proteinlerin nicel olarak tayini

PROTEİNLERİN NİCEL OLARAK TAYİNİ
Doğal kaynaklardaki protein miktarlarını hesaplayabilmek için pekçok yol vardır. Yöntemlerin bu derece çokluğuna
karşın, genelde herhangi bir örnekteki protein miktarını en iyi saptayan ve tam istediğimiz sonucu veren bir yol yoktur. Ancak
protein miktarını en iyi şekilde saptayabilmek için proteinin ve örnekteki diğer bileşiklerin yapısına , deneyin hassasiyetine göre
metod seçilmelidir.
Farklı proteinler farklı absorpsiyon spektrumu gösterirler ve hiç bir protein standardı tüm proteinler için gerekli görevi
yerine getiremez. En iyi uygulama şekli, çalışılacak olan her protein için bir standart eğri çizmektir. Fakat bu her zaman olası
değildir. Çünkü, protein saf olarak elde edilmeyebilir. Bu durumlarda ticari olarak satılan saf proteinler standart olarak kullanılır.
En yaygın kullanılan protein standartı sığır serum albuminidir (BSA).
Standart grafik, içerisindeki madde derişimi bilinmeyen bir çözeltinin absorbans değerinden yararlanılarak derişim
değerinin bulunduğu grafiktir.
Standart grafik
Doğal kaynaklardaki protein miktarını saptama yöntemleri:
a) Biüret Yöntemi
1-10 mg/ml hassasiyette çalışan bu yöntem, alkali koşullar altında Cu2+ iyonlarının amonyum,aminoasitler, peptidler, proteinler
ve biüretler gibi amonyumlu bileşiklerle mavi-mor renkli kompleks oluşturması esasına dayanır. Protein ve peptidlerde iki peptid
bağı oluşumuna katılan 4 azot atomu ile biüret ayıracından gelen Cu2+nin renkli kompleks oluşturması esastır. Oluşan bu
kompleks 540-560 nm dalga boyunda maksimum absorbans verir.
Biüret bileşiği yapı olarak peptid bağına benzer bir maddedir ve Cu2+iyonları ile proteinlerin verdiği reaksiyona benzer bir renkli
kompleks oluşturur. Bu nedenle kullanılan yönteme Biüret Yöntemi, Cu2+içeren çözeltiye de Biüret Ayıracı adı verilir.
www.hasanunal.net
NH2
NH2
O=C
NH2
O=C
NH
+
NH2
O=C
C=O
NH
NH
NH
Cu+2 Bazik
O=C
O=C
NH2
NH2
Biüret
O=C
NH
+
O=C
O=C
Peptit Zincirleri
C=O
NH
Cu+2 Bazik
RHC
NH
NH2
Biüret Kompleksi
O=C
NH
C=O
NH2
Biüret
O=C
RHC
Cu+2
O=C
NH
RHC
CHR
Cu+2
O=C
NH
NH
Peptit Zincirleri
C=O
NH
Biüret Kompleksi
b) Lowry Yöntemi
Metod, alkali koşullar altında Biüret reaksiyonu ve aromatik aminoasitlerin (Tirozin,Triptofan) Cu2+ katalizli
oksidasyonundan sonra, ayıraçta bulunan Fosfomolibdik, Fosfotungstik asit ile heteropolimolibden mavisine indirgenmeyi içeren
Folin-Ciocalteu reaksiyonunun bir kombinasyonudur.Koyu mavi renk oluşumu karakteristiktir ve 750 nm dalga boyunda
maksimum absorbans verir. Yöntem çok duyarlıdır (30-150 µg/ml), ancak pH’ya bağımlıdır.
c)Warburg-Christian Yöntemi :
Diyaliz ya da fraksinasyon yoluyla protein olmayan maddelerin uzaklaştırılmasından sonra 260-280 nm’de UV.
absorbsiyon analizleri yapılır. Proteinlerin triptofan ve tirozin reziduları 275-280 nm’de UV. absorbansını arttırır. Çünkü beraber
durumdaki bu iki amino asitin saf bir protein çözeltisindeki derişimleri birçok proteinde genellikle sabittir. 260/280 nm
yönteminde duyarlılık 0,05-210 mg/ml dır. ml.'deki mg protein = A280 - A260 dır.
(1.55 x A280 )- (0.76 x A260) = mg protein/ ml
www.hasanunal.net
d)Bradford (Coomassie Blue) Yöntemi :
Oldukça duyarlı olan bu yöntem (150-750 µg/ml); organik boyaların, proteinlerin asidik ve bazik grupları ile
etkileşerek, renk oluşturmasını esas alır. Mavi rengin oluşmasında proteinin aminoasit bileşimi (özellikle arjinin gibi bazik
aminoasitler ve aromatik aminoasitler) önemlidir.Yöntemde protein 595 nm dalga boyunda maksimum absorbans verir.
Ayrıca protein tayini yapılırken, koşullar uygun olduğu taktirde, Smith yöntemi, Kjeldahl analizi, bulanıklık ölçümleri
(turbidimetri), özgül aktivitenini ölçülmesi, kırılma indeksinin ölçulmesi (refraktometri) ve saflaştırılıp kurutulmuş örneklerin
doğrudan tartılması yöntemlerindende yararlanılabilir.
Biüret Testi İçin Standart Eğrinin Hazırlanması
Araç ve Gereçler
*2 mg/ml standart serum albumin (% 0.9 NaCl içinde),
*% 10 sodyum deoksikolat (DOC); proteinin üç boyutlu yapısını bozarak Cu2+ iyonlarının bütün peptid azotlarına bağlanmasını
kolaylaştırır
*% 0.9 NaCl
Biüret çözeltisi; 1.5 gm bakır sülfat (CuSO4.5 H20) ve 6 gm Sodyum potasyum tartarat (NaKC4H4064H20) 500 ml damıtık suda
çözülür. 300 ml % 10 W/V sodyum hidroksit (NaOH) çözeltisi birinci çözeltiye devamlı karıştırarak eklenir ve ayıraç 1 lt'ye damıtık
su ile tamamlanır (bakır oksit çökeleği oluşursa 1 gm potasyum iyodür eklenebilir).
Test Tüpü
Pipet (1 ve 5 ml. lik pipet)
Kolorimetre tüpler
İzlenecek Yol
TABLO
Tüp No
Bileşikler (ml)
1
2
3
4
5
6
A) 2 mg/ml BSA
-
0.1
0.2
0.5
l.0
l.4
1.0
B) % 10 Sodyum deoksikolat (DOC)
0.1 0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
C) % 0.9 NaCl
1.4 1.3
1.2
0.9
0.4
-
0.4
D) Biüret çözeltisi
1.5 1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
Toplam Hacim
3.0 3.0
3.0
3.0
3.0
3.0
3.0
1)
7 (örnek)
Kör tüpü (1 no.lu tüp) ve Örnek tüpü (7 no.lu tüp) hariç bütün tüplere tabloda verilen miktarlarda BSA (Standart Serum
Albumin) ilave edin.
2)
7 no.lu örnek tüpüne derişimini bilmediğiniz protein örneğinden 1 ml ekleyin.
3)
Bütün tüplere 0.1 ml Sodyum Deoksikolat (DOC) ilave edin.
4)
Bütün tüplere tabloda verilen miktarlarda % 0.9 NaCl (Serum fizyolojik) ekleyin
5)
Bütün tüplere 1,5 ml Biüret çözeltisi ilave edin.
www.hasanunal.net
6)
Oluşan rengin sabitlenmesi için 30 dakika bekleyin.
7)
540 nm ye ayarlı spektrofotometrede 1 numaralı kör tüpüne karşı 2,3,4,5,6 ve 7. tüplerin absorbanslarını okuyun.
8)
2,3,4,5 ve 6. Tüpler için okuduğunuz absorbans değerlerini ordinatta (y ekseni),bu tüplerdeki BSA derişimlerini absiste (x
eksenine) göstererek Standart grafiği çizin.
9)
Bu standart grafiği kullanarak derişimini bilmediğiniz 7 no.lu tüpteki örneğinizin protein derişimini bulun.
www.hasanunal.net