MİKROTEKNİK DERS NOTLARI Mikroteknik (Mikro preparasyon yöntemleri

MİKROTEKNİK DERS NOTLARI
Mikroteknik (Mikro preparasyon yöntemleri): Mikroskopta incelenecek preparatların yapılma
teknikleridir. 2 şekilde yapılır. 1) Canlı inceleme
2) Daimi (Sabit) preparat hazırlanması
Hücre ve Dokuların İnceleme Metotları: Hücre ve dokuların incelenmesi iki ana yolla yapılır.
a)Taze (canlı veya henüz ölmüş): Taze hücre ve dokulardan mikroskobik preparatlar hazırlanması. Örneğin
balığın kalbini çıkarıp inceleme
b)Hücre, doku ve organlardan boyanmış daimi preparatlar hazırlanması (Daimi preparat).
A)Taze Preparatların Hazırlanması: Usulüne göre öldürülmüş bir hayvanın (Memeli, kanatlı veya
soğukkanlı) yumuşak dokuların (deri altı bağ dokusu, epitel kazıntılar, kas ve sinir telleri, kan, lenf vs.) veya
kültürde yetiştirilmiş dokular, küçük parçalar halinde kesilip lam üzerinde tiftiklendikten sonra üzerine
hemen lamel kapatılarak mikroskop altında incelenir. İnceleme sırasında dokunun kuruyarak bozulmasını
önlemek için incelemenin çabuk yapılması gerekir. Kuruma tehlikesi çabuk çalışma ile giderilemiyorsa
izotonik sıvılardan faydalanılır. Bu amaç için kullanılan izotonik sıvılara birkaç örnek verecek olursak
1. Serum Fizyolojik (Fizyolojik Tuz Çözeltisi: NaCl): Yoğunluğu yaklaşık plazma yoğunluğunda
olan sodyum klorürlü sudur. Memeliler için : % 0.9, Kanatlılar için: % 0.75, Kurbağa için: %0.64 lük
çözelti kullanılır.
2. Ringer çözeltisi:
Sodyum klorür (NaCl)
Memeliler için …………….. 8 gr
Kurbağa için ………………… 6,5 gr
Kalsiyum klorür (Susuz)……………. 0,2 gr
Potasyum klorür ……………………… 0,2 gr
(Çıkmayacak)
Sodyum bikarbonat ………………… 0,2 gr
Glikoz (dekstroz) …………………….. 1 gr
Saf su ………………………………………. 1000 ml
Not: Laboratuarda su deyince saf su anlayacağız
Not: Çözelti uzun müddet saklanamaz. Eğer bu çözelti kullanılmadan önce steril hale getirilecekse önce
filtre edilir daha sonra otoklava konulur.
3. Locke Çözeltisi:
NaCl ………………………………………. 9 gr
KCI ………………………………………… 0,42 gr
CaCl2 (Susuz)…………………………. 0,24 gr
(Çıkmayacak)
NaHCO3………………………………… 0,2 gr
Saf su …………………………………… 1000 ml
Not: Çözelti çok iyi korunmalı ve kaynatılmamalıdır. Locke çözeltisi memeli ve kuş dokularının ve
embriyolarının incelenmesinde ringer çözeltisinden daha kullanışlıdır.
4. Tyrode Çözeltisi: İki kısımdan oluşan bir çözeltidir.
Çözelti A
Çözelti B
NaCl………………………8 gr
NaHCO3…………………….0,5 gr
CaCl2…………………….0,2 gr
Saf su………………………..250 ml
NaH2PO4……………..0,05 gr
MgCl2………………….0,1 gr
(Çıkmayacak)
Glukoz………………..1 gr
Saf su………………….750 ml
Gereksinim duyulduğu miktarda 3 kısım çözelti A ile 1 kısım çözelti B’ yi karıştırmak gerekir. (3:1)
*Yukarıda verilen 4 çözeltide CaCl2‘ ün çökmemesi için en son olarak katılması gerekir.
Hücre ve dokuları öldürmeyen bu sıvılardan başka organizmaları öldüren tipte sıvılarda vardır. Bu sıvılar
canlı halde inceleme ile tespit edilmiş inceleme oranı da geçit teşkil eder. Bu araç için kullanılan sıvılar;
Potasyum Hidroksit (KOH), Asetik Asit (CH 3OOH) tir. Bu sıvılar hücreleri saydamlaştırır ve çekirdeği
görünür hale getirir.
TAZE PREPARATLARI HAZIRLAMA ŞEKİLLERİ
a) Lam ve lamel arasında yapılır. Materyal küçük ise direkt lam üzerine konur, materyal büyük ise lam
üzerine kibrit çöpü koyup lamel bunun üzerine lamel kapatılır ve mikroskopta inceleme yapılır.
b) Frotis Yöntemi (Yayma): Lamın bir ucuna incelenmek istenen sıvıdan bir damla konup ikinci bir lam ile
45o lik açı oluşturacak şekilde yavaşça sürerek yapılan bir yöntemdir.
c) Canlı organizmalara çeşitli maddeler enjekte edilir. Bu işlem için çeşitli boyalar kullanılır. Bu boyalara
vital boyalar denir.
Vital Boyalar: Vital inceleme sıvı bir ortamda yaşayan serbest hücrelere, doku parçalarından ayrılmış
hücrelere, saydam zarlara, hayvanların saydam bölgelerine veya apak organlarına uygulanabilir. Canlı halde
boyamaya vital boyama denir. Vital boyalar asidik vital boyalar ve bazik vital boyalar olarak ikiye ayrılır.
Her iki gruba giren boyalarda organizma ölmez.
Bazik Vital Boyalar
Asidik Vital Boyalar
-Metilen mavisi (Vakuol boyar)
-Trypan mavisi
-Tolvidin mavisi (Vakuol boyar)
-Pyrol mavisi
-Metilen yeşili (Çekirdek boyar)
-Kongo kırmızısı
-Metilen azurin (Vakuol boyar)
-Nil mavisi (Vakuol boyar, az toksittir)
-Cresly mavisi (Vakuol boyar, az toksittir)
-Cresly viole (Mitokondri boyar)
-Nötr kırmızısı (Vakuol boyar)
-Jaunus yeşili (Mitokondri boyar)
Bazı Vital Boyaların Hazırlanması (Çıkmayacak)
1. Metilen Mavisi: 0,3 gr Alkol (%95, 30 ml). Alkolde çözünen metilen mavisine 100 ml saf su ilave
edilir. Hazırlanan metilen mavisine Crustacea’ lere enjekte edilerek organizasyonu açığa çıkartmak
için kullanılır.
Canlı organizmaları incelemek için ; Metilen mavisi 1 gr, NaCl2 0,6 gr ve saf su 100 ml
2. Metilen Yeşili: Metilen yeşili 1 gr , alkol (%70, 99 ml)
 %70’ lik alkol materyali saklamak için kullanılır.
3. Nötr Kırmızısı: Nötr kırmızısı 0,1 gr, izotonik çözeltisi 1000 ml
4. Kongo Kırmızısı: Kongo kırmızısı 1 gr ile 1000 ml saf su karıştırılır.
GEÇİCİ PREPARATLAR
Mikroskopta incelenecek materyalin uzun süre saklanması gerekmiyorsa geçici preparat hazırlanır.
Bir lam üzerine 1-2 damla su veya laktofenol çözeltisi damlatılarak inceleme ortamı hazırlanır. İncelenecek
materyal kesiti ya da bir parçası olacak şekilde damlatılan bu sıvı içerisine konur. Materyal ışık
mikroskobunda inceleneceğinden ışığı geçirebilmeli yani ince olmalıdır. Materyal üzerine 45 o lik açıyla
lamel kapatılır. Sıvı lamelin kenarına taşmamalıdır. Şayet taşarsa kurutma kağıdıyla sıvının fazlasını almak
gerekir. Örn: Mikrofungusların incelenmesi laktofenol kullanılırsa materyal çok iyi görünür. Laktofenol
kullanılan preparatlar 5-6 ay bozulmadan kalabilir. Ayrıca % 10 luk gliserin çözeltiside kurumaya karşı
dayanıklı preparat yapımında kullanılır.
DAİMİ PREPARATLARIN HAZIRLANMASI
Daimi preparatlar kesitlerin veya frotislerin (yayma) tespit edilip boyanması ile elde edilir. Bu
işlemler;
1-Uyuşturma
2-Tespit etme (Fiksasyon) 3-Dehidrasyon (Suyunu alma)
4Saydamlaştırma
5-Materyali parafine yatırma ve blok hazırlama
6-Parafin bloklarının
kesilmesi ve kesitlerin lamlara aktarılması 7-Boyama
8-Preparatın monte edilmesi
1. Uyuşturma: Uyuşturma için kullanılan malzemeler.
 % 10 luk etil alkol: Tatlı su omurgasızları için kullanılır
 MgCl2: Deniz hayvanları için % 7,5 luk çözeltisi kullanılır. Ayrıca eşit hacimdeki deniz suyu ile
seyreltilebilir.
 Eter Buharı: Böcekler, örümcekler ve kara omurgalıları için kullanılır.
 Kloroform: Eterin aynısıdır.
 Mentol: Mentol kristalleri su yüzeyine serpilir gece boyunca bekletilir. Bu madde tek başına
yaşayan tatlı su hayvanları için kullanılır
 Düşük Sıcaklık: Yeterli miktarda anestezi verilmiş hayvanın buzdolabında saklanması ile
kullanılır.
2. Tespit Etmek (Fiksasyon): Hayvanları veya hücre ve dokuları öldürmek için yapılır. Tespit sırasında
hücrenin ve dokunun mümkün olduğu kadar bozulmamasına ve tespit edilen hücrede oluşabilecek
değişikliklerin minimum düzeyde olmasına dikkat edilmelidir. Tespit işleminde kullanılan çözeltilere
fiksatif veya fiksatör denir. Fiksatifler etki sırasında sitoplazmayı pıhtılaştırır veya çökeltir. Her iki
durumda da proteinler esas yapılarını korurlar.
 Fiksasyon: Anatomik elemanların yapı ve şekillerini değiştirmeye vakit bulamadan süratle
öldürmek, hücre ve dokunun morfolojisini korumak ve bunların çeşitli boyalarla boyanmasına
hazırlamak için yapılan çalışmalardır.
Fiksasyonun yapılmasıyla;
I. Doku ve hücreler arasındaki kırılma indisi arttırılmış olur.
II. Hücre ve dokular sertleşir ve bundan sonraki işlemler kolaylaşır.
III. Hücre ve doku elemanlarının dağılması önlenmiş olur.
İyi fiksatif şu özellikleri taşımalıdır;
 Dokulara nüfus etme yeteneği iyi olmalıdır. Bu yetenek çeşitli fiksatiflere göre değişir. Asetik asitli
fiksatifler çabuk etki ederler. Ozmik asitli fiksatiflerin etkisi daha yavaştır.
 Dokudaki proteinleri total olarak pıhtılaştırmalıdır. Pıhtılaştırma ani şiddetli olmalıdır. Aksi taktirde
dokuda büzülme meydana gelir. Asetik asitli fiksatifler iyi sonuç verirler.
 Fiksatörün asitliği de önemlidir. Dokuların asitleştirilmesi ile pıhtılaşma ve çökme olur
 Tespit sırasında sıcaklıkta önemlidir. Genellikle histolojik fiksatifler oda sıcaklığında kullanılmalıdır
 Fiksatifin hacmi materyalin 15 ile 20 katı kadar olmalıdır.
Yalnız başına kullanılan bir kimyasal madde iyi bir fiksatifin bütün üstünlüklerine sahip değildir. Tek
başına kullanılan fiksatifler daha sınırlıdır. Fornolin, aseten, etil alkol tek başına en çok kullanılan
fiksatiflere örnektir. Birbirleriyle karıştırılarak kullanılan fiksatiflerin birinin zararlı etkisini diğeri
bertaraf eder. En çok kullanılan fiksatifler; formaldehit, etil alkol, asetik asit, pikrik asit, potasyum bi
kromat…vb.
Uygun fiksatif seçimi yapılması istenen analize göre
değişir. Örn: Suda hazırlanmış bir fiksatif dokudaki glikojeni, alkolde hazırlanmış bir fiksatif ise lipitleri
eriteceğinden söz konusu maddelerin araştırılmasında kullanılamazlar.
Nükleus
ya
da
kromozomlar
incelenecekse asit fiksatifler çok kullanılır. Aseton, fornolin ve glutaraldehit en az denaturasyona neden
olduklarından ve enzimleri de iyi koruduklarından enzim etkinliğini araştırmada kullanılır.
Yapılarına Göre Fiksatifler *****
1. Fiziksel Fiksatifler: Bu fiksatifler hücre veya dokuya ya düşük ya da yüksek sıcaklıkta uygulanır.
Düşük sıcaklıkta uygulanan fiksatör organizmayı dondurur. Bu suretle doku ve hücredeki proteinler
çöker ve pıhtılaşmaya uğrar. Yüksek sıcaklıkta ise materyal su veya alkolde kaynatılır. Fiziksel
fiksatiflere desikasyon (kurutma) da dahil edilebilir. Bu işlem genellikle protislerde yaygın olarak
kullanılır.
2. Kimyasal Fiksatifler:
I.
Madensel Fiksatifler:
 Madensel Tuzlar (Bikarbonatlar): Genellikle Stronsiyum ve Çinko bikarbonatları
kullanılır. Bu tuzlar bazik özellik gösterirler. Baryum, Kalsiyum, Bakır bikarbonatlarında
mitoz bölünme için iyi bir tespit maddesidir.
Bu çözeltilerin PH’ ı 4,2’ nin üzerinde olursa sitoplazma iyi tespit edilir. PH’ı 4,2’ nin
altında ise çekirdek daha iyi tespit edilir.
Civa klorür, Platin klorür, Uranyum nitrat, Sodyum florür tespit özelliği olan diğer
madensel tuzlardır.
 Madensel Asitler:
 Kromik Asit: Kırmızı kristaller halindedir. Dokuyu oldukça iyi sertleştirse de dokuda
büzülmeye ve sitoplâzmada vakuolleşmeye neden olur. Saf suda % 1’ lik çözeltiler
halinde kullanılır. Başka maddelerle de kullanılabilir.
 Ozmik Asit (Ozmiyum tetra oksit): Sarımsı kristaller halindedir. Açıkta bırakıldığı
zaman çabuk buharlaşır. Buharı toksik özellikte yani zehirleyici özelliktedir. Hücreleri
çok hızlı bir şekilde öldürür. Sitoplâzmayı iyi tespit eder. Çekirdeği ise tespit etme
özelliği yoktur.
II.
Organik Fiksatifler:
 Organik Asitler:
 Asetik Asit: Hücre içine çok çabuk girer ve nükleusu iyi tespit eder. Renksizdir. % 1’
lik çözeltileri kullanılır. 17 OC’ nin altında katı olduğundan Glasiyal Asetik Asit adını
alır. Tek başına kullanıldığı zaman sitoplazmayı iyi tespit etmez. Mitokondrileri çözer
veya eritir. Dokularda şişmeye neden olur. Bunun içinde genellikle alkolle birlikte
kullanılır. Bu özelliği fiksatif olarak kullanılan diğer kimyasalın dokuda neden olduğu
büzülmeyi önlemesi bakımından istenen bir durumdur.
 Pikrik Asit: Sarı renkli kristal halindedir. Su veya alkoldeki doymuş çözeltileri
kullanılır. Çözeltileri genellikle soğuk suyla hazırlanır. Hücre içine geçişi yavaştır.
Dokunun çok fazla büzülmesine neden olur. Bu yüzden tek başına ender kullanılır.
Asetik Asitle kullanılırsa bu etki önlenebilir. Lipitleri eritmez, karbonhidratları tespit
etmez, glikojen için çok iyi bir fiksatiftir.
 Organik İndirgeyiciler:
 Metil Alkol: Frotisler için iyi bir fiksatiftir. Buharı göz için zararlı etkiye sahiptir.
 Etil Alkol: Sadece saf halde iken iyi bir fiksatiftir. Dokuların fazla suyunu almak için
kullanılır. Sinir sisteminde çok etkilidir. Frotisler için yaygın kullanılır. Yağları çözer,
glikojeni çöktürür, sitoplazmayı çok iyi tespit eder.
LABORATUVARDA MUTLAK (SAF) ALKOL HAZIRLANMASI
Bunun için Bakır Sülfat (CuSO45H2O) kullanılır. Rengi cam göbeği mavisi rengindedir. Bakır Sülfat
kristallerinin buharlaşması için porselen bir kap içine konarak kristal suyun buharlaşması sağlanır.
Buharlaştığında kil rengine döner. Bakır Sülfat tozu aynı kapalı bir cam kap içine konulup içine % 96’ lık
Etil Alkol ilave edilir. Bir süre bekletilerek mutlak alkol elde edilir. Elde edilen alkolün saflığı % 99’ dur.
Fiksatiflerle Çalışırken Dikkat Edilmesi Gereken Kurallar
1-Parçanın fiksatifin yüzünde kalmamasına veya kaba yapışmamasına dikkat edilmelidir.
2-Parça arasıra fiksatif içinde çalkalanmalıdır.
3-Madeni araçların (Pens,bistüri,jilet...vb.) fiksatife batırılmaması gerekir. Çalışma sırasında camdan
yapılmış bir spatula veya iğne kullanılmalı. Eğer yoksa madeni araçlar fiksatife batırıldıktan hemen sonra
suyla yıkanmalıdır.
4-Tespit edilecek parçaların bulunduğu kaplar güneşte bırakılmamalıdır.
Yıkama: Tespitten sonra materyalin hemen yıkanması gerekir. İyi yıkanmayan materyal, iyi kesilmez ve iyi
boyanmaz. Yıkama işleminde Saf su tercih edilir. Yıkanacak olan materyal suyun rengini değiştirir. Yıkama
suyun rengini değişmeyene kadar işlem devam eder. Bazı fiksatiflerden sonraki yıkama işlemi alkolle
yapılır. Örnek: Bovin fiksatifi...gibi.
3. Dehidrasyon (Doku ve Hücredeki Fazla Suyu Alma): Suyunu alma işlemi; alkol serilerinden
geçirilerek yapılır. Alkol banyolarının süresi materyalin büyüklüğüne göre değişir. 5 milim kadar olan
materyaller için 20-30 dakika yeterlidir. Dehidrasyonda diğer önemli bir konu kullanılan fiksatife
göre alkol serilerinin başlangıç derişimlerinin değişmesidir.
*******
Sulu Fiksatif
Alkollü Fiksatif
Saklama Ortamı
__________ı______________ı______________ı__________________ı________ı__________
%35
%50
%70
%95
%100
Eğer fiksatif alkol ile hazırlanmış ise alkol serisi %95, su ile hazırlanmış ise %35-%50’ lik alkolden
başlayarak yapılmalıdır.
*Dehidrasyon için en çok kullanılan etil alkoldür. Bundan başka metil alkol, butil alkol ve amil alkol de
dehidrasyon işlerinde kullanılabilir.
4. Saydamlaştırma: Suyu tamamen alınmış materyal bir takım sıvılara konularak saydamlaştırılır.
Mikroskopta daha iyi bir görüntü elde etmek için yapılır. Saydamlaştırma için sedir yağı, ksilol,
toluol, metil benzoat ve kreazot kullanılır. Saydamlaştırma sırasında kullanılan bu maddeler
bulanık bir renk oluyorsa dokuda su kalmış demektir. O zaman kesitlerimizi tekrar %100' lük alkole
almamız gerekir.
 Ksilol: Mutlak alkolden alınan materyal ksilolde bekletilir. Saydamlaşan madde ksilol kabının dibine
çöker. Bekleme süresi çok uzun olmamalıdır. Aksi takdirde materyal gevrekleşir, kolay kırılır ve
kesit alınması zorlaşır.
 Toluol: Ksilol gibi kullanılır.
 Metil Benzoat: Çok iyi şeffaflaştırma yapar. Ksilol ile birlikte kullanılmamalıdır. Saydamlaştırma
işlemi 12-24 saat arasında değişir.

Sedir Yağı: Ksilol ve Toluol' e oranla dokulara daha yavaş nüfus eder. Dokularda sertleşme meydana
getirmez. Bu madde ile saydamlaştırma yaptıktan sonra materyale parafin emdirilmesinde başarılı
sonuç elde edilmesi için sedir yağının dokudan tamamen uzaklaştırılması gerekir.
5. Materyalin Parafine Yatırılması ve Parafin Blokların Hazırlanması:
Suyu alınmış ve saydamlaştırılmış materyallerin parafin bloklara alınmasından önce parafin
banyolarından geçirilmeleri gerekir. Amacımız bu işlemler sonucunda parafinin dokuların içine iyice
nüfus etmesi sağlanmış olur. Parafin banyoları küçük kaplar içinde etüvde yapılır. Kullanılacak aletlerin
de etüvde sıcak bir durumda bulundurulması gerekir. Parafin banyoları aşağıdaki sıra dahilinde yapılır.
a) Materyal eşit olarak hazırlanan ksilol + parafin karışımına konur. ( 1 saat bekletilir)
b) I. parafin banyosu (hiç kullanılmamış parafinden hazırlanır) (1-2 saat bekletilir)
c) II. parafin banyosu (1-2 saat bekletilir)
d) III. Parafin banyosu (1-2 saat bekletilir)
Materyal parafin banyolarından sonra bloklara alınır. Parafin blokları kesmeye yarayan alete
mikrotom denir. Çeşitli amaçlara uygun mikrotomlar geliştirilmiştir. Örn: El mikrotomu, kızaklı, ultra,
döner, dondurma mikrotomu...vb gibi. Mikrotom bıçakları; her iki yüzü düz, bir yüzü düz, bir yüzü düz bür
yüzü iç bükey veya her iki yüzüde iç bükey olacak şekildedir.Parafinli ve dondurma kesitleri için iki yüzü
düz bıçaklar kullanılır.
Blok almada madeni çerçeveler, kağıt kaplar veya porselen kaplar kullanılabilir.Blok kabının dibine
sıvı parafinden bir miktar dökülür. Hafifçe üflenerek donması sağlanır. Etüvden çıkarılan materyal bu
yüzeye yavaşça yerleştirilir ve üzerine erimiş parafin dökülür. Bu işlemden sonra blokların soğutulması
gerekir. Kendi haline donmaya bırakılan parafin kristalleşir ve kesilmez. Bu çabuk dondurma işlemini
sağlamak için blok içinde parafin üst yüzeyi üflenerek hafifçe dondurulur. Daha sonra içinde soğuk su
bulunan bir kaba dikkatli bir şekilde batırılır. Böylece parafinin kristalleşmesi engellenmiş olur.
6. Blokların Kesilmesi ve Kesitlerin Lamlara Aktarılması:
Hazırlanan blok, jiletle parafinin fazlası alındıktan sonra mikrotomla kesilmeye hazır hale getirilir.
Mikrotomun blok monte edilecek kısmına kesme ayarı 3-8 mikrom olacak şekilde ayarlanır ve kesmeye
başlanır (1 mikron=10-6 metre).
Mikrotom ile Kesmede Ortaya Çıkabilecek Bazı Problemler:
I. Eğer parafin kesitler düz bir şekilde çıkmıyor ise;
*Parafin blok yüzünün alt ve üst kenarları birbirine veya bıçak yüzüyle paralel değildir.
*Bıçağın kesici yüzü düz değildir. Bıçak yüzünün başka bir kısmı denenir.
II. Eğer parafin kesitler oluşmuyor ise ve her kesit teker teker kopuyorsa;
*Bıçak körelmiş olabilir (Bıçak yenilenmeli veya bilenmeli)
*Bıçak yanlış eğime sahiptir. Eğimi yeniden ayarlanmalı.
III. Materyal kırılıyor veya kesit içinden çıkıyor ise;
*Dehidrasyon veya saydamlaştırma iyi yapılmamıştır. (Parafin eritilerek yeniden suyu alınır veya
şeffaflaştırılır.)
*Materyal çok sert olabilir. Yumuşatmak için %70 alkol ve suda bir miktar bekletilir.
Kesitleri lam üzerine aktarmadan önce lam üzerine yapıştırıcı sürmek gerekir. Daha sonra
mikrotomdan elde edilen kesitler yumuşak bir fırça ile lamlara aktarılır. Lamlarda parafinin erime
derecesinden etüve veya ısıtıcı plaka üzerine konur. Böylece parafin erir ve kesitlerin lam üzerine iyice
yapışması sağlanır. (Parafinin erime sıcaklığı 55-65 oC dir)
Yapıştırıcı Madde: Eşit hacimdeki gliserin ve yumurta akı karıştırılır ve filtre edilir. Bozulmaması için
timol kristalleri konur.
HAUPT Yapıştırıcı: Jelatin (1 gr), Saf su (100 ml) 30 oC de karıştırılır. Üzerine gliseril (15 ml) ve fenol
kristalleri konarak filtre edilir.
NOT: Fenol kristalleri toksik maddedir.
7. Kesitlerin Boyanması:
Hücre ve dokuların incelenmesinde önemli bir konuma sahiptir. Tespit edilmemiş hücre ve dokular
genellikle boya tutmazlar. Boyamanın amacı; hücrenin iç yapıları ile dokuların bünyesinde bulunan çeşitli
yapıların özelliklerini açığa çıkarmaktır. Boyama sırasında fiziksel ve kimyasal reaksiyonlar birlikte cereyan
eder. Hücrelerin bazı kısımları asit, bazı kısımları alkali gibi davranmakta, asit olan bölgeler katyonlarla,
alkali olan bölgeler ise anyonlarla bağlanma özelliği gösterirler. Boyamanın özelliği şu üç etkene bağlıdır;
a) Boyanın kuvveti
b) Doku proteinlerinin ve boyanın iyonlarına ayrılma oranı
c) Boya eriyiğinin ve doku proteinlerinin PH' ı
Boyalar iki sınıfa ayrılır:
A-Bitkisel kökenli boyalar: İkiye ayrılır
a) Doğal Boyalar
b)Sentetik Boyalar
Doğal Boyalar:
1-Bitkisel Kökenli Boyalar: Safran, Hematoksilin, İndigo, Orsein ve Turnusol
2-Hayvansal Kökenli Boyalar: Koşnil ve Karmin
Doğal boyalar arasında koşnil, karmin, hematoksilin, safran, çivit (indigo), orsein ve turnusol
sayılabilir
*Koşnil: Boyası bazı bazı dikensiz kaktüs türleri üzerinde yaşayan Cococus cocti adlı kırmızı hemipter bir
böceğin dişilerinden (yumurta ve yağ dokularından) elde edilir.
*Karmin: Boyası koşnilin bir tuzla kaynatılması sonucu oluşturulan çökeltidir. Bu haliyle suda erimez,
kullanılacağı zaman eriyebilecek bir bileşiğe dönüştürülür. Bu boya parafinli kesitlerde kullanılmaz. Küçük
dokular ve embriyolojik total boyalarda çok kullanışlıdır. Karminin asetik asitle karışımı çizgili kası
boyamada idealdir.
*Hematoksilin: Histolojide en önce kullanılmaya başlanan ve en çok kullanılan boyaların başında gelir.
Vatanı Güney ve Orta Amerika ile Batı Hindistan olan ve akasya ağacına çok benzeyen Bakkan ağacının sert
gövdesinden elde edilir. Elde edilmesi çok zor ve uzun zaman aldığından en pahalı boyalar arasındadır.
*Safran: Crocus sativus bitkisinin stigmalarından, İndigofera bitkisinden, orsein ve turnusol ise bazı
likenlerden elde edilir.
Boyaların Hazırlanması:
*Aseto-karmin: (Karmin: 0,5 gr, Asetik asit glasiyal 45 ml, saf su 35 ml)
Asetik asit saf su ile karıştırılır. Üzerine karmin ilave edilir. Karışımı ağzı dar boyunlu bir cam kap
içine konur ve 1 saat çok hafif kaynatılır. Kaynama sırasında taşmanın önlenmesi için cam kaba bir mantar
aracılığıyla uzun bir cam boru takılarak boruyu devamlı soğutmak gerekir. Karmin soğuduktan sonra
süzülür. Süzgeç kağıdında kalan kalıntılar yeniden kullanılabilir.
*Alkollü Hematoksilen: (Hematoksilen 1 gr, %100' lük alkolden 70 ml, saf su 30ml)
Hepsi birbirine karıştırılarak yapılır.
Mordanlama: Bazı boyaların dokuyu boyaması güç olduğundan bu dokulara boya karşısında kimyasal
olarak bir aktiflik kazandırmak gerekir. Bu işleme Mordanlama denir. Bu işlem için kullanılan maddelere
de Mordanlayıcı denir. Genel olarak mordanlayıcı madde olarak Amonyum ferri sülfat kullanılır. Bu
tuzlar boyanın dokuya sıkıca tutunmasını sağlar. Boya sabitleşir ve ve dehidrasyon sırasında rengi açılmaz.
Sentetik Boyalar:
Sentetik boyalarda boyanın kimyasal yapısı bilindiğinden herhangi bir organele veya hücresel yapıya
özel olan boya seçilerek aynı lam üzerinde iki veya daha fazla boyanın peşpeşe kullanılmasıyla çeşitli hücre
kısımları farklı renklerde boyanabilir.
Metakromazi: Tiazin grubundan bazı bazik boyalar bazı hücre yapı taşlarını boyanın asıl renginden farklı
boyarlar. Bu özelliğe metakromazi denir. En çok kullanılan metakromazi boyalar; metilen mavisi, metil
moru, kristal moru, touluidin mavisi, selestin mavisidir. Bunlardan her biri dokuyu kırmızıya çalan erguman
rengine boyar.
*Giemsa Boyası: (Giemsa boyası:1 gr, Gliserol:66 ml, Metil alkol:66 ml)
Önce giemsa boyası ile gliserolü 60 OC deki etüvde 2 saat karıştırılmalıdır. Sonra üzerine metil alkol
ileve edilir. Kullanılacağı zaman ana çözeltiden (ana çözelti:10 ml, saf su:90ml) ilave edilerek giemsa boyası
elde edilir.
8. Preparatın Monte Edilmesi:
Boyama işlemi bittikten sonra kesitler alkol serilerinden geçirilir. Seriler düşük konsantrasyonda
başlayıp mutlak alkole kadar çıkmalıdır. Alkol serilerinden geçen preparat son olarak ksilole konur. Lamdaki
kesitler üzerine 1 damla yapıştırıcı damlatılır. 45 OC' lik açıyla hava kabarcığının kalmamasına dikkat
edilerek kapatılır. Kapatılan preparat 30OC' deki ısıtıcı bir plak (hot-plate) veya etüvde bekletilerek
yapıştırıcının kuruması sağlanır.
Lamelle Kapatma Ortamları: Lamellerin kapatılması doğal bir reçine veya sentetik bir ortamda yapılır.
Doğal reçineler içinde en çok Kanada Balzamı kullanılır.(Abies balzamea adı verien çamdan elde edilir.).
Sentetik yapıştırıcılar ise; Depex, distren,coedax sayılabilir.
Lam Buzlandırma Eriyiğinin Hazırlanması (Piza Eriyiği):
BaSO4...............................15 mg
NH4F.................................15 mg
(NH4)SO4..........................10 mg
oksalik Asit.......................8 mg
Gliserin.............................32 ml
Saf su................................12 ml
Başka bir kapta giliserin ve saf suyu karıştırıp sonra plastik şişeye ilave ederek katı maddelerin
karıştırılarak erimesi sağlanır. Hazırlanan karışım bir hafta bekletilir. Bir hafta sonra fırça ile lamın ucuna
sürüp oda sıcaklığında 1 saat bekletip çeşme suyunda yıkanır. Böyleve lamın bir ucunun buzlu olması
sağlanır.