Prof. Dr. Nilgün Çerikçioğlu Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi

Yorumlar

Transkript

Prof. Dr. Nilgün Çerikçioğlu Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi
Prof. Dr. Nilgün Çerikçioğlu
Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi
Tıbbi Mikrobiyoloji AD, 2016
 Antifungaller
 Geniş
Direnç gelişimi
spektrumlu antifungaller
 Tedavi
için antifungal seçiminde karmaşa
•Tür düzeyinde tanımlama
•Antifungal
Duyarlılık
Testi

(AFDT)
• uygun
• doğru tedavi
Comparative Evaluation of a New Commercial Colorimetric Microdilution Assay (SensiQuattro Candida EU) with MIC
Test Strip and EUCAST Broth Microdilution Methods for Susceptibility Testing of Invasive Candida Isolates
JCM, 53, 255- 261 , 2015
STANDART REFERANS YÖNTEMLERİ
Buyyon Mikrodilüsyon (BMD) [CLSI - EUCAST]

Zaman alıcı

İş yoğunluğu

Rutin laboratuvarlar için uygun değil
SEÇENEK - YÖNTEMLER
Kolay
 Uygulaması
Kısa süreli

Ticari olarak elde edilebilir

Maliyet – etkin

Manuel

Yarı otomatize

Otomatize
Seçenek Yöntemler
Seçenek Yöntemlerden Beklenenler (İ)
1. CLSI ya da EUCAST BMD ile kıyaslanabilir
sonuçlar :
2. Esas uyum (EU): ±2 kat sulandırımı aşmayan
MİK sonuçları
3. Kategorik Uyum (KU):
Yorumlanabilir MİK sonuçları arası uyum
[Hassas (H), Intermediate (I) (Orta) , Dirençli (D)] ≥ %90)
Seçenek Yöntemlerden Beklenenler (İİ)
4. Çok Büyük Hata (ÇBH): Yalancı duyarlılık
(<%1.5)
5. Büyük Hata (BH): Yalancı dirençlilik
6. Küçük Hata (KH): Dirençli/duyarlı ↔Orta (I)
7. Reproducibility: Tekrarlanabilirlik
8. Değişikliklere uygunluk (İlaç ekleme / çıkarma,
son noktada değişiklik…..)
FDA ONAYLI TESTLER

SYO ( Sensitre Yeast One) (TREK
Diagnostic systems, Inc., Cleveland, ABD)

Vitek 2 (bioMérieux, Fransa)

E test
(AB Biodisk İsveç--bioMérieux,
Fransa)
Antifungal Susceptibilities of Candida Isolates Causing Bloodstream Infections at a Medical Center in
Taiwan, 2009-2010; AAC, 58, 3814 – 3819, 2014
SYO

Kolorimetrik Buyyon Mikrodilusyon

CLSI uyumlu

1998 (5 antifungal) → 2012 (9 antifungal)

Dehidrate iki kat seri sulandırımlar( SYO-YO10)

Alamar mavisi

Kolorimetrik okuma

Kırmızı: üreme +

MİK:Üremenin olmadığı en düşük ilaç [C]
Mavi:üreme –

Candida türleri

Cryptococcus türleri

Hızlı çoğalan mayalar

Aspergillus türleri
Üretici firmanın önerileri
doğrultusunda test hazırlanır.
Posakonazol
 Vorikonazol
 Flukonazol
 Itrakonazol

C.albicans
C.glabrata
C.tropicalis
Trailing (Hafif mor renk)
VİTEK 2

Tam otomatize

9-24 saat içerisinde (ortalama 15 saat)

Spektrofotometrik okuma
VİTEK 2 AF03 IUO
Güncelleştirilmiş Form

FCZ son konsantrasyon 1→ 0.5

Yeni CLSI CBP leri ile uyumlu

Dirençli kökenleri saptayabiliyor.
E test
 Kullanıma
hazır
 MİK
 Antifungalin
gradient
konsantrasyonlarını içeren şerit

Amfoterisin B

Anidulafungin

Kaspofungin

Mikafungin

Flukonazol

Itrakonazol

Posakonazol

Vorikonazol

Flusitozin
RPMI 1640
AM3 besiyerleri

Flukonazol

Üremenin %80
inhibisyonu

Küçük kolonilerin
dışlanması

Büyük kolonilerin
kestiği nokta
VOR
 Üremenin %80 inhibisyonu
 Büyük kolonilerin kestiği nokta

C. lusitaniae – Amfoterisin B
RPMI-1640
AM3
ÇALIŞMALARDAN ÖRNEKLER
VİTEK 2 (AST-YS01 kart) – SYO (Y08 formatı)
UYUMU / Candida türleri
(CLSI M27 A3 S3 Temelli KIYASLAMA !)
FCZ için EU düşük bulunan türler

C.albicans → %70±10

C.parapsilosis → %71.4±12

C.kefyr → %50

Toplamda → %81.4±4.6 EU
Interlaboratory evaluation of VITEK2 system and Sensititre YeastOne© for antifungal susceptibility testing of yeasts
isolated from blood cultures against four antifungal agents
NEWMICROBIOLOGICA, 34, 195-201, 2011
Amfoterisin B için EU düşük bulunan türler
 C.krusei %60
 C.kefyr %50
 Toplamda → %84.3±4.3 EU
Flusitozin için EU düşük bulunan türler
 C.guilliermondii, C.tropicalis %66
 C.lusitaniae %50
 Toplamda → %81.4±4.6 EU
Vorikonazol için EU düşük bulunan türler
 C.guilliermondii %16.6
 C.tropicalis, C.lipolytica %50
 Toplamda → %88,6±3.4 EU
SONUÇ: VİTEK 2 daha güvenilir / 13 saatte sonuç !!
SYO-CLSI M27 A3-S4
SYO MİK
yorumu
Türe özgül revize CBP lere göre
ya da
ECV lere göre
474 Kan izolatı Candida türü
Problemli hastalar(YBÜ, Cerrahi servisi, Hematoloji
Servisi)
Antifungal Susceptibilities of Candida Isolates Causing Bloodstream Infections at a Medical Center in
Taiwan, 2009-2010; AAC, 58, 3814 – 3819, 2014
SYO-CLSI EU ORANLARI
C.albicans
→
 C.parapsilosis
 C.krusei

C.glabrata
 C.tropicalis

→
→
>%95 FCZ (H)
%100 VOR (H)
%90.9 FCZ (DBD)
%78.6 VOR (H)

Tüm izolatlar >%97
MİKA,ANİDİLA

Tüm izolatlar %100
Amfo B (WT)
(MİK<1)
SYO-CLSI UYUMU

24 saatte sonuç

C.tropicalis
VOR «duyarlı değil»

C.tropicalis
POS «WT dışı» izolatlarda
SYO-CLSI UYUMU

24 saat

Uyum %95-99

ECV → SYO da 1 dilüsyon değişiyor.

CLSI – CBP → SYO için uygun mu?

SYO ya özgül CBP ler belirlenmeli?
E test-SYO-CLSI M38 A2
Aspergillus/Aspergillus dışı küfler
AMFOTERİSİN B
YÖNTEMLER ARASI UYUM
± 2 DİLÜSYONDA
GÖRECE
VORİKONAZOL
İTRAKONAZOL
In Vitro Susceptibility Testing of Aspergillus and Non-Aspergillus Filamentous Moulds to Antifungal Agents:
Evaluation of Three Different Methods
Macedonian Journal of Medical Sciences. 15; 5(3):280-287, 2012
E test
CLSI ile uyumlu
 Zon içi mikrokoloniler DEĞERLENDİRME

DIŞI
Kaspofunginde rezidüel üreme (okuma
zorluğu)
 Amfoterisin B ve ITR direncini
saptamada SYO’dan üstün !!!!
 Besiyeri hazırlığında üretici firma
önerilerine %100 uyulmalı!!!

SYO

Aspergillus / Aspergillus dışı kökenlerde /
Amfoterisin B dirençli kökenleri saptayamıyor !!!!!

Kaspofungin → yalancı yüksek MİK değeri

ITR, VOR, POS
Tüm küf cinsleri için için uygun
CLSI
SYO
Farklı antifungal ajanlar için
E test sonuçları
SYO-CLSI
EKİNOKANDİN / CANDIDA KÖKENLERİ
Toplamda KU
AND %98.3
CAS %93.6
MİKA %99.6
CAS - C.glabrata %89.7
C.krusei %69.1
Sonuç
Ekinokandin, CLSI YENİ CBP ve ECV
SYO için uygun
Comparison of the Sensititre YeastOne colorimetric antifungal panel with CLSI microdilution for antifungal susceptibility
testing of the echinocandins against Candidaspp., using new clinical breakpoints and epidemiological cutoff values
Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 73, 365-368, 2012

MALDI TOF MS / CLSI
CAS
Candida albicans

Rapid Antifungal Susceptibility Testing by MatrixAssisted Laser Desorption Ionization–Time of Flight
Mass Spectrometry Analysis; Journal of Clinical
Microbiology, 51, 9, 2964 –2969, 2013
YÖNTEM
 C.albicans
 Fks1
klinik izolat n=65
mutant(+) kontrol kökenleri
 MALDİ TOF
 CAS
MS-CLSI (revize CBP)
RPMI da 9 farklı ilaç konsantrasyonu
+
C.albicans kökenleri
37 °C, 15 saat-3 saat inkübasyon
Toplanan Maya Hücreleri




Steril su ile yıkama
Formik asit ile süspansiyon (1 er µl)
Etanol + Sinnamik asit
Bruker Daltonik Biotyper(3,0 yazılım)
Spektraların Toplanması- Veri Tabanı
Eldesi

65 C.albicans spektraları / veritabanı ile kıyaslama

CCI (Composite Correlation Index)

MPCC (Minimal Profile Change Concentration)
saptanması
MALDİ TOF MS Spektra ve rölatif jel MALDI
a. WT C. albicans izolatı
b. Fks1 mutant C.albicans izolatı
WT ve fks1→ 0, 0.03 ve 32 µg/ml CAS ile muamele sonucu
her iki izolat için minimal değişiklikler görülmektedir.
MALDI TOF MS CCI lerin ısı haritasına
çevrilmesi
MALDI TOF MS - CLSI UYUMU

65 kökenin 61’i uyumlu sonuç

51 köken HASSAS

11 köken DİRENÇLİ(fks1 mutasyon+)

1 ÇBH (%1.6)

Toplam uyum %98.4
MİKROKALORİMETRİ – CLSI

Amfo B, VOR, POS, CAS

Aspergillus türleri
 Prensip:

Sabit sıcaklıkta (izotermal / 37 °C)

Mikrobiyal üreme

Artan metabolizmayla birlikte ISI üretimi

Mikrokalorimetri ile ısı üretiminin ölçülmesi
Isothermal microcalorimetry: a novel method for real-time determination of antifungal susceptibility
of Aspergillus species,; Clinical Microbiology and Infection , 18, 7, E241–E245, 2012
A.fumigatus ATCC 204305
için MHIC saptanması.
Sol panelde «ISI AKIŞI»,
Sağ panelde
ANTİFUNGALLERİN
varlığında TOPLAM ISI
(SDB ‘de inokülüm: 2.5
X10 ⁴ konidia/ ml.)
GC: Growth Control
(Üreme Kontrol)
Sayılar: Antifungal
konsantrasyonu (mg/L).
NOKTALI YATAY ÇİZGİ:
Amfo B ve TRİAZOLLER
için: üretilen TOTAL
ISININ %50 inhibisyonu
Ekinokandinler için: ISI
AKIŞ PİK’inde %50
azalma.
MHIC = DAİRE içindeki
KONSANTRASYONLAR

GC (Growth Control)
(Üreme kontrolü)

Daire içindekiler
Noktalı yatay
çizgi
MHIC
Amfoterisin B ve triazoller:
GC ye göre toplam ısının %50 inhibisyonu
Ekinokandinler:
GC ye göre toplam ısı akış pikinde %50
o
o
Antifungalsiz ortam
Kontrol
Değişik konsantrasyonlarda ilaç varlığında
ISI DEĞİŞİKLİKLERİ
MHIC (Minimal Heat Inhibitory Concentration)
ölçümü
CİNS ve TÜRE göre: 5. (Candida türleri) – 22. – 72. saatte sonuç
Mikrokalorimetri –/CLSI M38 A2
Uyumu (± 2 dilüsyon)

Amfo B → %90

VOR
→ %100

POS
→ %90

CAS
→ %70
Mikrokalorimetri - Dezavantajları

Dolaşımda gaz habbecikleri / mikroorganizma
kümeleri → Kanallarda tıkanıklık

Kanaldan kalorimetriye transferde
mikroorganizma miktarında değişiklikler

RUTİN KULLANIMA UYGUN DEĞİL

Yeni üretilen ilaçlar için kullanılabilir.
AKIM SİTOMETRİ
AKIM SİTOMETRİSİ / CLSI




C.albicans
Amfoterisin B + Maya …..30 dk.
FCZ + Maya………………6 saat
Vital DNA boyası (FUN-1..)
MİK= (en düşük İlaç [C]

Hücreiçi Floresein yoğunluğunda %50
CLSI M27 A2 ile uyum: %96 (amfo B için)-%99 FCZ için
 Dezavantaj: Özel ekipman gerekliliği

Int J Pharmaceutical & Biological Archives.
5, 1-6, 2014.
DİĞER YÖNTEMLER

ERGOSTEROL ÖLÇÜMÜ

FCZ Farklı [C]+ Maya
Toplam Ergosterol miktarında Değişiklik
o
CLSI ile ~ %100 uyumlu
«Trailing» sorunu YOK
Küfler için uygun
Dezavantaj: Geliştirilmesi gerekli
Quantitation of Candida albicans Ergosterol Content Improves the
Correlation between In Vitro Antifungal Susceptibility Test
Results and In Vivo Outcome after Fluconazole
Treatment in a Murine Model of
Invasive Candidiasis. AAC. 44, 2081-2085, 2000.
XTT (Kolorimetrik Yöntem)
(XTT) + Mantar (Candida, Cryptococcus, küfler) + Antifungal
( Farklı [C]
 Biyofilm içinde / planktonik
 Canlı mantar hücrelerinin varlığında….XTT
indirgenmesi…RENK DEĞİŞİMİ
 Spektrofotometrik ölçüm


Amfoterisin B, FCZ, ITR, FLC



MİK : Metabolik aktiviteyi %50--%80 azaltan antifungal [C]
CLSI ile UYUM→ %90-100
Kısa sürede sonuç

Dezavantajı: Geliştirilmesi gerekli
Biofilm production and evaluation of antifungal susceptibility amongst clinical Candida spp. isolates, including strains of the Candida parapsilosis complex

Med Mycol . 49 , 253-262. , 2011.

Benzer belgeler

Slayt 1 - Bamcag

Slayt 1 - Bamcag •ATB Fungus 3 (bioMérieux) •Vitek 2 yeast susceptibility test (bioMérieux) •Sensititre YeastOne colorimetric plate (Trek Diagnostic Systems)

Detaylı

Antifungal Duyarlılık Testleri

Antifungal Duyarlılık Testleri Amfoterisin B için EU düşük bulunan türler  C.krusei %60  C.kefyr %50  Toplamda → %84.3±4.3 EU Flusitozin için EU düşük bulunan türler  C.guilliermondii, C.tropicalis %66  C.lusitaniae %50  ...

Detaylı