lc-tandem ms-mrm temel araştırma ve klinik laboratuvarda kullanımı

Transkript

LC-TANDEM MS-MRM
MS-MRM
LC-TANDEM
TEMEL ARAŞTIRMA
ARAŞTIRMA VE
VE
TEMEL
KLİNİK LABORATUVARDA
LABORATUVARDA KULLANIMI
KULLANIMI
KLİNİK
Prof.Dr.
Dr.Hüray
HürayİŞLEKEL
İŞLEKEL
Prof.
DokuzEylül
EylülÜniversitesi
ÜniversitesiTıp
TıpFakültesi
Fakültesi
Dokuz
Aralık2011
2011-- ADANA
ADANA
11Aralık
Kütle Spektrometresi Tarihsel Süreci
2
Kimya Dalında Nobel Bilim Ödülü (2002)
(Fenn J. B. ve Tanaka K)
• Fenn ve Ta
Kütle Spektrometri (MS)
Bilinmeyen bileşiklerin tanımlanması
Organik ve inorganik moleküllerin
yapısal özelliklerinin belirlenmesi
Her tipte bilinen bileşiğin kantitasyonu
“yüksek duyarlılık ve özgüllükte”
analitik bir teknik
MS moleküllerin kütlelerini tartar
Tek bir hidrojen atomu ağırlığı
1.66 X 10-24 g
MS moleküllerin kütlelerini tartar
Kütle Spektrometre doğrudan moleküler
kütleyi ölçmek yerine molekülleri
kütle/yük oranınına (m/z) göre ayrıştırır ve
ölçer
Moleküller iyonlara dönüştürülmeli
(elektriksel olarak + ya da - yüklü olmalı)
Gaz fazına geçirilmeli
Kütle Spektrometresi
İyon
kaynağı
Kütle
Analizörü
Atmosferik
basınçta
molekülün
gaz fazına
geçirilmesi ve
iyonizasyonu
Detektör
Gaz fazındaki iyonların
vakum altında m/z e göre
ayrımlanması
Veri Analizi
m/z
Kütle Spektrumu
Ayrımlanan
iyonların
tespiti
Kütle Spektrumu
+ Q 1 : 6 .7 0 0 to 6 .8 3 4 m in fro m S a m p le 8 (M C F ) o f D a ta Q 1 s c a n s M C .w iff, s u b tra c te d (6 .3 9 9 to 6 .5 4 9 ...
M a x. 2 .6 e 5 c p s .
2 2 .0
2 .6 e 5
2 .4 e 5
1 7 .0
sinyal yoğunluğu
2 .2 e 5
2 .0 e 5
1 .8 e 5
1 .6 e 5
2 2 .8
1 8 .0
1 0 1 3 .6
1 .4 e 5
1 .2 e 5
-1 8 .0
1 .0 e 5
8 .0 e 4
0 .8
3 8 .0
2 4 .0
1 9 .0
6 .0 e 4
-1 7 .0
3 9 .0
2 .0
4 .0 e 4
-1 6 .0
2 0 .2
2 .0 e 4
3 .0
4 0 .0
2 5 .0
0 .0
990
995
1000
1005
1010
1015
1020
1025
m /z , a m u
1030
kütle/yük (m/z)
1035
1040
1045
1050
1055
1060
LC-MS/MS ile özgül ve duyarlı
kantitasyonun sırrı ????
Kompleks biyolojik karışımların analizinde
ilk boyut, kromatografik olarak
bileşenlerine ayrımlanma
Winnik ve Kitchin, Toxicology and Applied Pharmacology, 2008
LC-MS de her analit için
1. Retansiyon zamanı
2. m/z değeri
Ayrımlanan bileşiklerin
iki aşamalı MS analizi
ile özgüllük artar (MS/MS)
Winnik ve Kitchin, Toxicology and Applied Pharmacology, 2008
Tandem MS (MS/MS)
(Sıralı Kütle Analizörü)
N2 Girişi
RF
Ion Guide
Q1
Q2
Çarpışma Hücresi
İyon seçimi
moleküler iyon/
precusor ion
Parçalanma
Q3
Dedektör
İyon seçimi
ürün iyon/
product ion
Neden Tandem MS (MS/MS)
Moleküler iyon parçalanması
proteinin
peptidlerinin dizilimi
helyumla
çarpıştırılarak
amid
bağlarının
kopartılması
peptidin aa dizilimi
Multiple Reaction Monitoring (MRM)
Çoklu Reaksiyon İzleme
Bileşiklerin kantitasyonunun yüksek
duyarlılık ve özgüllükte yapıldığı
hedefli bir tandem MS yöntemi
PubMed
“MRM” “2000-2010”
"Multiple Reaction Monitoring"
Yayın/yıl
500
400
300
200
100
0
2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010
Yıl
Kantitasyonu yapılacak analit/lere özgü ve daha önceden tanımlanmış
m/z değerindeki ana iyon ve fragment iyon ikilisi (transition) izlenir.
 Ana iyon ile fragman ion çifti olarak adlandırılan “transition” kantite
edilecek analite spesifik olup, bir ya da daha fazla ürün iyon çifti
izlenerek spesifite artırılmış olur.
 MS analizi süresince tüm m/z değerlerini taramak yerine sadece
belirli m/z aralıklarına odaklanılır ve diğerleri göz ardı edilir.
 Bir dizi transition ile birlikte hedef analitin tam retansiyon zamanı
birleşince kesin bir ölçüm olur.
 Tek bir LC- MS/MS deneyi sırasında birden çok analitin ölçümü
mümkündür.
Çoklu Reaksiyon İzleme-MRM
Triple Quadrupole MS/MS
N2 Inlet
RF
Ion Guide
Q1
Q2
Collision Cell
Q3
Detector
Triple Quadrupole Ion Trap MS/MS
N2 Inlet
RF
Ion Guide
Q1
Q2
Collision Cell
Q3
Detector
İzotop İşaretli İnternal Standart
MS öncesi (ekstraksiyon,
HPLC enjeksiyonu…)
MS koşullarındaki
değişiklikleri standardize
etmek ve kesin,
tekrarlanabilir sonuçlar için
İnternal Standart Özellikleri
Hedef analit ile
kimyasal özellikleri
kromatografik ayrımlanma özelliği
iyonizasyon etkinliği
fragment iyon dağılımı aynı olmalıdır.
Tek farkı
olmasıdır.
analitten daha ağır kütleye sahip
MRM Yöntemiyle Kantitasyon
Örnek
İnternal Standart
(örnek pik alanı )
(internal standart pik alanı)
x (internal standart konsantrasyonu)
MRM-LC-MS/MS ile
Kantitasyon Alanları
İlaç Düzeyi Belirlenmesi
Adli Toksikoloji
 Tedavi etkinliğinin, tedaviye uyumun ve ilaca bağlı
toksisitenin belirlenmesi amacıyla biyolojik sıvılarda ilaç
düzeylerinin ölçümü
 µL örnek hacimlerinde ng, pg düzeyinde duyarlılıkta
ölçüm
 antiepileptik ilaçlar
kardiyoaktif ilaçlar
bronkodilatörler
antibiyotikler
antiretroviral ilaçlar
antipsikotikler
antimetabolitler
immunsupresan ilaçlar vb.
alkol
•Grebe and Sngh Clin. Biochem Rev Feb 2011 Mayo Clinic
illegal ilaç ve metabolitleri
Yeni Doğan Metabolik
Hastalıkları
 Yeni doğan metabolik hastalıklarının taramasında (NBS)
 Amino asit analizleri
 Yağ asidi oksidasyon defektlerinde karnitin, açil karnitin
 Organik asidemi, asidürilerde organik asitler
 Doğrulama
 Tirozinemi I:Tirozin
 Propionik asidemi:3-OH-propionik asit
 Metil malonik asidemi:MMA
 MSUD:Dallı aa lerin analizi
 CAH:17 OH progesteron
 Lizozomal depo hastalıkları:Enzim substrat reaksiyon ürünü
Hormon/Vitamin/Biyolojik Amin
Analizleri
 Steroid hormonlar
Östrojen (E1ve E2)
Kortizol
Testosteron
 25-hidroksi vitamin D
HPLC-UV, HPLC-EC
RIA
Otomatize kemilüminesans immunoasaay
 College of American Patologists LC-MS/MS i referans yöntem olarak önerdi
 NIST kalite kontrol materyali (SRM 972)
(25OHD2 ve 25OHD 3 ve 3-epi izomerleri)
Klinik Laboratuvarda LC-MS/MS
Diğer Yöntemler (İmmun Ölçüm-HPLC-GCMS)
ile Karşılaştırıldığında
DUYARLILIK
ÖZGÜLLÜK
SONUÇ VERME
SÜRESİ
Klinik Laboratuvarda LC-MS/MS
Diğer Yöntemler ile Karşılaştırıldığında
Otomatize immun ölçüm yöntemleri
 Sonuç verme süresi kısa
 Sınırlı manuel işlem gerekliliği






Özellikle düşük konsantrasyonlarda analitik spesifitesi yetersizliği
Sınırlı dinamik aralık
Monoklonal antikor gerekliliği
Tekrarlanabilirlik yetersizliği
Yüksek reaktif maliyeti
Radyoaktif atık uzaklaştırılması, uzun inkübasyon süresi, çapraz reaktiviteyi
engellemek için organik ekstraksiyon/kromatografi gerekliliği (RIA)
GC-MS ve HPLC



GC-MS non-polar uçucu ve ısıya dayanıklı metabolit analizinde uygun
İş akışının daha uzun (Özellikle GC-MS örnek derivatizasyonu gerektirmesi)
Analitik spesifite daha düşük (Özellikle konvansiyonel HPLC)
LC-MS/MS ile Ölçüm Sınırlılıkları
Örnek hazırlığında manuel işlem gerekliliği
Analizin kompleksliği, kullanıcı eğitimi,
deneyim gerekliliği
Cihazın kurulum maliyeti, bakım ve
sürdürülebilirliği
1985
1986
1987
1988
1989
1990
1991
1992
1993
1994
1995
1996
1997
1998
1999
2000
2001
2002
2003
2004
2005
2006
2007
2008
2009
2010
Yayın/yıl
PubMed “Oxidative stress”
14000
12000
10000
8000
6000
4000
2000
0
Yıl
PubMed
“Oxidative stress” “LC-MS/MS”
60
Yayın/yıl
50
40
30
20
10
0
0 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10
0
20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20
Yıl
Oksidatif stres değerlendirmesinde
LC-MS/MS kullanımı
Oksidatif stres biyobelirteçlerinin çoklu kantitasyonunda
 örnek hazırlık aşamasında kimyasal derivatizasyon
işlemine nadiren gerek duyulması
 ön ayrımlama işlemleri ve örnek hazırlığı ile ardışık
olarak (in-line) kullanılabilmesi
 yüksek duyarlılık ve özgüllükte analiz
*Giustarini, D., et al., Crit Rev Clin Lab Sci, 2009.
*Winnik and Kitchin, Toxicology and Applied Pharmacology, 2008
LC-MS/MS ile İzoprostanların Ölçümü
LC-MS/MS ile
Tiyol Biyobelirteçlerin Ölçümü
LC-MS/MS İle
Okside Aromatik Amino Asit Ölçümü
LC-MS/MS ile
8-OHdG ve İlişkili DNA Biyobelirteçleri Ölçümü
8-Hidroksi-2’-deoksi-guanozin (8OHdG)
 Oksidatif DNA hasarının klasik bir biyobelirteçi
 8OHdG ölçüm yöntemleri:
HPLC-ECD
GC-MS
LC-MS
Enzimatik teknikler
LC-MS/MS (Avrupa Oksidatif DNA Hasarı Standartlar Komitesi (ESCODD)
önerisi)
DNA BAZ HASARI ÖLÇÜMÜ İÇİN
LC-MS/MS-MRM YÖNTEMİ
OPTİMİZASYON VE
GEÇERLİ KILMA ÇALIŞMALARI
8OHdG (8-hidroksi-2‘ deoksiguanozin)
O
.
HN
H2 N
N
H
N
N
HO H
C4-OH-adduct radical
O
HN
H2 N
O OH
N
H
N
N
H
guanine
+
. OH
N
HN
H2 N
N
.
H
N
H
O
N
HN
H2 N
.
N
-eOH
H
N
H
,-H+
O
N
HN
H2N
OH
N
N
DNA
8-hydroxyguanine
ScdA (8,5'-siklo-2‘ deoksiadenozin )
Gereç ve Yöntem
LC-MS/MS
HPLC (Shimadzu LC-20AD)
Triple Quadrapole Ion Trap LC-MS/MS (Applied
Biosystems 4000 Q-TRAP)
Elektrosprey iyonizasyon (Turbo V iyon kaynağı)
MRM-pozitif iyon modu
Analyst Software Version 1.5
LC Koşulları
 Kolon Özellikleri: RP C18, 2.1 mm x 150 mm, 3.5 μm
 Guard kolonu: 2.1 mm x 12.5mm, 5 μm
 Mobil faz: %2 Asetonitril, %95 dH2O
 Akış hızı: 0.3 mL/dk
 Enjeksiyon hacmi: 10 – 20 μL
MS Koşulları
Kaynak bağımlı parametreler
Bileşik bağımlı parametreler
 curtain gas: 10 psi
DP: 61
 ion spray voltage: 5.500 V
EP: 10
 temperature: 500 °C
CE: 25
 ion source gas 1: 50 psi
CXP: 10
 ion source gas 2: 50 psi
dwell time: 150 ms
 duration time: 26 dk
MRM Ana İyon/Ürün İyon Çiftleri
ScdA
ScdA 15N5
8OHdG
8OHdG 15N5
MRM
Transition
(m/z)
250/164
255/169
284/168
289/173
Retansiyon
Zamanı
(dk)
4.7
4.7
5.3
5.3
Sonuçlar
S-cdA Fragmantasyonu
250
N H 2
N
m /z 1 6 4
H O
+ H
H
N
C
N
Ana iyon
N
O
H
H
O H
H
H
H
164
Ürün iyon
8-OH-dG Fragmantasyonu
O
168
N
NH
HO
Ürün iyon
N
HO
N
NH2
+
m /z 1 6 8 (B H 2 )
+2H
CH2
O
H
H
H
OH
H
H
m /z 1 1 7 (S + )
284
Ana iyon
S-cdA İyon Kromatogramı (0-26 dk)
Intencity (cps)
S-cdA
RT: 4.72 dk
Retansiyon zamanı (dk)
8-OH-dG İyon Kromatogramı (0-26 dk)
Intencity (cps)
8-OH-dG
RT: 5.32 dk
8-OH-dG Standart Grafiği
( 0.2, 0.5, 1, 2.5, 5, 10, 25, 50 pmol/mL) (n:2)
ScdA Standart Grafiği
(0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 2.5, 5, 10, 25 pmol/mL) (n:2)
konsantrasyon
(pmol/mL)
İdrar S-cdA İyon Kromatogramı
Intencity (cps)
R-cdA
m/z 250.0 → 164.0
S-cdA
m/z 250.0 → 164.0
R-cdA15N5
m/z 255.0 → 169.0
RT: 4.02 dk
S-cdA15N5
m/z 255.0 → 169.0
RT: 4.84 dk
Intencity (cps)
İdrar 8-OH-dG İyon Kromatogramı
8-OH-dG
m/z 284.0 → 168.0
8-OH-dG15N5
m/z 289.0 → 173.0
RT: 5.38 dk
Gün-içi Tekrarlanabilirlik
Ortalama
(pmol/mL)
(n=10)
SD
% CV
S-cdA
0,25
0,0121
4,94
8-OH-dG
0,20
0,0106
5,24
Günler-arası Tekrarlanabilirlik
Ortalama
(pmol/mL)
(n=10)
SD
% CV
S-cdA
0,15
0,0137
9,25
8-OH-dG
0,14
0,0031
2,31
En Düşük Tespit Limiti (LOD)
En Düşük Kantitasyon Limiti (LOQ)
LOD
LOQ
S-cdA
1,1x10-3 pmol/mL
(S/N =3.5)
4,4x10-3
pmol/mL
(S/N=12.6)
8-OH-dG
1.8x10-4 pmol/mL
(S/N=3.6)
5,8x10-4
pmol/mL
(S/N =11)
İnternal Standart Kullanarak İdrar Örneklerinde
S-cdA Kantitasyonu
S-cdA
S-cdA 15N5
*S-cdA
S-cdA
Ana İyon Ana İyon 164/169
(pmol/mL) (nmol/L)
164
169
İdrar
Örneği
Kreatinin
(mmol/L)
S-cdA (nmol/
mmoL kreatinin)
1.Örnek
14000
53300
0,26
0,24
0,24
6,26
0,04
2.Örnek
18500
130000
0,14
0,13
0,13
14,23
0,01
3.Örnek
16900
42100
0,40
0,37
0,37
18,25
0,02
4.Örnek
23700
138000
0,17
0,16
0,16
3,56
0,04
*S-cdA (pmol/mL)= (0,26)ax(0.076 mM)bx(24µL)cx(1000)d/(2000)e
a: 164/169 pik alanlarının oranı
b: İnternal standart konsantrasyonu
c: Eklenen internal standart miktarı
d: µL’den mL’ye dönüşüm faktörü
e: İnternal standart dilüsyon faktörü
İnternal Standart Kullanarak İdrar Örneklerinde
8-OH-dG Kantitasyonu
İdrar
Örneği
8-OH-dG 8-OH-dG15N5
Ana İyon
Ana İyon
168
173
168/173
*8-OH-dG
(pmol/mL)
8-OH-dG
(nmol/L)
8-OH-dG nmol/
Kreatinin
mmoL kreatinin
(mmol/L)
1.Örnek
108000
2380000
0,05
0,20
0,20
6,26
0,03
2.Örnek
398000
5320000
0,07
0,33
0,33
14,23
0,02
3.Örnek
284000
2910000
0,10
0,43
0,43
18,25
0,02
4.Örnek
359000
9110000
0,04
0,17
0,17
3,56
0,05
*8-OH-dG (pmol/mL)= (0,05)ax(0.092 mM)bx(2.4µL)cx(1000)d/(50)e
a: 168/173 pik alanlarının oranı
b: İnternal standart konsantrasyonu
c: Eklenen internal standart miktarı
d: µL’den mL’ye dönüşüm faktörü
e: İnternal standart dilüsyon faktörü
Normal Akciğer Dokusunda S-cdA ve 8-OH-dG
S-cdA
R-cdA
R-cdA15N5
S-cdA15N5
8-OH-dG
8-OH-dG15N5
Tümörlü Akciğer Dokusunda S-cdA ve 8-OH-dG
S-cdA
R-cdA
R-cdA15N5
S-cdA15N5
8-OH-dG
8-OH-dG15N5
AKCİĞER KANSERİNDE
OKSİDATİF HASARIN
DOKU VE İDRARDA
DNA BAZ HASARI VE 8-İZOPROSTAN
DÜZEYLERİ İLE GÖSTERİLMESİ
DİYET ALAN
FENİLKETONÜRİLİ
ÇOCUKLARDA
FONKSİYONEL
B12 VİTAMİN
EKSİKLİĞİNİN
İNCELENMESİNDE
MMA VE
HOMOSİSTEİN
DÜZEYLERİNİN
BELİRLENMESİ
Genetik ve
Biyokimya
İnsan genom projesinin
sonlanması
 İnsan Genom Projesinin
ilginç bir sonucu: mRNA
ve protein sayılarının
arasındaki zayıf
korelasyonun ortaya
konması
 İnsan genomunda
25-30 000 protein
kodlayan gen
 İnsan proteomu >
500 000 protein
White House Press Release, June 26, 2000
Proteomiks &MS (PubMed)
Proteomiksde MRM uygulama alanları
EKSPRESYONEL PROTEOMİKS
Protein
Tanımlama
Doku hücre,
organel vb
proteinleri
Protein Ekspresyon
Analizi (göreceli &
mutlak kantitasyon)
Bir duruma özgü
proteinler tanımlanması
(diferansiasyon, evre,
ilaç yanıtı vb)
Protein Biyobelirteç
Keşif (Discovery)
Doğrulama (Verification)
Geçerlilik onaylama
(Validation)
FONKSİYONEL PROTEOMİKS
Proteinler arası
etkileşim analizi
Biosentez yolları,
sinyal yolakları,
multiprotein
karışımlar
Protein modifikasyon
haritalaması
(PTM analizi
fosforilasyon,glikozilasyon,
oksidasyon vb)
MRM Yöntemiyle Protein Kantitasyonu
Metot
Geliştirme
Basamakları
Hedef
Protein
Hedef
Peptid
Kütle
Yü
k
Q1 öncül iyon m/z
Q2 transition m/z
/öncül/ürün
iyon çifti:
744.8/959.4
76
İnsan Plazmasındaki Proteinlerin
“Dinamik Aralığı”
1,000,000,000
Albumin, IgG
100,000,000
Apolipoprotein E
10,000,000
amol/uL plazma
1,000,000
100,000
L-selectin
10,000
1,000
IL-8
100
10
1
0
0
10
20
30
40
50
60
Plazma Proteinleri
Anderson, N.L. and Anderson, N.G., Molecular & Cellular Proteomics, 2003, 2(1): 50.
Örnek Hazırlama Yaklaşımları
MRM-Metabolomiks (<1500 Da)
Hedefli olmayan
Hedefli
 Hücre, doku ya da
organizmada bulunan tüm
bilinen ve bilinmeyen
(100-1000 lerce) metabolitin
incelenmesi
 Belirlenmiş metabolitlerin
(10-100 lerce) kantitasyonu
 Amino asitler ve türevleri
Şeker fosfatlar
Nukleotidler
Koenzim A ve türevleri
Karboksilik asitler
Lipidler ve türevleri…..
 Hastalık metabolizması
 Hücresel metabolik olaylar
 Terapotik hedefler
 İlaçların etki mekanizmaları
 Var olan biyobelirteçlerin
validasyonu…..
Grubumuz
Ar. Gör.Melis KANT
Ar. Gör. Merve Akış
Ar. Gör. Gamze TUNA
(DEÜTF Tıbbi Biyokimya AD)
Teşekkür…
Prof. Dr. Güldal KIRKALI
Prof. Dr. Miral DİZDAROĞLU
(NIST/Washington DC)

lc-tandem ms-mrm temel araştırma ve klinik laboratuvarda kullanımı

Transkript

Benzer belgeler

MAX 4000, CDX 2000B ve Super Max elektrometreleri, QA Beam