4. Retinoik Asidin.FH10

ARAÞTIRMALAR (Research Reports)
Retinoik Asidin Prenatal Dönemdeki
Endokondral Kemikleþme Üzerine Etkileri
The effects of retinoic acid on endochondral ossification during prenatal
development
Neriman Çolakoðlu,
Assoc. Prof. MD.,
Department of Histology and Emriyology,
Fýrat University Medical Faculty,
[email protected]
Ayþe Murat Aydýn,
Assist. Prof. MD.,
Department of Radiodiagnostic
Fýrat University Medical Faculty,
amurat@fýrat.edu.tr
Hatice Banu Özel,
Dr. MD.,
Department of Histology and Emriyology,
Fýrat University Medical Faculty,
[email protected]
Özet
Amaç:Bu çalýþmada yüksek doz all-trans retinoik asidin sýçan fetuslerinde endokondral kemikleþme
üzerine olan etkilerinin araþtýrýlmasý amaçlandý.
Gereç ve Yöntemler:Bu çalýþmada 9 adet gebe Wistar-Albino cinsi ergin sýçanlar kullanýldý.
Gebe sýçanlar 3 gruba ayrýldý. I. Grup kontrol olarak kullanýldý. II. Grup deneklere gebeliðin 12.
gününde nörülasyon (prenatal 8.5-11.5 günler arasý nörülasyonun baþlangýç ve bitiþ günleri
olarak tespit edildi) sonrasý III. Grup deneklere ise gebeliðin 8. gününde (nörülasyon öncesi)
tek doz 60mg/kg all-trans retinoik asit gavaj yapýlarak uygulandý. Bütün gebe sýçanlara
gebeliklerinin 18. gününde servikal dislokasyon yapýldý ve her gruptan 6 fetus bu çalýþma için
kullanýldý. Iþýk mikroskobik ve radyografik teknikler kullanýlarak fetal vertebralardaki kemikleþme
incelendi.
Bulgular:Osteoblastik aktivite ve kemikleþen alanlar I. grupta belirgindi. II. grupta kemikleþme
baþlamasýna raðmen III. grup vertebralarda kemikleþme belirtileri gözlenmedi. II. gruptaki
kemikleþen alanlar I. gruba göre daha az olarak ayýrt edildi.
Sonuç:Mevcut bilgiler ýþýðýnda nörülasyondan önce uygulanan yüksek doz all-trans retinoik
asidin kemik morfogenezisini bozduðu fakat nörülasyon sonrasý uygulanan all-trans retinoik
asidin kemik oluþumu sýrasýnda daha az yan etki gösterdiði söylenebilir.
Anahtar Kelimeler: Fetus; Kemik; Osteogenezis; Retinoik asit.
Enver Ozan,
Prof. MD.,
Department of Histology and Emriyology,
Fýrat University Medical Faculty,
ezon@fýrat.edu.tr
Aysel Kükner,
Prof. MD.,
Department of Histology and Emriyology,
Abant Ýzzet Baysal Medical Faculty,
[email protected]
This manuscript can be downloaded from the webpage:
http://tipdergisi.erciyes.edu.tr/project6/2007;29(4)280-284.pdf
Submitted
Revised
Accepted
: November 8, 2006
: March 5, 2007
: April 5, 2007
Abstract
Purpose: The aim of this study was to investigate the effects of excess all-trans retinoic acid
on endochondral ossification in fetuses of rats.
Material and Methods: Nine Wistar-Albino pregnant rats were used in this study. Pregnant
rats were divided into three groups. The first group of rats were used as control. The second
group were fed by gavage a single dose of 60 mg/kg all-trans retinoic acid on day 12 of gestation
after neurulation which began 8.5 day of gestation and finished 11.5 day of gestation whereas
third group received same dose all-trans retinoic acid on day 8 of gestation (before neurulation).
All pregnant rats were sacrificed at day 18 of gestation. Six fetuses from each group were used.
Ossification of fetal vertebrates was light microscopically and radiographycally determined.
Results: Osteoblastic activity and ossified areas were significant in group-I. Ossification signs
were not evident in group-III whereas ossification in vertebrates begun in group-II . However,
ossified areas of group-II were less than those of group-I.
Conclusion: In view of present findings, we suggest that administration of excess all-trans
retinoic acid prior to neurulation disrupted bone morphogenesis. However, its administration
following neurulation had less adverse effect on bone formation.
Key Words:Bone; Fetus; Osteogenesis; Retinoic acid.
Corresponding Author:
Neriman Çolakoðlu,
Departman of Histology and Emriyology,
Fýrat University Medical Faculty,
Elazýð, Turkey
Telephone
E-mail
280
: +91 -xxx
: [email protected]
Erciyes Týp Dergisi (Erciyes Medical Journal) 2007;29(4):280-284
Neriman Çolakoðlu, Ayþe Murat Aydýn, Hatice Banu Özel, Enver Ozan, Aysel Kükner
Giriþ
Kemiðin fetal geliþimi iki þekilde olmaktadýr. Her iki
þekilde de primitif kollagenöz destek dokusunun yerini
kemik dokusuna býrakmasý söz konusudur. Uzun kemikler,
vertebra, pelvis ve kafatasý kemiðinin tabanýný oluþturan
kemikler için sürekli büyüyen bir kýkýrdak model oluþur
ve bu kýkýrdak daha sonra yerini kemiðe býrakýr. Bu
geliþim süreci endokondral kemikleþme olarak bilinir.
Kafatasýnýn yassý kemikleri, maxilla, mandibulanýn büyük
kýsmý ise primitif mezenþim dokusunun direkt kemik
dokusuna dönüþümü ile þekillenir. Bu tip kemikleþme ise
intramembranöz kemikleþme olarak bilinir (1).
Endokondral kemikleþme sýrasýnda kondrositler
proliferasyon, olgunlaþma, hipertrofi, matriks vezikül
biyogenezisi ve apoptozisi içeren aþamalardan geçmektedir.
Bu olaylar dizisi kýkýrdak dokusunun yerini kemik
dokusuna býrakmasýyla sonlanýr. Çoðalan kondrositler
çoðunlukla proteoglikan ve tip II kollagenden oluþan
ekstrasellüler matriksi sentezlerler (2). Kondrositlerin
olgunlaþmasý; hücresel büyüklükteki artýþ (hipertrofi), ve
alkalin fosfataz aktivitesi ve tip X kollagen gibi
hipertrofinin fenotipik belirteçlerinin ekspresyonu ile
birlikte seyreder (2-7). Alkalin fosfataz aktivitesi ve tip
X kollagen ekspresyonu matriks mineralizasyonunu
düzenler (3-7). Kondrosit olgunlaþmasý baþta bone
morfogenetik protein (BMP) ve paratiroid hormonu ile
iliþkili proteinler olmak üzere birçok otokrin ve parakrin
faktör tarafýndan düzenlenmektedir (2). Endokondral
kemikleþme sýrasýnda kondrositlerin çoðunluðu apoptozis
ile ölmekte, mineralize matriks osteoklastlar tarafýndan
sindirilmekte ve kondrositlerin bir kýsmý fenotipik kemik
hücrelerine (osteoblast benzeri hücreler)
farklanabilmektedir (8). Ýnvivo kemik geliþimi oldukça
kompleks bir fenomendir. Osteogenezis; osteoblastlarýn
mezenþimal prekürsörlerinin çoðalýp sýrasýyla
preosteoblastlara (osteoprogenitör hücrelere), osteoblastlara
ve olgun osteoblastlara farklýlaþýp ekstraselüler matriksin
birikip mineralize olmasýyla sonuçlanýr (9).
Retinoidler olarak adlandýrýlan A vitamini ve metebolitleri
fizyolojik konsantrasyonlarda büyüme, hücresel
farklýlaþma, üreme (10, 11) gibi organizmanýn normal
fonksiyonlarýnýn düzenlenmesinde rol oynamaktadýrlar.
Aktif A vitamini meteboliti olan all-trans retinoik asit
(atRA) omurgalýlarýn embriyonik geliþimleri sýrasýnda
hücresel farklýlaþmada, morfogenezisde retinolden çok
daha aktiftir (12). Genetik analizler retinoik asit
reseptörlerinin (RAR) yokluðunda kýkýrdak oluþumunda
ciddi yetersizlik olduðunu göstermiþtir. Transgenik farelerin
geliþen ekstremitelerinde aktif RAR’lar negatif veya zayýf
Erciyes Týp Dergisi (Erciyes Medical Journal) 2007;29(4):280-284
olarak eksprese olduklarýnda kondrogeneziste problem
olmakta ve iskelet malformasyonlarý oluþmaktadýr. Bu
sonuçlar RAR ile ilgili sinyallerin iskelet geliþiminde
önemli rol oynadýðýnýn göstergesidir. RAR’lar kondroblast
farklýlaþmasýný düzenlemekte ve retinoik asit (RA)
sinyaline iþtirak ederek iskelet taslaðýnýn apozisyonel
büyümesinde rol oynamaktadýrlar (13).
Prenatal geliþim sýrasýnda bir morfogen olarak hareket
eden retinoik asit, gebeliðin erken dönemlerinde yüksek
dozda uygulanmasýna baðlý olarak teratojenik etki de
göstermektedir. Maternal yüksek doz RA omfalosel,
ekzensefali, ekzoftalmus ve ekstremite kýsalýðý gibi
defektlere yol açmaktadýr (14).
Bu çalýþmada prenatal geliþimin farklý iki döneminde
uygulanan atRA’in endokondral kemikleþme üzerine
olan etkilerinin ýþýk mikroskobik ve radyolojik olarak
belirlenmesi amaçlandý.
Yöntem ve Gereçler:
Araþtýrma, aðýrlýklarý 250-270 gr olan 9 adet WistarAlbino cinsi ergin (3 aylýk) diþi sýçanlar üzerinde
gerçekleþtirildi. 22 ± 2 0C oda ýsýsýnda 12 saat ýþýk (7:0019:00) ve 12 saat karanlýkta (19:00-7:00) tutulan sýçanlar,
özel olarak yaptýrýlan kafeslerde beslendi.
Maternal All-trans Retinoik Asit Uygulanmasý
Çalýþmada kullanýlan sýçanlara her gün 8.00 - 9.30 saatleri
arasýnda vajinal smear yapýldý. Proöstrüs evresinde olduðu
tespit edilen sýçanlar, ayný günün akþamý erkek sýçanlarla
1:1 þekilde eþlenip ayný kafese konuldu. Ertesi gün sabah
saat 7.00’da erkek ve diþi sýçanlar ayrýldý. Yapýlan vajinal
smear sonrasý sperm (+) olarak tespit edilen sýçanlarýn
gebeliðin 0. gününde olduklarý kabul edildi. Gebe olduðu
saptanan 9 adet sýçan 3 ana gruba ayrýldý.
I.Grup: Kontrol grubu normal beslenen gebe sýçanlara
(n=3) gebeliklerinin 18. gününde servikal dislokasyon
uygulandý. Midsaggital insizyonla fetusleri alýndý. Bu
fetuslerden rastgele seçilen 6 adeti I.grubu oluþturdu.
II.Grup : Gebeliklerinin 12. gününde (GD 12) gavajla 60
mg/kg dozda atRA (15) verilen sýçanlara (n=3)
gebeliklerinin 18. gününde servikal dislokasyon uygulanýp,
midsaggital insizyonla fetusleri alýndý. Bu fetuslerden
özellikle geliþim geriliði olanlar seçilip (n= 6) II.grup
oluþturuldu.
III. Grup: Gebeliklerinin 8. gününde (GD 8) gavajla 60
mg/kg dozda atRA (15) verilen sýçanlara (n=3)
281
Prenatal Dönemde Endokondral Kemýkleþme Üzerýne Retýnoýk Asýdýn Etkýlerý
gebeliklerinin 18. gününde servikal dislokasyon uygulanýp,
midsaggital insizyonla fetusleri alýndý. Bu fetuslerden
özellikle geliþim geriliði olanlar seçilip (n= 6) III.grup
oluþturuldu.
Fetuslar Bouin tespit solüsyonuna atýldý, anomaliler
açýsýndan incelenip, radyografileri çekildikten sonra
midsaggital olarak diseke edildi. Bouin solüsyonunda 24
saatlik tespitten sonra dereceli alkollerle (50, 60, 70, 80,
90, 96, 100º ) yýkandý. Xylol serilerinden geçirildi. Isýsý
54ºC olan etüvde xylol-parafin, yumuþak parafin ve sert
parafin ile muamele edilip bloklar hazýrlandý. Parafin
bloklardan 5 µm’lik kesitler alýnýp Hematoksilen – Eozin
tekniði ile boyandý. Kesitler BH2 Olympus
fotomikroskopla incelenip fotoðraflandý.
Bulgular
Kontrol grubuna ait kesitlerde endokondral kemikleþme
belirgin olarak izlendi. Bu grup vertebralarda hipertrofik
kýkýrdak zonu, kemikleþen alanlar ve yüksek osteoblastik
aktivite saptandý (Resim 1). Nörulasyon sonrasý (GD12)
atRA’e maruz kalan fetuslarýn (grup II) vertebralarýnda
kontrol grubu ile benzer þekilde hipertrofik kýkýrdak zonu,
kemikleþmenin oluþtuðu alanlar ve osteoblastik aktivite
gözlenmekle birlikte, vertebralar kontrolden daha küçük
çaplý olarak ayýrt edildi (Resim 2). Nörulasyon öncesi
(GD8) atRA’e maruz kalan fetuslarda (grup III) vertebra
çaplarýnýn kontrole ve grup II’ye göre oldukça küçük
olduðu ve herhangi bir kemikleþme belirtisine sahip
olmadýklarý tespit edildi. Bu grup fetuslarda perivertebral
bölgelerde belirgin vaskülarizasyon gözlendi ve
vertebralarýn henüz kýkýrdak yapýlarýný koruduðu saptandý
(Resim 3).
Yapýlan radyografik çalýþmalar da ýþýk mikroskobik
bulgularý desteklemekte idi. Kontrol grubuna ait
radyografide kemik yapýlarý ossifiye idi; vertebra, kafatasý,
ekstremite ve yüz kemikleri belirgin olarak ayýrt edildi
(Resim 4a). II. Grup deneklerdeki ossifikasyonun kontrol
grubundaki kadar geniþ çaplý ve belirgin olmadýðý gözlendi.
Vertebralar kýsmen ossifiye idi (Resim 4b). III. Grup
deneklerdeki kemiklerin ossifikasyonu belirgin olmayýp
kýkýrdaðýmsý olarak gözlendi. Kafatasý, yüz kemikleri ve
ekstremite kemiklerinin geliþimi yetersiz ve küçük boyutlu
olarak ayýrt edildi (Resim 4c). Grup II ve III ‘teki fetuslarýn
tepe-oturma nokta uzunluklarý kontrol grubuna göre daha
kýsa olarak tespit edildi.
282
Resim 1. Grup I. Hipertrofik kýkýrdak zonu (h), osteoblastik aktivite
(oklar), kemikleþen alanlar (*) belirgin olarak gözlenmekte. Hematoksilen
Eozin x 120
Resim 2. Grup II. Hipertrofik kýkýrdak zonu (h), osteoblastik
aktivite (ok) ve kemikleþen alanlar (*). Vertebra çapýnýn Grup I’den
daha küçük olduðu belirgin. Hematoksilen Eozin x 120
Resim 3. Grup III. Vertebra çapýnýn Grup I ve II’ye göre anlamlý
derecede küçük olduðu, ve rtebranýn kýkýrdak yapýsýnda olduðu (*) ve
perivertebral bölgenin oldukça vaskülarize olduðu ayýrt edilmekte.
Hematoksilen Eozin x 120
Erciyes Týp Dergisi (Erciyes Medical Journal) 2007;29(4):280-284
Neriman Çolakoðlu, Ayþe Murat Aydýn, Hatice Banu Özel, Enver Ozan, Aysel Kükner
Þekil 4: Fetuslerin lateral radyografileri. a: Grup I . Kemik yapýlar belirgin þekilde ossifiye izlenmektedir.
Vertebralar (kalýn ok), kafatasý ( ince ok ) ve yüz kemikleri (ok baþý) net izlenmektedir. b: Grup II. Vertebralar
kýsmen ossifiye izlenmektedir (kalýn ok).c:Grup III. Genel olarak kemiklerin ossifikasyonu yetersizdir (kalýn ok).
Kafatasý ve yüz kemiklerinin geliþimi yetersizdir ve bu kemikler küçük boyutlardadýr. Ekstremiteler belirgin
derecede kýsa ve ince olarak gözlenmektedir (ince ok). b ve c ‘deki fetuslerin boyutlarýl a ile karþýlaþtýrýldýðýnda
küçüktür.
Tartýþma
Fizyolojik koþullarda retinoik asit kondrojenik farklýlaþma
ve mineralizasyonu aktive eden A vitamini
metabolitlerindendir (16,17). Memeli ekstremite
geliþiminde RA kondrojenik hücreleri de kapsayan birçok
hücre türünün farklýlaþmasýný etkilemektedir (13). Birçok
deneysel çalýþma endojen retinoidlerin ve A vitamini
metabolitlerinin vertebra ve ekstremite geliþiminde önemli
rol oynadýðýný göstermiþtir (18). Teratolojik çalýþmalar
retinoidlerin gerek fazlalýðýnýn gerekse yetersizliðinin
ekstremite geliþiminde bozukluða yol açtýðýný ortaya
koymuþtur ( 18-20).
Yu ve Xing RA’in iskelet geliþiminin erken safhalarýnda
(kondrogenezis) etkili olduðunu bildirmektedirler.
Yaptýklarý çalýþmada RA’in kýkýrdak farklýlaþmasýný inhibe
ederek iskelet malformasyonlarýna yol açtýðýný tespit
etmiþlerdir (21). Biz de yaptýðýmýz çalýþmada kýkýrdak
taslaðýn yerini kemik dokuya býrakmamasýný
kondrogenezis aþamasýndaki bir inhibisyondan
kaynaklandýðýný düþünmekteyiz.Yapýlan iki farklý
çalýþmada atRA’in embriyonik mezenþimal hücrelerin
kondrojenik farklýlaþmasýný inhibe ettiði, farklýlaþan
kondrositlerde ise fenotipik kaybýn meydana geldiði
saptanmýþtýr (22, 23).
Yapýlan bu çalýþmada da morfolojik ve radyolojik
incelemeler atRA fazlalýðýnýn ekstremite ve fetal tepe oturma noktasý uzunluðunda önemli derecede kýsalýða
yol açtýðýný gösterdi. Yine fetal vertebralardan alýnan
kesitlerde geliþimin erken döneminde atRA uygulanan
deneklerde osteogenezisin geciktiði gözlendi. Radyografik
incelemelerimizde bu bulgumuzu destekler nitelikte olup
bu grup vertebralarýn kemikten daha çok kýkýrdaðýmsý bir
taslaktan ibaret olduðunu gösteriyordu.
Bu çalýþmanýn sonucunda prenatal dönemde teratojenik
dozda maternal atRA’e maruz kalan fetuslerde vertebra
ve ekstremite geliþiminde bozukluk ve ossifikasyonda
gecikme saptanmýþtýr. Bu durum özellikle nörülasyon
öncesinde atRA’e maruz kalan fetuslarda daha belirgin
olarak gözlendi. Ýskelet geliþiminde ve kemikleþmede
birçok sinyal molekülünün birbiriyle etkileþtiði ve
koordineli hareket ettiði bilinmektedir. Biz yüksek doz
atRA’in sinyal molekülleri arasýndaki etkileþimi bozup
hücresel proliferasyonu ve farklýlaþmayý inhibe ederek
ekstremite ve vertebralarda geliþim bozukluklarýna yol
açtýðýný düþünmekteyiz.
Erciyes Týp Dergisi (Erciyes Medical Journal) 2007;29(4):280-284
283
Prenatal Dönemde Endokondral Kemýkleþme Üzerýne Retýnoýk Asýdýn Etkýlerý
Kaynaklar
1.Young B, Heath JW, eds. Wheater’s Functional Histology.
Sydney: Churchill Livingstone; 2000.
2. Garimella R, Bi X, Cmacho N, Sipe JB, Anderson HC.
Primary culture of rat growth plate chondrocytes: an in
vitro model of growth plate histotype, matrix vesicle
biogenesis and mineralization. Bone 2004; 34: 961-970.
signaling and skeletal development. Novartis Found Symp.
2001; 232: 171-185
14.Colakoglu N, Kukner A. Teratogenicity of retinoic acid
and its effects on TGF-â2 expression in the developing
cerebral cortex of the rat. J Mol Histol 2004; 35: 823827
3. Kirsch T, von der Mark K. Remodelling of collagen
types I, II and X and calcification of human fetal cartilage.
Bone Miner 1992; 18: 107-117.
15.Yasuda Y, Konishi H, Kihara T, Tanimura T.
Developmental anomalies induced by all-trans retinoic
acid in fetal mice: II. Induction of abnormal
neuroepithelium. Teratology 1987; 35: 355-366
4. Kirsch T, Nah HD, Shapiro IM, Pacifici M. Regulated
production of mineralizastion competent matrix vesicles
in hypertrophic condrocytes. J Cell Biol 1997; 137: 11491160.
16.Koyama E, Golden EB, Kirsch T, et al. Retinoid
signaling is required chondrocytes maturation and
endochondral bone formation during limb skelotogenesis.
Dev Biol 1999; 208: 375-391
5. Kirsch T, Harrison G, Golub EE, Nah HD. The roles
of annexins and types II and X collagen in matrix vesicles
– mediated mineralization of growth plate cartilage. J
Biol Chem 2000; 275: 35577- 35583.
17.Wu LN, Ishikawa Y, Nie D, Genge BR, Wuthier RE.
Retinoic acid stimulates matrix calcification and initiates
type I collagen synthesis in primary cultures of avian
weigth-bearing growth plate chondrocytes. J Cell Biochem
1997; 65: 209-230.
6. Leboy PS, Shapiro IM, Uschmann BD, Oshima O, Lin
D. Gene expression in mineralizing chick epiphyseal
cartilage. J Biol Chem 1988; 263: 8515-8520.
18.Means AL, Gudas LJ. The roles of retinoids in
vertebrate development. Annu Rev Biochem 1995; 64:
201-233
7. Schmid TM, Bonen DK, Luchene L, Linsenmayer TF.
Late event in chondrocytes differentiation: hypertrophy,
type X collagen synthesis and matrix calcification. In vivo
1991; 5: 533-540.
19.Lee GS, Kochhar DM, Collins MD. Retinoid-induced
limb malformations. Curr Pharm Des 2004; 10 (22) :
2657-2699.
8. Cancedda FD, Gentili C, Manduca P, Cancedda R.
Hypertrophic chondrocytes undergo further differentiation
in culture.J Cell Biol 1992; 117: 427- 435
20.Zhou J, Kochhar DM. Cellular anomalies underlying
retinoid-induced phocomelia. Reprod Toxicol 2004; 19:
103-110
9. Raouf A, Seth A. Ets transcription factors and targets
in osteogenesis. Oncogene, 2000; 19:6455-6463.
21.Yu Z, Xing Y. All-trans retinoic acid inhibited
chondrogenesis of Mouse embryonic palate mesenchymal
cells by down-regulation of TGF-â/Smad signaling.
Biochem Biophys Res Commun 2006 ; 340: 929-934.
10. Noy N. Retinoid binding proteins: Mediators of retinoid
action. Biochem J 2000; 348: 481-495
11. Pauken CM, LaBorde JB, Bolon B. Retinoic acid acts
during periimplantational development to alter axial and
brain formation. Anat Embryol 1999; 200: 645-655
12. Nau H. Retinoid teratogenesis: Toxicokinetics and
structure-specificity. Arc Toxicol 1993; 16: 118-127.
13. Underhill TM, Sampaio AV, Weston AD. Retinoid
284
22. Cho SH, Oh CD, Kim JS, Kim IC, Chun JS. Retinoic
acid inhibits chondrogenesis of mesenchymal cell by
sustaining expression of N-cadherin and its associated
proteins. J Cell Biochem 2003; 89: 837-847
23. Bhasin N, Kernick E, Luo X, Seidel HE, Weiss ER,
Lauder JM. Differential regulation of chondrogenic
differentiation by the serotonin 2B receptor and retinoic
acid in the embryonic mouse hindlimb. Dev Dyn 2004 ;
230: 201-209.
Erciyes Týp Dergisi (Erciyes Medical Journal) 2007;29(4):280-284