Bölüm 4 DNA Ekstraksiyonu ve Saflastirilmasi - EU

Transkript

Gıda Örneklerinde
Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri
Bölüm 4
DNA Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması
M. Somma
WORLD HEALTH ORGANIZATION
REGIONAL OFFICE FOR EUROPE
WELTGESUNDHEITSORGANISATION
REGIONALBÜRO FÜR EUROPA
ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE
BUREAU REGIONAL DE L'EUROPE
ВСЕМИРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ
ЕВРОПЕЙСКОЕ РЕГИОНАЛЬНОЕ БЮРО
2
İçindekiler
Bölüm 4
Giriş
3 Ekstraksiyon yöntemleri
4 Saflaştırma yöntemleri
4 CTAB ekstraksiyon ve pürifikasyon yöntemi
6 Spektrofotometre ile DNA miktar tayini
9 DNA’nın spektrofotometrik olarak belirlenme ilkeleri
9 Nükleik asit konsantrasyonunun belirlenmesi
11 Deneysel
13 Kaynaklar
17 Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri
Bölüm 4
3
Giriş
Nükleik asitlerin ekstraksiyonu ve saflaştırılması çoğu moleküler biyolojik çalışmada
ve rekombinant DNA tekniklerinin tümünde ilk adımdır. Nükleik asit ekstraksiyon
yöntemlerinin buradaki amacı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) kullanarak bir GD
spesifik analiz için farklı kaynaklardan nükleik asit saflaştırılmasını sağlamaktır.
Nükleik asitlerin kalitesi ve saflığı PCR analizleri için en önemli faktörlerden
bazılarıdır. Yüksek saflıkta, inhibisyon bulaşanlarından arındırılmış nükleik asitleri
elde etmek için, uygun ekstraksiyon yöntemleri uygulanmalıdır. PCR analiz
performansını inhibe eden olası bulaşanlar Tablo 1’de listelenmiştir. Örnekteki PCR
inhibitorlerinin varlığından kaynaklanan yanlış (negatif) bir sonucun ortaya çıkmasını
engellemek için PCR inhibisyonu test edilerek kontrollü bir deney gerçekleştirilmesi
önemlidir. Bu amaçla, bir bitki-spesifik (ökaryot veya kloroplast) veya türe spesifik
PCR analizi sıklıkla kullanılır.
Tablo 1. PCR işleminin bazı inhibitörleri
İnhibitör
İnhibisyon Konsantrasyonu
SDS
Fenol
Etanol
İzopropanol
Sodyum asetat
Sodyum klorit
EDTA
Hemoglabin
Heparin
Üre
Reaksiyon karışımı
>%0,005
>%0,2
>%1
>%1
>5 mM
>25 mM
>0,5 mM
>1 mg/ml
>0,15 i.u./ml
>20 mM
>%15
Nükleik asitlerin ekstraksiyonu ve pürifikasyonu için çok çeşitli yöntemler vardır, en
uygun tekniğin seçimi genellikle asağıdaki kriterlere bağlıdır:

Hedef nükleik asit

Kaynak organizma

Başlangıç materyali (doku, yaprak, tohum, işlenmiş materyal vb.)

İstenen sonuçlar (verim, saflık, pürifikasyon için gerekli süre)

Bir sonraki uygulama (PCR, klonlama, işaretleme, blotlama, RT-PCR, cDNA
sentezi),vs
Nükleik asitlerin ekstraksiyonu ve saflaştırılması için günümüzde en yaygın olarak
kullanılan bazı yöntemlerin ilkeleri aşağıdaki bölümlerde açıklanacaktır.
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri
Bölüm 4
4
Ekstraksiyon yöntemleri
Biyolojik materyalden nükleik asitlerin ekstraksiyonu hücre parçalanması, hücre
nükleazların inaktivasyonu ve nükleik asitlerin parçalanmış hücreden ayrımını
gerektirir. Genellikle ideal parçalama prosedürü birtakım tekniklerin bileşiminden
oluşur. Bu süreç karmaşık baslangıç materyalini (doku gibi) parçalayacak kadar sert,
ancak hedef nükleik asidi koruyacak kadar da yumuşak olmalıdır. Temel parçalama
prosedürü aşağıdaki yöntemlerle gerçekleştirilebilir:

Mekanik parçalama (öğütme, hipotonik parçalama gibi)

Kimyasal uygulama (deterjanlarla parçalama, tıol ile redükleme, kaotropik katkı
madeleri,vs gibi)

Enzimatik parçalama (Proteinaz K gibi)
Hücre içi nükleazların inaktivasyonu ve hücre membranının parçalanması işlemleri
birleştirilebilir. Örneğin, tek bir çözelti hücre membranını parçalamak için deterjanlar,
hücre içi enzimleri inaktive etmek için de güçlü kaotropik tuzlar içerebilir. Hücre lizizi
ve nükleaz inaktivasyonundan sonra hücre içi diğer faktörlerin uzaklaştırılması
filtrasyon veya presipitasyon(çökeltme) gibi işlemlerle kolayca yapılabilir.
Saflaştırma yöntemleri
Hücre ekstraktlarından nükleik asitlerin saflaştırılması yöntemleri genellikle aşağıdaki
tekniklerden iki veya daha fazlasının birlikte kullanımını gerektirir:
Ekstraksiyon / presipitasyon
Kromatografi
Santrifügasyon
Afinite kolon ayrımı
Bu tekniklerin kısa açıklamaları takip eden paragraflarda verilecektir (Zimmermann
ve ark., 1998).
Ekstraksiyon / Presipitasyon
Çözücü ekstraksiyonu nükleik asitlerden kontaminantları uzaklaştırmak için sıklıkla
kullanılır. Örneğin, fenol ve kloroform kombinasyonu proteinleri uzaklaştırmak için,
izopropanol ve etanol ile presipitasyon genellikle nükleik asitleri konsantre etmek için
kullanılır. Hedef nükleik asitlerin miktarı düşük olduğunda, presipitasyonun etkisini
artırmak için karışıma bir inert taşıyıcı (glikojen gibi) ilave edilebilir. Nükleik asitlerin
diğer presipitasyon yöntemleri yüksek konsantrasyonlu tuz (salting out) kullanılarak
Bölüm 4
5
yapılan seçici presipitasyon ve pH’daki değişiklikler kullanılarak yapılan protein
presipitasyonunu içerir.
Kromatografi
Kromatografi yöntemleri jel filtrasyonu, iyon değişimi, seçici adsorpsiyon veya affinite
ile bağlanma gibi farklı ayrıştırma tekniklerinden oluşabilir. Jel filtrasyonu, jel
partikülleri porlarının moleküler eleme özelliği ile işler. Belirli por çapına sahip bir
matriks daha küçük moleküllerin difüzyon yolu ile porlara girişine izin verir, daha
büyük moleküller porlar tarafından içeri alınmaz ve boş hacimle ayrıştırılılar. Böylece
moleküller molekül büyüklüğü azalışına bağlı olarak sırayla elüye edilir. İyon değişimi
kromatografisinde, bir hedef molekül ve kolon matrisindeki fonksiyonel gruplar
arasındaki elektrostatik interaksiyondan yararlanılır. Nükleik asitler (yüksek negatif
yüklü, lineer polianyonlar) iyon değişimi kolonundan basit tuz tamponları ile
ayrıştırılır. Adsorpsiyon kromatografisinde, nükleik asitler diğer biyolojik moleküllerin
aksine, belirli tuzlar varlığında (örn. kaotropik tuzlar vb.) seçici olarak silika veya cam
yüzeyler üzerine tutunur. Daha sonra düşük konsantrasyonlu bir tuz tamponu veya
su ile nükleik asitleri, bir sonraki uygulamada direkt olarak kullanabilen bir örnek
oluşturacak biçimde, ayrıştırmak mümkündür.
Santrifügasyon
Seçici santrifüj güçlü bir saflaştırma yöntemidir. Örneğin yüksek g-gücünde kendi
kendine oluşan CsCl gradientlerdeki ultrasantrifügasyon, plazmit saflaştıması için
uzun süredir kullanılmaktadır. Genellikle, santrifüj bir başka yöntemle kombine
edilerek kullanılır. DNA ve RNA’yi daha küçük kontaminantlardan (tuzlar, nükleotidler,
vb) tampon degişimi veya büyüklük tespiti amacıyla saflaştırmak için jel filtrasyonla
santrifügasyonu birleştiren spin kolon kromatografisi buna bir örnektir. Bazı
prosedürler, kromatografik bir matriks ( bknz. Bir üst paragraf) üzerindeki selektif
adsorpsiyon ile santrifugal elüsyonu bir nükleik asit çeşidinin seçici saflaştırılmasi için
kombine eder.
Afinite kolon ayrımı
Son yıllarda bir çok saflaştırma yöntemi nükleik asitlerin afinite immobilizasyonunu
manyetik ayrıştırmayla birleştirmiştir. Örneğin, poly(A)+mRNA, biyotin işaretli
oligo(dT) ile streptavidin kaplı manyetik partiküllere bağlanabilir. Bu bağlanmış
partiküller solusyondan ve bağlanmamış kontaminantlatdan bir mıknatıs yardımı ile
ayrıştırabilir. Bu katı faz tekniği, santrifugasyon, organik ekstrasyon ve faz
Bölüm 4
6
ayrıştırmanın bazı aşamalarını basit, hızlı bir manyetik ayrıştırma ile yaptığı için
nükleik asit saflaştırma olayını basitleştirir.
CTAB ekstraksiyon ve pürifikasyon yöntemi
İlk
kez
Murray
ve
Thompson
tarafından
1980’de
geliştirilen
CTAB
(Cetyltrimethylammonium bromide) protokolü Wagner ve arkadaşları tarafından
1987’de yayınlanmıştır (Wagner ve ark., 1987). Bu yöntem bitki ve bitki kaynaklı gıda
maddelerinden DNA ekstraksiyonu ve pürifikasyonu için kullanılır. Yöntem özellikle
polisakkaritlerin ve polifenolik bileşenlerin elimine edilmesine uygundur; diğer bir
deyişle saf DNA eldesi ve dolayısıyla da DNA kalitesinde etkilidir. Bu prosedür bitki
moleküler
genetiğinde
yaygın
bir
biçimde
kullanılmakadır
ve
GDO’ların
saptanabilmesi için yapılan validasyon denemelerinde test edilmiştir (Lipp ve ark.,
1999; 2001). Birkaç değişiklik tekniğin birçok ham ve işlenmiş gıda matriksinde
kullanılabilmesi için geliştirilmiştir (Hupfer ve ark., 1998; Hotzel ve ark., 1999; Meyer
ve ark., 1997; Poms ve ark., 2001).
CTAB yönteminin ilkeleri: Liziz, ekstraksiyon ve presipitasyon
Bitki hücreleri, az tuzlu bir ortamda nükleik asitlerle birlikte çözünmez bir kompleks
oluşturan, iyonik bir deterjan olan CTAB ile lize olabilir. Bu koşullarda, polisakkaritler,
fenolik bileşenler ve diğer kontaminantlar süpernatantta kalır ve ortamdan yıkama ile
uzaklaştırılabilir. DNA kompleksi tuz konsantrasyonu arttırılarak çözünülür ve etanol
ve izopraponal ile presipite edilir. Bu bölümde, bu üç temel aşamanın ilkeleri, hücre
duvarı lizizi, genomik DNA ekstraksiyonu ve presipitasyonu açıklanacaktır.
Hücre duvarı lizizi: Daha önce açıklandığı gibi, DNA ekstraksiyonunun ilk aşaması
hücre ve çekirdek duvarlarının parçalanmasıdır. Bu amaçla, homojenize örnek ilk
aşamada EDTA Tris/HCl ve CTAB içeren ekstraksiyon tamponu ile muamele edilir.
Bütün biyolojik membranlar kovalent olmayan bağlarla birbirine bağlı lipit ve protein
moleküllerinden oluşan temel bir yapıya sahiptir.
Bölüm 4
7
Şekil 1. Hücre membranlarının basit gösterimi (Şekil 1, 2, 3 Genetic Science
Learning Center, University of Utah http://gslc.utah.edu)
Şekil 1’de gösterildiği gibi, lipit molekülleri, içinde protein moleküllerinin bulunduğu,
süreklilik gösteren bir çift tabaka biçiminde dizilmiştir. Lipit molekülleri baş olarak
isimlendirilen hidrofilik uçlar ve kuyruk olarak isimlendirilen hidrofobik uçlardan
oluşur. CTAB yönteminde membran lizizi, ekstraksiyon tamponu içinde bulunan bir
deterjan (CTAB) ile yapılır. Lipitler ve deterjan benzer kompozisyonlara sahip olduğu
icin, ekstraksiyon tamponunun CTAB bileşeni hücre ve çekirdek membranını
oluşturan lipitleri tutma özelliğine sahiptir. Bir deterjan kullanılarak çözünen lipitlerin
mekanizmasi Şekil 2’de gösterilmektedir.
Şekil 2. Lipit çözünmesi
Şekil 3, hücre membranının CTAB ekstrasyon tamponuna maruz kaldığında
deterjanın genomik DNA’yı çıkararak lipitleri ve proteinleri nasıl yakaladığını
göstermektedir. Spesifik bir tuz (NaCl) konsantrasyonunda, deterjan nükleik asitlerle
çözünmez bir kompleks oluşturur. EDTA magnezyum dahil farklı metallere
bağlanabilen kelatlayıcı bir bileşendir. Magnezyum DNAaz enziminin kofaktörüdür.
Mg ve EDTA bağlanması ile, varolan DNAaz’ın aktivitesi azalır. Tris/HCl pH’yı
tamponlama kapasitesine sahip bir çözeltidir (düşük veya yüksek pH DNA’ya zarar
verir). Nükleik asitler saflaştırmanın bu aşamasında kolayca degrade olabildiği için
örneğin homojenizasyonu ve CTAB tampon çözeltisinin eklenmesi arasındaki
zamanın en aza indirilmesi önemli bir noktadır. Hücre ve organel membranları
Bölüm 4
(mitokondri
ve
kloroplast
8
gibi)
parçalandıktan
sonra
DNA
pürifikasyonu
gerçekleştirilir.
Şekil 3. Hücre membranının parçalanması ve genomik DNA’nın ekstrasyonu
Ekstraksiyon: Bu aşamada polisakkaritler, fenolik bileşikler, proteinler ve sıvı
çözeltide bulunan diğer hücre lizatları, CTAB nükleik asit kompleksinden ayrılır. Çok
sayıda enzimatik reaksiyonu inhibe etme yetenekleri nedeniyle fenolik bileşiklerin
olduğu gibi polisakkaritlerin de yok edilmesi özelikle önemlidir. Düşük tuz
konsantrasyonlarında ( 0,5 M NaCl), nükleik asit kompleksi kontaminantları çökmez
ve solüsyonun klorofomr ile ekstraksiyonu sırasında uzaklaştırlıbailir. Kloroform
proteinleri denatüre eder ve sıvı ile organik fazların ayrılmasını kolaylaştırır. Normal
olarak, sıvı faz formu üstteki fazdır. Ancak, sıvı faz tuz konsantrasyonu nedeniyle
yoğun ise alt fazı oluşturacaktır. Buna ek olarak, sıvı çözeltinin pH’sı 7,8-8,0
değerlerine yeteri kadar denkleştirilmemiş ise nükleik asitler organik faza
dağılacaktır. Gerektiğinde sıvı fazdaki kirleticileri tamamen ortadan kaldırabilmek için
kloroform ekstraksiyonu iki veya üç kez uygulanır. Nükleik asitleri en iyi şekilde geri
kazanabilmek için organik faz geri özütlenerek bir önceki ekstrakta eklenebilir.
Nükleik asit kompleksi bir kez saflaştırıldığında, prosedürün son aşaması olan
presipitasyon gerçekleştirilebilir.
Presipitasyon: Son aşamada, nükleik asitler deterjandan ayrılır. Bu amaçla, ilk
olarak sıvı solusyon yüksek konsantrasyonlu NaCl ( 0,8 M NaCl) ve CTAB
karışımından oluşan bir presipitasyon çözeltisi ile muamele edilir. Tuz nükleik asit
presipitatı oluşumu için gereklidir. Sodyum asetat tamponlama kapasitesi nedeniyle
NaCl yerine tercih edilebilir. Bu koşullar altında, alkol içerisinde suda olduğundan
daha çözünür olan deterjanlar, nükleik asitler presipite olurken yıkanıp atılabilirler.
Takip eden %70 alkol ile muamele, nükleik asitlerin geri kalan tuzdan arındırılarak ek
bir saflaştırma yapılmasını sağlar.
Bölüm 4
9
Spektrofotometre ile DNA miktar tayini
DNA,
RNA,
oligonükleotidler
ve
hatta
mononükleotidler
seyreltilmiş
veya
seyreltilmemiş sıvı solusyonlar içinde, ultraviyole ışığı altında (aynı zamanda görünür
dalga boylarında) sahip oldukları absorbsiyon A (optik yoğunluk, OD) üzerinden
direkt olarak ölçülebilir. Örnek saf olduğunda (örneğin proteinler, fenol veya agaroz
gibi kontaminantlar çok düşük miktarlda mevcut yahut yoksa) nükleotid bazları
tarafından absorbe olan ultraviyole radasyonun miktarı spektrofotometrik olarak basit
ve doğru biçimde ölçülebilir. Bu yöntem için, düşük iyon konsantrasyonlu sıvı
tamponlar (örneğin TE tamponu) idealdir. Nüklek asitlerin konsantrasyonu genellikle
bir köre (boş örnek) karşı 260 nm’de A ölçülerek belirlenir. Kontaminantların varlığı,
oran hesaplaması ile ayırt edilebilir. Proteinler 280 nm’de absorbladığı için A260/A280
oranı nükleik asitin saflığını hesaplamak için kullanılır. Saf DNA yaklaşık 1,8 , saf
RNA ise yaklaşık 2,0 değerini vermelidir. 230 nm’de görülen absorpsiyon, örneğin
karbonhidratlar,
peptitler,
fenoller veya
aromatik
bileşenler
gibi
maddelerle
kontaminasyonu gösterir. Saf örneklerde A260/A230 oranı yaklaşık 2,2 olmalıdır.
Alternatif bir yöntem olan etidiyum bromidli agaroz yöntemi, nükleik asitlerin düşük
miktarlarda mevcut olduğu durumlarda kullanışlıdır. Nükleik asit miktarı, bir seri
konsantrasyon standardıyla karşılaştırılarak, UV ışığına maruz bırakıldığında
etidiyum bromid tarafindan ışınan floresanın yoğunluğundan hesaplanabilir.
DNA’nın spektrofotometrik olarak belirlenme ilkeleri
Spektrofotometrik ölçümde, bir çözeltideki çözüntü konsantrasyonunu belirlemek için
ışığın çözeltide iletilme oranını kullanır. Cihaz, belirli bir dalga boyunda bir ışık
hüzmesinin bir örnekten geçtiği ve iletilen ışık enerjisi miktarının örneğin diğer
tarafında bir fotosel ile ölçüldüğü basit bir ilkeyle çalışır.
Şekil 4’te gösterildiği gibi tek ışık yolu olan bir spektrometre, ışık kaynağı, prizma,
örnek kuyucuğu ve fotoselden oluşur. Bunların her birine aydınlatma yoğunluğunu ve
dalga boyunu kontrol etmek ve fotoseldeki enerjiyi voltaj dalgalanmasına
dönüştürmek için uygun elektrik ya da mekanik sistemler bağlanmıştır. Oluşan voltaj
dalgalanması daha sonra metre ölçeğinde görüntülenir veya daha sonraki
incelemeler için bir bilgisayara kaydedilir.
Bölüm 4
10
Şekil 4. Işık iletimi şeması
Bütün moleküller ışık enerjisini belirli bir dalga boyunda emerler. Böylece bir çözelti
içindeki çözüntünün konsantrasyonunu bulmak olasıdır. Beer-Lambert kuralına göre
absorsiyon (emilim, soğurma) A (optik yoğunluk, OD olarak da adlandırılır) ile makro
molekülün konsantrasyonu (c) arasında aşağıdaki denklemde verilen doğrusal bir
ilişki vardır:
A=OD= ε.I.c
ε molar sönüm katsayısı (molar extinction coefficient), c konsantrasyon ve l küvetin
ışık yolu uzunluğudur. Proteinler ve nükleik asitler, ultraviyole alanda ışığı 210 ve 300
nm arasında emerler. Daha önce açıklandığı gibi DNA ve RNA çözeltilerinin
maksimum emilimi 260 nm’de, protein çözeltilerinin ise 280 nm’de olmaktadır. DNA
ve RNA çözeltileri ışığı kısmen 280 nm’de ve protein çözeltileri 260 nm’de
soğurduğundan 260 ve 280 nm (A260/A280) ölçüm aralığındaki bir oran, nukleik
asitlerin saflık değerini verir. DNA ve RNA yaklaşık olarak 1,8 ve 2,0 değerlerinde
A260/A280’e sahiptir. 10 mm’ lik bir ışık yolu ve 260 nm’lik bir dalga boyu için A=1
absorpsiyon, yaklaşık 50 µg/ml dsDNA, 37 µg/ml ssDNA, 40 µg/ml RNA veya 30
µg/ml oligonükleotidlere denk gelmektedir. Eğer proteinden kaynaklanan bir
kontaminasyon varsa A260/A280 yukarıda verilen değerlerden daha az olacaktır ve
nükleik asit miktarının doğru ölçümü mümkün olmayacaktır. Burada, DNA
çözeltilerinde RNA’dan kaynaklanan kirlenmelerin spektrofometre ile sağlıklı bir
şekilde tespit edilemeyeceğinin altını çizmek gerekir. 325 nm’de A ölçümü,
çözeltideki çöküntü varlığını ya da küvetin kirli olduğunu göstermede kullanılır.
Bölüm 4
11
Nükleik asit konsantrasyonunun belirlenmesi
Küvet seçimi: Absorbans (A) ölçümü için kullanılan nükleik asit miktarı küvet
kapasitesine bağlıdır. Örnek konsantrasyonuna, seyreltme faktörüne ve mevcut
örnek hacmine bağlı olarak uygun bir küvet, seçilmelidir. GDO saptaması için
kullanılan birçok prosedürde elde edilen genomik DNA’nın hacmi 50 ile 100 µl
arasındadır. Düşük hacimli nükleik asitlerin spektroskopik ölçümü için 5 ile 70 µl
kapasitede, mikro hacimli küvet çeşitleri kullanılır.
Kurulum : Spektrofotometrenin kalibrasyonu şu nedenlerle önemlidir :

Doğru ışık yolu uzunluğunu ayarlamak,

dsDNA, ssDNA veya RNA için doğru faktörü belirlemek,

Su ya da bir tampon solüsyonundan (A260=0) oluşan boş bir solüsyonu ölçmek
(kör),

Kurulum referansını belirli aralıklarla yenilemek,

Kurulum referansının güvenilirliliğini kontrol etmek için saf nükleik asitten belirli bir
miktar ölçmek
Bilinmeyen örneklerin ölçümü : Kullanılan küvetin kapasitesine bağlı olarak belirli
miktarda DNA çözeltisi konsantrasyon değerlendirmesi için kullanılır (örneğin 0,2
ml’nin altında kapasitesi olan bir küvet için 5 µl DNA 195 µl su ile seyreltilir).
Spektrofotometre ayarlandıktan ve nükleik asit çözeltisi eklendikten sonra küvetin
kapağı kapatılır, çözelti karıştırılır ve absorbans ölçülür. Pipetten kaynaklanan
hataları aza indirmek için ölçüm en az iki kere tekrarlanmalı ve her zaman en az 5 µl
DNA çözeltisi kullanılmalıdır. 0,02’den az veya 1 ile 1,5 (kullanılan cihaza bağlı
olarak) arasındaki A260 ölçümleri, yüksek hata payı olasılığı nedeniyle tavsiye
edilmemektedir.
Bir çözeltide bulunan belirli bir nükleik asitin c konsantrasyonu A260’ın 260 nm’de
ölçülen absorbans olduğu düşünülerek aşağıdaki denklemler kullanılarak hesaplanır.
Tek zincirli DNA
c(pmol/µl) = A260/0,027
Çift zincirli DNA
c(pmol/µl) = A260/0,020
Tek zincirli RNA
c(pmol/µl) = A260/0,025
Oligonükleotid
c(pmol/µl) = A260100/1,5NA+0,71NC+1,20NG+0,84NT
Bölüm 4
12
Referans DNA’nın, 50 µg/ml icin A260=1 olduğu dsDNA olduğu düşünülerek, 10 mm duvar
kalınlığı olan bir küvette 1x TNE tamponunda çözülmüş saf calf thymus DNA’nın absorbans
ölçümleri Tablo 2’de örneklenmiştir. DNA konsantrasyonu 25 µg/ml’dir.
Tablo 2. 1x TNE tamponundaki çok saf calf thymus DNA’nın absorbans ölçümleri
Dalga boyu
Absorbans
A260/A280
c (µg/ml)
325
0,01
-
-
280
0,28
-
-
260
0,56
2,0
28
230
0,30
-
-
Bölüm 4
13
Deneysel
Ekipman
NOT
Ekipmanların tamamı kullanımdan önce sterilize edilmeli ve herhangi bir olası DNA kalıntısı
uzaklaştırılmalıdır. Kontaminasyondan kaçınmak için, aerosoldan korunmuş filtreli pipet
uçları kullanılmalıdır.
 Steril bir jilet, veya bir havan gibi, örneğin boyutlarını küçültmede kullanılacak
aletler

Su banyosu veya ısıtıcı blok

Mikrosantrifüj

Mikropipetler

Vorteks karıştırıcı

1,5 ml mikrosantrifüj tüpleri

Tartım kapları veya eşdeğeri

Spatüller

Terazi (0.01 g tartabilen)

Looplar

Mikrosantrifüj tüpleri için taşıyıcı raf

Opsiyonel : DNA peletlerini kurutmak için vakum desikatör
Çözeltiler
NOT
Kimyasalların tümü moleküler biyolojide kullanılabilir saflıkta olmalıdır. Deiyonize su ve
tamponlar kullanımdan önce otoklavlanmalıdır. Ayrıca, hiçbir kimyasal, DNA ve DNaz
içermemelidir.

Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB)

Kloroform

İsopropanol

Na2EDTA
CAS 124-03-8
CAS 6381-92-6
Bölüm 4
14

Etanol

NaCl

Proteinaz K

RNaz A

Tris(hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride (Tris-HCl)

Steril deiyonize su
CTAB tampon çözeltisi
20 g/l CTAB
4g
1,4 M NaCl
16,4 g
0,1 M Tris HCl
3,15 g
20 mM Na2EDTA
1,5 g

100 ml deiyonize suya eklenir.

1 M NaOH ile pH 8’e ayarlanır.

Deiyonize su ile 200 ml’ ye tamamlanır ve otoklavlanır.

4°C’de maksimum 6 ay depolanır.
CTAB presipitasyon çözeltisi
5 g/l CTAB
1g
0,04 M NaCl
0,5 g

Deiyonize su ile 100 ml’ ye tamamlanır.

Çözeltinin pH’sı 1 M NaOH ile 8’e ayarlanır.

Deiyonize su ile 200 ml’ye tamamlanır ve otoklavlanır.

Çözelti 4°C’ de maksimum 6 ay saklanır.
1,2 M NaCl

7 g NaCl deiyonize suda çözülerek 100 ml’ye tamamlanır.

Otoklavlanır ve oda sıcaklığında saklanır.
%70 (v/v) Etanol çözeltisi
70 ml saf etanol 30 ml steril deiyonize su ile karıştırılır.
Bölüm 4
15
RNAaz A 10 mg/ml -20°C’de saklanır.
Proteinaz K 20 mg/ml -20°C’de saklanır.
Prosedür
Bu prosedür steril koşullar gerektirir. Kontaminasyon, örnek hazırlama sırasında tek
kullanımlık ekipman ve dekontaminasyon çözeltileri kullanılarak ve toz oluşturmaktan
kaçınılarak engellenebilir.

Homojenize örnekten 100 mg steril bir 1,5 ml’lik mikrosantrifüj tüpe aktarılır.

300 µl steril deiyonize su eklenir, bir loop ile karıştırılır.

500 µl CTAB-tampon çözeltisi eklenir, bir loop ile karıştırılır.

20 µl Proteinaz K (20 mg/ml) eklenir, sallayıcı karıştırıcıda 65°C 30-90 dakika inkübe
edilir.

20 µl RNaz A (10 mg/ml) eklenir, sallayıcı karıştırıcıda 5-10 dakika inkübe edilir.

Yaklaşık 16000x g’de 10 dakika santrifüjlenir.

Süpernatant 500 µl kloroform içeren bir mikro santrifüj tüpüne eklenir, 30 saniye
karıştırılır.

Faz ayrılana kadar 16000x g’de 10 dakika santrifüjlenir.

Üst tabakanın 500 µl’si, 500 µl kloroform içeren yeni bir mikro santrifüj tüpüne
aktarılır ve karıştırılır.

16000x g’de 5 dakika santrifüjlenir.

Üst tabaka yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarılır.

2 hacim (çektiğimiz üst tabaka çözeltinin 2 katı) CTAB presipitasyon çözeltisi eklenir,
pipet ile karıştırılır.

60 dakika oda sıcaklığında inkübe edilir.


Süpernatant atılır.

Pelet 350 µl NaCI (1,2 M)’de çözündürülür.

350 µl kloroform eklenir ve 30 saniye çalkalanır.

Faz ayrılana kadar 16000x g’de 10 dakika santrifüjlenir.

Üst tabaka yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarılır.

0,6 hacim izopropanol eklenir ve çalkalanır.



%70’lik Etanol çözeltisinden 500 µl eklenir ve dikkatlice karıştırılır.
Bölüm 4



Pelet kurutulur ve 100 µl steril deiyonize suda DNA tekrar çözündürülür.
16
DNA çözeltisi buzdolabında maksimum iki hafta, veya dondurucuda -20°C’de daha
uzun bir süre saklanabilir.
Bölüm 4
17
Kaynaklar
Hotzel, H., Müller, W. and Sachse, K. (1999). Recovery and characterization of
residual DNA from beer as a prerequisite for the detection of genetically modified
ingredients. European Food Research Technology 209, 192-196.
Hupfer, C., Hotzel, H., Sachse, K. and Engel, K.H. (1998). Detection of the genetic
modification in heat-treated products of Bt maize by polymerase chain reaction.
Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und -Forschung A 206, 203-207.
Lipp, M., Bluth, A., Eyquem, F., Kruse, L., Schimmel, H., Van den Eede, G. and
Anklam, E. (2001). Validation of a method based on polymerase chain reaction
for the detection of genetically modified organisms in various processed
foodstuffs. European Food Research Technology 212, 497-504.
Lipp, M., Brodmann, P., Pietsch, K., Pauwels, J. and Anklam, E. (1999). IUPAC
collaborative trial study of a method to detect genetically modified soy beans and
maize in dried powder. Journal of AOAC International 82, 923–928.
Meyer, R. and Jaccaud, E. (1997). Detection of genetically modified soya in
processed food products: development and validation of PCR assay for the
specific detection of glyphosate-tolerant soybeans. In Amadò, R. Battaglia (Eds.).
Proceedings of the ninth European conference on food chemistry (Vol. 1).
Authenticity and adulteration of food-the analytical approach. 24-26 September
1997. Interlaken 1, 23-28. ISBN: 3-9521414-0-2.
Murray, M.G. and Thompson, W.F. (1980). Rapid isolation of high molecular weight
plant DNA. Nucleic Acids Research 8, 4321–4325.
Poms, R.E., Glössl, J. and Foissy, H. (2001). Increased sensitivity for detection of
specific target DNA in milk by concentration in milk fat. European Food Research
Technology 213, 361-365.
Wagner, D.B., Furnier, G.R., Saghay-Maroof, M.A., Williams, S.M., Dancik, B.P. and
Allard, R.W. (1987). Chloroplast DNA polymorphisms in lodgepole and jack pines
Bölüm 4
18
and their hybrids. Proceedings of the National Academy of Science USA 84,
2097–2100.
Zimmermann, A., Lüthy, J. and Pauli, U. (1998). Quantitative and qualitative
evaluation of nine different extraction methods for nucleic acids on soya bean
food samples. Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und -Forschung A 207,
81–90.
Bölüm 4

Bölüm 4 DNA Ekstraksiyonu ve Saflastirilmasi - EU

Transkript

Benzer belgeler

SGS MRL-LIMS Auto Report Sending Application

laurence jenkell

MİKROBİYAL GENOTİPLENDİRMEDE YENİ TEKNOLOJİLER

biyoteknoloji 2015

PDF - Acıbadem Üniversitesi Sağlık Bilimleri Dergisi

Bolum 11 Roundup Ready? Soya`nin Es Zamanli - EU

nükleik asitler

genetiğe giriş - BahceBitkileri.org

Erciyes Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Dergisi

ET ÜRÜNLERİNDE TBA TAYİNİ Gıdalarda bulunan yağlar ile hanın