969; 19:95-101.
28.Lennon VA, Wingerchuk DM, Kryzer TJ, Pittock SJ, Lucchinetti CF,
Fujihara K, Nakashima I, Weinshenker BG. A serum autoantibody
marker of neuromyelitis optica: distinction from multiple sclerosis.
Lancet 2004; 364:2106-2112.
29.Jarius S, Franciotta D, Bergamaschi R, Wright H, Littleton E, Palace
J, Hohlfeld R, Vincent A. NMO-IgG in the diagnosis of neuromyelitis
optica. Neurology 2007; 68:1076-1077.
30.Dinc A, Takafuta T, Jiang D, Melikoglu M, Saruhan-Direskeneli G,
Shapiro SS. Anti-endothelial cell antibodies in Behcet’s disease. Clin
Exp Rheumatol 2003; 21(4 Suppl 30):27-30.
31.Briani C, Doria A, Marcolongo R, Tognon S, Ruggero S, Toffanin E,
Ermani M, Ghirardello A, Zampieri S, Semenzato G. Increased titres
of IgM anti-heparan sulfate antibody in Behcet’s disease. Clin Exp
Rheumatol 2006; 24(Suppl 42):104-107.
32. Weedon David. Skin Pathology Textbook. 2nd Edition. Elsevier Health
Sciences ; 2002.
TE
D
298

Benzer belgeler