Türkçe Çeviri
Transkript
Türkçe Çeviri
BAŞLIK: Endometriosis hastalığına sahip kadınlarda peritoneal sıvı endometrial ve endometriotik hücrelerin mikroRNA ekspresyonunu modifiye ediyor ORİJİNAL BAŞLIK: Peritoneal fluid modifies the microRNA expression profile in endometrial and endometriotic cells from women with endometriosis YAZARLAR: Aitana Braza-Boïls1,*, Salam Salloum-Asfar2, Josep Marì-Alexvere1, Ana Belen Arroyo2, Rocío Gonzalez-Conejero2, Moises Barceló -Molina1, Javier García-Oms3, Vicente Vicente2, Amparo Estelles1, Juan Gilabert-Estelles3, ve Constantino Martínez2 ENSTİTÜ: 1Grupo de Hemostasia, Trombosis, Aterosclerosis y Biología Vascular, Instituto de Investigación Sanitaria La Fe, Valencia, Spain 2Centro Regional de Hemodonación, Servicio de Hematología y Oncología Medica, Hospital Universitario Morales Meseguer, Universidad de Murcia, IMIB-Arrixaca, Murcia, Spain 3 Area Maternoinfantil, Hospital General Universitario, Valencia, Spain ÖZET: Bu araştırmanın amacı endometriozisli hastalardan alınan peritoneal sıvının (PS) endometrial ve endometriotik hücrelerin mikroRNA(niRNA) ekspresyonu üzerine etkisini incelemektir. Bu amaçla sağlıklı 8 kadının endometriumundan yapılan stromal hücre kültürleri, 11 endometriozis (ötopik) ve endometrioma (ektopik) hastasının dokularından yapılan stromal hücre kültürleri sağlıklı kadından alınmış PS (Kontrol PS) veya endometriozisli hastalardan alınmış PS (endometriozis PS) ile muamele edilmiştir. Bir gruba ise hiçbir işlem uygulanmamıştır. miRNA tespiti için arrayler kontrol PS, endometriozis PS uygulanmış veya müdahalede bulunulmamış 8 kontrol grubu kültürü, 11 endometriozis kültürü ve 11 endometrioma kültürü hücrelerine uygulanmıştır. Kültürlere miRNA-16-5p, miRNA-29c-3p, miRNA-424-5p kullanılarak VEGF-A ekspresyonu üzerindeki düzenleyici etkileri araştırılmıştır. miRNA29c-3p’nin miRNA:VEGF ikilisi oluşturarak yaptığı baskılayıcı etkiyi doğrulamak için lusiferaz ekspresyon assayleri kullanılmıştır. Sonuçlar endometriozis PS’nın bütün ötopik hücrelerde miRNA ekspresyonunu etkiledğini gösterdi. Müdahale yapılmayan grupla karşılaştırıldığında endometriozis PS’in 267 miRNA ekspresyonunu değiştirdiği gözlendi. 267 miRNA içinden 9 miRNA (miR-16-5p, miR-21-5p, miR29c-3p, miR-106b-5p, miR-130a-5p, miR-149-5p, miR-185-5p, miR-195-5p, miR-424-5p ) anjiogenez, proteoliz ve endometriozis oluşumu ile ilişkisi olabilecek miRNA olmalarından dolayı ileri deneylerde valide edildi. miRNA 149-5p hariç diğer 8 miRNA validasyon grubunda da endometriozis PS ile muamele edilen hücrelerde istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde daha düşük seviyelerde eksprese edildi. (miR-16-5p, miR-106b-5p, miR-130a-5p; miR-195-5p avemiR-424-5p, P < 0.05; miR-21-5p, miR-29c-3p ve miR-185-5p, P < 0.01). Stromal hücrelrin miRNAs miR-165p, miR-29c-3p ve miR-424-5p mimikleri ile transfeksiyonu sonucu VEGF-A proteininin ekspresyonunda önemli bir düşüş görüldü. Yine de mimik transfeksiyonu sonrası VEGF miRNA ekspresyonunda önemli bir düşüş görülmemesi miRNA’nın miRNA’yı yıkmak yerine VEGF-A translasyonunu önlediğini düşündürdü. Lusiferaz deneyleri miRNA-29c-3p’nin VEGF-A için bir hedef gen olduğunu destekledi. Araştırmamız PS ile muamele edilmiş ötopik hücrelerde miRNA ekspresyonunu gösteren ilk çalışmadır. Aldığımız sonuçlar endometriozis patogenezinin açıklanmasına katkı sağlayabileceği gibi yeni tedavi olanaklarının geliştirilmesinde kullanılabilir. GİRİŞ Endometriosis en sık görülen jinekolojik hastalıklardan biri olup genel populasyonda prevalansı %10 civarındadır ve infertil hastalarda ise %50 varan sıklıklarda görülebilmektedir (Burney ve Giudice, 2012). Hastalık endometrial dokunun uterus dışında bulunması ile karakterize olup genel olarak ağrı ve infertilite problemlerine yol açmaktadır (McKinnon ve ark., 2012). Endometriozisin patogenezinin açıklanmasında en yaygın kabul geren teori retrograd menstruasyon teorisidir (Sampson, 1927). Sampson’ın teorisine göre endometrial parçalar menstruasyon sırasında retrograd olarak peritona ulaşır. Endometriozis hastlarında bu endometrial parçalar devamlılığını sürdürür, yeni damarlanma geliştirerek ektopik lezyonlar haline gelir. Endometriozis benign bir hastalık olmasına rağmen bazı özellikleri, örneğin yaygın anjiogenez, malign hastalıklarda da görülür. Bu bilgi ışığında birçok araştırmacı anjiogenezin endometriozis patogenezindeki rolünü araştırmıştır (Donnez ve ark., 1998; Gilabert-Estelles ve ark., 2007, 2012; Ramon ve ark., 2011; Rahmioglu ve ark., 2012; Rocha ve ark.,2013;Braza-Boils ve ark.,2014). Anjiogenez proanjiojenik ve antianjiojenik etkenlerin dengesiyle olur ve dokualra oksijen, sağlanmasında kritik rol oynar. Bütün anjiojenik etkenlerin içinde ana rol vaküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) ve VEGF reseptörü sisteminindir ve VEGF-A bu sistem içinde en önemli rolü oynar (Shibuya, 2008). Ektopik endometriosis lezyonları pelvik peritonun içinde bulunur ve PS ile sürekli temas halindedir. Bu sebepten ötürü PS komponentlerinin endometriozis gelişimi üzerindeki etkisinin gösterilmesi patogenezin aydınlatılması açısından çok önemlidir. (Cosín ve ark., 2010; Berbic ve Fraser, 2011; Braza-Boïls ve ark., 2013; Olkowska-Truchanowicz ve ark., 2013). Endometriozisli hastaların PS’ında artmış makrofaj sayıları, artmış proinflamatuvar sitokin ve proanjiojenik sitokin seviyeleri, anormal T, B lenfosit ve VEGF-A seviyeleri bildirilmiştir. (Giudice ve Kao, 2004; Gilabert-Estelles ve ark., 2007; Martínez-Roman ve ark., 1997; Olkowska-Truchanowicz ve ark., 2013; Rocha ve ark., 2013). Yakın zamvea Berkes ve ark. (2014) araştırma grubundaki endometriozisli hastaların %49’unda nötrofil ekstraselüler trap (NET) formasyonu gösterirken, kontrol grubundaki hastaların PS’ında nadiren NET formasyonu olduğunu göstermiştir. Gözlemleri artmış NET formasyonunun yanında, bu formasyonunun en fazla Evre 1 ve Evre 2 hastalıkta oluştuğunu göstermiştir. Bu bulgular NET formasyonunun endometriozis başlangıcında rol oynayabileceğine işaret etmektedir. MikroRNA’lar (miRNA) RNA translasyonunu etkileyerek anjiogenezi etkileyebilen ve normal olarak kodlanmayan RNA parçalarıdır (Bartel, 2009). Birçok çalışma miRNA’ların hastalık patogenezinde rol olan proteinlerin ekspresyonu üzerine olan etkisini göstermiştir (Burney et al., 2009; Ohlsson-Teague et al., 2009, 2010; Kuokkanen et al., 2010; Ramo ́n et al., 2012). Jinekolojik hastalıklar içinde endometriozisin oluşumunun bozulmuş miRNA ekspresyonu ile ilgisi gösterilmiştir (Pan et al., 2007, 2008; Toloubey- dokhti et al., 2008; Burney et al., 2009; Guo, 2009; Ohlsson-Teague et al., 2009, 2010; Hawkins et al., 2011; Ramón et al., 2011; Gilabert- Estelles et al., 2012; Braza-Boïls et al., 2013, 2014; Laudanski et al., 2013). Yakın zamanda yaptığımız bir çalışmada miR-16-5p, miR-29c-3p ve miR-424-5p’deki değişikliklerin endometriozis gelişimi ile ilişkisini göstermiştik. In silico çalışmaların gösterdiği üzere bu üç miRNA’nın VEGF-A ekspresyonu üzerindeki etkisi olabilmektedir. miRNA-424-5p’nin anjiogenez regülasyonundaki etkisi başka çalışmalar tarafından da desteklenmektedir(Wang and Olson, 2009; Chamorro-Jorganes et al., 2011). Bunların yanısıra miRNA-16-5p ve miRNA-424-5p’nin endotelyal hücrelerdeki hücre içi anjiojenik aktivete üzerindeki etkisi araştırılmıştır (Chamorro-Jorganes et al., 2011) ve araştırmacılar bu miRNA’ların anjiojenik aktivite üzerinde direkt etkisi olduğunu öne sürmüştür. miRNA-29c’nin anjiogenezdeki rolünün yanı sıra farelerde VEGF-A’nın miRNA-29a tarafından direkt olarak etkilendiği ve miRNA’nın endojen VEGF-A translasyonunu azalttığı da gösterilmiştir (Yang ve ark., 2013). Bildiğimiz kadarıyla bu üç miRNA’nın (miRNA-16-5p, miRNA-29c-3p, miRNA-424-5p) endometriozis hastalarının endometrial ve endometriozis hücrelerinde VEGF-A translasyonu üzerine olan etkisi gösterilmemiştir. Bu çalışmada endometriozis hastalarından alınan PS’nın stromal hücre kültürlerinde üretilen ötopik endemetrium ve ovaryan endometrioma hücreleri üzerine olan etkileri incelenmiştir. Bunların yanı sıra miRNA’ların artmış anjiogenez ile ilişkisi incelenmiştir. MATERYAL VE METOD Etik kurul onayı Çalışmaya katılan bütün hastaların ve kontrol grubunun yazılı onamı alınmıştır. Çalışmamız Politecnico La Fe Üniversitesi Hastanesi Etik Kurul, Valencia, İspanya ve General Universitario Hastanesi, Valencia ,İspanya tarafından onaylanmıştır (#PBL00093). Hasta ve kontrol grupları Hasta grubu Orta ve şiddetli endometriozis hastası beyaz ırk kadınları (Evre III ve Evre IV, revize edilmiş ASRM sınıflama sistemi) araştırmaya dahil edilmiştir. Bütün hastalara laparoskopik yaklaşımla abdominal kavite incelemesi ve total endometriotik doku eksizyonu yapılmıştır. Hastalar klinik olarak veya ultrasonografi bulguları ile şüphelenilen ve laparoskopi ile doğrulanan vakalardan seçilmiştir. Laparoskopik inceleme sırasında araştırma sonuçlarını etkileyebilecek, endometriozis dışında patoloji saptanan hastalar araştırmaya dahil edilmemiştir. Kontrol grubu Sağlıklı endometrium dokuları tubal strelizasyon için laparoskopi yapılan endometriozis hastası olmayan kadınlardan alınmıştır. Endometriotik dokuların yokluğu kapsamlı laparoskopik değerlendirme ile doğrulanmıştır. Kontrol ve hasta gruplarında alınan PS 1500g 4 oC derecede 30 dakika santrifüj işleminden sonra 0.2 mikrometre pora sahip membrandan filtre edilmiş ve -80 oC derecede saklanmıştır. Son 6 ay içerisinde menoraji, menometroraji semptomlarına sahip olan, hamile kalmış veya emzirmiş kadınlar araştırma dışında tutulmuştur. Araştırmaya dahil edilen hiçbir kadın son 3 ay içerisinde hormonal tedavi almamıştır. Doku örnekleri ve hücre soyları Stromal hücre kültürlerini oluşturmak için 11 orta veya şiddetli endometriozis hastasından alınan, 11 endometrial doku (ötopik hücreler)(ortalama yaş 32 yıl; aralık 19-40), 11 ovaryan endometrioma (ektopik hücreler)(ortalama yaş 30 yıl; aralık 19-42) ve 8 sağlıklı kadından alınan kontrol endometrial doku (kontrol hücreleri)(ortalama yaş 36 yıl; aralık 24-43) kullanılmıştır. Endometrial hücre soyu EA.hy926 Amerikan Tipi Kültür Kolleksiyonu’ndan (Manassas,VA, USA) alınmıştır. Endometrial hücreler 2mM glutamin ve %10 fetal bovin serumu eklenmiş, fenol kırmızısı içermeyen Dulbecco’nun modifiye edilmiş Eagle medyumda saklanmıştır. Dicer (HCT- DK) eksik, HCT-116 insan kolon kanseri hücre soyu Dr Renato Baserga (Thomas Jefferson University, PA, USA) tarafından bağışlanmıştır. HCT-DK kültürü 2mM glutamin ve %10 fetal bovin serumu eklenmiş McCoy’un 5A’sında (Sigma-Aldrich, Madrid, Spain) yapılmıştır. PS havuzu PF havuzu 10 endometriozis hastasından (ortalama yaş 33 yıl; aralık 27-39) ve 10 menstrual siklusun proliferatif fazında bulunan fertil sağlık kadından (ortalama yaş 37 yıl; aralık 21-47) elde edilmiştir. Stromal hücre kültürleri ve PS maruziyeti Hücre kültüreleri ve PS muamelesi daha önce Braza-Boïls ve ark tarafından daha önce tarif edildiği gibi yapılmıştır (Braza-Boïls et al., 2013). HCT-DK ve EA.hy926 hücre soylarına Amerikan Tipi Hücre Kültürü Kolleksiyon protokollerine göre kültür yapılmıştır. İstatistiksel Analiz Deneylerden elde edilen sonuçlar PARTEK Genomic Suite yazılımı ile analiz edilmişyit. Gruplar arası karşılaştırma eşleştirilmemiş t-test ile yapılmıştır. İstatistiksel analizler SPSS versiyon 20 ile yapılmıştır (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA) . Lusiferaz aktiviteleri wild-type ve mutant vektörlerin mimikleri ve SCR’leri arasında lineer mix model kullanılarak karşılaştırılmıştır. SONUÇ miRNA ekspresyon profilleri GeneChip miRNA 2.0 kitleri 1105 matür miRNA ve onların 1121 pre‐miRNA probarını içerir. RNA profilleri endometriozis PS, kontrol PS ile muamele edilmiş veya müdahalede bulunulmamış 3 kontrol endometirum kültürü, 4 endometriozis hastasına ait endometrium kültürü ve 3 ovaryan endometrioma kültüründen yapıldı. Kontrol PS ile muamele edilmiş kontrol hücreleri müdahalede bulunulmamış hücre kültürü ile kıyaslandığında herhangi bir miRNA ekspresyonu patterni değişikliği göstermedi(Fig. 1a). Kontrol hücreleri ile kıyaslandığın ötopik (endometriozis endometrium kültürü) ve ektopik (ovaryan endometrioma kültürü) hücreler kontrol ve endometrios PS ile muamele sonrası farklı şekillerde miRNA ekspresyonunda farklılıklar gösterdi(Fig. 1b ve c). ANOVA testi endometriozis PS ile muamele edilen ötopik hücrelerde miRNA ekspresyonunda ciddi değişiklikler gösterdi (Fig. 2e ve h). Değişiklik gösteren miRNA’ların hemen hemen hepsi baskılanma şeklinde değişiklik gösterdi. Ötopik endometriozis PS’sine ve kontrol PS’sine verdiği miRNA değişim patterni hücre kültürleriyle karşılaştırıldığında en ciddi disregulasyon gösteren pattern olarak saptandı, P < 0.05 ve 2‐kat değişim (Fig. 2H) . Endometriozis PS’si ötopik hücrelerinin miRNA’larında bazılarında 12‐kat değişime yol açtığı görüldü. miRNA’lar arasında anlamlı farklılık gösteren hepsi Ven şemasında gösterilmektedir (Fig. 3). PS ile değişim gösteren 267 miRNA’ların içerisinde 82 tanesi matür miRNA’lardı (Fig. 3b). Değişim gösteren miRNAların arasından dokuz tanesini (miR‐16‐5p, miR‐21‐5p, miR‐29c‐3p, miR‐106b‐5p, miR‐130a‐5p, miR‐149‐5p, miR‐185‐5p,miR‐195‐5p, miR‐424‐5p) ileri deneylerde kantitatif Real‐time PCR ile validasyon için seçtik. Bu miRNA’lar içinden miR‐149‐5p hariç diğerlerinin hepsinin ekspresyonunun azaldığı gözlendi. qRT‐PCR ile validasyon miRNA‐149‐5p dışındaki incelenen diğer sekiz miRNA endometriozis PS ile muamele sonrası ötopik hücre kültürlerinde azalmış ekspresyon gösterdiler (Fig 4a‐e,h ve i). miR‐16‐5p ve miRNA‐424‐5p kontrol PS ve endometriozis PS ile muamele edilen kontrol kültürlerinde daha az ekspresyon gösterdi. Ektopik hücrelerde sadece miRNA‐16‐5p PS muamelesi ile anlamlı düşüş gösterdi. Fonksiyonel deneyler VEGF‐A ekspresyonunun seçilen üç miRNA tarafından (miRNA‐16‐5p,miRNA‐29c‐3p, miRNA‐424‐5p) down‐ regüle edilebileceğini test etmek için EA.hy926 endotel hücre kültürleri, kontrol ve endometriozis ötopik hücre kültürleri bu miRNA’ların mimikleri ile transfekte edildi (Fig. 5). miRNA’ların etkili olduğunu saptamak için qRT‐PCR ile miRNA seviyeleri tespit edildi. Sonuçlar kullanılan eksojen miRNA’ların etkiden sorumlu olduğunu gösterdi. Transfekte edilen EA.hy926 hücre soyu azalmış VEGF‐A ekspresyonu gösterdi (Fig. 5a ve d). Yine aynı şekilde ötopik hücre kültürleri aynı mimiklerle transfekte edildiğinde azalmış VEGF‐A ekspresyonu gözlendi. Bu değişiklik sadece hasta hücrelerden yapılan kültürlerde istatistiksel anlamlıydı (Fig. 5 c ve d). Kontrol hücrelerinde değişik dozlarda yapılan tranfeksiyonda VEGF‐A seviyelerinde anlamlı değişiklik gözlenmedi(Fig. 5e). TARTIŞMA Bu çalışmada PS’nın endometrial stromal hücrelerde miRNA ekspresyonunu değiştirdiğini göstedik. Bir önceki çalışmamızda, endometrial ve endometriotik dokularda bozulmuş miRNA ekspresyon profili olduğunu (miR‐16‐5p,miR‐29c‐39 ve miR‐424‐5p) ve in silico çalışmalarda bu miRNA’ların VEGF‐A ekspresyonunu değiştirdiğini göstermiştik (Braza‐Boïls ve ark., 2014). Şimdiki çalışmamızda mimik miRNA kullandığımız fonksiyonel deneyler ile bu miRNA’ların sadece EA.hy926 soyundaki hücrelerde değil aynı zamanda endometriozisli ve sağlıklı kadınların endometrial dokularında da VEGF‐A translasyonunu etkilediğini gösterdik. Anjiogenez endometriozis dahil birçok jinekolojik hastalıkta önemli rol oynamaktadır. miRNA‐29c‐3p anjiogenezin birkaç basamadığında etkisi göstermekte olup öncül endometriotik lezyonların oluşmasında önemli rol oynayabilir (Braza‐Boïls ve ark., 2014). Farelerde yapılan bir çalışmada miRNA‐29a ve miRNA29c’nin VEGF‐A ekspresyonunu direk olarak etkilediği gösterilmiştir(Yang ve ark., 2013). Şimdiki çalışmamızda da miRNA‐29c‐3p’nin insanlarda VEGF‐A ekspresyonunu önemli şekilde azalttığını ve lusiferaz deneylerinde miRNA‐29c‐3p’nin VEGF‐A ‘yı direkt olarak hedef aldığını gösterdik. Hem miRNA‐16‐5p hem de miRNA‐424‐5p miRNA’ları VEGF‐A miRNA’sına bağlayan nükleotid sekansına bağlanıyor. Bu durum iki miRNA’nın hedef genlerinin benzer olduğunu göstermekte. Şimdiki çalışmamızda miRNA‐16‐5p ve miRNA‐424‐5p mimikleri ile transfeksiyon yapılan hücrelerde önemli şekilde azalan VEGF‐A protein ekspresyonu gözlemledik. Yine de VEGF‐A miRNA seviyeleri transfeksiyon sonrası önemli bir şekilde azalma göstermedi. Bu durum miRNA’ların VEGF‐A miRNA’sının yıkımını sağlamak yerine translasyon sürecinde etki gösterdiğine işaret etmekte. Chamorro‐Jorganes ve ark. bir çalışmasında miRNA‐16‐5p ve miRNA‐424‐5p’nin direkt olarak VEGF‐A’yı hedef aldığı gösterilmiştir. Bu bulgularda bizim çalışmamızla uyum içersindedir. miRNA‐424‐5p’nin endometriozis hastalarında gözlenen artmış VEGF‐A seviyeleriyle ilgili olabileceğini daha önceki bir çalışmamızda belirtmiştik (Braza‐Boïls ve ark.,2014). Diğer araştırmacılar da miRNA‐424‐5p’nin VEGF‐A’yı direkt olarak hedef aldığını ve anjiojenik aktivitesini etkilediğini gözlemlemiştir (Wang and Olson, 2009; Chamorro-Jorganes et al., 2011). miRNA’lar hücreler arası iletişimi ekzomlar aracılığıyla sağladığı düşünülmektedir. (Boon ve Vickers, 2013; Kosaka ve ark., 2013). Yine de, miRNA’ların hangi aşamada ekzomlar içine paketlendiği ve hangi aşamada miRNA’ların salgılandığı açıklanmış değildir. Ekzomal miRNA’lar kanda, idrarda ve başka vucüt sıvılarında izole edilmiştir ve bu miRNA ekzomlar üzerindeki yüzey proteinleri ile hangi tip hücreden salgılandıklarına dair ipuçları taşıyabilirler. (Zhang ve ark., 2015). Sound olarak, hastalardan alınan PS endometriozisli kadınlardan alınan endometrial hücrelerde miRNA ekspresyonunu etkilidiğini gözlemledik. miRNA‐16‐5p, miRNA‐29c‐3p ve miRNA‐424‐5p ile yapılan fonksiyonel deneylerde bu miRNA’ların VEGF‐A ekspresyonunu sadece EA.hy926 soyundaki hücrelerde değil aynı zamanda endometrial stromal hücrelerde de değiştirdiğini gözlemledik. miRNA zengini ekzomların endometriozisin bu in‐vitro modeli üzerindeki tam etkisinin anlaşılması için daha ileri çalışmalara ihtiyaç vardır. Bu sonuçlar endometriozisin tedavisinde yeni stratejiler geliştirilmesinde yardımcı olabilir. Referanslar Bartel DP. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell 2009;136:215 – 233. Berbic M, Fraser IS. Regulatory T cells and other leukocytes in the pathogenesis of endometriosis. J Reprod Immunol 2011;88:149–155. Berkes E, Oehmke F, Tinneberg HR, Preissner KT, Saffarzadeh M. Association of neutrophil extracellular traps with endometriosis-related chronic inflammation. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 2014;183:193 – 200. Betel D, Koppal A, Agius P, Sander C, Leslie C. Comprehensive modeling of microRNA targets predicts functional non-conserved and non-canonical sites. Genome Biol 2010;11:R90. Boon RA, Vickers KC. Intercellular transport of microRNAs. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2013;33:186–192. Braza-Bo ̈ıls A, Gilabert-Estelle ́s J, Ramo ́n LA, Gilabert J, Mar ı́ -Alexandre J, Chirivella M, Espan ̃a F, Estelle ś A. Peritoneal fluid reduces angiogenesis- related microRNA expression in cell cultures of endometrial and endometriotic tissues from women with endometriosis. PLoS One 2013; 8:e62370. Braza-Bo ̈ıls A, Mar ́ı-Alexandre J, Gilabert J, Dolors S-I, Espan ̃a F, Estelle ́s A, Gilabert-Estelle ś J. microRNA expression profile in endometriosis: its relation to angiogenesis and fibrinolytic factors. Hum Reprod 2014; 29:978 – 988. Burney RO, Giudice LC. Pathogenesis and pathophysiology of endometriosis. Fertil Steril 2012;98:511–519. Burney RO, Hamilton AE, Aghajanova L, Vo KC, Nezhat CN, Lessey BA, Giudice LC. MicroRNA expression profiling of eutopic secretory endometrium in women with versus without endometriosis. Mol Hum Reprod 2009;15:625–631. Chamorro-Jorganes A, Araldi E, Penalva LO, Sandhu D, Ferna ́ndez- Hernando C, Sua ́rez Y. MicroRNA-16 and microRNA-424 regulate cell-autonomous angiogenic functions in endothelial cells via targeting vascular endothelial growth factor receptor-2 and fibroblast growth factor receptor-1. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2011;31:2595 – 2606. Chamorro-Jorganes A, Araldi E, Rotllan N, Cirera-Salinas D, Sua ́rez Y. Autoregulation of glypican-1 by intronic microRNA-149 fine tunes the angiogenic response to FGF2 in human endothelial cells. J Cell Sci 2014; 127:1169 – 1178. Cos ́ın R, Gilabert-Estelle ́s J, Ramo ́n LA, Go ́mez-Lecho ́n MJ, Gilabert J, Chirivella M, BrazaBo ̈ıls A, Espan ̃a F, Estelle ś A. Influence of peritoneal fluid on the expression of angiogenic and proteolytic factors in cultures of endometrial cells from women with endometriosis. Hum Reprod 2010;25:398 – 405. Donnez J, Smoes P, Gillerot S, Casanas-Roux F, Nisolle M. Vascular endothelial growth factor (VEGF) in endometriosis. Hum Reprod 1998; 13:1686 – 1690. Gilabert-Estelle ś J, Ramo ́n LA, Espan ̃a F, Gilabert J, Vila V, Re ́ganon E, Castello ́ R, Chirivella M, Estelle ś A. Expression of angiogenic factors in endometriosis: its relation to fibrinolytic and metalloproteinase (MMP) systems. Hum Reprod 2007;22:2120–2127. Gilabert-Estelles J, Braza-Boils A, Ramon LA, Zorio E, Medina P, Espan ̃a F, Estelles A. Role of microRNAs in Gynecological Pathology. Curr Med Chem 2012;19:2406–2413. Giudice LC, Kao LC. Endometriosis. Lancet 2004;364:1789–1799. Guo SW. Epigenetics of endometriosis. Mol Hum Reprod 2009;15:587 – 607. Hawkins SM, Creighton CJ, Han DY, Zariff A, Anderson ML, Gunaratne PH, Matzuk MM. Functional microRNA involved in endometriosis. Mol Endocrinol 2011;25:821–832. Hulsmans M, Holvoet P. MicroRNA-containing microvesicles regulating inflammation in association with atherosclerotic disease. Cardiovasc Res 2013;100:7 – 18. Paraskevopoulou MD, Georgakilas G, Kostoulas N, Vlachos IS, Vergoulis T, Reczko M, Filippidis C, Dalamagas T, Hatzigeorgiou AG. web server v5.0: service integration into miRNA functional analysis workflows. Nucleic Acids Res 2013;41:W169 – W173. Kosaka N, Yoshioka Y, Hagiwara K, Tominaga N, Katsuda T, Ochiya T. Trash or treasure: extracellular microRNAs and cell-to-cell communication. Front Genet 2013;4:173. Kozomara A, Griffiths-Jones S. miRBase: integrating microRNA annotation and deep-sequencing data. Nucleic Acids Res 2011;39:D152–D157. Kuokkanen S, Chen B, Ojalvo L, Benard L, Santoro N, Pollard JW. Genomic profiling of microRNAs and messenger RNAs reveals hormonal regulation in microRNA expression in human endometrium. Biol Reprod 2010; 82:791 – 801. Laudanski P, Charkiewicz R, Kuzmicki M, Szamatowicz J, Charkiewicz A, Niklinski J. MicroRNAs expression profiling of eutopic proliferative endometrium in women with ovarian endometriosis. Reprod Biol Endocrinol 2013;11:78. Lewis BP, Burge CB, Bartel D. Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates that thousands of human genes are microRNA targets. Cell 2005;120:15–20. Mart ı́ nez-Roma ́n S, Balasch J, Creus M, Fa ́bregues F, Carmona F, Vilella R, Vanrell JA. Transferrin receptor (CD71) expression in peritoneal macrophages from fertile and infertile women with and without endometriosis. Am J Reprod Immunol 1997;38:413–417. McKinnon B, Bersinger NA, Wotzkow C, Mueller MD. Endometriosis- associated nerve fibers, peritoneal fluid cytokine concentrations, and pain in endometriotic lesions from different locations. Fertil Steril 2012; 97:373 – 380. Nakashima T, Jinnin M, Etoh T, Fukushima S, Masuguchi S, Maruo K, Inoue Y, Ishihara T, Ihn H. Down-regulation of mir-424 contributes to the abnormal angiogenesis via MEK1 and cyclin E1 in senile hemangioma: its implications to therapy. PLoS One 2010;5:e14334. Wagaarachchi P, Robertson S, Print C, Hull L. MicroRNA-regulated pathways associated with endometriosis. Mol Endocrinol 2009;23:265 – 275. Ohlsson-Teague EM, Print CG, Hull ML. The role of microRNAs in and friends. J Cell Biol 2013;200:373–383. Rayner KJ, Hennessy EJ. Extracellular communication via microRNA: lipid particles have a new message. J Lipid Res 2013;54:1174–1181. endometriosis and associated reproductive conditions. Hum Reprod Rocha AL, Reis FM, Taylor RN. Angiogenesis and endometriosis. Obstet Gynecol Int 2013;2013:859619. Olkowska-Truchanowicz J, Bocian K, Maksym RB, Białoszewska A, Salloum-Asfar S, TeruelMontoya R, Arroyo AB, Garc ́ıa-Barbera ́ N, Update 2010;16:146 – 165. Włodarczyk D, Baranowski W, Za ̨bek J, Korczak-Kowalska G, Malejczyk J. CD4? CD25? FOXP3? regulatory T cells in peripheral blood and peritoneal fluid of patients with endometriosis. Hum Reprod 2013;28:119–124. Pan Q, Chegini N. MicroRNA signature and regulatory functions in the endometrium during normal and disease states. Semin Reprod Med 2008; 26:479 – 493. Pan Q, Luo X, Toloubeydokhti T, Chegini N. The expression profile of micro-RNA in endometrium and endometriosis and the influence of ovarian steroids on their expression. Mol Hum Reprod 2007;13:797 – 806. Rahmioglu N, Missmer SA, Montgomery GW, Zondervan KT. Insights into assessing the genetics of endometriosis. Curr Obstet Gynecol Rep 2012; 1:124 – 137. Ramo ́ n LA, Braza-Bo ̈ıls A, Gilabert-Estelle ́ s J, Gilabert J, Espan ̃ a F, Chirivella M, Estelle ś A. microRNAs expression in endometriosis and their relation to angiogenic factors. Hum Reprod 2011;26:1082–1090. Ramo ́ n LA, Braza-Bo ̈ıls A, Gilabert J, Espan ̃ a F, Chirivella M, Estelle ́ s A, Gilabert-Estelle ś J. microRNAs related to angiogenesis are dysregulated in endometroid endometrial cancer. Human Reprod 2012;27: 3036–3045. Chaudhry A, Schuetz E, Luengo-Gil G, Vicente V, Gonza ́lez-Conejero R, Mart ı́ nez C. Regulation of coagulation factor XI expression by microRNAs in the human liver. PLoS One 2014;9:e111713. Sampson JA. Metastatic or embolic endometriosis, due to the menstrual dissemination of endometrial tissue into the venous circulation. Am J Pathol 1927;3:93–110. Shibuya M. Vascular endotelial growth factor-dependent and independent regulation of angiogenesis. BMB Rep 2008;41:278–286. Toloubeydokhti T, Pan Q, Luo X, Bukulmez O, Chegini N. The expression and ovarian steroid regulation of endometrial micro-RNAs. Reprod Sci 2008;15:993 – 1001. Wang S, Olson EN. AngiomiRs: key regulators of angiogenesis. Curr Opin Genet Dev 2009;19:205–211. Yang L, Engeland CG, Cheng B. Social isolation impairs oral palatal wound healing in SpragueDawley rats: a role for miR-29 and miR-203 via VEGF suppression. PLoS One 2013;8:e72359. Zhang J, Li S, Li L, Li M, Guo C, Yao J, Mi S. Exosome and exosomal microRNA: trafficking, sorting, and function. Genomics Proteomics Bioinformatics 2015;13:17–24.