DNA Üzerinde Mutagenezler Yapılarak Enzimlere İstenilen

YILDIZ TEKNİK ÜNİVERSİTESİ
FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
DNA Üzerinde Mutagenezler Yapılarak Enzimlere İstenilen
Özelliklerin Kazandırılması
Özgün MAVUK
07056001
Biyomühendislik Anabilim Dalında
Hazırlanan
PROJE ÖDEVİ
Ödev Danışmanı
: Doç. Dr. Dilek TURGUT-BALIK (YTÜ)
İSTANBUL, 2009
İÇİNDEKİLER
Sayfa
SİMGE LİSTESİ……………………………………………………………………….….….iv
KISALTMA LİSTESİ……………………………………………………………………..…..v
ŞEKİL LİSTESİ…………………………………………………………………………. ….vii
ÇİZELGE LİSTESİ……………………………………………………………….………….iix
ÖNSÖZ………………………………………………………..………………………..….….ix
ÖZET…………………………………………………………….………………………....….x
1.
GİRİŞ …………………………………………………………………………….1
1.1
Sıtma…………………….………………………..………...…………………......1
1.2
Sıtma Yaşam Döngüsü ve Parazitleri.…………..………...………………………..5
Omurgasız Canlıdaki (Vektör) Yaşam Döngüsü………………………………...4
Omurgalı Canlıdaki (Konak) Yaşam Döngüsü………………..………………....5
1.2.2
Sıtma Parazitleri…..………………………………………………….…………....7
1.3
Sıtmanın Dünyadaki ve Türkiye'deki Yeri………………………….……………11
1.3.1
Sıtmanın Dünyadaki Önemi….…...…...……………………………………...….11
1.3.2
Sıtma'nın Türkiye'deki Önemi……………...………………………………...........17
1.4
Sıtma Metabolizması……………………………………………………………..24
Yağ Asitleri ve Lipitler…………………………………………………………25
Proteinler ve Amino asitler…………………………………………………….26
Nükleotidler ve Nükleik Asitler……………………………………………….27
Vitaminler ve Kofaktörler……………………………………………………..28
Redoks Metabolizması…………………………………………………………28
Hücreye Alım ve Geçirgenlik………………………………………………….29
Karbonhidratlar ve Enerji Üretimi………………………………………….....30
1.4.2
Sıtmanın Anaerobik Metabolizması………………………………………………33
1.5
Kilit Enzimler……………...………………………………………..…………....35
1.5.2
Laktat Dehidrogenaz(LDH)……………………………………………………...36
2.
MATERYAL VE YÖNTEM………………………...…………………...…….....37
2.1
Yönlendirilmiş Mutagenez……………………………...........................................37
2.2
Materyal………………………………………………………………..…............40
PCR 1……………………………………………………………………………40
PCR 2……………………………………………………………………….…..41
2.2.1
Genomik DNA…………………………………………….…………...................42
2.2.2
Primerler……………..………………………………………………………....…..42
2.3
Yöntem………………………..………………………………………...…...........43
1. Aşama…………………………………………………………………………43
2. Aşama…………………………………………………………………………43
3.
BULGULAR VE TARTIŞMA……………………………………….………....44
KAYNAKLAR………………………………………………………………….……………44
SİMGE LİSTESİ
µl
Mikrolitre
µM
Mikromolar
kb
kilobaz
kcat
Kinetik -Katalizleme
kDa
Kilodalton
M
Molar
ml
Mililitre
mM
Milimolar
ng
Nanogram
nM
Nanomolar
ºC
Santigrat derece
pmol
Pikomol
Tm
Erime sıcaklığı
u
Ünite
KISALTMALAR
3D
Üç boyutlu
A
Adenin
AIDS
Edinilmiş Bağışıklık Eksikliği Sendromu
AIDS
Kazanılmış immün yetmezlik sendromu
APAD+
3-asetilpiridin adenin dinükleotid koenzimi
ATP
Adenozintrifosfat
ATP
Adenozin trifosfat
C
Sitozin
DDT
Dikloro difenol trikloroethan
dH2O
Distile su
DHFR
Dihidrofolat redüktaz
DNA
Deoksiribonükleikasit
dNTP
Deoksiribonükleotidtrifosfat
G
Guanin
G6PD
Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz
GFP
Yeşil fluoresan protein
GİS
Gastrointestinal Sistem İnfeksiyonları
GNDA
Gossilik nitril-1,1’ diasetat
H5N1
Hemaglutinin tip 5 ve nöraminidaz tip 1(kuş gribi)
IOM
Ulusal Tıp Enstitüsü (Institute of Medicine )
LDH
Laktat dehidrogenaz
M.Ö.
Milattan Önce
M4-LDH
Kas tipi laktat dehidrogenaz
mRNA
Mesajcı RNA
NAD
Nicotinamide adenine dinucleotide
NAD+
Nikotiamid adenin dinükleotid
NADH
Nikotinamid adenin dinükleotid (indirgenmiş)
NADP
Nikotinamid adenin dinükleotid fosfat
NPP
Yeni alım yolakları (new permeation pathways)
PCR
Polimeraz zincir reaksiyonu
Pf
Plasmodium falciparum
PfLDH
Plasmodium falciparum laktat dehidrogenaz enzimi
Pfu polimeraz Pyrococcus furiosus'tan elde edilen DNA polimeraz
pkk
P.knowlesi
Protein kinaz C-bağlı kinaz
Plasmodium knowlesi
Pm
Plasmodium malariae
Po
Plasmodium ovale
Pv
Plasmodium vivax
PvLDH
Plasmodium vivax laktat dehidrogenaz enzimi
PVM
Parazitoporus kofuk membran
RNA
Ribonükleikasit
ROI
Reaktif oksijen ara maddeleridir (reactive oxygen intermediates)
rRNA
Ribozomal RNA
SOD
Süperoksit dismutaz
T
Timin
TCA
Trikarboksilik asit
TVM
Tubülo-veziküler membran
U
Urasil
WHO
Dünya Sağlık Örgütü
ŞEKİL LİSTESİ
Şekil 1.1 Sıtmanın Ana Semptonları……………….……………………………………….....2
.
Şekil 1.2 Sıtmanın sivrisinekteki yaşam döngüsü ……………………………..……………...4
Şekil 1.3 Sıtmanın insandaki yaşam döngüsü ……..……………………………………….....5
Şekil 1.4 Plasmodium parazitinin hayat döngüsü …………...………………………….……..6
Şekil 1.5 2006 yılında dünya çapında saptanan P.falciparum kaynaklı sıtma olguları
………………………………………………………………………………………………….7
Şekil 1.6 Sıtmada tipik ateş düzenleri ………………………………..………….………….....9
Şekil 1.7 Sıtma durumuna göre ülke kategorizasyonu ………………………………...……..11
Şekil 1.8 Afrika’da görülen sıtmaya bağlı ölüm ..……………………………………...…….12
Şekil 1.9 P. falciparum’da klorokin direncinin dünyada yayılımı…...……………………....12
Şekil 1.10 Türkiye Sağlık Profili …………………………………………………...………..18
Şekil 1.11 Bağlantılı metabolik yolaklar ………………………………………………...…..25
Şekil 1.12 Apikoplastta yağ asidi sentezi……..………………………………………….......26
Şekil 1.13 Konak sitoplasmasının hücreye alınması…...………………….………………….26
Şekil 1.14 Besin kofulundaki aktiviteler……...…………………………………………...….26
Şekil 1.15 . Plasmodium’un nükleotid metabolizması……………………………………..…27
Şekil 1.16 Plasmodium’un redox metaboliazması………………………………………...….29
Şekil 1.17 Hücreye alım yolakları ……………………………………………………….......30
Şekil 1.18 Plasmodium’un pirüvat metabolizması ………….……………...………………..31
Şekil 1.19. Plasmodium’un mitokondri yapısı …………………………………………...…..32
Şekil 1.20 Plasmodium glikoliz şeması………………………………...…………………….33
Şekil 1.21 Glikoliz ve laktik asit oluşumu………………………………..………………......34
Şekil 1.22 Plasmodium vivax laktat dehidrogenaz ın kristal yapısı: NADH ile komplex.......36
Şekil 2.1 Overlap yapan mutant bazlar yardımıyla mutagenez……….……………………....40
Şekil 2.2 PvLDH’ı kodlayan genin 661-720 pozisyonları arasındaki nükleotid dizilimi…….63
TABLO LİSTESİ
Tablo 1.1 Plasmodium parazitlerinin karşılaştırılması……………………………….……......9
Tablo 1.2 İnsanda sıtmaya karşı doğal direnç ……………………..………………………....10
Tablo 1.3 Seçilmiş bulaşıcı hastalıklar, bildirilen vakalar.……..…….….……………………16
Tablo 1.4 Seçilmiş bulaşıcı hastalıklar, bildirilen vakalar 2……………..……………...…...17
Tablo 1.5 1917-1925 döneminde Türkiye genelinde sıtmalı hasta oranı..………………..... 20
Tablo 1.6 Türkiye'de sıtma vakalarının yıllara göre dağılımı, 1925-2002…………………...21
Tablo 1.7 Türkiye'de sıtma vakalarının stratalara ve yıllara göre dağılımı ………..………...22
Tablo 1.8 Yıllara göre seçilmiş enfeksiyon hastalıklarının insidansı..…………………….....23
Tablo 1.9 Yıllara göre seçilmiş enfeksiyon hastalıklarının vaka sayıları……………….…....23
Tablo 1.10 Seçici toksisite…..………………………………………………………………..35
Tablo 1.11 PvLDH’ın insan ve diğer sıtma parazitlerinin LDH dizlerine hizalanması ……..37
ÖNSÖZ
Bu çalışmayı yapmamda bana her türlü destek veren ve kendisinden çok şey öğrendiğim
değerli hocam Doç. Dr. Dilek Turgut-Balık’a çok teşekkür ederim.
Bu çalışmanın yürütülmesine maddi destek sağlayan Yıldız Teknik Üniversitesi’ne ve Yıldız
Teknik Üniversitesi Biyomühendislik Bölümü’ne ve bölümdeki hocalarıma teşekkür ederim.
Çalışmamın yürütülmesine katkıda bulunan Biyomühendislik Bölümü, Moleküler Genetik
Laboratuarı asistanları Biyolog Ayşegül Erdemir, Mol. Biyolog Aslıhan Balcıoğlu ve Biyolog
Ayberk Akat’a teşekkür ederim.
Dostluklarıyla her zaman yanımda olan İlke, Gökçe, Didem, Gülin ve diğer lisans öğrencisi
arkadaşlarıma teşekkür ederim.
Özgün Mavuk
ÖZET
Sıtma, şuan da dünyadaki en ölümcül hastalıklardan biridir. İnsanda hastalık yapan türler;
Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae, ve
Plasmodium knowlesi.’dir. Son derece önlenebilir ve tedavi edilebilir olmasına rağmen, her
yıl yaklaşık 881 000 ölüme yol açar. Günümüzde kullanılan antimalaryal ilaçlara karşı olan
direnç, sıtmanın kontrolünü aksatan bir temel halk sağlığı sorunudur. Bu durum yeni ilaçların
geliştirilmesini zorunlu kılmaktadır. Bunun için ilk adım olarak parazitin metabolik yollarında
kullandıkları enzimler, ilaç tasarımları için hedef olarak seçilmiştir. Plasmodiumların
glikolitik enzimleri hem yeni antimalarial ilaç tasarımlarında alternatif yol temsil edebileceği
düşünüldüğü için hedef moleküller olarak, hem de hastalığın tespiti sırasında kandaki parazit
düzeyini gösteren birer indikatör olarak tanımlanmıştır
Yönlendirilmiş mutagenez çalışmaları sonucunda laktat dehidrogenaz enziminden bir amino
asit çıkarılması ile elde edilmiş olan mutant Plasmodium vivax laktat dehidrogenaz enzimi,
yabanıl tip Plasmodium vivax laktat dehidrogenaz enzimiyle karşılaştırılmıştıdığında substrata
olan afinitesinin ve kcat değerinin düşük olması beklenmektedir.
Anahtar Kelimeler: Sıtma, Laktat dehidrogenaz, Plasmodium vivax, Yönlendirilmiş
Mutagenez
1. Giriş
1.1
Sıtma
Malaria, mal ve aria kelimelerinin birleĢiminden oluĢur ve Ortaçağ Ġtalyanca‟sında „kötü hava'
anlamına gelir (Bynum, 2002). Plasmodium parazitlerinin eritrositlerde parazitlenmesiyle
ortaya çıkan; hepatosplenomegali (karaciğer ve dalakta büyüme), anemi, kaĢeksi (aĢırı
zayıflama) ve dokularda pigment birikimi ile özellenen; ağır komplikasyonlara yol açabilen
bir
hastalıktır.
Anofellerin
yaĢamlarını
sürdürebilmeleri
ve
sivrisinekteki
evrimin
yürütülebilmesi, ancak tropikal ve subtropikal iklimde, sıcak ve nemli iklim koĢullarında; yani,
17-300 0C sıcaklık ve % 60-80 nemde mümkün olabilmektedir. Sıtma, Dünya tarihi üzerine
diğer bütün enfeksiyon hastalıklarından daha fazla etki etmiĢtir. GeçmiĢte ciddi sağlık
problemlerine yol açan birçok enfeksiyoz hastalık çağımızda büyük oranda kontrol altına
alınmıĢken, sıtma önemini günümüzde de korumaktadır (Alver vd., 2007).
Su birikintilerinin sivrisinek yetiĢmesine imkân sağlaması için derinliğin 70 cm‟den az ve
suyun hareketsiz olması gereklidir. Sıtma, en çok durgun su birikintilerinin bulunduğu
yerlerde, akarsu kenarlarında, kanalizasyon ve atık su teĢkilatının olmadığı yerlerde görülür.
Sıtma yaz aylarında oldukça tehlikelidir ve salgınlar endemik olmaktan çıkıp, tüm bölgeye
yayılarak epidemik bir vaziyet alabilir. Yüksek rakımlı arazilere çıkıldıkça sıtma
nadirleĢmekle beraber, uygun koĢullar oluĢtukça görülebilir (Gökberk, 1948).
Sıtmanın kendine özgü tekrarlayan ateĢ durumunun kayıtları, M.Ö. 2700 yıllarında Çin‟den
baĢlayarak tarih boyunca görülebilir (Cox, 2002). Hastalığı ilk defa bildirenler Eski
Mısırlılar'dır. M.Ö. 460-370 yıllarında Hipokrat da bataklık bölgelerde, tekrarlayan ateĢ ve
dalak büyüklüğüyle seyreden bir hastalığın mevcudiyetini fark etmiĢ ve dört ayrı Ģekilde
olabileceğini bildirmiĢtir. Roma Ġmparatorluğu‟nun gerilemesinde sıtmanın önemli rolü
olmuĢtur ve o dönemde Roma‟da çok yaygın olduğundan „Roma AteĢi‟ olarak anılmıĢtır
(BBC News, 2001). Torti (1753), ateĢli hastalıklar için yazmıĢ olduğu kitabında ilk defa
'Malaria' adını kullanarak diğer hastalıklardan ayrı olarak ele almıĢtır. Avrupa‟nın ve Kuzey
Amerika‟nın büyük kısmında sık görülmesine rağmen, artık endemik değildir (Gratz, 2006)
Sıtmalı bir hastanın kanındaki parazitler ilk kez 6 Kasım1880‟de Cezayir, Constantine‟de
görevli, Fransız ordusu cerrahlarından olan Charles Louis Alphonse Laveran tarafından fark
1
edildi. Bu keĢfi sayesinde 1907‟de Nobel ile ödüllendirildi. Sıtma parazitinin hastalardan
sineklere iletilebileceği ilk 20 Ağustos 1897‟de, Hindistan Tıbbi Servisi‟nde görevli bir
Ġngiliz subayı olan Ronald Ross tarafından belirtildi. Sıtma ile daha sonraki çalıĢmalarında
sıtma parazitlerinin sinekler tarafından kuĢlar arasında iletildiğini gösterdi. Bu iletim ise bir
sporogenik döngüyü gerektirmekteydi (parazitlerin sineklerin içinde geliĢtiği bir zaman
aralığı). Ross, sıtma iletimi ile ilgili bu problemi çözdüğünden 1902‟de Nobel ile
ödüllendirildi. (Bynum, 2002).
Şekil 1.1 Sıtmanın ana semptomları (Kilama W, Ntoumi F, 2009)
Birçok hastada tipik sıtma nöbetleri baĢlamadan önce halsizlik, baĢ ağrısı, kas ağrısı, kırıklık,
hafif ishal gibi 14- 30 gün süren prodromal belirtiler görülür. Prodromal dönem sıklıkla gribal
enfeksiyon ve GĠS enfeksiyonları ile karıĢtırılır. Daha sonra tipik sıtma nöbetleri baĢlar.
Tipik bir sıtma nöbetinde 3 dönem bulunur;
1. ÜĢüme-titreme dönemi: Hasta Ģiddetli bir üĢüme ve titreme hisseder. Bu dönem 30
dk. – 2 saat arasında sürer.
2. AteĢ Dönemi: Yoğun baĢ ağrısı ve ateĢ vardır. Bazen hezeyanlar görülebilir. AteĢ
40-41 oC ye kadar yükselebilir. Solunum sık, nabız taĢikardiktir. Bu dönem 2-6
saat bazen daha da uzun sürebilir.
3. Terleme dönemi: Hastanın ateĢi terlemeye baĢlamayla birlikte düĢer. Bu dönem 23 saat sürer ve çok fazla terleme görülür.
Anemi sıtmanın genel bir komplikasyonudur. AteĢe bağlı oluĢan vazodilatasyon yaĢamsal
organlara kan akımını azaltır. Bu durumdan tüm dokuların etkilenebilmesine karĢın en fazla
beyin (serebral sıtma) etkilenir.
2
1.2.
Sıtma Yaşam döngüsü ve Parazitleri
Sıtma parazitleri hayvanlar aleminin bir alt evreni olan Protozoon‟ların Apicomplexa Ģubesi,
Eucoccidiida takımı, Plasmodiidea ailesi ve Plasmodium cinsi içerisinde yer alırlar. (Yotoko ve
Elisei, 2006). Plasmodium cinsi içinde 200 tür tanımlanmıĢtır ve yeni türlerin keĢfi devam
etmektedir (Perkins ve Austin, 2009). Ġnsan sağlığı yönünden önemli olan türler ise; P.vivax,
P.malariae, P.ovale, P.falciparum ve P.knowlesi’dir. Bütün türlerin konağı ise Anopheles
türlerinin diĢileridir. Bu grupların genel özellikleri Ģu Ģekildedir;
Apicomplexa şubesi: Bu Ģubedeki parazitlerin evrim dönemlerinden birinde tepe kompleksi
bulunmaktadır.
Plasmodiidea ailesi: Buradaki parazitlerde makro ve mikro gamet birbirinden bağımsız olarak
oluĢur, bir mikrogametositten sivrisinek vücudunda 8 tane kamçılı mikrogamet meydana gelir.
Mikrogametin makrogameti döllemesiyle zigot oluĢur, zigot Ģekil değiĢtirip hareketli ookinete
dönüĢür, sonra da içinde sporozoitler oluĢur. Heteroksen bir geiĢme gösterirler. Omurgalı konak
vücudunda merogoni, omurgasız konakta sporogoni ile çoğalırlar.
Plasmodium cinsi: Eritrositler içinde Ģizogoni (merogeni) ve gametosit geliĢimi görülür.
Parazitin oluĢturduğu pigmentler ıĢık mikroskobunda görülebilir. Memelilerde geliĢen
Plasmodium türlerinin vektörleri Anofel cinsi sivrisineklerdir. Plasmodium’larda gametositler
paraziteminin pik yapmasında 4-6 gün sonra oluĢmaya baĢlarlar. P.vivax ve P.ovale‟ nin
ekzoeritrositer formları karaciğerde ve diğer bazı dokularda kalıcı olabilir. Bu türlerdeki
rölapstan, ekzoeritrositer dönemde parenkim hücresi içine giren, geçici bir süre geliĢimi duran
sporozoitler sorumludur. P.falciparum ve P.malariae türlerinde ise ekzoeritrositer dönemde
sporozoitler oluĢumu görülmemektedir. Yani bunlarda Ģizogoni tek nesildir. Türler arasında
çeĢitli farklılıklar bulunmaktadır; örneğin P.falciparum ‟un gametositleri hilal Ģeklindedir ve
bunlar kan dolaĢımında diğer eritrositik dönemlerden sonra görülür.
Ġnsan sıtma parazitinin yaĢam döngüsünde Anofel‟de omurgasız faz (ekstrinsik faz), insanda
omurgalı faz (intrinsik faz) olmak üzere iki dönem vardır. EĢeyli üremenin gerçekleĢtiği
ekstrinsik faz son konaktan, aseksüel üremenin olduğu intrinsik faz ara konakta yer alır
(ġekil.1.3 ) (Özcel, 1999).
3

Omurgasız Canlıdaki (Vektör) Yaşam Döngüsü
Şekil 1.2 Sıtmanın sivrisinekteki yaĢam döngüsü [1]
Sıtma parazitleri, sivrisinekte eĢeyli üremenin (döllenme) ve sporogoninin görüldüğü iki evre
geçirmektedir.
Döllenme:
Anopheles cinsi sivrisineklerin sıtmalı insandan kan emerken aldıkları mikrogametosit (erkek) ve
makrogametosit (diĢi), sivrisineğin midesinde hızla gametlere dönüĢür (Özcel, 1999).
Sivrisineğin midesinde mikrogametositler 8 kamçılı bir yapı meydana getirerek mikrogametlere
ve makrogametositler ise makrogametlere dönüĢmektedir. Makrogamet ve mikrogametin
döllenmesiyle zigot meydana gelmekte ve zigotun meydana gelmesinden kısa bir süre sonra ise
zigot hareketli ookinete dönüĢmektedir. Ookinet mide duvarını delerek mide epitelyum hücreleri
ve basal membranın arasındaki boĢlukta ookist adı verilen yuvarlak Ģekilli bir duvar
oluĢturmaktadır (Kayser, 2005).
Sporogoni:
Ookist hızla geliĢip (40-60 μm çaplı) sivrisineğin vücut boĢluğuna (hemosöl) doğru ĢiĢerek
binlerce sporozoit meydana getirmektedir. Ookist patlayarak, sporozoitler sineğin vücut
boĢluğundan tükürük bezlerine hareket etmekte ve orada yerleĢmektedir. Sivrisinekteki bu yaĢam
4
döngüsü parazit türüne ve ortamın sıcaklığına bağlı olarak 8-14 gün arası sürmektedir. Sivrisinek
kan emerken tükürük bezindeki bu sporozoitler konak canlıya geçip konak canlıdaki yaĢam
döngüsünü baĢlatmaktadır (Kayser, 2005).

Omurgalı Canlıdaki (Konak) Yaşam döngüsü
Şekil 1.3. Sıtmanın insandaki yaĢam döngüsü [2]
Sıtma parazitlerinin omurgalı konak canlıdaki yaĢam döngüsü, karaciğerdeki dönem (Hepatik ya
da ekzoeritrositik Ģizogoni) ve alyuvardaki dönem (eritrositik Ģizogoni) olmak üzere ikiye ayrılır.
Ekzoeritrositik (Hepatik) Şizogoni:
Sıtma sporozoitlerini taĢıyan anofel sivrisineği konak canlıdan kan emerken binlerce sporozoit,
konağın dolaĢım sistemine girmektedir. Enfeksiyonun ortaya çıkması için çok az sayıda
sporozoit yeterli olmaktadır (örneği P.falciparum için 10 sporozoit). Enfeksiyonun meydana
geldiği ilk bir saat içinde sporozoitler kan yolu ile eĢeysiz üremenin gerçekleĢeceği karaciğer
hücrelerine (Hepatosit) girmektedirler. Sporozoitler burada çok çekirdekli bir yapı olan hepatik
Ģizontu oluĢtururlar. Sitoplazmik bölünmeler sonucunda bir karaciğer hücresinde binlerce
merozoit oluĢmaktadır. Merozoitlerin oluĢumu 6-15 gün içinde gerçekleĢmektedir.
Fakat
P.vivax ve P.ovale gibi parazit türlerinde Ģizont oluĢumu hemen gerçekleĢmez ve sporozoitler
uyku dönemi geçirir. Bu uyku dönemi aylar hatta yıllarca sürebilir. Merozoit oluĢtuktan sonra
karaciğer hücresi patlar ve merozoitler kan dolaĢımına katılır (Kayser, 2005).
5
Eritrositik Şizogoni:
Merozoitlerin alyuvarlara girmesiyle baĢlar. Alyuvara giren sporozoit mikroskop altında yüzük
Ģeklinde görülür. Bu yapı geliĢerek, çok çekirdekli eritrositik Ģizontu oluĢturur. ġizont eĢeysiz
bölünerek çok sayıdaki merozoitleri oluĢturmakta ve merozoitlerin alyuvarları patlatarak kan
dolaĢımına katılmasıyla eritrositik Ģizogoni dönemi tamamlanmaktadır (Kayser, 2005).
Şekil 1.4. Plasmodium parazitinin hayat döngüsü [3]
Merozoitlerin yeni bir alyuvara girmesiyle bu eĢeysiz dönem tekrarlanmaktadır. Kısa bir zaman
sonra bu döngüler belli aralıklarla olmaya baĢlamaktadır. P.vivax, P.falciparum ve P.ovale‟de
döngüler 48, P.malariae‟da 72, P.knowlesi’de 24 saatlik döngüler halinde gerçekleĢmekte ve her
alyuvarın parçalandığı dönemde konak canlıda ateĢ nöbetleri meydana gelmektedir. Birkaç
döngü sonra bazı merozoitler eĢey hücreleri olan mikrogametosit ve makrogametositlere
dönüĢmektedir. Anofel sivrisinekleri, hücreleri kan emerek aldıklarında Plasmodium’ların da
6
hayat döngüleri yeniden baĢlamakta ve kan dolaĢımında kalan gametosit hücreleri ise belirli bir
zaman sonra ölmektedirler (Kayser, 2005). Temelde Plasmodium türlerinin hayat döngüleri
yukarıda anlatıldığı gibi meydana gelse de, türler arasında döngü süresi, ookinit, sporozoit,
merozoit ve gametlerin büyüklüğü ve hücre içindeki Ģekilleri bakımından farklılıklar
görülmektedir (Özcel, 1999).
1.2.2 Sıtma Parazitleri
Ġnsanda hastalık yapan türler; Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale,
Plasmodium malariae, ve Plasmodium knowlesi.’dir. P. falciparum en ölümcül parazitken, P.
vivax ise dünya çapında en yaygın olan parazittir. P. vivax'ın ölümcül olmadığı kabul edilse de
hastalarda ciddi sorunlara neden olur. (Dünya‟da sıtmanın %90 kadarı P.vivax ve
P.falciparum‟un neden olduğu, %80‟i P.vivax‟ın neden olduğu sıtmadır ( Mendis v.d., 2001)).
Plasmodium ovale ve Plasmodium malariae da, insanlarda genelde ölümcül değildir ve
nispeten daha hafif hastalık yapar. Ayrıca memeliler, kuĢlar ve sürüngenler gibi birçok türü
enfekte edebilen birçok sıtma paraziti vardır (Su v.d., 2009).
Şekil 1.5 2006 yılında dünya çapında saptanan P.falciparum kaynaklı sıtma olguları (WHO, 2008)
Plasmodium türlerinin bölgelere göre dağılımında toplumların genetik özelliklerinin etkili
olduğu düĢünülmektedir (Sarı C. v.d., 2004). Plasmodium vivax daha çok sıcak ve tropik
bölgelerde hastalığa sebep olmakta ve Plasmodium türleri içinde tüm dünyada geniĢ bir yayılım
göstermektedir. Tropikal Afrika, Asya ve Güney Amerika‟da oldukça yaygındır (Unat v.d.,
1995; Mendis, 2002). P. ovale yalnızca Batı ve Pasifik yerlilerinde hastalık oluĢtururken P.
malariae olgusuna ise pek rastlanmamıĢtır (Unat v.d., 1995). P. falciparum ise diğer türlere
7
göre daha ciddi ve ilerleyen bir hastalığa neden olup, çoğunlukla birkaç gün içinde hastanın
ölümüne yol açar (Darwin, 2002; Gilles, 1993). Afrika ve Güneydoğu Asya‟nın büyük bir
bölümünde yaygındır (Unat vd, 1995). P. knowlesi genelde Güneydoğu Asya‟da görülen bir
primat sıtmasıdır. Uzun kuyruklu makaklarda (Macaca fascicularis) hastalık yapar, fakat doğal
ya da yapay yollarla insanları da enfekte edebilir. Plasmodium knowlesi beĢinci önemli insan
sıtma parazitidir. 24 saatlik aseksüel eritrosit döngüsünden de anlaĢılabileceği gibi, Ģiddetli
sıtmaya neden olabilir ve insanlarda görüldüğü ilk olarak 1965‟te rapor edilmiĢtir (Chin v.d.,
1965). Mikroskopik tanı aĢamasında P.malariae ile karıĢtırıldığından bugüne kadar teĢhisi
kesin olarak yapılamamaktadır (Cox-Singh v.d., 2008). En çok bulunduğu Güneydoğu Asya‟da
görülen sıtma olgularının %70‟inden sorumludur (McCutchan v.d., 2008). Ġletiminin iki olası
yolu vardır; hasta maymundan insana ya da hasta insanda baĢka bir insana (Bronner v.d., 2009).
En ağır seyirli sıtmaya P.falciparum‟un neden olmasının nedenleri; her yaĢtaki eritrositi
enfekte edebilmesi, böylece enfekte olan eritrosit sayısının artması; enfekte eritrositler içinde
birden çok sayıda parazit bulunabilmasi; enfekte eritrositlerin birbirine ve damar çeperine
yapıĢma özelliği kazanması ve mikrodolaĢımı bozup kan akımını azaltmasıdır (Gülez v.d.,
2003). Ġleri derecede parazitemi vardır ve beyin gibi önemli organlara yerleĢme nedeniyle
(beyin sıtması) tehlikeli komplikasyonlar sık oluĢur. Primer doku dönemi çok kısadır ve
araciğerde sekonder doku dönemi bulunmaz [4].
Plasmodium vivax : Benign tersiyan malarya
Plasmodium ovale: Ovale tersiyan malarya
Plasmodium falciparum: Malign tersiyan malarya
Plasmodium malariae: Quartan malarya
Plasmodium knowlesi: Quotidian malarya
(Tersiyan ve quartan ayırımı nöbetlerin görülme sıklığını belirtir. Tersiyan da 2 günde bir,
quartan 3 günde bir, quotidian ise hergün sıtma nöbeti oluĢur.
8
Şekil 1.6 Sıtmada tipik ateĢ düzenleri [2]
Tablo 1.1. Plasmodium parazitlerinin karĢılaĢtırılması
Tür
Eritrosit
Maksimum
Her
ġizogoni
YaĢı
Parazitemi
Ģizontta
Süresi (h)
merozoit
P. vivax
Genç
25 000
16
(12- 48
24)
P. ovale
Genç
25 000
P. falciparum Her yaĢta > 1 000 000
P. malariae
YaĢlı
10 000
8 (6-14)
48
16 (8-24)
36-48
8 (6-12)
72
9
GörünüĢ
P. knowlesi
hiperparazite
24
mi
Sıtmanın klinik seyrini, Plasmodium'un türü yanında, kiĢinin sıtmaya karĢı doğal
immünitesinin derecesi önemli ölçüde etkiler. Plasmodium türlerine karĢı insanlarda ırk ve
yaĢa bağlı bir doğal direnç vardır. Eritrositlerde glukoz-6-fosfat dehidrogenaz (G6PD)
eksikliği ve hemoglobin bozuklukları, kiĢide sıtmaya karĢı tolerans sağlar (Ruwende C. vd,
1995; Beutler E, 1978). Örneğin Duffy kan grubuna sahip beyazlar, zencilere göre P.vivax
sıtmasına daha duyarlıdır. Bu kan grubunu taĢımayan zenciler ise doğal olarak dirençlidir
(Galinski MR v.d., 1992). Orak hücreli anemisi olanlar da eritrositlerinde taĢıdıkları anormal
hemoglobin nedeniyle P.falciparum‟a karĢı doğal dirence sahiptirler (Canatan N, Dünyada Ve
Türkiye‟de Talasemi Ve Anormal Hemoglobinler). Sıtma parazitlerine karĢı enfekte kiĢilerde
antikor yapımı vardır. Ġnsanlarda oluĢan bağıĢıklık türe özgüdür (Saygı G, 1998).
Tablo1.2 Ġnsanda sıtmaya karĢı doğal direnç [5]
Bununla birlikte sıtma parazitlerinin klasik antimalarial ilaçlara karĢı direnç kazanmaları
sıtmanın tehlikeli boyutunu daha ileri aĢamalara götürmektedir. P.falciparum ve P.vivax ‟ın
da var olan antimalarial ilaçlara karĢı direnç kazanmıĢ olmaları, bu türler için ilaç
tasarımlarını zorunlu hale getirmiĢtir (Chaikuad A vd., 2005; Turgut-Balık D. v.d., 2006).
Bunun için ilk adım olarak parazitin metabolik yollarında kullandıkları enzimler, ilaç
tasarımları için hedef olarak seçilmiĢtir. Çünkü parazitin yaĢam devresinde bu enzimler
önemli rol oynamaktadır (Turgut-Balık D. v.d., 2006). Plasmodiumların glikolitik enzimleri
10
hem yeni antimalarial ilaç tasarımlarında alternatif yol temsil edebileceği düĢünüldüğü için
hedef moleküller olarak, hem de hastalığın tespiti sırasında kandaki parazit düzeyini gösteren
birer indikatör olarak tanımlanmıĢtır (Turgut-Balık D. v.d., 2006; Roth v.d., 1988; Klenerman
P. v.d., 1992; Makler ve Hinrichs, 1993)
1.3
Sıtmanın Dünyadaki ve Türkiye’deki Yeri
1.3.1 Sıtmanın Dünyadaki Önemi
Şekil 1.7 Sıtma durumuna göre ülke kategorizasyonu (World Malaria Report, WHO, 2008)
Sıtma, Ģu anda dünyadaki en ölümcül hastalıklardan biridir (verem ve sıtma birlikte global
hastalık yükünün % 4.5‟ini oluĢturur) (WHO, Global Health Risks, 2009). Son derece
önlenebilir ve tedavi edilebilir olmasına rağmen, her yıl yaklaĢık 881 000 ölüme yol açar. On
ölümden dokuzu Afrika Sahra Çölü‟nün güney kısmında görülür ve sıtma nedeniyle
ölenlerin %85‟i beĢ yaĢ altı çocuklardır. Bu her 30 saniyede bir Afrika‟da bir çocuğun öldüğü
anlamına gelir.
11
Şekil 1.8 Afrika‟da görülen sıtmaya bağlı ölüm ( Carter, ve Mendis, 2002; Trape v.d., 1998)
Sıtmanın insani yükünün yanında ekonomik yükü de büyüktür; sıtmanın Afrika ülkelerine her
yıl 12 milyar Amerikan dolarına mal olduğu düĢünülüyor. 2008‟de, 45‟i Afrika bölgesinde
olmak üzere 109 ülke sıtma endemik olarak rapor edildi. 2006‟da tahminen 247 milyon sıtma
olgusu gözlenmiĢtir (Kokwaro, 2009). Ġklim değiĢikliğinin ise, 2004‟te gerçekleĢen dünya
çapındaki sıtma nedenli ölümlerin %3‟ünden sorumlu olduğu belirlendi (WHO, Global Health
Risks, 2009).
Şekil 1.9 P. falciparum’da klorokin direncinin dünyada yayılımı (Hayton, v.d., 2005; Mehlotra v.d.,
2008; Zakeri v.d., 2008)
En ölümcül tür olan Plasmodium falciparum‟un sık kullanılan hemen tüm sıtma ilaçlarına
karĢı direnç gösterdiği gözlenmiĢtir. Bu durum sıtma endemik bölgelerde yapılan hastalık
kontrol çalıĢmaları önünde büyük bir engel teĢkil eder.
12
13
14
15
Tablo 1.3. SeçilmiĢ bulaĢıcı hastalıklar, bildirilen vakalar (Dünya Sağlık Ġstatistikleri, WHO; 2009)
Dünya nüfusunun yaklaĢık yarısı (3.3 milyar) sıtmanın bulaĢma riskinin olduğu bölgelerde
yaĢarken, beĢte biri (1.2 milyar) sıtma riskinin yüksek olduğu bölgelerde yaĢamaktadır. Diğer
2.1 milyar insan ise düĢük risk bölgelerinde bulunmaktadır. Sıtma, solunum yolları
enfeksiyonları (4.2 milyon), ishal enfeksiyonları (2.2 milyon), AIDS (2 milyon) ve veremden
(1.5 milyon) sonra en çok ölüme neden olan dördüncü enfeksiyon hastalığıdır (WHO, 2008).
16
Afrika ve az geliĢmiĢ ülkelere baktığımızda ise; 45‟i Orta ve Güney Afrika bölgesinde,
diğerlerinin çoğu Asya, Okyanusya, Orta ve Güney Amerika ve Kafkasya‟da olmak üzere 109
ülke endemiktir (Tablo 1.3-1.4).
Herhangi bir sıtma riskiyle karĢı karĢıya olan en kalabalık nüfus Güneydoğu Asya ve Batı
Pasifik bölgelerinde bulunurken, Afrika yüksek sıtma riski altında en fazla insan nüfusu
barındıran bölgedir (Tablo 1.3-1.4).
Tablo 1.4. SeçilmiĢ bulaĢıcı hastalıklar, bildirilen vakalar 2 (Dünya Sağlık Ġstatistikleri, WHO; 2009)
1.3.2 Sıtmanın Türkiye’deki Önemi
Tarım yapılan hemen her yerde kendini gösteren sıtma, Anadolu coğrafyasında da sonuçları
itibariyle toplumsal yaĢamı etkilemiĢ ve her dönemde mücadele edilmeye çalıĢılmıĢtır.
Ülkemizde sıklıkla P.vivax nadiren ise seyahat kaynaklı P.falciparum ‟un yol açtığı
sıtma olguları görülmektedir (Akdur R, 1999).
17
18
Şekil 1.10 Türkiye Sağlık Profili (WHO, 2007)
Sıtma, Türkiye‟de bulunan yedi farklı birikinti modelinde görülür:

Nehirlerin ve göllerin karların erimesiyle taĢarak çevrelerindeki alçak arazileri
doldurması ve kendi yataklarına çekilmesinin ardından uzun süre temelde kalan su
birikintileri

Nehir deltalarında oluĢan sürekli bataklıklar (Kızılırmak ve YeĢilırmak deltaları)

Büyük nehirlerin yatakları yakınındaki alçak araziler, dağ eteklerinden kaynayan
suların getirdiği sürekli bataklıklar (Söke ve civarı)

Geçirimsiz zeminlerde yeraltı sularının yüzeye çıkması sonucu oluĢan bataklıklar
(Ankara ve Sincan civarı)

Dağ sıraları ile deniz arasındaki alçak arazideki sürekli bataklıklar ( Ġskenderun,
Mersin ve Silifke)

Pirinç tarımı ve değirmenlere su vermek için ĢiĢirilen suların, hendeklerin neden
olduğu birikintiler ile köylerde hayvan sulaması için oluĢturulan su toplama yerleri
(Tekeli Ġ, Ġlkin S, 2004)
Birinci Dünya SavaĢı ve KurtuluĢ SavaĢı nedeniyle, eğitimli nüfusun büyük kayıp verdiği
Türkiye‟de, sınırlı sayıdaki iĢgücü de salgın hastalıklarla mücadele etmekte, kalkınma için
gerekli olan iĢgücünün artırılması mümkün olamamaktaydı. Yıllar süren savaĢların yaralarının
sarılması ve kalkınma sürecinin baĢlaması için ülkenin sağlık konusundaki geri kalmıĢlığı,
sıtma, verem, frengi gibi salgın hastalıkların yaygınlığı ve çocuk ölümlerinin önlenemez
yükseliĢi bir an önce durdurulmalıydı.
19
Birinci Dünya SavaĢı esnasında Osmanlı Ordusuna her Ģeyden fazla sıtma büyük zarar verdi.
Dört sene içinde ordunun sıtma vakaları ise tahmin edilemeyecek derecede yüksekti. 1924
yılına kadar memleket hastanesine müracaat eden hastaların üçte birinden fazlasının sıtma
mikrobu taĢıdığı anlaĢıldı (Aksu L, 1943) 1920 ve 1921 yıllarında ölüm oranları doğum
oranlarının 2,5 katına ulaĢtı (Türkiye Cumhuriyeti Sağlık Bakanlığı, Sağlık Hizmetlerinde 50
Yıl, 1973). Ankara ve çevresinde sıtma, 1923-1924 senelerinde büyük salgın halinde görüldü.
(Aksu L, 1943 )
Cumhuriyetin ilanından sonra artan bir Ģekilde sürdürülen sıtma mücadelesi çalıĢmaları, Ġkinci
Dünya SavaĢı yıllarında kesintiye uğradı ve sıtma bu dönemde yeniden canlandı. SavaĢ
koĢullarında askeri birliklerin yer değiĢtirmesi ve ekonomik sıkıntı nedeniyle beslenme
imkânlarının zayıflaması ile sıtma yaygınlaĢtı. Ġkinci Dünya SavaĢı sırası ve sonrasında
yaĢanan büyük nüfus hareketleriyle çok büyük salgınların çıkmaması bir tecrübeli bir sıtma
mücadelesi kadrosunun yetiĢtirilmesiyle mümkün olmuĢtu (Gökberk C, 1948).
1955 yılından sonra sıtmanın eradike edilmesi konusunda Dünya Sağlık Örgütü'nün önerileri
ile yoğun bir faaliyete geçilmiĢ, 1958- 1964 yılları arasında sıtma olgu sayısı yıllık 5000,
1965-1975 yılları arasındaki on yıllık dönemde ise olgu sayısı yıllık 2000 civarına düĢmüĢtür.
Bu olgu sayıları, 1977 yılında sıtma mücadelesinin aksaması ve sivrisineklerin DDT'ye direnç
kazanması ile 100.000'in üzerine çıkmıĢtır. Olgu sayılarında artma nedeni ile tekrar
mücadeleye hız verilmiĢ ve olgu sayıları 1990 yılında 8.680‟e inmiĢtir. Buna karĢılık sıtmalı
olgu sayısı, 1993'te 47.210 ve 1994'te 84.345'e yükselmiĢtir.
1990 yılından itibaren bu olguların %87'si gibi büyük bir kısmının da Güney Doğu Anadolu
Bölgesindeki illerden bildirildiği görülmüĢtür (T.C Sağlık Bakanlığı, Sıtma SavaĢ Daire
20
BaĢkanlığı Ġstatistikleri 2002; Akdur R, 1999). Türkiye‟de, Adana, Mersin, Hatay en çok
olgunun görüldüğü bölge olup; ikinci sıklık bölgesi Gaziantep ve Diyarbakır gibi güneydoğu
illerini içermektedir.
Tablo 1.6 Türkiye'de sıtma vakalarının yıllara göre dağılımı, 1925-2002[6]
Sıtma savaĢı ile sıtma mikrobunun tamamen yok edilmesi birbirinden farklı mücadeleleri
gerektirmekteydi. Sıtma savaĢı bir program dahilinde aĢama aĢama devam etmeli ülke
genelinde sıtmaya elveriĢli ortamların ortadan kaldırılması ve halkın hastalıkla mücadele,
temizlik alıĢkanlığı gibi konularda bilinçli olması gerekliydi. Türkiye gibi geri kalmıĢ ve
kalkınma mücadelesi veren bir ülkede halkın yeterince bilince sahip olmadığı düĢünülünce
yapılan sıtma mücadelesinin birdenbire sonuç vermesini beklemek mümkün değildi. Halkın
ilaçları uygun miktarda ve zamanlarda almaması ve daha birçok iktisadi ve toplumsal
nedenler, bilgi ve medeniyet seviyesi baĢarının erken elde edilmesini engellemekteydi
(Gökberk C, 1948).
21
Sıtmanın cinsiyet farkı gözetmeden her iki cinste de görülebildiği bilinmektedir (Akdur R,
1999). Ancak, sıtma görülme sıklığının cinsiyetlere göre dağılımı incelendiğinde kadınlara
oranla erkeklerde daha sık görüldüğü bildirilmektedir (Akkafa F v.d., 2002; Ertuğ S v.d.,
2002; Öksüz R v.d., 2001; Yazar S v.d., 2002). Bunun da nedeni olarak, erkeklerin dıĢ
ortamlarda kadınlardan daha çok bulunmaları ve Anopheles cinsi sivrisinekler ile daha çok
temas etmeleri gösterilmektedir (Ertuğ S. v.d., 2002).
Türkiye‟de sıtmaya en sık Eylül ayında rastlanıldığı bildirilmektedir (T.C Sağlık Bakanlığı,
Sıtma SavaĢ Daire BaĢk. Ġstatistikleri, 2002). Manisa‟da sıtma olgularının Mayıs- Kasım
ayları arasında görüldüğü bildirilirken, vektör yoğunluğunun Temmuz-Ağustos-Eylül
aylarında en üst düzeye ulaĢtığı ve bu aylarda açık havada uzun süre kalmanın bulaĢ riskini
arttırdığı ifade edilmiĢtir (Östan Ġ. v.d., 2002). Diyarbakır‟da sıtma olgularının en sık Temmuz
ayında (Saka G. v.d., 2000), ġanlıurfa‟da ise Haziran ve Ekim ayları arasında saptandığı
bildirilmiĢtir (Ertuğ S. v.d., 2002).
22
23
Son yıllarda ülkemizde tespit edilen sıtmalı olgu sayısında belirgin bir azalma görülmekle
birlikte sıtma, günümüzde halen önemini koruyan bir enfeksiyon hastalığıdır. Kimyasal
maddenin (DDT) ilk aĢamada anofeli klinik bir kesinlikte öldürmesine karĢın, bir süre sonra
güçlü ve dirençli bir tür üremiĢtir. Bugün 57 sivrisinek türü, DDT ve diğer böcek zehirleri
içinde hiçbir Ģekilde etkilenmeden yaĢayabilmektedir. Günümüzde sıtma, Dünya Sağlık
Örgütü (WHO)‟nin yanlıĢ uygulamalarıyla hastalıklar arasında en dirençli ve zalim
olanlarından biri haline gelmiĢtir. TaĢıyıcılarının kimyasallara dirençli hale gelmelerinin yanı
sıra plazmodyum paraziti de, onu yok etmek üzere ölçüsüzce kullanılan ilaçlara karĢı benzer
direnç geliĢtirmiĢtir. Ölçüsüzce yayılan tonlarca DDT, öngörülmeyen birçok sağlık
sorunlarına yol açmıĢ ve ekolojik dengeyi bozan yeni durumlar, ortaya çıkmıĢtır (Nikiforuk A,
MahĢerin Dördüncü Atlısı, Salgın ve BulaĢıcı Hastalıklar Tarihi, ĠletiĢim Yayınları, Ġstanbul
2007). Ayrıca bataklıkların ve büyük miktardaki su birikintilerinin kurutulması geri dönüĢü
olmayan sorunların ortaya çıkmasına neden olmuĢtur (Süyev M, 1953)
1.4
Sıtma Metabolizması
Tek bir sıtma parazitiyle gerçekleĢen bir enfeksiyonda 10 milyona kadar yeni organizma
oluĢturulabilir ve parazitin hemen tüm metabolik faaliyeti bu devasa büyümeyi desteklemeye
odaklıdır (IOM, Malaria: Obstacles and Opportunities, 1991). Diğer parazitler gibi
Plasmodium‟lar da yaĢamlarını devam ettirmek, geliĢmek ve üremek için farklı ürünlere
ihtiyaç duyarlar ve parazitliğin genel özelliklerinden biri olarak bu ürünler için baĢka bir
canlıya, konağa bağımlıdırlar. Plasmodium‟ların hayat döngüleri boyunca farklı organ ve
dokuları istila etmeleri, geliĢimleri sırasında değiĢik ortamlara uyun sağlamak zorunda
olmaları, biyokimyasal özelliklerinin oldukça karmaĢık bir Ģekilde geliĢmesine neden
olmuĢtur (Özcel,1999).
Tüm canlıların gereksinim duyduğu karbonhidratlar, amino asitler, mineraller ve eser
elementlere ek olarak parazitler pürin bazları, nükleozidler, yağ asitleri, sterol ve porfirinler
gibi
diğer
maddelere
de
gereksinim
duymaktadırlar.
Plasmodium‟ların
metabolik
gereksinimlerinin büyük çoğunluğunu konak plazmasından ve eritrositlerinden karĢıladığı
bilinmektedir (Hyde,1990; Özcel,1999).
24
MOLEKÜL
YAPI TAŞI
ANA FONKSİYONU
DNA
Nükleotidler
Genetik Madde
RNA
Nükleotidler
Protein sentezi
şablonu
Protein
Amino asitler
Hücre yapısı ve
Fonksiyonu
Lipit
Yağ asileri
Membran Bileşeni
Karbohidrat
Şeker
Enerji Üretimi
Şekil 1.9 Bağlantılı metabolik yolaklar [7]
AĢağıda parazit metabolizmasının kimi yönleri biyomoleküllerin sınıf ve iĢleyiĢleri
çerçevesinde, sıtmaya özgü yönleri vurgulanarak verilmiĢtir;

Yağ Asitleri ve Lipitler
Lipitler hücre membranlarının en önemli bileĢenlerindendir. Hızla büyüyen parazit iç ve dıĢ
membran miktarının artması nedeniyle büyük miktarda lipide ihtiyaç duyar. Bu büyük lipit
ihtiyacı lipit metabolizmasını antimalarial ilaçlar için çekici bir hedef yapar (Mitamura ve
Palacpac, 2003).
Membran lipitleri polar bir baĢ gubu bulanan gliserol (3-carbon unite) temelden ve iki uzun
yağ asidi zincirinden oluĢur. GeçmiĢte, parazitlerin yağ asitlerini de novo sentezleyemediği
düĢünülüyordu fakat tip II yağ asidi sentezi yolağıyla iliĢkili birçok enzim Plasmodium
apikoplastında saptandı.
25
Şekil 1.12 [8]

Proteinler ve Amino asitler
Proteinler 3D yapılar oluĢturan lineer aminoasit zincirlerinden oluĢur. Enzim ve yapısal
protein rolleri aracılığıyla hücresel yapı ve iĢlevinden sorumludurlar. Eritrositik dönem
paraziti protein sentezi için üç kaynaktan aminoasit sağlar
1) Hemoglobinin yıkılmasıyla
2) Konak plazmasından (ya da hücrelerinden) serbest aminoasitlerin alınmasıyla
3) de novo sentez ile
Şekil 1.13 Konak sitoplasmasının hücreye alınması [6]
Şekil 1.14 Besin kofulundaki aktiviteler [5]
26
En
verimli
amino
asit
kaynağı
düzenli
hemoglobin
yıkımıdır.
Parazit,
konak
hemoglobinin %65 kadarını aminoaside yıkabilir. Fakat amino asitlerin çoğu enfekte
eritrositten çekilir ve hemoglobinden yıkılan aminoasitlerin sadece %16‟sı parazit
proteinlerine dönüĢür (Krugliak, 2002).
Birçok aminoasit enfekte eritrositler tarafından büyük oranlarda alınır ve in vitro çalıĢmalar
P.falciparum‟un yedi amino asidin dıĢarıdan alımına ihtiyaç duyduğunu göstermiĢtir: :
izolösin, metionin, sistein, glutamat, glutamin, prolin, tirozin (Divo v.d., 1985). Parazit
karbondioksiti düzenleyebildiğinden alanin, aspartat ve glutamat sentezleyebilir (Sherman,
1979). Fakat, karbondioksitin düzenlenmesiyle elde edilen aminoasitler ve dıĢardan alınan
aminoasitlerin bir kısmı anında proteinlere dönüĢtürülmez. Bu aminoasitlerin çoğu enerji
üretiminde yer alan yolaklarla etkileĢebilir ve yakıt olarak iĢ görebilir. Ek olarak, bazı
aminoasitler biyosentez ve diğer metabolik yolaklarda ön madde ya da bileĢen olarak görev
alabilir [7].
Ribozomlar, protein ve ribozomal RNA‟dan oluĢan çok moleküllü komplekslerdir ve
mRNA‟yı proteine dönüĢtürürler. Plasmodium protein sentezi büyük olasılıkla diğer
ökaryotlarla aynıdır. Parazit yaĢam döngüsünün vektör ve omurgalı dönemlerinde farklı
rRNA moleküllerinin görülmesi ise ilginçtir (McCutchan v.d., 1995). Döneme özgü
ribozomun fonksiyonel önemi bilinmemektedir.

Nükleotidler ve Nükleik asitler
Nükleotid polimerleri DNA ve RNA‟dır. Nüklotidler pürin ya da primidin baza bağlı bir riboz
Ģekeri grubundan oluĢur. Bu bazlar de novo sentez ile ya da „kurtarma‟ mekanizması ile
ortamdan sağlanır.
Şekil 1.15 Plasmodium’un nükleotid metabolizması [7]
27
Sıtma parazitleri önceden ĢekillendirilmiĢ pürini kurtarma mekanizmasıyla sağlar ve
pirimidinleri de novo sentezler. Konak bu bazları iki yolla da sağlayabildiğinden, parazitin
nükleotid metabolizmasındaki bu sınırlı yeterliliğin ilaç yapımında kullanılması mümkün
olabilir [7].

Vitaminler ve Kofaktörler
Birçok biyokimyasal proses büyüme proseslerinde direkt olarak yer almayan kofaktörlere
ihtiyaç duyar. Vitaminlere genelde küçük miktarlarda ihtiyaç duyulur ve geri dönüĢtürülürler.
Pantotenat eritrosit tarafından karĢılanmayan tek vitamindir (Divo et al, 1985)
biyosentezinde
gerekli
olan
açil-koenzim
A‟nın
formasyonunda
gerekli
ve lipit
olduğu
düĢünülmektedir.
Folat ve türevleri nükleotid ve aminoasit sentezi için, özellikle metil grupların transferinde
önemli kofaktörlerdir. Dihidrofolat, DHFR tarafından tetrahidrofolata indirgenir. Birçok
antimalarial ilaç parazit DHFR‟sini inhibe eder.
Yüksek miktardaki DNA replikasyonu için gereken pirimidin talebini karĢılayabilmek için
folata ihyiyaç duyulur. Parazit önceden ĢekillendirilmiĢ folatı değerlendiremez ve GTP, paraaminobenzoik asit ve glutamattan dihidrofolat sentezlemelidir. Sulfadoksin gibi sulfa ilaçlar
dihidrofolatın de novo sentezini inhibe eder. Sulfadoksin ve pirimetaminden oluĢan fansidar
folat metabolizmasını yolağın iki noktasından inhibe eder.
Heme birçok önemli enzimin bileĢenidir. Parazit hemoglobin yıkımı sonucunda oluĢan
heme‟den yararlanamaz ve heme‟i de novo sentezler. Heme‟in sentezlenmesi için gereken
tüm enzimler parazit genomunda mevcuttur. Heme‟in mitokondride mi apikoplastta mı
sentezlendiği belirsizdir [7].

Redoks Metabolizması
Metabolizma ve solunumun ürünleri süperoksit, hidroksil radikal ve hidrojen peroksit gibi
reaktif oksijen ara maddeleridir (ROI). Özellikle oksi-hemoglobin yıkımı ROI üretimiyle
sonuçlanır. ROI lipit, protein ve nükleik asitlere zarar verebildiğinden oksijen ve suya okside
edilmelidir. Redoks metabolizmasında görev alan parazit enzimleri belirlenmiĢtir. Süperoksit
28
dismutaz (SOD), katalaz ve glutatyon peroksidaz ROI‟nin deoksitifikasyonunda yer alır.
Okside glutatyon glutuyon redüktaz tarafından geri kazanılır ve NADPH‟ın eĢdeğerlerinin
azaltılması büyük ihtimalle pentoz fosfat çevrimi ile sağlanır. Glutamat dehidrogenaz da
NADPH için baĢka bir potansiyel kaynaktır. Ayrıca parazitin konak katalazını ve yiyecek
kofulundaki SOD‟yi kullandığı ileri sürülmüĢtür [7]. Ġlginç bir Ģekilde, sıtma paraziti konak
eritrositine glutatyon sağlayarak oksidatif hasardan korunmasında yardımcı olur (Atamna and
Ginsburg, 1997).
Şekil 1.16 Plasmodium’un redox metaboliazması [8]
 Hücreye Alım ve Geçirgenlik
Sıtma parazit yüksek oranda metabolik faaliyet gösteren, hızla büyüyen bir organizmadır ve
nükleik asitlerin, proteinlerin ve lipitlerin sentezinde ön madde olarak kullanmak üzere büyük
miktarda küçük moleküler metabolite ihtiyaç duyar. Bu nedenle, konak eritrosit yavaĢ
metabolizması ve sınırlı transport kapasitesi nedeniyle aktif Ģekilde büyüyen parazit için bazı
potansiyel problemler yaratır. Enfekte eritrositin düĢük moleküler ağırlıklı çözeltiler için
29
geçirgenliği normal eritrositlere kıyasla önemli ölçüde yüksektir (Ginsburg, 1994). Bu artıĢın
bir kısmı daha yüksek oranda endojen eritrosit transporterları olarak görülür ve parazitin hızlı
olan anabolik metabolizmasını yansıtır. Ek olarak, eritrosit membranında normal eritrositte
olmayan yeni alım yolakları (NPP) görülür. Geçirgenlikteki bu artıĢın büyük bir kısmı konak
eritrositinkilerden oldukça farklı karakteristiğe sahip olan bir çeĢit alım yolağına bağlanabilir
(Kirk v.d., 1999; Kirk 2004). Bu yeni alım yolağı düĢük moleküler ağırlıklı çözeltiler için
geniĢ çeĢitlilikte spesifikliğe sahiptir fakat nötral bileĢenleri ve anyonları tercih eder (bkz.
ġekil 1.17 ).
Şekil 1.17 Hücreye alım yolakları [7]
Metabolitler ayrıca PVM ve parazit plazma membranını da geçmelidir. PVM‟de bir kanal
belirlendi (Desai v.d., 1993) ve tubülo-veziküler mebran (TVM) denen PVM çıkıntılarının
besin maddelerinin alınmasıyla iliĢkilendirildi (Lauer et al, 1997). Ayrıca 'parasitoforus kanal'
ile konak plazmasına direkt bir bağlantı belirlendi (Taraschi and Nicolas, 1994). Parazir
plazmasının transpoter‟larının, heksoz transporterında belirlendiği gibi, diğer ekaryotlarla
aynı çalıĢtığı tahmin edilmektedir (Woodrow et al, 1999; Kirk 2004).

Karbonhidratlar ve Enerji Üretimi
Eritrosit evresindeki parazit öncelikli enerji kaynağı olarak glikozu fermente eder ve laktata
dönüĢtürür (glikoliz). Glikolizin asıl amacı hücrenin enerji birimi olan ATP‟nin üretilmesidir.
Diğer bir deyiĢle, anabolik ve homestatik prosesler için ATP gereklidir.
30
Şekil 1.18 Plasmodium‟un pirüvat metabolizması [8]
Aerobik metabolizma pirüvatın trikarboksil asit (TCA) çevrimi aracılığıyla daha ileri
katabolizmasıdır.
TCA
çevrimi
ve
oksidatif
fosforilasyon
genellikle
ökaryotların
mitokondrisinde gerçekleĢir. Plasmodium‟ların mitokondrileri, diğer ökaryotlarınkilere göre
daha düz ve daha az yüzey alanına sahiptir ama buna rağmen, bu mitokondrilerin ATP üretme
yeteneğine sahip olduğu ortaya konmuĢtur (Hyde,1990; Özcel,1999).
Hidrojen atomları NAD+‟ın NADH‟a indirgenmesi sırasında yakalanır. Yakalanan
hidrojenlerin elektronları bir dizi elektron taĢıyıcısına verilir ve son olarak su oluĢturmak
üzere moleküler oksijene transfer edilir. Elektron iletimi sırasında, oksidatif fosforilasyon adı
verilen bir proses aracılığıyla tutulan enerjiden ATP sağlanır [7]. TCA çevrimi ve oksidatif
fosforilasyon glikoz baĢına 38 molekül ATP oluĢtururken, glikoliz sadece 2 molekül ATP
oluĢturur.
31
Şekil 1.19 Plasmodium‟un mitokondri yapısı [8]
P. falciparum sadece bir mitokondriye sahiptir fakat henüz mitokondrinin metabolik yolu tam
olarak açıklanmamıĢtır (Turgut-Balık, 2006). Genellikle bu proseslerin, eritrositik dönemde
iĢlevsiz olduğu kabul edilir. NADH dehidrogenaz kompleks I bileĢenlerini kodlayan genler
P.falciparum genomunda eksiktir. Bunun yerine tek altbirimli NADH dehidrogenaz geni
proton pompası olmadan ubikinonu parçalayan enzimi tanımlar. Bu nedenle Plasmodium
falciparum‟un eritrositik evresinde TCA çevrimi gerçekleĢmemekte olup sadece glikoliz ile
enerji ihtiyacını karĢılamaktadır (Gardner,2002; Pal-Bhowmick v.d.., 2009). Fakat yakın
zamanlarda eritrositik dönemdeki parazitlerde de iĢleyen elektron transport zinciri ve oksidatif
fosforilasyon belirlenmiĢtir (Uyemura v.d., 2000). Ek olarak, parazit mitokondrisi membran
potansiyeline ve sitokrom oksidaza sahiptir. Bir antimalarial ilaç olan atovaquone elektron
transferini inhibe eder ve mitokondrial membran potansiyelini çökertir. Mitokondrinin
eritrositik dönemdeki bir olası iĢlevi primidin sentezidir [7].
32
1.4.2
Sıtmanın Anaerobik Metabolizması
Sıtma parazitleri, metabolizmaları için gerekli olan ATP ihtiyacını glikoliz ile sağlar. Glikoliz
dönüĢtürülmesi basamakları temelde diğer organizmalarla aynıdır [7]. Tüm enzimlerin
aktivitesi Plasmodium’da ve klonlanmıĢ genlerle belirlenmiĢtir. Fruktoz difosfatı kodlayan
gen saptanamamıĢtır. Bu durum trehaloz (Ģeker), glikojen ve diğer karbonhidrat depolarının
sentezi için gereken enzimlerin üretimin olmadığını ve bu nedenle karbonhidrat üretimi
olmadığını gösterir (Gardner,2002). Parazitte yüksek miktarda glikoliz görülür ve enfekte
olmamıĢ eritrositten 75 kat daha fazla glikoz kullanılır.
Şekil 1.20 Plasmodium glikoliz Ģeması [8]
33
Hem sıtma parazitlerinde hem de yetiĢkin insan eritrositlerinde ATP‟nin temel metabolik
kökeni glikolizdir (Basco v.d., 1995). Çünkü sıtma parazitleri ve konakçı oldukları eritrositler
etkin bir sitrik asit döngüsü ve aktif bir mitokondriden yoksundur (Roth v.d., 1988; Trager,
1986). Oksijen kullanımı (az eldesi ya da değerlendirilememesi nedeniyle) yetersiz kaldığında,
ATP üretimi de yetersiz kalır ve enerji kaybını mümkün olduğunca telafi edilmesi için
glikoliz arttırılır. Parazit tarafından kullanılan glikozun çoğu (yaklaĢık %85‟i) laktata
dönüĢtürülür ve bu durum laktatın birikmesine neden olur. Fakat parazitin açısından
bakıldığında, bu durum yetersiz ATP‟ye kıyasla daha önemsizdir (Clark v.d., 2006). Ġskelet
kasları oksijen yıkımının en çok olduğu dokulardan olduğundan (Krebs v.d., 1975), sıtma
sırasında laktat birikiminin de çok olması beklenir.
Ġnsan vücudundaki glikoz miktarı, polimerleri ve glikojen de dahil, sınırsız değildir (Dekker
v.d., 1997). Sonuç olarak glikoliz arttığında er geç yakıtı bitecektir. Bu durum, ağır sıtma
vakalarında ve sepsiste sık görülen düĢük kan Ģekeri oranından da anlaĢılır. Sıtma
hastalığındaki ölümlerin temel nedeni birçok araĢtırmacı tarafından dokudaki oksijen azlığının
devam ettirilemeyen anaerobik metabolizmaya neden olması olarak kabul edilir (Clark v.d.,
2006).
Şekil 1.21 Glikoliz ve laktik asit oluĢumu
Glikozun büyük kısmı laktata dönüĢtürülür. Yüksek laktat dehidrogenaz (LDH) aktivitesinin
glikolitik yolakta daha önce üretilen NADH‟tan yeniden NAD+ eldesinde rolü olduğu
düĢülmektedir. Glikolitik ara maddelerinin bazıları sentez amacıyla baĢka yönlere çekilebilir
[7].
34
1.5
Kilit Enzimler
Plasmodium falciparum‟da 5.268 protein olduğu tahmin edilmektedir ve bu proteinlerin
kabaca %60‟ı diğer organizmalarla çok az benzerlik göstermekte ya da hiç göstermemektedir.
Bu nedenle görevleri bilinmemektedir. Belirlenen proteinlerden %31‟i en az bir
transmembran bölgeye sahiptir ve %17.3‟ü bir sinyal peptidi ya da ankoruna sahiptir (Gardner,
2002). Proteinlerin sadece %6‟sı parazitin yaĢam boyunca görülmektedir. Merozoitler büyük
miktarda tanıma ve saldırı proteinine sahiptir. Tropozoitler eritrositin yeniden düzenlenmesine
ve hemoglobin yıkımına yarayan proteinlere sahiptir. Gametositler kendilerine özgü
transkripsiyon faktörlerini ve hücre döngüsü/DNA iĢleme proteinlerini bolca bulundurur.
Sporozoitler ise var ve rif ailelerinin yanında saldırı proteinleri bulundurur (Florens, 2002).
P.falciparum ve P. vivax‟ın varolan ilaç kazanmıĢ olması bu türler için yeni ilaç tasarımlarını
zorunlu hale getirir ve bunun için parazitin metabolik yolaklarında kullandığı enzimler ilaç
tasarımı için hedef olarak seçilmiĢtir. Aynı zamanda hastalığın tespit edilmesinde de bu
spesifik proteinler kullanılabilir. Çoğu kit LDH ya da P. falciparum‟un histidin zengin
protein-2 adolaz ile bir arada tespit eder [5].
Seçici Toksisite





parazitte benzersiz hedef
konak ve parazit hedefleri arasında
ayrım
hedefin parazit için konaktan daha
önemli olması
ilacın parazitte birikiminin daha fazla
olması
ilacın parazit tarafından aktifleĢtirilmesi
Tablo 1.10 Seçici toksisite [7]
Plasmodium‟ların glikolitik enzimleri hem yeni antimalarial ilaç tasarımında hem de
hastalığın
tespiti
sırasında kandaki
parazit
düzeyini
gösteren indikatörler olarak
tanımlanmıĢtır ( Turgut-Balık v.d., 2006; Roth v.d., 1988). Yapılan çalıĢmalar sonucunda
tanımlanan glikolitik enzimlerin özellikleri ile konaktaki homolog enzimlerin farklı olduğu
tespit edilmiĢtir (Klenermn v.d, 1992). LDH konaktaki homoloğudan farklı olduğu gösterilen
ilk sıtma enzimlerindendir (Gomez v.d., 1997).
35
1.5.2
Laktat Dehidrogenaz (LDH)
LDH L-laktatın pürivata oksidasyonunu veya pirüvatın laktata redüksiyonunu koenzim
nikotinamid adenin dinükleotid (NAD+) aracılığıyla katalizler (Holbrook v.d., 1975). Ağırlığı
140 kDa olan tetramerik bir yapıya sahiptir. Ġki farklı konfigürasyonlarda dizlimi ile 5
izoenzime sahiptir (Fersht, 1985). Bu izoenzimler kimyasal kompozisyon,kinetik ve
immünolojik özellikleriyle birbirinden ayrılabilir (Holbrook v.d., 1975).
Şekil 1.22 Plasmodium vivax laktat dehidrogenaz ın kristal yapısı: NADH ile komplex
LDH glikolizin son ürünü olan pirüvik asidi dönüĢümlü bir reaksiyonla laktik aside çevirir ve
bu nedenle parazitin karbonhidrat metabolizmasında önemli rol oynar. Aynı enzim hem
insanda hem de parazitte bulunur fakat elektroforetik, kinetik ve yapısal olarak farklıdır;
1) Ġnsan M4-LDH‟ından farklı olarak PfLDH aktif bölge halkasında 5 ilave
aminoasit (aspartik asit, lisin, glutamik asit, triptofan ve asparajin) içerir (Bzik
v.d., 1993). Bu 5 aminoasit ilavesi enzim yüzeyinde bir yarık oluĢturur (Dunn
v.d., 1996).
2) Ġnsan M4-LDH‟ından farklı olarak PfLDH 3-asetilpiridin adenin dinükleotid
(APAD+) adlı koenzimi daha hızlı kullanabilme yeteneğine sahiptir (Makler ve
Hinrich, 1993) .
3) Ġnsan M4-LDH‟ından farklı olarak PfLDH yüksek pirüvat konsantrasyonunda
inhibe olmaz (Vander v.d., 1981).
4) PfLDH‟ın gossilik nitril diasetat ve türevleri tarafından inhibisyona insan
LDH‟ından daha duyarlı olduğu bildirilmiĢtir (Royer v.d., 1986)
36
P.falciparum ve P.vivax LDH geni dizileri karĢılaĢtırıldığında %90 oranında benzerlik olduğu
görülmüĢtür. P.falciparum‟da olan aktif bölgedeki ilave 5 aminoasit P.vivax LDH‟ında da
mevcuttur (Chaikuad v.d., 2005).
Tablo 1.11
PvLDH‟ın insan ve diğer sıtma parazitlerinin LDH dizlerine hizalanması (Turgut-Balik v.d., 2004)
2. MATERYAL VE YÖNTEM
2.1
Yönlendirilmiş Mutagenez
YönlendirilmiĢ mutagenez uygulamaları bir gendeki özgül değiĢimlerin yapıldığı iĢlemlerdir.
Bu teknikle protein yapısı ve görevi ile ilgili araĢtırmalar yapılmaktadır. YönlendirilmiĢ
mutagenez ile bir gende baz değiĢimi ve dizi delesyon ve insersiyonu yapılabilir. Sonuç
olarak proteinin dizisi ve dolayısıyla onun yapısı, hücresel yerleĢimi ve düzenlenmesi
değiĢtirilir. DeğiĢtirilmiĢ protein in vivo olarak GFP iĢaretlemesi ile, in vitro ise enzim kinetik
ve bağlanma ölçümleri ile izlenebilir. SeçilmiĢ amino asitlerinin değiĢtirilmesi sayesinde
protein katlanması, diğer proteinlerle etkileĢim ve enzimatik kataliz vb süreçler için
polipeptidin hangi kısımlarının önemli olduğunun kesin biçimde anlaĢılabilir.
37
Bu yöntem aynı zamanda vektördeki restriksiyon alanların değiĢtirilmesi, vektör elementlerin
insersiyon veya delesyonu, promotor eklenmesi veya değiĢtirilmesi gibi DNA yapılarının
modifiye edilmesinde kullanılır
Oligonükleotidlerin kullanıldığı yöntem molekülerde ilk olarak 1978‟de yapılmıĢtır. PCR
tekniğini geliĢtiren Kary B. Mullis ve M.Smith kasım 1993‟de kimya Nobel ödülünü almıĢtır.
1987‟de fenotipik seçim gereğini ortadan kaldıran bir teknik geliĢtirmiĢtir. Mutasyon
yapılacak plazmid dNTPaz ve Urasil deglikozidaz isimli iki geni E.coli aktarıldı [9].
Temel prosedür istenilen baz değiĢikliğine sahip kısa DNA primerinin sentezi ile baĢlar daha
sonra ilgilenilen geni içeren tek zincirli DNA sentetik primer ile hibridize edilir ve ardından
bu tek zincirli fragment DNA polimeraz kullanılarak uzatılır. Bu iĢlem genin uzunluğunu
kopyalar daha sonra elde edilen çift zincirli molekül taĢıyıcı hücreye klonlanarak tanıtılır ve
mutantlar seçilir. Aynı sonuç PCR kullanılarak, istenilen mutasyon içiren oligonükleotid
primeri ile alınabilir [9].
YönlendirilmiĢ mutagenez için PCR temelli metotların önemli avantajları ve dezavantajları
vardır;
Avantajları
1. Mutasyon oranı yüksek olması
2. Çift zincirli DNA kalıbının kullanılabilmesi
3. Yüksek ısılara dayanıklı oluĢu
4. Reaksiyonların hepsinin bir tüp içerisinde gerçekleĢmesi
5. Kolay ve hızlı olması
6. Ticari kitlerinin varlığı
Dezavantajları
38
1. PCR ürünleri içindeki yanlıĢ ürünlerin oranının yüksek olmasından dolayı istenmeyen
mutasyonların sık olması.
2. Amplifiye edilmiĢ DNA‟ların 3‟ ucuna istenmeyen nükleotidlerin girmesi
3. Bazı mutagenez için birden fazla primer ve amplifikasyon reaksiyonu gerekmektedir.
4. Her yeni kullanılan ürün için PCR optimizasyonu yapılmalıdır.
5. PCR amplifikasyonunda kontaminasyondan dolayı mutagenez olmayan klonların sıkça
oluĢması.
6. PCR ile 2-3kb‟dan uzun DNA fragmentlerinin amplifikasyonunda zorluklar.
PCR temelli mutagenez‟de oluĢturulan ürünler oldukça stabildir. Bu ürünlerin çoğunun sabit
olması, mutasyon ürünün overlap yapmasından faydalanılarak amplifikasyon olmasına
bağlanabilir. Overlap oluĢumu ile yapılan mutagenezde (ġekil 2.1) ayrı ayrı PCR‟larda
overlap yapabilen DNA fragmentleri amplifiye edilir. Mutasyon overlap mutant bazlarla
oluĢturulur ve amplifikasyon sonucu elde edilen fragmentlerin her ikisinde de mutasyon
mevcuttur. Overlap yapan fragmentler karıĢtırılır ve 3. bir PCR yapılır. Böylece fragmentler
uzaklaĢtırılmıĢ olur. BaĢlangıç primerleri ve mutant DNA kalıbı kullanılarak 4. bir PCR da
yapılabilir. Bu metodun etkinliği çok yüksektir. Fakat bir mutasyonun oluĢması için 2 mutant
primeri, 2 yan oligonükleotid ve 3 basamaklı PCR gereklidir. Bazı durumlarda mutasyon
içeren amplifiye DNA fragmentlerinin uygun yerlerinde restriksiyon bölgeleri varsa bu
metodun daha basit bir versiyonu kullanılabilir. (BĠYOĠNFORMATĠK 1 A. Telefoncu, Ö.Ġ.
Küfrevioğlu, N.Pazarlıoğlu )
YönlendirilmiĢ mutagenezde en önemli basamak, mutagenik nükleotidlerin dizaynıdır.
Mutagenik oligonükleotidler en az bir baz değiĢimi içermelidir. Fakat insersiyon ve
delesyonla daha kompleks mutasyonlar da oluĢturulabilir. Mutagenik oligonükleotidlerin
uzunluğu, içerdiği mutasyonların kompleksliğine bağlıdır. Tek baz değiĢimi içiren
mutasyonlar, ortalama 25 baz uzunluğunda hazırlanır. Daha kompleks mutasyonlar 80 baz ve
daha fazla uzunlukta oligonükleotid gerektirir. Oligonükleotid uzunluğu tanımlandıktan sonra,
mutagenezin en etkin hale gelmesi için annealing spesifitesi, ikincil yapının doğal eğilimi, Tm
sıcaklığı, baz kompozisyonu ve baz sırası gibi diğer özelliklerin optimizasyonu kolaylıkla
ayarlanabilir.
39
2.2

Materyal
PCR 1
PvKA Reaksiyonu için Gerekli Bileşenler
dH2O
33 µl
10x Pfu Polimeraz tamponu
5 µl
stok dNTP solüsyonu(10 mM)
5 µl
Pfu Polimeraz (2,5 u/µl)
0.5 µl (final konsantrasyonu 1.25 ul/ml)
Pv in pkk(Pv 7-13 in pkk) (10 ng/µl)
1.5 µl
Pv7 (5‟) (20 pmol/µl)
2.5 µl (final konsantrasyonu50 pmol/ml)
K2 (3‟) (20 pmol/µl)
2.5 µl
(son hacim 50 µl olacak Ģekilde)
40
PvKB Reaksiyonu İçin Gerekli Bileşenler;
dH2O
33 µl
10x Pfu Polimeraz tamponu
5 µl
stok dNTP solüsyonu(10 mM)
5 µl
Pfu Polimeraz (2,5 u/µl)
0.5 µl
Pv in pkk (Pv 7-13 in pkk) (10 ng/µl)
1.5 µl
Pv13 (3‟) (20 pmol/µl)
2.5 µl
K1 (5‟) (20 pmol/µl)
2.5 µl
(son hacim 50 µl olacak Ģekilde)

PCR 2
1. AĢama
dH2O
15.5 µl
10x Pfu Polimeraz tamponu
2.5 µl
stok dNTP solüsyonu(10 mM)
2.5 µl
Pfu Polimeraz
0.5 µl
PvKA
2 µl
PvKB
2 µl
2. AĢama
dH2O
14.5 µl
10x Pfu Polimeraz tamponu
2.5 µl
stok dNTP solüsyonu(10 mM)
2.5 µl
Pv7 (20 pmol/µl)
2.5 µl
Pv13 (20 pmol/µl)
2 µl
Pfu Polimeraz
0.5 µl
(son hacim 50 µl olacak Ģekilde)
41
2.2.1
Genomik DNA
P.vivax Belem soyundan elde edilen saf genomik DNA kullanılmıĢtır. PvLDH enziminin kilit
amino asitlerinden olan 246. pozisyondaki Prolin(CCT)‟in yönlendirilmiĢ mutagenez
yardımıyla Treonin(ACG) ile değiĢtirilmesi amaçlanmaktadır.
Şekil 2.2 PvLDH‟ı kodlayan genin 661-720 pozisyonları arasındaki nükleotid dizilimi (Akbulut, Çelik,
Turgut-Balık, 2005)
2.2.2
Primerler
P.vivax LDH enzimini kodlayan genin polimeraz zincir reaksiyonu için gerekli 5‟-3‟
primerleri tasarlanmıĢtır.
Pv7 (5‟ primeri)
TCTGGAGGGCTGGAACAAAG
Pv13 (3‟ primeri)
GCAGAGAAGAGTAGGTGAAAGGAAG
Ek olarak PvLDH‟ın mutasyona uğratılacak bölgeleri ile komplementer Pv7 ve Pv13 uç
primerlerine uygun mutagenez primerleri tasarlanmıĢtır.
Prolin
Orijinal iplik
5‟ CCT GCC TCT /CCT/ TAT GTT G 3‟
Treonin
Mutant 5‟ primeri (K1)
5‟ CTT GCC TCT /ACG/ TAT GTT G 3‟
K2 (komplementeri)
3‟ GAA CGG AGA /TGC/ ATA CAA C 5‟
Mutant 3‟ primeri (K2 )
5‟ C AAC ATA /CGT/ AGA GGC AAG 3‟
42
2.3
Yöntem
Bu
çalıĢmada
yönlendirilmiĢ
mutagenez,
PCR
metodu kullanılarak
iki
aĢamada
gerçekleĢtirilmiĢtir.

PCR 1
PvLDH‟ın mutasyona uğratılacak bölgeleri ile çakıĢan iki mutant DNA fragmenti (A
ve B fragmentleri) Pv7, Pv13, K1 ve K2 primerleri kullanılarak ayrı ayrı elde edilmiĢtir.
A fragmentini eldesi için PvLDH 5‟ primeri (Pv7) ile mutant 3‟ primeri (K2), B fragmentini
elde etmek için ise mutant 5‟ primeri (K1) ile PvLDH 3‟ primeri (Pv13) kullanılmıĢtır.
Amplifikasyon; 94°C‟de 1,5 dakika, 58°C‟de 2 dakika, 72°C‟de 2 dakika Ģartlarında ve 20
döngüde gerçekleĢtirilmiĢtir.

PCR 2
% 1‟lik agaroz jelden saflaĢtırılan mutant DNA‟nın A ve B fragmentlerini birleĢtirmek için
PCR yapılmıĢtır.
1. AĢama
Öncelikle konsantrasyonları esas alınarak belirlenen miktarlarda kullanılan A ve B
fragmentleri ile son hacim 25 µl olacak Ģekilde gerçekleĢtirilen PCR‟ın reaksiyon Ģartları
94°C‟de 2 dakika, 50°C‟de 1 dakika, 72°C‟de 2 dakika ve 7 döngü olacak Ģekilde
gerçekleĢtirilmiĢtir.
2. AĢama
Uç primerlerin (Pv7 ve Pv13) ve diğer PCR bileĢenlerinin ilavesi ile reaksiyon 50 µl‟ye
tamamlanmıĢ ve istenen mutagenezi taĢıyan geni tam uzunlukta elde etmek için 94°C‟de 1.5
dakika, 55°C‟de 1 dakika, 72°C‟de 2,5 dakika Ģarlarında ve 20 döngü olarak amplifikasyon
yapılmıĢtır.
43
3. BULGULAR VE TARTIŞMA
Plasmodium vivax ile aynı deney yapılmıĢ ve edilen veriler yabanıl tip Plasmodium vivax
laktat dehidrogenaz enzimin kinetik sonuçlarıyla karĢılaĢtırılmıĢtır. Sonuç olarak enzimlerin
substrata olan afiniteleri ve kcat değerleri düĢmüĢtür. Yaptığımız bu deneyde de Plasmodium
vivax laktat dehidrogenaz enziminin benzer sonuçlar göstermesi beklenmektedir.
KAYNAKLAR
A.A. Divo, T.G. Geary, N.L. Davis and J.B. Jenson (1985) Nutritional requirements of
Plasmodium falciparum in culture. I. Exogenously supplied dialyzable components necesary
for continuous growth. J. Protozool. 32, 59-64.
AKBULUT E, ÇELĠK V, TURGUT BALIK D (2005). Plasmodium vivax ve Plasmodium
falciparum‟un Laktat Dehidrogenaz Enzimini Kodlayan Genlerinin Nükleotid Düzeyinde
KarĢılaĢtırmalı Analizi. Türkiye Parazitoloji Dergisi, 29 (3): 149-153
Akdur R, 1999. Sıtmanın epidemiyolojisi. Özcel MA. Ed. Sıtma, Malaria., Türkiye
Parazitoloji Derneği, Ege Üniversitesi Basımevi, s.51-74.
Akkafa F, ġimĢek Z, Dilmeç F, Baytak ġ, 2002. ġanlıurfa Ġlinde Sıtma Epidemiyolojisi. T
Parazitol Derg, 26 (2): 143-146.
Aksu L, 1943. Malarya (Sıtma)-Tarihçe, Coğrafya, Türkiye‟de Sıtma, Entomoloji,
Bakteriyoloji, Biyoloji, Klinik, Patoloji, Tedavi, Mücadele ve Profilaksi, s.26, 34, 189
ALVER Oktay,YILMAZ Emel, AKÇAĞLAR Sevim, TÖRE Okan, 2007. Bursa‟da Sıtma.
Türkiye Parazitoloji Dergisi, 31 (4): 249-255.
A. Telefoncu, Ö.Ġ. Küfrevioğlu, N.Pazarlıoğlu, BĠYOĠNFORMATĠK 1
Basco L K; Marquet F; Makler M M; Le Bras J (1995). Plasmodium falciparum and
Plasmodium vivax: lactate dehydrogenase activity and its application for in vitro drug
susceptibility assay. Experimental parasitology;80(2):260-71.
44
BBC News, DNA clues to malaria in ancient Rome. February 20, 2001.
Beutler E, 1978. Hemolytic Anemia in Disorders of Red Cell Metabolism. New York: Plenum
Press.
Bronner U, Divis PCS, Färnert A, Singh B, 2009. Swedish traveller with Plasmodium
knowlesi malaria after visiting Malaysian Borneo Malaria Journal 8:15.
Bynum W. F. (2002).Mosquitoes Bite More Than Once. SCIENCE VOL 295 4 JANUARY
2002. http://www.sciencemag.org
Bzik D J; Fox B A; Gonyer K Expression of Plasmodium falciparum lactate dehydrogenase in
Escherichia coli. Molecular and biochemical parasitology 1993;59(1):155-66.
C.J. Woodrow, J.I. Penny and S. Krishna (1999) Intraerythrocytic Plasmodium falciparum
expresses a high affinity facilitative hexose transporter. J. Biol. Chem. 274, 7272-7277.
Carter R, Mendis KN, 2002. Evolutionary and historical aspects of the burden of malaria. Clin
Microbiol Rev 15: 564–594.
Carter, R., and Mendis, K.N. 2002. Evolutionary and historical aspects of the burden of
malaria. Clin. Microbiol. Rev. 15:564–594.
Chikuad, A., Fairweather, V., Conners, R., Josep-Horne, T., Turgut-Balık, D. ve Brady, R.L.,
(2005). Structure of Lactate Dehydrogenase from Plasmodium vivax: Copmlexes with NADH
and APADH. Biochemistry
Chin, W., P. G. Contacos, G. R. Coatney, and H. R. Kimball. 1965. A naturally acquired
quotidian-type malaria in man transferable to monkeys. Science 149:865.
Cox F (2002). "History of human parasitology". Clin Microbiol Rev 15 (4): 595-612.
doi:10.1128/CMR.15.4.595-612.2002. PMID 12364371.
Cox-Singh, J., et al. 2008. Plasmodium knowlesi malaria in humans is widely distributed and
potentially life threatening. Clin. Infect. Dis. 46:165–171.
Darwin, K., Malaria at a Glance, 2002, Wellcome News Malaria Suplement 6 the Wellcome
Trust, 36p.
45
Dekker E, Hellerstein MK, Romijn JA, Neese RA, Peshu N, Endert E, Marsh K, Sauerwein
HP: Glucose homeostasis in children with P.falciparum malaria: precursor supply limits
gluconeogenesis and glucose production. J Clin Endocrinol Metab 1997, 82:2514-2521.
Dunn, C. R., M. J. Banfield, J. J. Barker, C. W. Higham, K. M. Moreton, D. Turgut-Balik, R.
L. Brady, and J. J. Holbrook, “The Structure of lactate Dehydrogenase from Plasmodium
falciparum Reveals a New Target for Anti-malarial Design” Nature Structural Biolology
(Derginin yeni adı: Nature Structural and Molecular Biology), 3: 912-915 (1996).
Ertuğ S, Gürel M, Eyigör M, Doyuran ES, 2002. AydınYöresinde Sıtma Olguları. ADÜ Tıp
Fakültesi Derg, 3 (2): 5-8.
Fersht, A., (1985). Structures and Mechanisms of Selected Enzymes, W.H. Freeman and
Company, New York, 400.
Florens (3 October 2002). "A proteomic view of the Plasmodium falciparum life cycle".
Nature 419: 520–526. doi:10.1038/nature01107.
Galinski MR, Medina CC, Ingravallo P, Barnwell JW, 1992. A reticulocyte-binding protein
complex of Plasmodium vivax merozoites. Cell, 69:1213-1226.
Gardner, Malcom (3 October 2002). "Genome sequence of the human malaria parasite
Plasmodium
falciparum".
Nature
419:
498–511.
doi:10.1038/nature01097.
http://www.nature.com/nature/journal/v419/n6906/full/nature01097.html.
Geary TG, Divo AA, Bonanni LC, Jensen JB: Nutritional requirements of Plasmodium
falciparum in culture. III. Further observations on essential nutrients and antimetabolites. J
Protozool 1985, 32:608-613
Gilles, H. 1993. Diagnostic methods in malaria, p. 78. In H. M. Gilles and D. A. Warrell (ed.),
Essential malariology, 3rd ed. P Edward Arnold, London, United Kingdom.
Gomez MS, Piper RC, Hunsaker LA, Royer RE, Deck LM, Makler MT & Vander Jagt DL
(1997) Substrate and cofactor specificity and selective inhibition of lactate dehydrogenase
from the malarial parasite P. falciparum. Mol Biochem Parasitol 90, 235–224.
Gökberk C, 1948. “Sıtma Epidemiyolojisi”, Pratik Doktor,XVIII, S.2, s.17
46
Gratz Norman G. (2006). Vector-and Rodent-Borne Diseases in Europe and North America.
World Health Organization, Geneva.
Gülez P, Hızarcıoğlu M, Kayserili E, Sun F, Canbal A. 2003. Plasmodium falciparum‟a bağlı
bir sıtma olgusu. Ġnfek Derg, 17(3): 359-363.
H. Atamna and H. Ginsburg (1997) The malaria parasite supplies glutathione to its host cell-Investigation of glutathione transport and metabolism in human erythrocytes infected with
Plasmodium falciparum. Eur. J. Biochem. 250, 670-679.
Hayton, K., Fairhurst, R.M., Naude, B., Su, X.Z., and Wellems, T.E. 2005. Drug–resistant
falciparum malaria: mechanisms, consequences, and challenges. In Frontiers in antibiotic
resistance: a tribute to Stuart B. Levy. ASM Press. Washington, DC, USA. 401–413.
Holbrook, J. J., A. Liljas, S. J. Steindel, and M. G. Rossman. 1975. Lactate dehydrogenase.
pp. 191-292 in P. D. Boyer (Ed.), The Enzymes, Vol. XI, 3rd Ed. Academic Press, NY.
Hyde, J. E. 1990. The dihydrofolate reductase-thymidylate synthetase gene in the drug
resistance of malaria parasites. Pharmacol. Ther. 48:45-59
K. Kirk (2004) Channels and transporters as drug targets in the Plasmodium-infected
erythrocyte. Acta Tropica 89, 285-298.
K. Kirk, H.M. Staines, R.E. Martin and K.J. Saliba (1999) Transport properties of the host
cell membrane. In: Transport and trafficking in the malaria-infected erythrocyte. Wiley,
Chichester (Novartis Foundation Sympsium No. 226), pages 55-73.
Kayser FH, 2005. Medical Microbiology,Thieme,Stuttgart-New York
Kilama W, Ntoumi F. Malaria: a research agenda for the eradication era. Lancet. 2009 Oct
31;374(9700):1480-2.
Klenerman P; Dickson H; Luzzi G A (1992). Plasma lactate dehydrogenase estimation in the
diagnosis of malaria. Annals of tropical medicine and parasitology ;86(5):563-5
Kokwaro, G.,Ongoing challenges in the management of malaria (2009). Malaria Journal,
8(Suppl 1):S2
47
Krebs HA, Woods HF, Alberti KG: Hyperlactataemia and lactic acidosis. Essays Med
Biochem 1975, 1:81-103.
M. Krugliak, J. Zhang and H. Ginsburg (2002) Intraerythrocytic Plasmodium falciparum
utilizes only a fraction of the amino acids derived from the digestion of host cell cytosol for
the biosynthesis of its proteins. Mol. Biochem. Parasitol. 119, 249-256.
Makler, M. T. and D. J. Hinrichs. 1993. Measurement of the lactate dehydrogenase activity of
Plasimodium falciparum as an assessment of parasitemia. Am. J.Trop. Med. Hyg. 48:205210.
Mehlotra, R.K., et al. 2008. Discordant patterns of genetic variation at two chloroquine
resistance loci in worldwide populations of the malaria parasite Plasmodium falciparum.
Antimicrob. Agents Chemother.52:2212–2222.
Mendis K, Sina B, Marchesini P, Carter R (2001). "The neglected burden of Plasmodium
vivax malaria" (PDF). Am J Trop Med Hyg 64 (1-2 Suppl): 97-106. PMID 11425182.
http://www.ajtmh.org/cgi/reprint/64/1_suppl/97.pdf
Öksüz R, Aydın K, Köksal Ġ, Çaylan R, Kaygusuz S, 2001.Kan Transfüzyonu Ġle BulaĢan Bir
Sıtma Olgusu ve Trabzon Bölgesindeki Sıtma Olgularının Değerlendirilmesi. Ġnfeksiyon
Derg, 15 (2): 193-198.
Östan Ġ, Yılmaz Ü, Kayran E, Erdurak K, Özbilgin A, 2002.Manisa Ġlinde 1999-2001 Yılları
Arasında Saptanan Sıtma Olgularının Değerlendirilmesi. T Parazitol Derg, 26 (3): 305-307.
Özcel MA (1999). Sıtma, Malaria., Türkiye Parazitoloji Derneği, Ege Üniversitesi Basımevi,
s.51-74.
Pal-Bhowmick, I., Kumar, N., Sharma, S., Coppens, I., ve Jarori, G.K., (2009). Plasmodium
falciparum enolase: stage-specific expression and sub-cellular localization. Malaria Journal,
8:179doi:10.1186/1475-2875-8-179
Perkins, S.L. and C.C Austin. (2009). Four new species of Plasmodium from New Guinea
lizards: Integrating morphology and molecules. Journal of Parasitology, 95(2):424-433.
48
Roth EF Jr, Calvin MC, Max-Audit I, Rosa J, Rosa R: The enzymes of the glycolytic pathway
in erythrocytes infected with Plasmodium falciparum malaria parasites. Blood 1988, 72:19221925.
Royer RE, Deck LM, Campos, NM, Hunsaker LA, Vander Jagt DL, 1986. Biologically active
derivatives of gossypol: Synthesis and antimalarial activities of peri-acylated gossylic itriles, J
Med Chemist, 29: 1799-1801.
Ruwende C, Khoo SC, Snow RW, Yates SN, Kwiatkowski D, Gupta S, Warn P, Allsopp CE,
Gilbert SC, Peschu N, 1995. Natural selection of hemi- and heterozygotes for G6PD
deficiency in Africa by resistance to severe malaria. Nature, 376:246-249.
S.A. Desai, D.J. Krogstad, and E.W. McCleskey (1993) A nutrient permeable channel on the
intraerythrocytic malaria parasite. Nature 362, 643-646.
S.A. Lauer, P.K. Rathod, N. Ghori and K. Haldar (1997) A membrane network for nutrient
import in red cells infected with the malaria parasite. Science 276, 1122-1125.
S.A. Uyemura, S. Luo, S.N.J. Moreno and R. Docampo (2000) Oxidative phosphorylation,
Ca2+ transport, and fatty acid-induced uncoupling in malaria parasites mitochondria. J. Biol.
Chem. 275, 9709-9715.
Saka G, Ertem M, Ġlçin E, 2000. Diyarbakır‟da Sıtma.T Parazitol Derg, 24 (2): 115-119.
Sarı C. ,Sakarya S. ,Ertabaklar H. ,Öncü S. ,Ertuğ S. (2004). Aydın ilinde 2001-2003 yılları
arasında saptanan sıtma olgularının değerlendirilmesi. Türkiye Parazitoloji Dergisi,28,3,119122.
Saygı G. Temel Tıbbi Parazitoloji. Cumhuriyet Üniversitesi Yayınları, kinci Baskı, 1998: 5970.
T. Mitamura and N.M.Q. Palacpac (2003) Lipid metabolism in Plasmodium falciparuminfected erythrocytes: possible new targets for chemotherapy. Microbes and Infection 5, 545552.
T.F. McCutchan, J. Li, G.A. McConkey, M.J. Rogers and A.P. Waters (1995) The
cytoplasmic ribosomal RNAs of Plasmodium spp. Parasitol Today 11, 134-138.
49
T.F. Taraschi and E. Nicolas (1994) The parasitophorous duct pathway: new opportunities for
antimalarial drug and vaccine development. Parasitol Today 10, 399-401.
Tekeli Ġ, Ġlkin S, 2004. Türkiye‟de Sıtma Mücadelesinin Tarihi, Cumhuriyetin Harcı,
Köktenci Modernitenin Ekonomik Politikasının GeliĢimi, Ġstanbul Bilgi Üniversitesi
Yayınları, Ġstanbul, s.124, 140, 154.
Thomas F McCutchan. (2008) Is a monkey malaria from Borneo an emerging human
disease?.Future Microbiology 3:2, 115-118
Trager, W., 1986, Metabolysm, Energy Sources, Respiration, in Living Together-the Biology
of Animal Parasitism,Plenum, New York, 169s.
Trape, J.F., et al. 1998. Impact of chloroquine resistance on malaria mortality. C. R. Acad.
Sci. III. 321:689–697
Turgut-Balik D, Sadak D, Celik V. (2006) “Analysis of active site loop amino acids of
enzymelactate dehydrogenase from Plasmodium vivax by site-directed mutagenesis studies”,
Drug Development Research, (67), 175-180.
Turgut-Balik Dilek , Akbulut Ekrem, Shoemark Debbie K, Celik Venhar, Moreton Kathleen
M., Sessions Richard B., Holbrook J. John & Brady R. Leo (2004). Cloning, sequence and
expression of the lactate dehydrogenase gene from the human malaria parasite, Plasmodium
vivax.Biotechnology Letters 26: 1051–1055
Unat EK, AltaĢ K. Tıp Helmintolojisi. In: Unat'ın Tıp Parazitolojisi. Ġstanbul:Ġ܆ CerrahpaĢa
Tıp Fak. Vakfı Yayınları (No: 15). 5. Baskı; 1995: 228-481.
Vander-Jagt DL, Hunsaker LA, Heidrich JE, 1981. Partial purification and characterization of
lactate dehydrogenase from Plasmodium falciparum. Mol Biochem Parasitol, 4: 255-264.
Yazar S, Yaman O, Arı Ö, 2002. Kayseri‟de Sıtma. T Parazitol Derg, 26 (2): 147-148.
Yotoko, KSC; C Elisei (2006-11). "Malaria parasites (Apicomplexa, Haematozoea) and their
relationships with their hosts: is there an evolutionary cost for the specialization?". Journal of
Zoological Systematics and Evolutionary Research 44 (4): 265–73.
50
Zakeri, S., et al. 2008. Association of pfcrt but not pfmdr1 alleles with chloroquine resistance
in Iranian isolates of Plasmodium falciparum. Am. J. Trop. Med. Hyg. 78:633–640. )
[1] http://www.webmd.com > Malaria symptoms, Son Güncelleme:16 Mayıs, 2007
[2] http://en.wikipedia.org/wiki/Malaria, Son güncelleme: 24.05.2010
[3] www.cdc.gov
[4] web.inonu.edu.tr/~eolmez/antimalaryaller.doc
[5] http://www.tulane.edu/~wiser/malaria/ch15_draft.pdf
[6] www.saglik.gov.tr > Sıtma SavaĢ Dairesi BaĢkanlığı Ġstatistikleri
[7] http://www.tulane.edu/~wiser/malaria/Summary.html Son güncelleme: 01.02.2005
[8] http://sites.huji.ac.il/malaria/FramIntroduction.html
[9] http://en.wikipedia.org/wiki/Site-directed_mutagenesis, Son güncelleme: 24.05.2010
51