Prof. Dr. Bayram YILMAZ

Endokrin Bozucular ve
Biyosidal Ürünler
Prof. Dr. Bayram Yılmaz
Yeditepe Üniversitesi
Tıp Fakültesi
Fizyoloji Anabilim Dalı
YEDİTEPE ÜNİVERSİTESİ
Istanbul
“Endocrine Disrupters”
Endokrin Bozucu:


“Xenoestrogens”
Organizmada bir hormonun

sentez

sekresyon

taşınma

reseptöre bağlanma ve etkisi ile

eliminasyonunu
etkileyen kimyasal maddedir
EPA Definition: Exogenous agents that interfere with the synthesis,
secretion, transport, binding, action or elimination of natural
hormones in the body that are responsible for the maintenance of
homeostasis, reproduction, development and/or behavior”
Endocrine Disrupting Chemicals (EDCs)
Endocrine
Disruptors
Industrial
solvents
& lubricants
PCB
Dioxins
PBB
Organo
chlorine
pesticides/
Fungicides
DDT
Methoxychlor
Chlorpyrifos
Atrazine
Vinclozolin
Plastics/
Plasticizers
Bisphenol A
Phthalates
Metals
Cadmium
Lead
Mercury
Uranium
Arsenic
Pharma
ceuticals
Natural
DES
& Pills
Phytoestrogens
“Persistent Organic Pollutants”
(POPs)
(2001, İsveç)
PCBler
Dioxin (TCDD)
Hekzaklorobenzen
Aldrin
DDT
“Dirty Dozen”
Dieldrin
Endrin
Klordan
Heptaklor
Mirex
Toxafen
Furanlar
Diethylstilbestrol (DES): Sentetik bir östrojen
"Recommended for routine prophylaxis in
ALL pregnancies... 96 per cent live
delivery with desPLEX in one series of
1200 patients - bigger and stronger
babies, too. No gastric or other side
effects with desPLEX - in either high or
low dosage." [1957]
► Perinatal uygulamalardan sonra
görülen genital sistem neoplazileri
► ABD’de 1971-74 arası DES’e
maruz kalan 1-4 milyon çocuk…
(New Engl J Med 1971)
Dioxin Kontaminasyonu
• Vietnam Savaşı sırasında 70 tondan fazla
Dioxin (TCDD, Agent Orange) Güney
Vietnam’a sprey şeklinde atıldı.
• Bu yeryüzünde görülmüş en büyük Dioxin
kontaminasyonudur.
• 1962-1971 arasında kullanılan bu
maddenin etkileri bugün hala Vietnam
nesillerini etkilemeye devam etmektedir.
• Kontaminasyona maruz kalan Amerikan
askerlerinin çocuklarında da yaygın lösemi
vakaları görüldüğü bildirilmiştir.
POLİKLORLU BİFENİLLER (PCB)
► Kimyasal yapıları
► Üretim ve kullanım
► Kontaminasyon alanları
345-34, Koplanar PCB
► Endokrin Bozucu Etkileri
3
2
ortho
2'
meta
3'
4' para
4
5
6
6'
ortho
5'
meta
246-4OH-3, Nonplanar PCB
PCBlerin Kullanıldıkları Yerler
 Kimyasal ve fiziksel yapı bakımından oldukça stabil (nonflammable) maddeler olduklarından,
 Sanayide başlıca; kapasitatör, transformer, hidrolik
pompa, matbaa mürekkebi, boya, pestisit ve izolasyon
sıvılarının yapımında
 Yanmayı ve enerji kaybını önlemek için yüksek gerilim
hatlarının izolasyonunda da kullanıldılar.
POPs: Besin Zinciri ve İnsana Taşınma Yolları
 POPs başlıca sindirim yoluyla insan
vücuduna geçer.
 POP kontaminasyonu olan sulardan
avlanan balık ve diğer hayvanların
tüketilmesiyle vücuda girerler.
 Deri yoluyla emilim
 Anne sütüyle yeni doğana geçerler.
 Volatilize olma özellikleri ?
 Özellikle yağ dokusunda birikme eğilimi
gösterirler
Türkiye’de Genel Kimyasal Kirlilik
Akın AN ve Önsan Zİ’den (www.react.boun.edu.tr)
► Nörotoksik
► Kanserojenik
► İmmün sistem üzerine
► Kardiyovazküler (aterosklerozis)
► Reprodüktif etkiler …
Endokrin Bozucu Etki Mekanizmaları
► Östrojenik
► Anti-östrojenik
► Androjenik
► Anti-androjenik
► Tiroid sentez ve sekresyonu üzerine etkiler
Dioxin, PCBler ve Pestisitlerin Diyabet ile ilişkisi (?)
► Pankreasta b-hücrelerinin toksinlere olan hassasiyeti
► Vietnam’da Dioxin’e maruz kalan ABD’li askerlerde yüksek
diyabet sıklığı
► Çalışma ortamında PCB ve pestisitlere maruz kalanlarda diyabet
► Bunların kan örneklerinde rastlanan yüksek dioxin ve PCB
miktarı
EDCs & Thyroid Function

Iodine uptake inhibitors

TPO inhibitors (iodine organification)

Thyroid hormones signaling
Pickford DB. (2010) Screening chemicals for
thyroid-disrupting activity: A critical comparison
of mammalian and amphibian models.
Crit Rev Toxicol, 40: 845-92.
Östrojenik ve Antiöstrojenik Etkiler
 Koplanar PCBler
antiöstrojenik etkilerden
 Nonplanar PCBler
östrojenik etkilerden
sorumludurlar
 Aryl Hydrocarbon
reseptörü ve antiöstrojenik
aktivite
TCDD (Dioxin)
 E2 reseptörü ve
östrojenik aktivite
Östradiol
Aryl Hydrocarbon (veya TCDD) Reseptörü
 Aryl Hydrocarbon reseptörü, sitoplazmada bulunan ve
DNA’ya bağlanma özelliği olan bir proteindir.
 Dioxin ve benzeri kimyasal maddeler bu reseptöre bağlanarak
etkilerini gösterirler.
TCDD
Gen
ekspresyonu
AHR
mRNA
Protein CYP 450
EDC – Tarama (Analiz) Yöntemleri

İn vivo metotlar

Hershberger assay

Uterotropik assay

Erkek rat pübertal gelişim deneyi

Dişi rat pübertal gelişim deneyi

Amphibian metamorphosis assay


Hipotalamo-Pituitary-Tiroit eksen analizi

Metamorfik matürasyon analizi
Balık HPG eksen analizleri
In vivo modeller
Vitellogenin
 Morfolojik parametreler (uterus,
ovaryum, testis, prostat ağırlığı vb)
 Histolojik incelemeler
 Biyomarker analizleri (c-fos, laktoferrin,
vitellogenin ekspresyonu vb)
 Hormon analizleri
Hendry et al, 2002; Exp
Biol Med, 227: 709-723.
Hershberger Assay
Vesicula seminalis
İdrar kesesi
Prostat
Testis
Epididimis
Penis
Penis
M. Levator ani
M. Bulbocavernosus
Cowper bezi
Uterotropic Assay
 İmmatür Uterotropic Assay
 20 günlük ratlar
 Üç günlük s.c. uygulama
 4. gün dekapitasyon
 OVX Uterotropic Assay
Kontrol (x20)
 Bilateral ovarektomi
 İki hafta iyileşme
 7 gün ilaç s.c. Uygulama
 24 saat sonra Dekapitasyon
Östradiol (x20)
Uterotropic Assay
Immatür
sıçanlarda
uterus
morfolojisi; Çözücü (a), Östrojen (b),
Aroclor
(10mg)
(c),
PCB
180
(10mg) (d), Aldrin (1mg) (e), Aldrin
(10mg)
(f),
Mirex
(10mg)
(g),
Endosulfan (1mg) (h). Östrojen
grubunda
histolojik
görülen
(b)
değişiklik
belirgin
uterus
boyutlarında artış, östrojen kadar
olmamakla
beraber
sırasıyla
endosulfan (h), PCB (d) ve Aroclor
(c) gruplarında da uterus boyutları
arttı. Bar 110 µm.
TÜBİTAK Projesi (104T240)
EDC – Tarama (Analiz) Yöntemleri

İn vitro metotlar

Östrojen proliferasyon deneyi

Östrojen reseptör bağlanma deneyi

Androjen reseptör bağlanma deneyi

Steroidogenez deneyi (Androjen)


testosteron sentezinin uyarılması veya baskılanması
Steroidogenez deneyi (Östrojen)

Östrojen sentezinin uyarılması veya baskılanması

Aromataz aktivite testi

Reporter Gene Assay
MCF-7 Focus Assay
MCF-7 meme kanseri hücreleri

E2 reseptörleri taşırlar

Başka hücre tipleri (HTB 133)
120
Foci/cm2 (Percent Maximum E2)

100
80
E2
60
40
20
0
0
-13
-12
-11
-10
-9
Log Molarity
-8
-7
-6
E2 Focus Assay’de Test Ettiğimiz Pestisitler
Aldrin
Dieldrin
Carbaryl
o,p DDE
Heptachlor
p,p DDE
Heptachlor Epoxide
o,p DDD
Lindane
p,p DDD
Methoxychlor
o,p DDT
Mirex
p,p DDT
a-BHC
Malathion
b-BHC
Parathion
d-BHC
Ivermectin
Endosulfan
Toxaphene
Toxaphene’in Antiöstrojenik etkileri
Östrojenisite Testi
E2 Reseptör Bağlanma Deneyi
Anti-Östrojenisite Testi
Tam Hücre E2 Reseptör Bağlanma Deneyi
Atrazine Induces Aromatase Enzyme
Atrazine is a potent endocrine
disruptor that both chemically castrates
and feminizes male amphibians

It also disrupts normal gonadal
development and feminizes the gonads
of developing males.”


Hayes et. al., 2006
Reporter Gen Assay
Anti-Estrogenic Effect of PCB 138 in MVLN Cells
Anti-Estrogenic Effect of PCB 138 in MVLN Cells
7
14
12
Arbitrary Units
*
5
4
3
*
2
*
10
8
*
6
*
4
2
1
0
0
Control
Control
DMSO
0,2 µM
1 µM
5 µm
10 µM
DMSO +
0,2 µM + 1 µM + E2 5 µM + E2 10 µM +
E2 10-8 M E2 10-8 M
10-8 M
10-8 M
E2 10-8 M
Anti-Estrogenic Effect of PCB 138 in H4IIE Cells
9
*
8
Arbitrary Units
Arbitrary Units
6
7
*
6
5
4
*
3
2
1
0
Control
DMSO
0,2 µM
1 µM
5 µm
10 µM
Reporter Gen Assay
Üsküdar in MVLN Cells
Arbitrary Units
2,5
2
1,5
1
0,5
0
Control
1 µl
5 µl
10 µl
20 µl
50 µl
Üsküdar in H4IIE Cells
Arbitrary Units
2,5
*
2
1,5
1
*
*
5 µl
10 µl
*
0,5
0
Control
1 µl
20 µl
50 µl
Reporter Gen Assay
Arbitrary Units
Dilderesi in MVLN Cells
4,5
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
*
*
5 µl
10 µl
*
*
20 µl
50 µl
*
Control
1 µl
Dilderesi in H4IIE Cells
1,4
Arbitrary Units
1,2
*
*
1
0,8
0,6
0,4
0,2
*
0
Control
1 µl
5 µl
10 µl
20 µl
50 µl
Yesildaglar N, Yildirim G, Attar R, Karateke A, Ficicioglu C, Yilmaz B.
Fertility Sterility, 2010; 93:1722-4.
Dioxin Reporter Gen Assay
140
(pg 2,3,7,8-TCDD BEQ/g fat)
120
100
80
60
40
20
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55

AHR (Dioxin) reseptör yolağı

EU 2011 gıda yönetmeliğine göre dioksin ve dioksin-benzeri
Subjects
maddeler için süt ve yağ gibi besinlerde maksimum değerler
sınırlanmıştır (2.5 ve 5.5 pg/g yağ).

Reporter gen assay – Referans metot (EU 2012, #252).
Genotoksisite Tarama Testleri

Ames test

Mutagenicity test - Chinese Hamster Ovary
(CHO) cell line

Rodent micronucleus test

Comet Assay

DNA methylation techniques

Sodium bisulfite sequencing
Comet Assay ile Genotoksisite Analizleri
Meme Epitel Hücrelerinde Genotoksisite Analizleri
Bisphenol A, Nonylphenol ve
Phythalate Esterleri
Plastiklerde bulunan kimyasal maddeler
 Bisphenol A: Sertleştirici olarak plastiklerin yapımında
kullanılırlar (Polikarbonat, epoxy resin gibi)
 Sıcak ortamda sıvılara difüze olur
 Östrojenik ve anti-androjenik etkiler
 Phythalate esterleri: Yumuşatıcı (elastikleştirici) olarak
plastiklerin yapımında kullanılırlar
 Nonylphenol: Yumuşatıcı (elastikleştirici) olarak plastiklerin
yapımında kullanılırlar
www.epa.gov
Bisphenol A
•
•
Short half-life, but widespread use in the production of
plastics and epoxy resins
•
drink containers (milk, water, infant bottles)
•
tinned food, bottle tops
•
Medical devices, dental sealants, electrical equipment,
CDs, water supply pipes
Leaches from plastic mainly under heat condition
Kristiansen C. Endocrine News, 2007
Bisphenol A
Diamenti-Kandarakis E. Endocrine Reviews, 2009
•
Produced at a rate of 800 million kg annually in US alone
•
92% of Americans have BPA in their urine, mainly
children and adolescents
•
Highly concentrated in placenta, the amniotic fluid and
breast milk
•
Exposure mainly from ingestion, but also through the skin
or inhaled household dust
•
? Safe daily intake: 50µg/kg body weight/day
•
AB ile paralel olarak, biberon gibi bebek beslenmesinde
kullanılan polikarbonat malzemelerin üretiminde BPA
kullanımı Türkiye’de yasaklandı.
Endokrin Bozucuların
İnsanlardaki Etkileri
Endokrin Bozucuların İnsanlardaki Etkileri
 Erkeklerde
Hipothalamus
GnRH
 Sperm sayısında azalma ve testis kanseri
 Kriptorşidizm
+
 Erkek bebek doğum oranında azalma
 Kadınlarda
EDC
 Meme ve rahim kanseri
Ön Hipofiz
LH and FSH
+
 İnfertilite problemleri
 Püberte problemleri
Gonad
 “Obesogens” : Lipid metabolism and Adipogenesis
 “Endocrine Disrupter” çalışmalarının 20. yılına girilmiş olmasına
rağmen, hangi kimyasal maddelerin ne tür endokrin bozukluğa
neden olduğu konusunda henüz tam uzlaşma sağlanamamıştır.
Perinatal ve erken evre maruziyet ve doz

Kimyasal kirleticilere maruz kalınan
dönem

Doz ve süre

Kongenital ve gelişim bozuklukları
Önlemler & Öneriler …
 “Sağlıklı” sanayileşmeyi teşvik etmek
 Kullanımı yasaklanmış maddeleri denetlemek
 EDC için yeni su arıtma teknolojileri geliştirmek
 Gebelik öncesi ve sırasında çevresel östrojenlerden sakınmak
 Kendini ve çocuklarını kimyasal kirleticilerden uzak tutmak
 Plastik kaplarda sıcak yiyecek ve içecek tüketiminden sakınmak
 “Yerli” gıda maddesi üretimini ve tüketimini teşvik etmek
EDCs & Multidisciplinary Approach