Campylobacter, Helicobacter: Antimikrobiyal Duyarlılık Testleri

Termofilik (42-430C) (C. fetus hariç)
Mikroaerofilik (düşük oksijen) ve kapnofilik
(artmış karbondioksit) (5%O2,10%CO2,85%N2)
İnsanlara bulaş: kontamine gıdalarla
özellikle kümes hayvanlarının ürünleri
pastörize edilmemiş süt veya işlenmemiş su ile olur
• • – – – – • – Örnek toplama ve işleme:
Dışkı buzdolabında saklanmalı ve kısa sürede
incelenmeli
Rektal sürüntüler taşıyıcı besiyerinde taşınmalı
C. fetus için kan alınmalı
Oksijenle temas önlenmeli
Dışkı örneğine filtrasyon yapılmalı
Zenginleştirilmiş besiyeri ve seçici besiyeri
kullanılmalı
Filtrasyon: 0.45 μm filtreden dışkı geçirilir
• • • • Azaltılmış O2 (5% O2) eklenmiş CO2 (10% CO2)
42 ℃ (seçicilik amacıyla)
Bir çok seçici besiyeri kullanılabilir
İki tip koloni:
☺ sulu ve yayılan
☺ yuvarlak ve dış bükey
• • • • • $#
"!
• • • • #$&%'
• – – ((
• %$!!
• • "",
– 3-8
• #%,
– 69.6:37;
– 75357
• ,
– />43
5+>8
5+>;850
– &""$&
– "
– &! 48
®##$% ®"$&"#
!%
!
&
* (
!
!
!
(
'
!) %
'
&
(
• – – !
% %"
% 250 suş
%,%
/),$
/)'%
/(+$
(),
/'++
/'%*
/&)%
/%)#
%$
/././
./
!&*)' (#$%$"'%$#!)!!.*#
(&!'" "
C. coli (n=12)
C. jejuni (n=85)
Antibiyotik
Duyarlı (%)
Dirençli (%)
Duyarlı (%)
Dirençli (%)
Meropenem
85 (% 100)
- (% 0)
12 (% 100)
- (% 0)
Eritromisin
75 (% 88.2)
10 (% 11.8)
10 (% 83)
2 (% 17)
Gentamisin
81 (% 95.3)
4 (% 4.7)
12 (% 100)
- (% 0)
Doksisiklin
75 (% 88.2)
10 (% 11.8)
12 (% 100)
- (% 0)
Siprofloksasin
41 (% 48.2)
44 (% 51.8)
6 (% 50)
6 (% 50)
- (% 0)
85(% 100)
- (% 0)
12 (% 100)
44 (% 51.8)
41 (% 48.2)
2 (% 17)
10 (% 83)
Sefalotin
Nalidiksik asit
00
P-75
2007-2009 YILLARINDA DIŞKI KÜLTÜRLERİNDEN İZOLE EDİLEN
Campylobacter TÜRLERİNİN DEĞERLENDİRİLMESİ
B. Levent, R. Kayalı, H. Bayrak, M. Alageyik, B. Esen
48 Campylobacter suşu
Siprofloksasin25 dirençli, 5 orta dirençli
Eritromisin3
Trends in antimicrobial susceptibility of Campylobacter
isolates in Poland (2000-2007).
Rozynek E, Dzierzanowska-Fangrat K, Szczepańska B, Wardak S, Szych J, Konieczny P, Albrecht P,
Dzierzanowska D
251 Campylobacter suşu, çocuklardan 2000 - 2007
siprofloksasin (%49.5 C. jejuni -% 51.3 C. coli),
tetrasiklin(%17.5 -%18.0)
ampisilin(%13.2 - %10.2)
Makrolidlere duyarlı
Çoklu antibiyotik direnci %5.1 2000-2003
%34.6 2004-2007
Pol J Microbiol. 2009;58(2):111-5.
• "
• "
• (#%&
"
&'
• Metronidazol
• Klaritromisin
• Amoksisilin
• Tetrasiklin
• Kinolonlar
• Furozolidonlar
• Ketolidler
• Rifamisinler
H. pylori’de antibiyotik duyarlılık testleri
Fenotipik
Kültürden
-Agar dilüsyon
-E-test
-Disk difüzyon
Genotipik
Biyopsi ve Kültürden
Primer izolasyon
BHI agar, Columbia agar, Brucella agar vb.
+
Vankomisin 10mg/L
Trimetoprim 5mg/L
Sefzulodin 5mg/L
Amfoterisin 5mg/L
+
% 7 – 10 at kanı veya koyun kanı
35-370C’de 5-7 gün, mikroaerofil koşullarda
( %8-10 CO2, %5-6 O2, %80-85 NO2, %98 nem),
inkübe edilir.
Antibiyotik duyarlılık testleri
-70’de
saklanmış olan H. pylori suşları antibiyotik
içermeyen zengin besiyerinde çoğaltılır.
Primer izolasyon sonrasında maksimum 3 defa
pasaj yapılabilir.
Mc Farland 0.5’e uygun süspansiyon yapılır,
besiyerine L şeklindeki öze ile yayılır.
3 günlük kültürden antibiyotik duyarlılık testi
uygulanır.
Kanlı agarda üç günlük kültür
Kültürdeki H. pylori suşları sarmal
formda olmalı, kokoid olmamalı.
CLSI standartlarına göre
uygulanacak agar dilüsyon testi
Besiyeri: Mueller – Hinton agar (MHA) + % 5
koyun kanı
İnokulum: SF içinde hazırlanmış 2 Mc
Farland’a (1 X 107uygun bulanıklıkta
1 X 108 CFU/ml)
süspansiyondan,
1-3 μL damla,
antibiyotik içeren
agar dilüsyon plaklarına
İnkübasyon:350C’de 3 gün, mikroaerofilik
atmosfer
CLSI standartlarına göre
uygulanacak agar dilüsyon testi
Kalite kontrol için kullanılacak;
standart suş: H. pylori ATCC® 43504
H. pylori NCTC® 11637
MİK aralıkları: μg/ml
Amoksisilin:
Klaritromisin:
Metronidazol:
Tetrasiklin:
0.016 – 0.12
0.016 – 0.12
64 – 256
0.12 – 1.0
Avrupa H. pylori çalışma grubunun
agar dilüsyon testi için önerileri
Besiyeri: Mueller – Hinton agar (MHA) + % 5
koyun kanı veya at kanı
İnokulum: SF içinde hazırlanmış 4 Mc
Farland’a (1 X
bulanıklıkta
109CFU/ml) uygun
süspansiyondan, 1-3 μL
damla,
antibiyotik içeren agar
dilüsyon plaklarına
İnkübasyon:370C’de 3 gün, mikroarofilik ortam
Avrupa H. pylori çalışma grubunun
agar dilüsyon testi için önerileri
Kalite kontrol için kullanılacak;
standart suş: H. pylori NCTC 11637
H. pylori CCUG 38770
H. pylori CCUG 38771
H. pylori CCUG 38772
Agar dilüsyon testi
FDA onaylı bir antibiyotik duyarlılık
testi
Çok miktardaki H. pylori suşunun
antibiyotik duyarlılığını çalışmak için
ideal ve standart bir yöntem
Uygulaması zor
Kontaminasyon
Mikroaerofil
E-test
Besiyeri: Mueller – Hinton agar (MHA) + % 5
kan
Columbia kanlı agar
İzosensitest kanlı agar
İnokulum: Buyyon içinde hazırlanmış 3 Mc
Farland’a uygun
bulanıklıkta
süspansiyondan,
tüm agar yüzeyine
yayılır
Uygulama: 90 mm plaklara bir tek strip
İnkübasyon:350C’de 3 gün, mikroarofilik ortam
E-test
FDA onayı olamayan bir antibiyotik
duyarlılık testi
BSCA (The British Society for Antimicrobial Chemotherapy)
EHSG (European Helicobacter Pylori Study Group)
Tek tek olgularda H. pylori suşunun
antibiyotik duyarlılığını çalışmak için ideal
bir yöntem
Uygulaması kolay
Pahalı
H. pylori’de klaritromisin
direncini saptamak için
moleküler testler
23S rRNA gen amplifikasyonu gerekenler
- - - - - - - - - Sequencing, pyrosequencing
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
OLA (Oligonucleotide Ligation Assay)
DEIA (DNA Enzyme Immunoassay)
INNO-LiPA (Line Probe Assay)
3’ mismatch PCR
PHFA (Preferential Homoduplex Assay)
Real-time PCR FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)-MCA
(Melting Curve Analysis)
DG-DGGE (Double Gradient-Denaturating Gradient Gel
Electrophoresis)
Amplifikasyon gerekmeyen
- FISH assay (Fluorescence in situ Hybridization assay)
&
$!
#*-0%&./+
'&
&
'
Real-time PCR FRET MCA
!
Metronidazol direnci
• Avrupa
• ABD
• Brezilya
• Meksika
• Asya
• Türkiye
%14.9-40
%22-37
%53
%76
%9-77
%47.7
Klaritromisin direnci
• Avrupa
• ABD
• Brezilya
• Meksika
• Asya
• Portekiz
• Türkiye
%1.7-27.5
%4-15
%9.8
%25
%1-13.8
%39.4 (çocuk)
%27.6-30.9
Amoksisilin direnci
Avrupa %0.2- 0.6
Kore %8.8-18.8
Kim et al. J Clin Gastroenterol 2006; 40: 683-687
Kim et al. Int J Ant Agents 2006; 28: 6-13
Tetrasiklin direnci
Avrupa %0-10
Florokinolon direnci
• Avrupa %3.9-20
June 1999- June 200124.2%
January-June 2001 37.5%
Helicobacter resistance: amoxicillin,clarithromycin,tetracycline,
metronidazole and rifampicin by agar dilution method
Ö. Karamerlioğlu, S. Çolakoğlu, E. Yula, F. Köksal, E. Nazlıcan
April 2002-April 2005 386 strain
• No resistance to amoxicillin, tetracycline, rifampicin.
• Metronidazole (2002) 34%, (2003) 37.2%, (2004) 33.8%.
• Clarithromycin (2002) 14.9%, (2003) 17.4%, (2004) 18.1%.
27.6%
Clarithromycin resistance in H. pylori by agar dilution and E-test
Academic Gastroenterology Journal 2005
Peren H. Bağlan, Gülendam Bozdayı, Muhip Özkan, Ali Özden
77 patient
AD 55.8 %
E-test 54.5%
Agar dilution 28 strains (Konya,Turkey- Fatma Kalem)
Clarithromycin
number(%)
Metronidazole
number(%)
Amoxicillin
number%)
Sensitive
20(71.5)
17(60.8)
28(100)
Resistant
8(28.5)
11(39.2)
0(0)
Helicobacter pylori antibiotic resistance in Iran.
120 strain
According to modified disc diffusion test,
1.6% to amoxicillin,
16.7% to clarithromycin,
57.5% to metronidazole, and
no resistance to tetracycline. s
World J Gastroenterol. 2005 Oct 14;11(38):6009-13.
Mohammadi M, Doroud D, Mohajerani N, Massarrat S. Biotechnology Research Center,
Pasteur Institute of Iran, Tehran, Iran.
Monitoring of Helicobacter pylori resistance to clarithromycin
by real-time PCR assay in gastric biopsy specimens over a 4year period in Turkey
M. Yalınay Çırak, D. Engin, S. Ünal, T. Karakan, s. Türet, Ş.
Dumlu (2007)
2003 % 16.3
2004 % 26.6
2005 % 29.6
2006 % 42
2007 % 50 (ilk 5 ay)
RETROSPECTİVE EVALUATİON OF HELİCOBACTER PYLORİ
CLARİTHROMYCİN RESİSTANCE İN CHİLDREN BY REAL-TİME PCR
!
"
#
'
'
'
'
#
"" !#
!
$ #
"
##$
#
$!$
"!
$$ "
#
The prevalence of primary and secondary Helicobacter pylori resistance to
clarithromycin and probable contributing cofactors: data from southeastern Anatolia.
Tüzün Y, Bayan K, Yilmaz S, Dursun M, Ozekinci T. (Diyarbakır)
Hepatogastroenterology. 2008 Jan-Feb;55(81):289-93
Primary resistance to clarithromycin 16.4 %
Clarithromycin resistance rates :Düzce, Turkey 30 %
Ayşe Demet Kaya, Elif Öztürk, Yusuf Akcan, Mustafa Behçet , Esra Karakoç,
Mihriban Yücel, Müge Mısırlıoğlu, Serdar Tuncer
Current Therapeutic Research. 68:3, 2007, 151-160.
P-71
FLORESAN IN SITU HİBRİDİZASYON (FISH) VE REAL-TIME PCR
YÖNTEMLERİ İLE Helicobacter pylori ENFEKSİYONU TANISI VE PRİMER
KLARİTROMİSİN DİRENCİNİN DEĞERLENDİRİLMESİ
E. Demiray Gürbüz, Ö. Yılmaz, M. Soytürk, S Sarıoğlu, Y. Doğan, C.
Gönen, İ. Şimşek
30 H. pylori
FISH %22.2
Real-Time PCR39.3
Teşekkür ederim…