Farelerde Koku Uyaranının Öğrenme Bellek Süreci Üzerine Etkisi ve

FARELERDE KOKU UYARANININ ÖĞRENME BELLEK SÜRECĠ
ÜZERĠNE
ETKĠSĠ
VE
BU
SÜREÇTE
SEROTONĠN
5-HT3
RESEPTÖRLERĠNĠN OLASI KATKISI
Aslı Irmak BİRANCI, Ayşe GÜZEL, Seda KOZAN, Tuğba KOCABAŞ
Danışman: Remzi Erdem
ÖZET
Evrimsel olarak en eski nöral işlevlerden olmakla birlikte, en az anlaşılmış duyu olan
kokunun öğrenme-bellek (Ö-B) süreci üzerine etkileri tam olarak bilinmemektedir.
Literatürde Ö-B sürecinde postsinaptik membran potansiyellerinin uzun erimli
potansiyalizasyon (LTP) ile modifiye edilmesinin rol oynadığı öne sürülmüştür. Bu
çalışmada, koku uyaranının LTP benzeri bir süreç yaratacağı ve sonuçta Ö-B işlevini
etkileyeceği varsayımları kuruldu. Bu amaçla, farelerde uzun süreli kokusal uyaran
uygulamasının uzaysal Ö-B sürecine etkisi araştırıldı. Ayrıca, serotonin 5-HT3 reseptörlerinin
bu süreçteki rolü araştırıldı.
Araştırmamızda 25 adet erkek Swiss albino fare (yetişkin, 38.5±3.80g) kullanıldı. Öncelikle,
oluşturulacak gruplar arasında uzaysal Ö-B yeteneği açısından homojen dağılımı sağlamak
amacıyla kullanılan Barnes Labirenti (BL) düzeneği ile uzaysal Ö-B süreci değerlendirildi.
Beş ardışık gün boyunca yapılan BL uygulamasının ardından, fareler, elde edilen öğrenme
eğrilerine göre “tabakalı rasgele örnekleme yöntemi” ile 4 gruba ayrıldı. Gruplar, Koku (n=7;
12 adet doğal koku, 10 dakika/koku, 2 saat/gün, 14 gün), Kontrol (n=6) ve bunların
Tropisetron (30 µg/kg/gün, s.c., 14 gün) uygulanan eşlenikleri (herbiri için, n=6) şeklinde
oluşturuldu. İlaç uygulanmayan gruplara aynı yolla, eş hacimde serum fizyolojik (300 µl/gün,
14 gün) uygulandı. BL verileri tüm gruplarda öğrenme sürecinin geliştiğini gösterdi.
Ardından, koku uyaranı ve/veya tropisetron uygulamalarının uzaysal Ö-B sürecine etkisi
Morris Su Labirenti (MSL) düzeneği ile değerlendirildi. Ortalama OSH olarak ifade edilen
öğrenme-bellek verileri, latans (sn), motor aktivite (yüzme hızı; cm/sn), kümülatif yüzme
mesafesi (cm), hedefe anlık uzaklık (cm) gibi ölçütlerin saptanmasına olanak veren ve
Üniversitemiz Mühendislik Fakültesi Biyomedikal Mühendisliği Bölümü ile ortaklaşa
geliştirilen MatLab tabanlı bir görüntü alma, işleme ve değerlendirme yazılımı ile incelendi.
GĠRĠġ VE GENEL BĠLGĠLER
Koku, duyular arasında en az anlaşılmış olanıdır ve bu konudaki bilgiler sınırlıdır. Son
araştırmalara göre, her koku için özgül bir reseptör kullanıldığı ve aynı zamanda farklı
reseptörlerin eşzamanlı aktivasyonu ile de değişik koku kombinasyonlarının algılandığı
düşünülmektedir. Bu da milyonlarca kokuyu nasıl ayırt edebildiğimizi açıklamaktadır (3).
Filogenetik olarak aşağı sınıf hayvanlarda beynin koku ile ilgili bölümleri, gelişmiş olan ilk
beyin yapıları arasında yer alır ve beynin geri kalan kısmının büyük bölümü kokuyla ilgili
olan bu başlangıç bölümünün çevresinde toplanır (9). Uzaysal öğrenme ve belleğin merkezi
olarak bilinen hipokampus de olfaktör korteksin bir bölümü olarak gelişmiştir. Bu da kokunun
öğrenme ve bellek süreci ile ilişkili bir rolü olabileceğini düşündürmektedir. Hayatta kalmak
için büyük ölçüde koku duyusuna itimat eden farelerde olfaktör korteks homunculusun büyük
bölümünü oluşturur. Bu nedenle, fareleri çeşitli kokulara maruz bırakarak sinaptik ağın
yeniden yapılanmasının geliştirilmesi ve hipokampusla bağlantısının artırılarak öğrenmebellek oluşumunu olumlu yönde etkilemesi olasıdır (9).
Özellikle öğrenme sürecinin oluşumunun sinaptik güç ve plastisitedeki, yani postsinaptik
membran potansiyelindeki, uzun erimli değişimlerle modifiye edildiği düşünülmektedir (2,6).
Bu alanda temel hücresel mekanizmalardan olan LTP’nin (Long Term Potentiation),
postsinaptik nöronu presinaptik nörondan salıverilen nörotransmitterlere karşı
duyarlılaştırarak iki nöron arasında ileri iletişimi gerçekleştirdiği ve özellikle uzun dönem
hafızada rolü olduğu düşünülmektedir. Burada, son yıllarda bellek süreci ile ilgili yeni bir
yaklaşımdan söz etmek gerekir. Bu görüşe göre, sinaptik yeni yapılanma bellek sürecini
açıklamak için yeterli bir model değildir, çünkü bellek bir nöral devre özelliğidir (5).
Hem koku yolaklarının hem de hipokampusun nörotransmitter olarak yaygın biçimde
asetilkolini kullanması nedeniyle koku yolağındaki nörotransmisyon ile hipokampustaki
nörotranmisyon işlevini ayırt etmek için kolinerjik ligandlar dışında bir ajan kullanılması
düşünüldü .
Öğrenme bellek sürecine katkıda bulunan birçok mekanizmanın içinde serotonerjik sistem de
yer almaktadır. Serotonin (5-HT)’in hücre membranında yer alan bir katyon kanalı olan 5HT3
reseptörlerinin presinaptik kolinerjik etkisi bilinmektedir. Klinikte kanser tedavisine bağlı
kusmaların önlenmesinde antiemetik (bulantı kesici) olarak kullanılan tropisetron, etkisini
presinaptik kolinerjik inhibisyon yaparak gösterir. Tropisetronun 5HT3 reseptörlerini bloke
ederek öğrenme belleği olumsuz yönde etkilediği gösterilmiştir (1).
Rasyonel:
Kokunun, sinaptik yeniden yapılanmayı geliştirdiği ve hipokampusla kurulan bağlantıların
öğrenme bellek sürecini etkilediği düşünülmektedir. Ancak kokunun öğrenme bellek üzerine
etkileri hakkındaki kanıtlar kısıtlıdır. Ayrıca, klinikte antiemetik olarak kullanılan, kan beyin
engelini kolaylıkla geçen ve özellikle farelerde etkin olan tropisetronun, koku ile oluşması
muhtemel öğrenme bellek değişikliklerine etkisini araştırmak bu sürece aracılık eden
mekanizmaya yönelik bilgi sağlayabilir.
Amaç:
Farelerde koku uyaranı ve/veya tropisetron uygulamasının öğrenme bellek süreci üzerindeki
etkisini Barnes Labirenti ve Morris Su Labirenti düzeneklerinde araştırmak
Hipotez:
- Tekrarlı ve uzun süreli koku uyaranı uygulaması farelerde öğrenme-bellek işlevini artırır.
-Koku bir çevresel zenginleştirmedir.
-Tropisetron kullanımı öğrenme-bellek işlevini bozar.
YÖNTEM VE GEREÇLER
Deney Hayvanları ve Barındırma KoĢulları:
Proje kapsamındaki deneysel çalışmalara Başkent Üniversitesi Hayvan Deneyleri Etik
Kurulundan onay alındıktan sonra başlandı (DA10/04). Deney hayvanı olarak Başkent
Üniversitesi Hayvan Üretim Merkezinden sağlanan 25 adet erişkin, erkek, Swiss Albino
(38,5 0,76 g) fareler kullanıldı. Deney hayvanları, standart barınma koşullarında (12 saat
aydınlık/ 12 saat karanlık, %50 bağıl nem, 24 2 C oda sıcaklığı) standart fare yemi ve su ile
beslenerek barındırıldı. Deneyin amacına uygun olarak hayvanlara tekrarlayan koku
uygulaması yapıldı; ancak bunun dışında deneysel işlemlerin öncesinde, sırasında ve
sonrasında hayvanlarda ağrı, acı, huzursuzluk yaratabilecek her türlü uygulamadan kaçınıldı.
Deney Grupları:
Barnes Labirenti (BL) düzeneği kullanılarak 5 ardışık gün boyunca farelerin öğrenme
düzeyleri ölçüldü. Bu 5 günün latans ortalaması ve öğrenme eğrileri göz önüne alınarak
fareler tabakalı rasgele örnekleme yöntemi kullanılarak bilişsel işlev düzeyleri açısından 4
homojen gruba ayrıldı. Gruplar; 1. Grup: Kontrol grubu (K), 2. Grup: çeşitli kokulara maruz
bırakılan grup (O), 3. Grup: Tropisetron uygulanan grup (KT), 4. Grup: kokuyla birlikte
tropisetron uygulanan grup (OT) şeklinde oluşturuldu.(Tablo 1).
Tablo 1. Deney Grupları
Koku uygulaması
Yok
Var
Tropisetron uygulaması
Yok
Var
Grup 1, K (6)
Grup 3, KT (6)
Grup 2, O (7)
Grup 4, OT (6)
Barnes Labirenti:
BL, deney hayvanlarında uzaysal öğrenme ve bellek ölçümünde kullanılan bir yöntemdir.
Deneyimizde kullanılan BL, fareler için tanımlanan boyutlara uygun olarak yapılmıştır. BL,
122 cm çapındaki bir tahta plaka üzerine çapları 5 cm olan ve aralarında 9° açı bulunan 40 delik
açılması ile oluşturuldu. Bu deliklerin birinin altına bir çekmece yerleştirildi. Fareler 5 ardışık
gün boyunca, bırakılma sıraları rasgele olmak üzere, etrafı kapalı bir silindir içinde düzeneğin
tam ortasına bırakıldı. Her bir deney hayvanı için 120 saniye değerlendirme süresi tanındı.
Deney hayvanının çekmeceyi bulması durumunda, her bir deney hayvanı çekmece içinde 10
saniye bekletildi. 26. gün bellek işlevinin değerlendirmesi BL ile retansiyon deneyi yapıldı.
.
BARNES LABİRENTİ
40 delik
122 cm
Resim 1. Barnes Labirenti ölçütleri
ve çekmecenin konumu
9°
5 cm
Çekmece
140 cm
Deney Protokolü
Ġlaç ve/veya koku uyg.
BL-1
MSL-1
Ġlaç ve/veya koku uyg. Uyg. ve MSL-2
0 1 2 3 4 5 6 …………………19….………22……………..26……………….30 (günler)
ġema 1. Deney protokolü
Koku Uygulaması-1
14 gün O ve OT gruplarına 12 çeşit koku kullanılarak uzun süreli, tekrarlayan koku uygulaması
yapıldı. Her bir koku kaynağını 10 dakikada bir değiştirmek suretiyle, toplam 2 saat boyunca
kokusal uyaran uygulandı. Kullanılan koku kaynakları gülsuyu, sirke, sarımsak, kül, karanfil,
portakal, çilek, soğan, kimyon, köri, kahve, nane olarak belirlendi ve flakonlar içine konuldu.
Bu kokular sentetik değil, doğal olmaları göz önüne alınarak seçildi. K ve KT gruplarını da aynı
işleme tabi tutmak açısından, koku kaynağı içeren flakonlar yerine içi su dolu flakonlar
kullanıldı.
Morris Su Labirenti-1
Farelerde öğrenme sürecini değerlendirebilmek amacıyla daha önce tanımlanan biçimde Morris
Su Labirenti (MSL) düzeneği kullanıldı (4). Deney süresince suyun sıcaklığı 22 ± 2°C’ de sabit
tutuldu. Yerleşimi sabit kalmak üzere havuzun rasgele bir yerine su yüzeyinden 1 cm aşağıda
olacak şekilde deney hayvanlarının üzerinde durabileceği bir platform konuldu. Havuzun
etrafına 3 yöne, farelerin oryantasyonunu sağlamak için ayırt edici belirteçler (ipuçları)
konuldu. Fareler 5 ardışık gün boyunca kuzey, güney, doğu ve batı olmak üzere, dört ayrı
yönden, suya bırakılma yönleri ve sıraları farklı olacak şekilde MSL’de yüzdürüldü. Her bir
deney hayvanı için 120 saniyelik değerlendirme süresi tanındı. Deney hayvanının kaçış
platformunu bulması durumunda, oryantasyon gelişimini sağlamak için her bir deney hayvanı
kaçış platformu üzerinde 10 saniye bekletildi. Bu uygulamalarla latans, motor aktivite (yüzme
hızı, cm/sn), kümülatif yüzme mesafesi (cm), hedefe anlık uzaklık (cm) gibi ölçütlerle uzaysal
öğrenme-bellek işlevinin değerlendirilmesi amaçlandı.
MSL - 1
MSL - 2
K
24
B
D
33
cm
75 cm
G
Resim 2. MSL’deki kaçış platformunun yerleşimi ve yönler (K: kuzey, G: güney, B: batı, D: doğu)
cm
46
cm
KUZEY
Resim 3. MSL 1
uygulamasında kullanılan
belirteçler (ipuçları)
DOĞU
BATI
GÜNEY
Koku uygulaması-2
Aynı kokular 10 gün boyunca her biri 10 dakika ara ile değiştirilecek şekilde günde 2 saat
uygulandı.
Morris Su Labirenti-2
Deneyin bir önceki deneyden etkilenmemesi için platformun yeri ve belirteçler değiştirildi.
Her bir deney hayvanına değerlendirme süresi olarak 90 saniye, platform üzerinde bekletilme
süresi olarak da 30 saniye tanındı. Fareler için itici güç oluşturması amacı ile suyun sıcaklığı
(20 ± 1°C) azaltıldı.
KUZEY
Resim 4. MSL 2
uygulamasında kullanılan
belirteçler (ipuçları)
BATI
DOĞU
GÜNEY
Ġlaç Uygulaması-1
İlaç gruplarına 14 boyunca 30 µg/kg/gün/300 µl, s.c tropisetron uygulanırken diğer gruplara
da enjeksiyon stresini ekarte edebilmek için aynı protokolle 300 µl/gün, s.c, serum fizyolojik
uygulandı.
Ġlaç Uygulaması-2
Bütün gruplara 10 gün boyunca injeksiyon aynı protokolle, aynı yolla, aynı hacimde yapıldı.
Veri Toplanması ve Ġstatiksel Analiz:
Tüm veriler, ortalama ortalamanın standart hatası (SEM) olarak ifade edildi. Günlük latans
ortalaması, 4 yönden elde edilen latansların ortalaması şeklinde değerlendirildi. Elde edilen
öğrenme ve bellek eğrileri nonparametrik Kruskal-Wallis varyans analizi ile değerlendirildi. P
değeri < 0,05 olan karşılaştırmalar istatistiksel olarak önemli kabul edildi.
BULGULAR
Barnes Labirenti
Tabakalı rasgele örnekleme yapıldı: İlk 5 gün değerlendirildiğinde tüm grupların öğrenme
gelişim eğrilerinin paralel seyrettiği ve gruplarda tabakalı rasgele örneklemenin başarılı bir
şekilde gerçekleştiği saptandı (Şekil 2).
Tüm gruplarda öğrenme gerçekleĢti: İlk 5 gündeki öğrenme eğrileri incelendiğinde tüm
gruplarda öğrenme artışındaki değişmenin zamana karşı önemli olduğu saptandı (P<0,005).
Koku bellek geliĢmesini bozdu: 14 günlük koku uygulamasının ardından kokunun
öğrenmeyi anlamlı bir şekilde bozduğu görüldü (P<0,05).
Tropisetron bellek geliĢmesini bozdu: 14 günlük ilaç uygulamasının ardından tropisetronun
öğrenme sürecini anlamlı bir şekilde bozduğu saptandı.(P<0,05)
*
*
*
*
ġekil 2. Öğrenme-bellek eğrileri: Latans ortalamalarının zamana göre değişmesi. * P<0,005
Uygulamalar sonrasında bellek gelişimini değerlendirmek amacıyla 20. günde yapılan
retansiyon incelendiğinde koku ile kontrol grupları arasında ve tropisetron ile kontrol grupları
arasında önemli fark saptandı (P<0,05).
Morris Su Labirenti 1
Kontrol grubunda platformu bulma sürelerinin zamanla artmasından ötürü öğrenmenin
gerçekleşmediği görüldü (Şekil 3). Koku grubunda ise ilginç olarak, ilk 3 günde öğrenmenin
gerçekleştiği gözlendi.
ġekil 3. Öğrenme eğrileri: Latans ortalamalarının zamana göre değişmesi.
Morris Su Labirenti 2
Deney protokolünün ikinci MSL kısmında, yine, kontrol grubunda beklenen öğrenmenin
gerçekleşmediği görüldü (Şekil 4). Ancak, çarpıcı olarak yine koku grubunda ortalama latans
değerlerinin kontrol grubundan belirgin biçimde düşük seyrettiği saptandı (Şekil 4).
ġekil 4. Öğrenme eğrileri: Latans ortalamalarının zamana göre değişmesi.
Ortalama Vücut Ağırlıkları
ġekil 5. Koku ve/veya ilaç uygulamasının vücut ağırlığı değişimlerine etkisi.
Deney protokolü süresince yapılan tartımlar sonucunda vücut ağırlığı değişimleri saptandı.
Tropisetron uygulanan grupların (KT ve OT) eğrilerinin paralel seyretmesi dikkat çekici
bulundu.
TARTIġMA
Projemizde, çok sayıda kokusal uyaran uygulanmasıyla LTP benzeri bir etki yaratarak
öğrenme ve belleğin geliştirilmesi amaçlandı (2, 6). Uzaysal öğrenme-bellek işlevinin ana
merkezi olarak kabul edilen hipokampusta asetilkolinin yanı sıra glutamat ve serotonin
reseptörlerinin de gösterilmesi, öğrenme-bellek sürecini bozmak için serotonerjik yolu
seçmemizde etkili oldu; çünkü kolinerjik yolak inhibe edilseydi kokunun algılanmasını da
etkileyebilirdi (2, 6). Bunun için, kan-beyin bariyerini geçebilen ve farelerde etkinliği bilinen
5-HT3 antagonisti tropisetron kullanıldı (7, 8). Ancak, tropisetronun nikotinik kolinerjik
reseptörler için parsiyel agonist olduğu da burada vurgulanmalıdır (9). Tropisetronun öğrenme
belleği bozduğu daha önceki bir çalışma grubu projesi ile de gösterilmiştir (1).
Deney hayvanı olarak farelerin kullanılmasının nedeni, bu deney hayvanı türünün koku
yolakları bakımından insanlarla benzeşim göstermesidir (9).
Koku bir çevresel zenginleştirme bileşeni ise tropisetron uygulamasıyla beraber koku
uygulamasının tropisetronun öğrenme bellek üzerindeki bu olumsuz etkisini en azından
azaltması beklendi (1). Ancak Barnes Labirenti bulgularına göre koku veya tropisetron
uygulanan farelerde bellek gelişmediği görüldü. Morris Su Labirenti-1 bulgularında ise koku
grubunda öğrenmenin geliştiği görülse de kontrol grubunun öğrenmemesinden ötürü bu sonuç
anlamlı bulunmadı. Bu yüzden 5 ardışık gün boyunca uygulanması gereken MSL 4 günde
sonlandırılarak ek deney protokolü oluşturuldu; olası hatalar düzeltilerek tekrar tropisetron
ve/veya koku uygulamasına karar verildi.
MSL-2’de de farklı bir sonuç elde edilemedi, yine, kontrol grubunda öğrenme gelişmedi. Bu
yüzden farelerin stereotipik yüzme davranışları göz önüne alınarak depresyona girdiği
düşünüldü (10).
Vücut ağırlıkları grafiği incelendiğinde ilaç gruplarının kokudan bağımsız olarak eğrilerinin
paralel seyretmesi dikkat çekti.
Sonuçlar ve Çıkarımlar
Öğrenme bellek sürecinde 5-HT3 reseptörlerinin rolü vardır.
Koku, bellek gelişmesini olumsuz etkilemiştir.
Tropisetron, bellek gelişmesini olumsuz etkilemiştir.
Barnes Labirenti uzaysal öğrenme-bellek işlevinin ölçümü için geçerli ve güvenilir bir
değerlendirme yöntemidir.
5. Projede kullanılan deney hayvanlarının sayısının bir davranış çalışması için yetersiz
olmasından dolayı varılan sonuçların daha ileri çalışmalarla desteklenmesi gerekir.
1.
2.
3.
4.
KAYNAKLAR:
1. Akyüz İ, Durgut S, Hocaoğlu E ve diğerleri. Farelerde Stres ve Çevresel
Zenginleştirmenin Öğrenme-Bellek ve Anksiyete Üzerinde Etkilerinde Serotonin 5-HT3
Reseptörlerinin Rolü. Başkent Üniversitesi Tıp Fakültesi VIII. Öğrenci Sempozyumu
Çalışma Grubu Raporları kitabı, 2006; 233-245.
2. Bliss TV, Collingridge GL. A Synaptic Model of Memory: Long- Term Potentiation in
The Hippocampus. Nature. 1993 Jan;361(6407): 31–9.
3. Buck L, Axel R. A Novel Multigene Family May Encode Odorant Receptors: A
Molecular Basis for Odor Recognation. Cell. 2004 Jan 23;116(2 Suppl):S117-9, 1p
Following S119.
4. Çelik BC, Kocaman E., Şimşek EK ve diğerleri. Farelerde Siklooksijenaz-2
İnhibisyonunun Strese Bağlı Öğrenme-Bellek Bozulması Üzerinde Etkisinin
Araştırılması. Başkent Üniversitesi Tıp Fakültesi XI. Öğrenci Sempozyumu Çalışma
Grubu Raporu, 2009; (basılmadı).
5. Çevik MÖ. Türk Nöroloji Dergisi 2009;15(EK1):95.
6. Cooke SF, Bliss TV. Plasticity in the Human Central Nervous System. Brain 129 (Pt 7):
1659–73.
7. Cui R, Suemaru K, Li B ve diğerleri. Tropisetron Attenuates Naloxone-Induced Place
Aversion in Single-Dose Morphine-Treated Rats: Role of Alpha7 Nicotinic Receptors.
European Journal Of Pharmacology . 2009 May;609 (1-3): 74–7.
8. Macor JE, Gurley D, Lanthorn T ve diğerleri. The 5-HT3 Antagonist Tropisetron is a
Potent and Selective Alpha7 Nicotinic Resetor Partial Antogonist. Bioorganic &
Medicinal Chemistry Letters. 2001 Feb; 11 (3): 319–21.
9. Mandorion N, Poncelet J, Bensafi M ve diğerleri. Humans and Mice Express Similar
Olfactory Preferences. Plos One. 2009;4(1):E4209. Epub 2009 Jan 16.
10. Uzbay T.: Psikofarmakolojinin Temelleri ve Deneysel Araştırma Teknikleri, Çizgi Tıp
Yayınevi, Ankara, 2004, 134-138.