S10-Farelerde Orta Serebral Arter Tıkanıklığına Bağlı Gelişen

FARELERDE
İNTRAPERİTONEAL
UYGULANAN
OZON
TERAPİNİN ORTA SEREBRAL ARTER TIKANIKLIĞINA BAĞLI
GELİŞEN ENFARKT ALANI ÜZERİNE ETKİLERİ
Gonca AŞUT, Tayfun BAYRAKTAR, Merve Naz İNAN, Saniye Gökçe
SAYKAL, Cemre Gül TEKİN, Aykut UÇAR
Danışman: Yrd. Doç. Dr. Tolga Reşat AYDOS
ÖZET
Çalışmamızda oksidatif mekanizmalar üzerinden etkili olduğu kabul edilen
ozon terapinin, topikal FeCl3 uygulamasıyla orta serebral arterde (OSA)
oluşturulan oklüzyon sonucu gelişen iskemi üzerindeki olası etkileri
araştırıldı. 24 yetişkin erkek Swiss albino fare rastgele olarak dört gruba
ayrıldı. Sham Grubu’na herhangi bir uygulama yapılmadı. FeCl3 Grubu,
OSA üzerine % 30’luk FeCl3 solüsyonu uygulandı. Ozon Grubu, 5 gün
boyunca gün aşırı i.p. ozon (0,7 mg/kg/gün) uygulandı. Ozon-FeCl3 Grubu,
5 gün boyunca gün aşırı i.p. ozon uygulamasını takiben FeCl3 uygulandı.
Sham (n=5) ve ozon (n=3) gruplarından elde edilen kesitlerde enfarkt
alanına rastlanmadı. FeCl3 (n=6) ve ozon-FeCl3 (n=4) gruplarından elde
edilen kesitlerde ise enfarkt oluşumu saptandı. FeCl3 grubunda enfarkt
alanlarının ortalaması 7,8±2 mm2 ve ozon-FeCl3 grubunda 5,8±0,8 mm2
olarak hesaplandı. Her iki gruptaki enfarkt alanlarının istatistiksel
değerlendirilmesinde anlamlı bir fark tespit edilmedi. Bu bulgular ışığında,
farelere intraperitoneal uygulanan ozon terapinin, OSA tıkanıklığına bağlı
gelişen enfarkt alanı üzerine etkisinin olmadığı sonucuna ulaşıldı.
Anahtar kelimeler: Ozon terapi, fare, iskemi, orta serebral arter, FeCl3
GİRİŞ
İskemi; kan damarının daralması veya obstrüksiyonu sonucu dokunun
kanlanmasının ortadan kalkması veya çok azalmasıdır. İskemiye bağlı
gelişen felçlerin ana nedenleri emboli, hemoraji, yüksek tansiyon ve
arteriovenöz bozukluklardır(5). Tüm organlarda iskemi görülmesine rağmen
iskemiden en sık etkilenen organlar kalp ve beyindir(10). Beyin iskemilerinin
büyük bir kısmının ve tüm iskemiye bağlı felçlerin % 15-30’unun nedeni
OSA tıkanıklığıdır(12,13). Erkeklerde OSA tıkanıklığı bayanlardan 2 kat fazla
görülmektedir. OSA tıkanıklığına bağlı gelişen felçler ilerleyen yaşlarda
artmaktadır(14).
İskemik tromboembolik inme profilaksisinde yaygın olarak aspirin, tPA,
klopidogrel ve tiklopidin kullanılmaktadır(8). Profilakside kullanılan
antitrombositik ajanlar siklooksijenaz (COX) sistemini inhibe ederek güçlü
bir trombosit aktivatörü olan tromboksan A2 seviyesini azaltırlar ve bu
mekanizma üzerinden etki gösterirler.
Çalışmamızda
OSA
tıkanıklığına
bağlı
gelişen
enfarkt
alanının
küçültülmesinde i.p. uygulanan ozonun etkileri incelenmiştir. Deneysel
OSA tıkanıklığı, çeşitli çalışmalarda “ip” ile OSA’nın bağlanması, mikroklip
ile OSA’nın tıkanması, elektrokoagülasyon, endotelin-1 ile OSA oklüzyonu,
mikroemboli ile OSA oklüzyonu, lazer aracılı fotokoagülasyon ile OSA
oklüzyonu metodları kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Çalışmamızda ise
Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Nöroloji Anabilim Dalından Dr. Hülya
Karataş-Kurşun ve Doç. Dr. Yasemin Gürsoy-Özdemir’in çalışmalarında
kullandıkları topikal FeCl3 uygulamasıyla OSA oklüzyonu modeli tercih
edilmiştir(11). Topikal FeCl3 uygulaması, damarın median intiması ve
endotele geçerek demir aracılı kimyasal oksidasyona bağlı endotel hasarı
oluşturur. Gelişen hasar sonucunda bu bölgede platelet adezyonu ve
agregasyonu meydana gelir. Koagülasyon kaskadının aktive olması sonucu
fibrin depolanması ile trombüs oluşur(16). Karotid arterde % 2,5 gibi düşük
dozlarda tam oklüzyon sağlanabilmesine rağmen, OSA’nın karotid artere
göre daha periferde olması, damarların farklı fizyolojik ve anatomik
yapıları ve OSA üzerindeki intakt duramater nedeniyle FeCl3 daha yüksek
dozlarda tam oklüzyon gerçekleştirebilmektedir(11).
Ozon, biyolojik sıvılarda çözünmüş olan organik ve inorganik moleküllerle özellikle poliansatüre yağ asitleri, askorbik asit gibi antioksidanlar, sistein
gibi sülfidril grubu içeren tiyol bileşikleri, redükte glutatyon (GSH) ve
albumin- ile çok kısa sürede tepkimeye girer(2,4). Ozonun organik ve
inorganik maddelerle girdiği bu tepkimeler süperoksit, hidrojen peroksit ve
hipoklorik asit gibi pek çok serbest oksijen radikalinin oluşumuna yol
açar(2). Ozon oluşturduğu bu serbest oksijen radikalleri ile çeşitli fizyolojik
cevapların doğmasına neden olur. Eritrositlerde 2,3-difosfogliserat (2,3DPG) miktarını artırır ve hemoglobin-oksijen ayrışma eğrisini sağa
kaydırır(4). Böylece eritrositler oksijeni dokulara daha kolay bırakırlar.
Nitrik oksit (NO) salıverilmesini artırarak vazodilatasyona dolayısıyla da
dokuların kan akımında artışa yol açar(15). Dokulara kan akımını artırması
nedeniyle genel olarak metabolizmayı artırır. Serbest oksijen radikallerinin
artması antioksidan enzim seviyelerinde ve bağışıklık sisteminin
aktivitesinde değişikliğe yol açar. Lökosit ve endotel hücrelerinde
interferon, interlökin ve büyüme faktörlerinin yapımını indükler(3,6). Ozon
tedavisi bu etkileri nedeniyle inflamatuar sürecin yoğun olduğu ve
bağışıklık sisteminin tetiklendiği fizyopatolojik durumlarda tedavi amacıyla
kullanılabilmektedir. Enfeksiyonlar, arteriyel dolaşım bozuklukları, senil
maküler dejenerasyon, akciğer, bağırsak, dişeti, deri ve eklem
hastalıklarında ozon tedavisinin uygulandığı görülmektedir(9). Ayrıca
iskemik hastalıklar, diyabet, immünosupresyon ve malnütrisyona bağlı
oluşabilecek kronik ülserlerin tedavisinde de ozonun faydalı olabileceği
düşünülmektedir(1).
Çalışmamızda farelerde topikal FeCl3 uygulamasıyla oluşturulan OSA
tıkanıklığı modelinde(11), i.p. uygulanan ozon terapinin, meydana gelen
enfarkt alanı üzerine etkileri araştırılmıştır.
GEREÇ ve YÖNTEM
Bu çalışma Başkent Üniversitesi Hayvan Deneyleri Etik Kurulu tarafından
onaylanmış (Proje no:DA11/10) ve Başkent Üniversitesi Araştırma
Fonunca desteklenmiştir.
Çalışmamızda 40,05±4,57 g ağırlığında 24 yetişkin erkek Swiss albino fare
kullanıldı. Araştırma Ünitesinde fareler sıcaklığı (25±20C) ve bağıl nemi
(%32±7) sabit, havalandırma (vantilatör ile) kontrollü, 12 saat
aydınlık/karanlık döngüsü uygulanan ortamda standart fare kafeslerinde
barındırıldı. Yem ve su kısıtlaması yapılmadı. Her biri rastgele seçilmiş 6
fareden oluşan 4 grup üzerinde çalışma yürütüldü.
Tüm gruplarda ketamin/ksilazin anestezisi (150/9 mg/kg, i.p.) uygulanan
fareler yüz üstü pozisyonda dış kulak yollarından ve burundan
sabitlenecek şekilde stereotaksi çerçevesine yerleştirildi (Şekil 1).
Şekil 1. Farelerin yüz üstü pozisyonda dış kulak yollarından ve burundan sabitlenecek
şekilde stereotaksi çerçevesine yerleştirilerek cerrahi işleme başlanması.
Sağ lateral epikantus ve sağ dış kulak yolu arasındaki hattın ortasından
dik olarak cilt kesisi yapıldı. Temporal kas, temporal kemiğin skuamöz
parçası görülene kadar sıyrıldı. Kemik yapı serum fizyolojik ile ıslatılarak
altındaki distal OSA’nın seyri gözlendi. OSA’nın seyri anlaşıldıktan sonra
dakikada 40.000 devir ile çalışan matkap (Nouvag AG, Germany)
yardımıyla zigomatik ark ve skuamöz parçanın anterior bileşkesinin 2 mm
üzerinde kemik inceltilmeye başlandı. İnceltme süresince aralıklarla soğuk
serum fizyolojik uygulanarak kemik soğutuldu. İnceltilen kemik, OSA ve
onu örten duramater parçasına zarar vermeden uzaklaştırılarak bir
pencere açıldı. Cerrahi işlemler sırasında x50 büyütmede mikroskopla
(Zeiss, Germany) çalışılırken OSA’yı daha rahat görebilmek için farelerin
sabitlendiği stereotaksi çerçevesi horizontal düzlemle 45°’lik açı yapacak
şekilde yan yatırılmıştır. Bu esnada ön ve arka ekstremitelerinden
sabitlenmesine rağmen karın bölgesinin sarkmasına bağlı farelerde
dolaşım ve solunum problemi yaşanmaması amacıyla karın bölgesi bir
tamponla desteklenmiştir. Deney grupları:
Sham Grubu: Pencere açıldıktan sonra herhangi bir uygulama yapılmadan
kafa derisi dikişle kapatıldı. Dikiş yapılan bölge oksitetrasiklimtetraklorür
içeren sprey (Neocof®) ile dezenfekte edildi.
FeCl3 Grubu: Pencere açılarak OSA ortaya çıkartıldıktan sonra, OSA
üzerine % 30’luk FeCl3 solüsyonu emdirilmiş filtre kâğıdı yerleştirildi, 1012 dakika bekleme sonrası filtre kâğıdı uzaklaştırılıp, trombüs oluşumuna
bağlı kan akışının kesilmesi mikroskop altında gözlendikten sonra kafa
derisi dikişle kapatıldı.
Ozon Grubu: Beş gün boyunca gün aşırı i.p. ozon (0,7 mg/kg/gün)
uygulamasını takiben farelerin kafatasında pencere açılarak ve herhangi
bir uygulama yapılmadan kafa derisi dikişle kapatıldı.
Ozon-FeCl3 Grubu: Beş gün boyunca gün aşırı i.p. ozon uygulamasını
takiben farelerin kafatasında pencere açılarak OSA ortaya çıkartıldıktan
sonra, OSA üzerine % 30’luk FeCl3 solüsyonu emdirilmiş filtre kâğıdı
yerleştirildi. 10-12 dakika bekleme sonrası filtre kâğıdı uzaklaştırılıp,
trombüs oluşumuna bağlı kan akışının kesilmesi gözlendikten sonra kafa
derisi dikişle kapatıldı.
Tüm gruplarda fareler cerrahi işlemlerin tamamlanmasından 24 saat sonra
yüksek doz anestezi (ketamin-ksilazin) altında dekapite edilip beyinleri
çıkarıldı. On dakika buz soğukluğundaki % 0,9’luk izotonik NaCl
çözeltisinde bekletilen beyinlerden tasarımı tarafımızca gerçekleştirilen
aletle (Şekil 2) 2 mm aralıklarla 5 koronal kesit alındı.
Şekil 2. Fare beyinlerinden 2 mm aralıklarla kesit alınması için geliştirilen alet.
Kesitler,
karanlık
ortamda
40
dakika
(homojen
boyanmanın
gerçekleşebilmesi için 20. Dakikanın sonunda kesitlerin diğer yüzü çevrildi)
% 2’lik 2,3,5, trifenil tetrazolium klorid monohidrat (TTC) çözeltisinde
bekletildi. Kesitler lam üzerine alınarak fotoğrafları çekildi (Kodak
Easyshare C190, 12.3 MP). TTC’nin, yaşayan mitokondriler tarafından
alınıp mitokondriyal solunum zincirinde yer alan dehidrogenazlar
tarafından indirgenmesi hızla çıkartılan beyin kesitlerinde enfarktlı
dokunun normal dokudan renk farkı yardımı ile ayırt edilmesine olanak
sağladı. Çekilen fotoğraflardaki enfarkt alanları Image J® programında
hesaplandı. Elde edilen veriler (ortalama±ortalamanın standart hatası)
Student’s t testi ile değerlendirildi.
BULGULAR
Kesit fotoğrafları üzerinde yapılan inceleme sonucunda sham (n=5) ve
ozon (n=3) gruplarından elde edilen beyin kesitlerinde herhangi bir
enfarkt alanına rastlanmadı (Şekil 3-A ve B). FeCl3 ve ozon-FeCl3
gruplarından elde edilen kesitlerde ise OSA’da gerçekleştirilen oklüzyonun
beyin dokularında enfarkt alanı oluşumuna yol açtığı saptandı. FeCl3
grubunda (n=6) enfarkt alanlarının ortalaması 7,8±2 mm2 ve ozon-FeCl3
grubunda (n=4) ise 5,8±0,8 mm2 olarak hesaplandı (Şekil 3-C ve D; Şekil
4). Her iki gruptaki enfarkt alanlarının istatistiksel değerlendirilmesinde
anlamlı bir fark tespit edilmedi.
Şekil 3. A)Sham B)FeCl3 C)Ozon D)Ozon-FeCl3 deney gruplarına ait TTC boyaması
yapılmış beyin kesitleri.
Şekil 4. Deney gruplarına ait beyin dokularında tespit edilen enfarkt alan ölçümleri
(Ortalama±OSH).
TARTIŞMA
Çalışmamızda, farelerde topikal FeCl3 uygulaması ile gerçekleştirilen OSA
tıkanıklığı sonucu oluşan enfarkt alanına, i.p. uygulanan ozon terapinin
etkileri incelendi. Sham ve ozon gruplarında enfarkt alanı tespit
edilmezken, FeCl3 ve ozon- FeCl3 gruplarında enfarkt alanlarının oluştuğu
gözlemlendi. Ancak oluşan enfarkt alanları arasında anlamlı bir fark
bulunamadı.
Ozon terapi günümüzde otohemoterapi, intraperitoneal, intramüsküler,
rektal ve vaginal insüflasyon, ozonlu su, ozon enjeksiyonu yöntemleri ile
uygulanmaktadır. Yapılan araştırmalarda böbrek iskemik hasarında(14)
uygulanan ozon terapi, süperoksit dismutaz (SOD) enziminin derişimini
artırarak reaktif oksijen moleküllerinin (ROM) toksititesini azaltmıştır.
Ayrıca iskemi sonrası endotelin-1’i baskılayarak böbrek kan akımını
artırmaktadır. Ancak, çalışmamızda beyindeki enfarkt alanına ozon
terapinin istatistiksel olarak anlamlı bir etkisi bulunmamıştır(7). Bu sonuç,
çalışmamızda ozonun intraperitoneal yolla verilmesi ve/veya ozonun
muhtemel etkilerini beyinde gerçekleştirememesinden kaynaklanabilir.
Dokulardaki iskemik hasar üzerine ozon terapinin olumlu etkilerinin
gösterildiği çalışmalarda deney hayvanı olarak sıçanlar kullanılmıştır.
Çalışmamızda sıçan yerine farelerin kullanılması, deney gruplarımızdaki
hayvan sayılarının azlığı gibi etmenler de sonuçlar üzerine etki göstermiş
olabilir.
Sonuç olarak, i.p. uygulanan ozonun OSA tıkanıklığına bağlı beyin
iskemisinde herhangi bir etkisi gözlenmemiştir. Yukarıda tartışılan
etmenler göz önünde bulundurularak planlanacak yeni bir deney düzeneği
ile beyin iskemisi üzerine ozon tedavisi etkileri daha net olarak ortaya
konulabilir.
(*) Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Nöroloji Anabilim Dalından Dr.
Hülya Karataş-Kurşun ve Doç. Dr. Yasemin Gürsoy-Özdemir’e çalışmamıza
verdikleri destekten dolayı teşekkürlerimizi sunarız.
KAYNAKLAR
1. Bocci, V.A.: Ozone.A New Medical Drug, 2nd Ed, Springer, New York City,
NY,USA; 2005
2. Bocci VA. Scientific and Mediacal Aspects of Ozone Therapy. State of Art.
Archives of medical research 2006; 37:425-435
3. Bocci VA, Paulesu L. Studies on the biological effects of ozon: Introduction of
interferon gamma on human leucocytes. Haematologica 1990; 75:510-515
4. Bocci VA, Borelli E, Travagli V, et al. The Ozone Paradox:Ozone is a Strong
Oxidant as well as a Medical Drug. Medicinal Reserch Reviews 2009; 29:646682
5. Caplan
LR. Dissections
Neurol. 2008; 4:34-42.
of
brain-supplying
arteries. Nat
Clin
Pract
6. Di Paolo N, Bocci V, Gaggiotti E. Ozone Therapy. Int. J Artif Organs 2004;
27:168-175
7. Barber E, Mene’ndez S, Leo’n OS, et al. Prevention of renal injury after
induction of ozone tolerance in rats submitted to warm ischaemia. Mediators
of Inflammation 1999; 8:37–41
8. Gustafsson D, Elg M. The pharmacodynamics and pharmacokinetics of the
oral direct thrombin inhibitor ximelagatran and its active metabolite
melagatran. Thromb Res. 2003; 109:9-15.
9. Gürel E. Ozone Therapy In Medicine. Sağlıklı Yaşam Tarzı Dergisi 2009; 1:92101
10.Johansen D, Ytrehus K, Baxter G. Exogenous hydrogen sulfide (H2S) protects
against regional myocardial ischemia–reperfusion injury. Basic Research in
Cardiology 2006; 10:53-60.
11.Karatas H, Erdener S, Gursoy-Ozdemir Y, et al. Thrombotic distal middle
cerebral artery occlusion produced by topical FeCl3 application: a novel model
suitable for intravital microscopy and thrombolysis studies. Journal of
Cerebral Blood Flow & Metabolism 2011:8
12.Karpiak SE, Tagliava A, Wakade C. Animal Models for the study of drugs in
ischaemic stroke. Ann.Rev.Pharmac. Tox. 1989; 29:403-414
13.Mohr JP, Gautier JC, Hier D, et al. Middle Cerebral Artery. Stroke 1986; 377450
14.Moulin T, Tatu L, Vuillier F, et al. Role of a stroke data bank in evaluating
cerebral infarction subtypes: patterns and outcome of 1,776 consecutive
patients from the Besancon stroke registry. Cerebrovasc Dis. 2000; 10:26171.
15.Vallacchi G, Bocci VA. Studies on the biological effects of ozon: Release of
factors from human endothelial cells mediators inflammation. 2000; 9:271276
16.Wang X, Xu L. An optimized murine model of ferric chloride-induced arterial
thrombosis for thrombosis research. Thromb Res. 2005; 115:95-100