PDF İndir - Adnan Menderes Üniversitesi

Tralleis Elektronik Dergisi
http://dergi.etralleis.com
e-TRALLEIS
3 (2014) 11-17
©ADÜ
Katalaz İmmobilizasyonu için Manyetik Gümüş Nanopartiküllerin
Sentezlenmesi ve Karakterizasyonu
Sibel CAN1, Meltem KAPLAN1, Murat UYGUN2, Deniz AKTAŞ UYGUN1
2
1
Adnan Menderes Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü, Aydın
Adnan Menderes Üniversitesi Koçarlı Meslek Yüksekokulu Bitkisel ve Hayvansal Üretim Bölümü, Aydın
ESER BİLGİSİ
Araştırma Makale - Fen Bilimleri
Sorumlu yazar: Murat UYGUN, [email protected]
Yayına Kabul Tarihi: 12.05.2014
Özet: Yapılan bu çalışmada katalaz enziminin geri dönüşümlü immobilizasyonu için manyetik gümüş
nanopartiküller hazırlanmıştır. Bu amaçla, ilk olarak manyetik çekirdek demir(II) ve demir(III) çözeltilerinin bazik
ortamdaki reaksiyonu ile sentezlenmiştir. Manyetik çekirdeğin üzeri gümüş ile kaplanarak manyetik gümüş
nanopartiküller hazırlanmıştır. Sentezlenen manyetik gümüş nanopartiküller N-asetil sistein ile
fonksiyonelleştirilmiştir ve Fe3+ ile kompleksleştirilmiştir. Hazırlanan manyetik gümüş nanopartiküllerin
karakterizasyonu SEM, AFM ve EDX ölçümleri ile gerçekleştirilmiştir. Sentezlenen manyetik gümüş
nanopartiküllerin katalaz immobilizasyonu etkinliği farklı tampon sistemlerinde araştırılmış ve katalaz
immobilizasyonuna pH’ın etkisi incelenmiştir.
Anahtar kelimeler: Katalaz, immobilizasyon, manyetik gümüş nanopartiküller, IMAK
Synthesis and Characterization of Magnetic Silver Nanoparticles for Catalase
Immobilization
Abstract: In this presented work, magnetic silver nanoparticles were synthesized for the reversible immobilization
of catalase. For this, magnetic core was synthesized by the reaction of iron(II) and iron(III) in basic medium.
Magnetic silver nanoparticles were prepared by covering the magnetic core with a thin layer of silver. Synthesized
magnetic silver nanoparticles were functionalized N-acetyl cysteine and complexed with Fe3+. Characterization of
prepared magnetic silver nanoparticle was carried out with SEM, AFM and EDX analysis. Catalase immobilization
efficiency of synthesized magnetic silver nanoparticles was investigated in various buffer systems and the effect of
medium pH on the catalase immobilization was studied.
Key words: Catalase, immobilization, magnetic silver nanoparticle, IMAC
Giriş
Günümüzde
nanometre
boyutlarına
sahip
maddelerin anlaşılması ve kontrolü olarak
tanımlanan nanoteknoloji, boyutu 100 nm’den
küçük aygıtların üretilmesi ve uygulamalarını da
içermektedir (Mamalis, 2007). Nanoteknoloji son
zamanlarda oldukça ilgi çekmektedir ve birçok
teknolojik uygulamaya uyarlanmıştır. Bunun
temel nedeni, partikül boyutunun küçülmesine
karşı değişen ve gelişen eşsiz fiziksel ve kimyasal
özelliklerdir. Partikül boyutu küçüldükçe yüzey
alanı/hacim oranı artmakta ve birim hacim başına
çok yüksek yüzey alanlarına ulaşılabilmektedir.
Ayrıca, boyut küçülmesine paralel olarak
partiküllerin optik özellikleri de değişmekte ve
böylece partiküllerin optik ve floresans
uygulamalarında yeni kullanım alanları ortaya
çıkmaktadır. Nanopartiküller bununla birlikte,
materyallerin sertliklerinin ve esnekliklerinin
11
S.CAN, M. KAPLAN, M. UYGUN, D. AKTAŞ UYGUN
arttırılmasında
ve
polimerik
yapıların
güçlendirilmesinde kullanılmaktadır (Papazoglou
ve Parthasarathy, 2007).
yer değiştirir. Böylece proteinin kromatografik
desteğe bağlanması sağlanmış olur (Denizli ve
Küfrevioğlu, 2007).
Manyetik nanopartiküller; proteinler ve enzimlerin
immobilizasyonunda,
biyoayırmada,
immunoanalizlerde, ilaç salınım sistemlerinde ve
biyosensörler uygulamaları başta olmak üzere pek
çok alanda kullanılmaktadır (Mandal ve ark.,
2005). Bir destek materyali olarak manyetik
nanopartiküllerin kullanılmasının pek çok avantajı
bulunmaktadır: i) İyi kütle transferi özelliklerine
sahip olması; ii) Basit bir mıknatısla çok kolay bir
şekilde kompleks ortamlardan ayrılabilmesi ve
böylece
immobilize
enzimlerin
defalarca
kullanılabilmesine olanak sağlaması; iii) Geniş
spesifik yüzey alanları sayesinde etkili enzim
immobilizasyonuna neden olması (Kuroiwa ve
ark., 2008) bunlar arasındadır.
Katalaz;
hayvanlar,
bitkiler
ve
mikroorganizmalarda yaygın olarak bulunan bir
enzimdir ve toksik hidrojen peroksitin bertaraf
edilmesinde etkili bir rol oynamaktadır. Katalaz
enzimi bu özelliğiyle biyolojik ve biyokimyasal
sistemlerde antioksidan aktivite göstermekte ve bu
şekilde hücreyi oksidatif hasarlara karşı
korumaktadır. Katalaz, tetrahedral düzende
organize olmuş dört özdeş alt birimden meydana
gelen bir tetramerdir ve her bir alt birim yaklaşık
15 kDa’dur. Enzim aktif merkezinde bir hem
grubu içermektedir (Scibior ve Czeczot, 2006).
Sunulan bu çalışmada, katalaz immobilizasyonu
için kullanılacak olan manyetik gümüş
nanopartiküllerin sentezi ve karakterizasyonu
çalışmaları yapılmıştır. Sentezlenen manyetik
gümüş nanopartiküller N-asetil sistein ile
fonksiyonelleştirilmiş
ve
Fe3+
ile
şelatlaştırılmıştır. Hazırlanan bu immobilize metal
iyon afinite desteği katalaz adsorpsiyonunda
kullanılmış ve adsorpsiyona ortam pH’ının etkisi
incelenmiştir.
Gümüş nanopartiküller eşsiz elektronik, mekanik,
manyetik ve optik özelliklerinden dolayı
günümüzde oldukça ilgi görmekte ve paketleme
ve işleme sistemlerinde, lastik, tekstil, kozmetik
ve gıda ürünlerinde, yara bakımı ürünlerinde,
terapötik aletlerde, teşhis ve ilaç salınımı gibi
medikal uygulamalarda oldukça yaygın olarak
kullanılmaktadır (Khan ve ark., 2011).
Materyal ve Yöntem
İmmobilize metal iyon afinite kromatografisi
(IMAK), bir protein molekülünün metal iyon
afinitesi etkileşimleri yardımıyla metal iyonuna
bağlanarak saflaştırılması temeline dayanmaktadır
(Porath ve ark., 1975).
Kimyasallar
Katalaz, N-asetil sistein, gümüş nitrat ve amonyak
Sigma Firmasından (Steinheim, Almanya);
demir(III) klorür, demir(II) klorür, KH2PO4 ve
K2HPO4
Merck
Firmasından
(Darmstadt,
Almanya); asetik asit, sodyum asetat ve etanol
Riedel-de Haen Firmasından (Seelze, Almanya);
diğer tüm kimyasallar ise Aldrich Firmasından
(Milwaukee, ABD) temin edilmiştir.
IMAK ile proteinlerin saflaştırılması ve ayrılması
işlemleri yanında saflaştırma işlemi sonunda
protein denatüre olmadığı için aktivitesini de
korumaktadır. IMAK’de proteinlerin adsorpsiyon
işlemi, protein üzerindeki elektron verici gruplar
ile immobilize edilmiş bir metal iyonu arasındaki
koordinasyonun oluşumuna dayanır. En yoğun
kullanılan metal iyonları elektron çifti kabul etme
eğiliminde olan Cu(II), Ni(II), Zn(II), Co(II) ve
Fe(II) gibi geçiş metal iyonlarıdır. Kromatografik
destek materyaline bağlanan şelat oluşturucu
bileşiklerdeki N, S ve O gibi elektron verici
atomların varlığı, metaller ile koordinasyon bağı
yapılmasını sağlar. Metal iyonunun boş
koordinasyon bölgeleri normalde su molekülleri
ile işgal edilirken, protein adsorpsiyonu sırasında
proteinden gelen uygun elektron verici gruplar ile
N-Asetil Sistein Bağlı Manyetik Gümüş
Nanopartiküllerin Sentezlenmesi
Manyetik gümüş nanopartiküller kimyasal
indirgenme
metodu
kullanılarak
sentezlenmişlerdir (Akduman ve ark., 2013). Bu
amaçla, 1.08 g demir(III) klorür 100 mL saf su
içerisinde, 0.396 g demir(II) klorür 100 mL saf su
içerisinde çözünmüştür. Hazırlanan çözeltiler
birbirine karıştırılarak üzerine 20.0 mL % 26’lık
amonyak çözeltisi ilave edilmiş ve 1 saat oda
sıcaklığında 100 rpm hızda karıştırılmıştır.
Sentezlenen Fe3O4 manyetik nanopartiküller bir
12
S.CAN, M. KAPLAN, M. UYGUN, D. AKTAŞ UYGUN
mıknatıs yardımı ile ayrılarak iki kez 100 mL saf
su ile yakınmıştır (Gupta ve Gupta, 2005).
Manyetik nanopartiküllerin yüzeyini gümüş ile
kaplamak üzere, taze olarak hazırlanmış bu
manyetik nanopartiküllerin üzerine 100 mL saf su
ilave edilmiş ve 0.0852 g gümüş nitrat eklenerek
100 rpm hızda karıştırılmış ve 10 mg sodyum
borhidrür
ile
indirgenmiştir.
Sentezlenen
kahverengimsi manyetik gümüş nanopartiküller
bir mıknatıs kullanılarak ayrılmış ve 100 mL saf
su ile yıkanmıştır (Xu ve ark., 2007). Hacmi 100
mL’ye
tamamlanan
manyetik
gümüş
nanopartiküllerin üzerine 0.409 g N-asetil sistein
ilave edilmiş ve 10 mg sodyum borhidrür ile
indirgenmiş ve 30 dakika oda sıcaklığında bir
manyetik karıtıcı yardımı ile 100 rpm hızda
karıştırılmıştır. Sentezlenen N-asetil sistein bağlı
manyetik gümüş nanopartiküller bir mıknatıs
yardımı ile ayrılmış, 100 mL saf su ile iki defa
yıkanmış ve etüvde 65 °C’de örnek ağırlığı sabit
tartıma gelinceye kadar 3 gün boyunca
kurutulmuştur. N-asetil sistein bağlı gümüş
nanopartiküllerin sentez basamakları Şekil1’de
şematik olarak gösterilmiştir.
Fe3+ ile Şelatlaştırılmış N-asetil Sistein Bağlı
Gümüş Nanopartiküllerin Sentezlenmesi
N-asetil sistein bağlı gümüş nanopartiküllere Fe3+
şelasyonu
işlemi
aşağıdaki
gibi
gerçekleştirilmiştir: Sentezlenmiş ve kurutulmuş
N-asetil sistein bağlı gümüş nanopartiküllerin 3.5
gramı alınarak 100 mL demir(III) nitrat çözeltisi
(2.5 x 10-4 M, pH: 5.0) ile 24 saat süre
karıştırılmıştır. Hazırlanan Fe3+ ile şelatlaştırılmış
N-asetil sistein bağlı gümüş nanopartiküller
manyetik olarak ayrılmış ve 100 mL saf su ile iki
defa
yıkanarak
katalaz
adsorpsiyonunda
kullanılmıştır (Akduman ve ark., 2013). N-asetil
sistein bağlı gümüş nanopartiküller üzerine Fe3+
şelasyonu basamakları Şekil 1’de şematik olarak
gösterilmiştir.
Şekil 1. N-asetil bağlı manyetik gümüş nanopartiküllerin sentezi ve Fe3+ ile şelatlaştırılmasının şematik gösterimi.
13
S.CAN, M. KAPLAN, M. UYGUN, D. AKTAŞ UYGUN
nanopartiküllere bağlanan katalaz miktarı
hesaplanmıştır (Uygun ve ark., 2012).
Q = [(C0-C)V]/m
Eşitlik 1.
Burada, Q birim nanopartikül kütlesi başına
bağlanan katalazın kütlesi (mg/g); C0 ve C sırası
ile adsorpsiyondan önceki sonraki katalaz
derişimleri (mg/mL); V toplam çözelti hacmi ve m
denemelerde kullanılan nanopartikül kütlesidir
(g).
Fe3+ ile Şelatlaştırılmış N-asetil Sistein Bağlı
Gümüş Nanopartiküllerin Karakterizasyonu
Sentezlenen manyetik gümüş nanopartiküllerin
yüzey morfolojisi, boyutu ve şekli SEM (taramalı
elektron mikroskobu) ve AFM (atomik kuvvet
mikroskobu) cihazları kullanılarak incelenmiştir.
SEM
analizleri
için,
manyetik
gümüş
nanopartiküller kurutulmuş ve toz halindeki
örneklerin üzeri altın ile kaplanmış ve SEM cihazı
(Philips, XL-30S FEG, Hollanda) kullanılarak
fotoğraflanmıştır. AFM analizi için, manyetik
gümüş nanopartikül çözeltisi bir cam tabak (1.0
cm x 1.0 cm) üzerine yayılmış, kurutulmuş bir
AFM cihazına (Digital Instruments, MMSPM
Nanoscope IV, ABD) yerleştirilerek taranmıştır.
Manyetik nanopartiküller üzerine N-asetil sistein
bağlanması EDX (enerji dağılımlı X-ışını) cihazı
(LEO, EVO40, Carl Zeiss NTS, ABD)
kullanılarak
saptanmıştır.
Nanopartiküllere
bağlanan N-asetil sistein miktarı bu analizden elde
edilen kükürt miktarından yola çıkarak
stokiometrik olarak hesaplanmıştır.
Bulgular ve Tartışma
Fe3+ ile Şelatlaştırılmış N-asetil Sistein Bağlı
Gümüş Nanopartiküllerin Karakterizasyonu
Sentezlenen manyetik gümüş nanopartiküllerin bir
fotoğrafı Şekil 2’de gösterilmiştir. Şekil 2’de
görüldüğü gibi, gümüş nanopartiküller bir
mıknatıs
yardımı
ile
kolaylıkla
toparlanabilmektedir.
(A)
Fe3+ ile Şelatlaştırılmış N-asetil Sistein Bağlı
Gümüş
Nanopartiküllere
Katalaz
İmmobilizasyonu ve İmmobilizasyona pH’ın
Etkisi
Sentezlenen Fe3+ ile şelatlaştırılmış N-asetil
sistein bağlı gümüş nanopartiküllere katalaz
immobilizasyonu kesikli sistemde incelenmiştir.
Bu amaçla, manyetik gümüş nanopartiküller
katalaz çözeltisinin sulu çözeltisi ile 2 saat
boyunca +4 °C’lik su banyosunda 100 rpm
karıştırma hızında muamele edilmiştir. Katalaz
adsorpsiyonuna
ortam
pH’ının
etkisinin
incelenmesi için farklı pH’larda tampon çözeltiler
kullanılmıştır.
Bu amaçla, farklı pH’larda
tamponlar (pH 3.0-5.0 asetat tamponu; pH 6.0-8.0
fosfat tamponu; pH 9.0 karbonat tamponu)
kullanılarak 6.0 ml’lik katalaz çözeltileri (0.05
mg.mL-1) hazırlanmış ve üzerlerine 0.6 mg
nanopartikül eklenerek 2 saat süre ile 100 rpm
hızda
manyetik
olarak
karıştırılmıştır.
Adsorpsiyon işlemi başında ve sonunda ortamda
bulunan katalaz miktarı spektrofotometrik olarak
280 nm’de tayin edilmiştir (Shimadzu, 1601,
Japonya) ve Eşitlik 1. gereğince manyetik
(B)
Şekil 2. Fe3+ ile şelatlaştırılmış N-asetil sistein bağlı gümüş
nanopartiküllerin suda süspanse olmuş (A) ve bir mıknatıs
ile ayrılmış (B) durumlarını gösteren fotoğraf.
Fe3+ ile şelatlaştırılmış N-asetil sistein bağlı
gümüş nanopartiküllerin yüzey özellikleri ve şekli
SEM analizleri ile incelenmiştir. Şekil 3’de
sentezlenen gümüş nanopartiküllerin SEM
fotoğrafı görülmektedir. Şekilden de görüldüğü
üzere, nanopartiküller küresel formdadır ve
birbirlerine
yakın
konumda
istiflenerek
agregatlaşmış haldedirler.
14
S.CAN, M. KAPLAN, M. UYGUN, D. AKTAŞ UYGUN
Şekil 3. Fe3+ ile şelatlaştırılmış N-asetil sistein bağlı gümüş nanopartiküllerin SEM fotoğrafı.
Hazırlanan gümüş nanopartiküllerin şekil ve boyut
özellikleri AFM kullanılarak incelenmiştir ve Fe3+
ile şelatlaştırılmış N-asetil sistein bağlı gümüş
nanopartiküllerin AFM fotoğrafı Şekil 4’de
gösterilmiştir. Şekil 4’den görüleceği üzere,
sentezlenen nanopartiküller küresel formdadır ve
ortalama partikül çapı 43 nm olarak ölçülmüştür.
Şekil 4. Fe3+ ile şelatlaştırılmış N-asetil sistein bağlı gümüş nanopartiküllerin AFM fotoğrafı.
15
S.CAN, M. KAPLAN, M. UYGUN, D. AKTAŞ UYGUN
Fe3+ ile şelatlaştırılmış N-asetil sistein bağlı
gümüş nanopartiküllerin EDX analizi partiküllerin
kimyasal bileşimi hakkında bilgi vermektedir.
Şekil 5’de manyetik gümüş nanopartiküllerin
EDX analizi sonuçları görülmektedir. Şekil’den de
görüldüğü üzere, hazırlanan nanopartiküller Fe, O,
Ag, N, C ve S atomlarından meydana gelmektedir.
Gümüş nanopartiküller üzerine bağlanan N-asetil
sistein miktarı EDX analiz sonuçlarına göre
hesaplanmıştır ve bağlanan N-asetil sistein miktarı
kükürt stokiometrisi kullanılarak 268.75 µmol.g-1
olarak hesaplanmıştır.
cps/eV
30
25
S
20
N
C
Ag O Fe
S
Ag
Fe
15
10
5
0
0
1
2
3
4
keV
5
6
7
8
9
Şekil 5. Fe ile şelatlaştırılmış N-asetil sistein bağlı gümüş nanopartiküllerin EDX spektrumu.
3+
Fe3+ ile Şelatlaştırılmış N-asetil Sistein Bağlı
Gümüş
Nanopartiküllere
Katalaz
İmmobilizasyonu ve İmmobilizasyona pH’ın
Etkisi
Fe3+ ile şelatlaştırılmış N-asetil sistein bağlı
gümüş
nanopartiküllere
katalaz
immobilizasyonuna pH’ın etkisi pH 3.0-9.0
aralığında incelenmiştir ve elde edilen sonuçlar
Şekil 6’da gösterilmiştir. Şekil’den görüldüğü
üzere, maksimum katalaz adsorpsiyonu pH 4.0
asetat tamponu kullanılarak elde edilmiştir ve
443.11 mg katalaz.g-1 nanopartikül olarak
hesaplanmıştır. Bu pH değerinin üzerinde ve
altında adsorplanan katalaz miktarı azalmıştır.
IMAK’de protein adsorpsiyonu temelde metal
iyonları ile proteinlerin amino asit birimleri
arasındaki şelatlayıcı bağlara bağlıdır. Katalazın
izoelektrik noktası 5.4’dür ve bu pH değerinde net
bir yüke sahip değildir (Samejima ve ark, 1962).
pH 4.0 noktasında katalaz iyonize olma
eğilimdedir ve bu da IMAK desteği üzerine
katalaz adsorpsiyonu etkilemiş olabilir (Erzengin
ve ark., 2011; Wong ve ark., 1991).
Şekil 6. Fe3+ ile şelatlaştırılmış N-asetil sistein bağlı gümüş
nanopartiküllere katalaz immobilizasyonuna pH’ın etkisi
(katalaz derişimi: 0.05 mg/ml; inkübasyon zamanı: 2 saat;
sıcaklık: 25 °C).
Sonuç
Bu çalışmada, manyetik gümüş nanopartiküllerin
sentezi, modifikasyonu ve Fe3+ ile şelasyonu ve
katalaz immobilizasyonunda kullanımı rapor
edilmiştir. Sentezlenen nanopartiküller SEM,
AFM ve EDX kullanılarak karakterize edilmiş ve
partikül boyutunu yaklaşık 69 nm olduğu ve
küresel yapıya sahip olduğu bulunmuştur.
Sentezlenen
nanopartiküllere
katalaz
immobilizasyonun farklı pH’lardaki tampon
çözeltilerinin etkisi incelenmiş ve maksimum
katalaz adsorpsiyonun pH 4.0 asetat tamponu
16
S.CAN, M. KAPLAN, M. UYGUN, D. AKTAŞ UYGUN
kullanılarak elde edildiği bulunmuştur. Sonuç
olarak, sentezlenen nano boyuttaki metal iyon
afinite desteğinin katalaz adsorpsiyonu kapasitesi
oldukça yüksek olmasından ve kompleks
ortamlardan dahi manyetik olarak basitçe
ayrılabilme potansiyeline sahip olmasından dolayı
katalaz adsorpsiyonunda ayırma teknolojisinde ve
immobilize
formda
ise
biyoteknolojik
uygulamalarda etkili bir şekilde kullanılabileceği
ön görülebilir.
Green 5 attached supermacroporous monolithic
cryogel. Applied Biochemistry and Biotechnology,
167: 552-563.
Wong, J.W., Albrigth, R.L. Wang, N.H.L. 1991.
Immobilized metal ion affinity chromatography
(IMAC) chemistry and bio-separation applications.
Separation and Purification Methods, 20: 49-106.
Xu, Z., Hou, Y., Sun, S. 2007. Magnetic core/shell
Fe3O4/Au and Fe3O4/Au/Ag nanoparticles with
tunable plasmonic properties. Journal of American
Chemical Society, 129: 8698-8699.
KAYNAKLAR
Akduman, B., Uygun, M., Uygun, D.A., Antalik, M. 2013.
Fe3O4 magnetic core coated by silver and
functionalized with N-acetyl cysteine as novel
nanoparticles in ferritin adsorption. Journal of
Nanoparticle Research, 15: 1564.
Denizli, A., Küfrevioğlu, Ö.İ. 2007. Protein kromatografisi
ve yeni nesil polimerik sistemler, Yaz Okulu
Notları, pp. 133, Erzurum.
Erzengin, M., Ünlü, N., Odabaşı, M. 2011. A novel
adsorbent
for
protein
chromatography:
supermacroporous monolithic cryogel embedded
with Cu2+-attached sporopollenin particles. Journal
of Chromatography A, 1218: 484-490.
Gupta, A.K., Gupta, M. 2005. Synthesis and surface
engineering of iron oxide nanoparticles for
biomedical applications. Biomaterials, 26: 39954021.
Khan, Z., Al-Thabaiti, S.A., Obaid, A.Y., Al-Youbi, A.O.
2011. Preparation and characterization of silver
nanoparticles by chemical reduction method.
Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 82: 513517.
Kuroiwa, T., Noguchi, Y., Nakajima, M., Sato, S.,
Mukataka, S., Ichikawa, S. 2008. Production of
chitosan oligosaccharide
using chitosanase
immobilized
on
amylase-coated
magnetic
nanoparticles. Process Biochemistry, 43: 62-69.
Mamalis, A.G. 2007. Recent advances in nanotechnology.
Journal of Materials Processing, 181: 52-58.
Mandal, M., Kundu, S., Ghosh, S.K., Panigrahi, S., Sau,
T.K., Yusuf, S.M., Pal, T. 2005. Magnetite
nanoparticles with tunable gold silver shell. Journal
of Colloid Interface Science, 286: 187-194.
Papazoglou,
E.S.,
Parthasarathy,
A.
2007.
BioNanotechnology, Morgan & Claypool Pub.
ABD.
Porath, J., Carlsson, J.A.N., Olsson, I., Belfrage G. 1975.
Metal chelate affinity chromatography, a new
approach to protein fractionation. Nature, 258: 598599.
Samejima, T., Kamata, M., Shibata, K. 1962. Dissociation
of bovine liver catalase at low pH. The Journal of
Biochemistry, 51: 181-187.
Scibior, D., Czeczot, H. 2006. Catalase: structure,
properties, functions. Postepy Higieny i Medycyny
Doswiadczalnej, 60: 170-180.
Uygun, D.A., Akduman, B., Uygun, M., Akgöl, S., Denizli,
A. 2012. Purification of papain using Reactive
17