Besiyeri

Bakterilerin
Üretilmesi
Dr. Banu SANCAK
Mikrobiyal Üreme
Üreme = Hücrelerin sayısında
artma
Bakteri üremesi icin
gerekli olan faktörler
nelerdir?
BAKTERİ ÜREMESİ İCİN GEREKLİ
OLAN FAKTÖRLER
A.Fiziksel faktörler:
1. Sıcaklık
2. pH
3.Ozmotik basınç
B. Kimyasal faktörler
1. Karbon
2. Nitrojen, sülfür, fosfor
3. Oksijen
4. Mineraller: K, Mg, Ca…
5. Büyüme fakterleri: vitaminler,
a.a.ler, pürin, pirimidin
Bakterileri
laboratuvar koşullarında
üretebiliyor muyuz?
Neden?
1. Canlı Ortamlar
1) Deney hayvanları:
Kobay, fare, sıçan, hamster, tavşan ve maymun.
2) Embryonlu yumurta:
Sarı kese, amniyotik zar, allantoik boşluk,
embryo.
3) Hücre kültürleri:
Hep-2, HeLa, Vero
2. Cansız Ortamlar
Besiyerleri
Fiziksel özelliklerine göre
Besiyerleri
Katı besiyerleri
Yarıkatı besiyerleri
Sıvı besiyerleri
1843 – 1910
Agar
ROBERT KOCH
 Experimented with medium to grow bacteria on.
 He tried gelatin, but it did not work.
 Wife of colleague recommended agar (a gelatinlike product derived from seaweed).
 Didn’t melt, and bacteria couldn’t digest it.
 He could also add various nutrients necessary to
grow certain organisms.
 Koch (pronounced Coke) originated use of a two part
dish for growing bacteria (______ ______
named after Julius Petri, a German
bacteriologist), and a technique for isolating pure
bacterial colonies.
Agar
• Kompleks polisakkarit
• 100°C :sıvı, ~40°C katılaşır
Katı (%2-3 agar)
Yarıkatı (%0.3-0.5 agar)
Fiziksel özelliklerine göre
Besiyerleri
Katı (%2-3 agar) : Koloni oluşumu
Yarıkatı (%0.3-0.5 agar): Hareket
Sıvı:Tortu, zar oluşması, bulanıklık
Besiyerleri
Katı besiyeri
• Kolonilerin
değerlendirilmesi
Yarı-katı besiyeri
Hareket özelliği
• Non motile bacteria
will only be found at
the site of inoculation
• Motile bacteria 
swim around go
everywhere
Sıvı Besiyeri
It is used as
• enrichment media
• biochemical testing
media
• Blood culture media
Amaçlarına göre besiyerleri
1. Temel (basit)
2. Zenginleştirici
3. Seçici
5. Ayırt edici
6. Transport
7. Saklama
1. Temel/Basit besiyeri
♪ Buyyon (nutrient broth)
Pepton %1, et suyu %1, NaCl %0.05
♪ Adi agar (nutrient agar)
%2-3 agar eklenmiş buyyon
2. Seçici besiyeri
 İstenmeyen bakterilerin inhibisyonu
 Antibiyotik, safra tuzu, boya …
Salmonella-Shigella agar
Mc Conkey agar, EMB agar, Endo agar
2. Seçici besiyeri
Salmonella-Shigella agar
Sığır eti özütü:………
Pepton:…………………….
Laktoz:…………………….
Safra tuzları………….
Sodyum sitrat……….
Sodyum tiyosülfat…
Ferrik sitrat:………….
Nötral kırmızısı:……
Brillant yeşili:……….
Agar…………………………
Lactose
gr/L
5
5
10
8.5
8.5
8.5
1
0.025
0.33 mg
13.5
Lactose fermenter
H2S + Ferric ammonium citrate
Acid
Neutral red
Pink colonies
Ferrous sulfide
Black precipitate
2. Seçici besiyeri
EMB (Eosin Methylene Blue)
dyes inhibit Gram (+) bacteria
selects for Gram (-) bacteria
G.I. Tract infections caused by Gram (-) bacteria
Gram negatif bakterileri üretir
3. Ayırt edici besiyeri
 Belli özelliklere göre bakterilerin
birbirinden ayırt edilmesini sağlar
gr/L
Pepton: …………………… 10
Laktoz: …………….
10
K2HPO4: ………………….
2
Eozin Y:…………………… 0.4
Metilen mavisi:………
0.06
Agar: ……………………… 15
pH:6.8
Eosin Methylene Blue (EMB)
Agar
E. coli
http://www.cat.cc.md.us/courses/bio141/
E.
aerogenes
labmanua/lab3/embeacolony.html
ASİT oluşumu: pembe koloni (Enterobacter aerogenes)
ASİT: metalik refle (E. coli)
Laktoz fermentasyonu (-): renksiz (S. typhimurium)
S. Typhimurium
P. aeruginosa
MacConkey's
(MAC)
MacConkey’s media is both selective & differential.
1. Selective because it only grows Gram-negative
bacteria. Inhibits the growth of Gram-positive
bacteria.
2. Differential because neutral red (pH-sensitive
dye) and lactose (type of sugar) have been added
to media.
- Bacteria that use lactose for food (lactose fermenters),
produce acidic metabolites that trigger the pH
sensitive dye to turn pink.
- So lactose fermenting bacteria will grow in bright pink
colonies while non-lactose fermenters will be
colorless and clear.
Enteric bacteria are the most frequently encountered
bacteria isolated from many types of clinical specimens.
They are most commonly lactose fermenters.
3. Ayırt edici besiyeri
EMB, Endo by: Laktoz (+) ve (-) bakterilerin ayrımı
3. Ayırt edici besiyeri
Kanlı agar: Hemoliz özelliği kullanılarak beta ve alfa
hemolitik Streptokokların ayrımı
27
Blood agar (BAP)
Most specimens received in a clinical microbiology lab are
plated onto Blood Agar. It is an enriched medium that
will grow even fastidious bacteria.
Also contains 5% sheep blood.
This media is not selective. It is enriched and differential:
Certain bacteria produce enzymes called ___________that
act on red cells to produce either:
* ______ hemolysis: Enzymes lyse the blood cells completely,
producing a clear area around the colony.
* _______ hemolysis: Incomplete hemolysis produces a greenish
discoloration around the colony.
* _______ hemolysis: No effect on the red cells.
Blood agar is usually inoculated from a patient’s throat swab.
Microbiologist are trying to detect Group A beta hemolytic
Streptococcus pyogenes (a Gram-positive cocci-shaped
bacteria that causes Beta hemolysis on blood agar.)
selective &
differential
media
29
4. Zenginleştirici besiyeri
 Üreyebilmek için kan, serum gibi maddelere ihtiyaç gösteren
 Özellikle nazlı bakteriler için
Kanlı agar
Çikolata agar: Haemophilus influenzae, Neisseria spp
Selenit F
besiyeri
30
Çikolata agar
Kanlı agar (%5 kan)
5. Transport besiyeri
 Amies besiyeri
 Stuart besiyeri
 Cary- Blair besiyeri
Sodyum tiyoglikolat……
Sodyum Klorür…………….
Disodyum Fosfat………..
Agar………………………………
gr/L
1.5
5
1.1
5
pH: 8.5 V.cholerae
transportunda kullanılabilir
Amies
Stuart
Pepton………………………
Sodyum Klorür………..
gr/L
10
10
pH: 8.5
Kültür gecikecekse
(> 6 saat) Cary Blair
tercih edilmeli
6. Saklama besiyerleri
 Gliserollü triptik soy buyyon
 Gliserollü beyin kalp infüzyon buyyon
Major Contribution to Culture
Media
Besiyerlerine
ekim yöntemleri
nelerdir?
Ekim Yöntemleri
•
•
•
•
Plak üzerine tek koloni ekim yöntemi
Tüpte sıvı besiyerine ekim yöntemi
Tüpte yarıkatı besiyerine ekim yöntemi
Tüpte katı besiyerine ekim yöntemi
İnokulasyonda kullanılan
araçlar
 Öze
– Yuvarlak (Katı besiyerine ekim)
– İğne (tüpte sıvı ve katı besiyerlerine ekim)
– Çengel (küf cinsi mantar ekimi)
 Eküvyon
Streak Plate
Tek koloni ekim yöntemi
Tek koloni ekim yöntemi
Tek koloni ekim yöntemi
1. Aerop ve fakültatif anaerop
kültür yöntemleri
• Etüv (normal atmosfer)
• Karbondioksitli etüv (%5-10CO2)
• Mumlu kavanoz (%5-10 CO2)
– 18-24 saat, 37 °C’de
2. Mikroaerofilik bakterilerin
üretilmesi
Mumlu
kavanoz
%1-4 O2
%5-10 CO2 (KAPNOFİLİK)
Mikroaerofiller
Brucella abortus
Campylobacter jejuni
Grow best under reduced O2 levels and increased CO2 levels
Normal Atmosphere:21 % O2, 0.3 to .03 % CO2
3. Anaerobik Kültür
Metodları
1 .Redükleyici madde
(Tiyoglikolatlı besiyeri)
2. Anaerobik kavanoz
3. Anaerobik kabin
3. Anaerobik Kültür
Metodları
Tiyoglikolatlı
besiyeri
• O2 girişini önlemek için redükleyici ajanlar içerir
– Tiyoglikolik asit, sistein,
– Birçok mikroorg.nın üremesi için zengin besiyeri
•
•
•
•
O2 tüpün 1/3 üst kısmına kadar penetre olmaktadır
Tiyoglikolik asit (TGA): organik bir bileşik: HSCH2CO2H.
thiol (mercaptan) + carboxylic acid ‘den mg.
HAVA VARLIĞINDA okside olur:[SCH2CO2H]2.
3. Anaerobik Kültür
Metodları
Anaerobik
kabin
3. Anaerobik Kültür
Metodları
Anaerobik
kavanoz
Üreme Özellikleri
Sıvı besiyerinde üreme özellikleri
1. Yüzeyde halka ya da
zar (ring or pellicle)
oluşumu
2. Flokülent (küçük parçalar)
3. Bulanıklık
4. Sediment
Katı besiyerinde
üreme özellikleri
nedir?
Koloni Özellikleri
•
•
•
•
•
•
Koloni büyüklüğü
Koloni biçimi
Koloni yapısı
Koloni rengi
Koloni kokusu
Hemolitik aktivitesi
FYI
Colonial Morphology
Shape
Edge
Elevation
Size
Chromogenesis
Opacity
Surface
Consistency
Emulsifiability
Odor
54
Shape
55
Edge
Elevation
Koloni Tipleri
S (Smooth) düzgün koloni
– Düzgün kenarlı, yuvarlak, homojen
görünümlü, hafif kabarık koloniler.
– Örnek: Staphylococcus aureus
Koloni Tipleri
R (Rough) kaba koloni
– Düzgün olmayan, kenarları girintili, yüzeyi
buruşuk veya granüllü koloniler
– Örnek: Mycobacterium tuberculosis
Koloni Tipleri
M (Mucoid) koloni
– Düzgün,yapışkan, parlak koloniler
– Örnek: Klebsiella pneumoniae
• Bacillus subtilis
– Colony shape and size: irregular
Margin (edge): undulate (wavy)
Elevation: umbonate
Color: white, dull
Texture: dry (or rough).
• Staphylococcus aureus
– Colony shape and size: circular
Margin (edge): entire
Elevation: corvex
Color: yellow
Texture: butyrous (buttery)
59
Bakterilerin hemoliz özelliği
• Alfa hemoliz
– Koloni çevresinde yeşilimsi
renk değişikliği
• Beta hemoliz
– Koloni çevresinde şeffaf
renk değişikliği
Bakterilerin hemoliz özelliği
• Gama hemoliz
– Koloni çevresinde renk değişikliği
görülmemesi
The Gram Stain
Gram's
iodine
Crystal
violet
Decolorise with
acetone
Gram-positives
appear purple
Counterstain with
e.g. methyl red
Gram-negatives
appear pink
Gram boyama
Preparat hazırlama
Kristal viyole ile boyama
Tüm hücreler boyayı alırlar
Lugol ile boyama
Tüm hücreler mavi-siyah boyanır
Etil alkol ile dekolorizasyon
Karşıt boya ile boyamaSulu fuksin
Gram pozitif
Gram negatif
Gram Staining Steps
1. Crystal violet acts as the primary stain. Crystal violet may
also be used as a simple stain because it dyes the cell
wall of any bacteria.
2. Gram’s iodine acts as a mordant (Helps to fix the
primary dye to the cell wall).
3. Decolorizer is used next to remove the primary stain
(crystal violet) from Gram Negative bacteria (those with
LPS imbedded in their cell walls). Decolorizer is
composed of an organic solvent, such as, acetone or
ethanol or a combination of both.)
4. Finally, a counter stain (Safranin), is applied to stain
those cells (Gram Negative) that have lost the primary
stain as a result of decolorization
Dr.T.V.Rao MD
67
Gram staining
• Named after Hans
Christian Gram,
differentiates
between Grampositive purple and
Gram-negative
pink stains and is
used to identify
Dr.T.V.Rao MD
certain pathogens.
68
Staining
• cationic dyes - basic, with positive charges
on the chromophore
• anionic dyes - acidic, with negative
charges on the chromophore
• surfaces of microbes are negatively
charged and attract basic dyes – positive
staining.
• negative staining – microbe repels dye &
it stains the background
69