Baskıda PDF Dosyasını İndir / In Press PDF File
Transkript
Baskıda PDF Dosyasını İndir / In Press PDF File
Araştırma Makalesi / Research Article 291 TE D Doi: 10.4274/npa.y6987 (Nöropsikiyatri Arflivi 2014; 51: XX) (Archives of Neuropsychiatry 2014; 51: XXX) Nöro-Behçet Hastalarının Serumlarında Beyin Dokusu ve Beyin Damarlarına Karşı Otoantikor Varlığı EC The Presence of Autoantibodies Against Vascular and Nervous Tissue in Sera From Patients with Neuro-Behçet’s Disease Ayşe İlksen ÇOLPAK1, Umut KALYONCU2, Yasemin GÜRSOY ÖZDEMİR1 1Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi, Nöroloji Anabilim Dalı, Ankara, Türkiye 2Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi, Ramatoloji Anabilim Dalı, Ankara, Türkiye ABSTRACT Introduction: Behçet’s disease is a chronic inflammatory disease of unknown aetiology that affects multiple organ systems. Since the diagnosis of this disease mainly relies on clinical criteria, a diagnostic laboratory test is required especially for neuro-Behçet’s patients without systemic involvement. Methods: In this study, we searched for the presence of autoantibodies against brain tissue, by means of indirect immunofluorescent staining technique in sera obtained from patients with neuro-Behçet’s disease, based on reports that humoral immune dysregulation may play a role in susceptibility to Behçet’s disease. After pre-absorbtion of sera with guinea pig liver powder to reduce nonspecific staining, serum samples were applied to mouse brain sections and immunoreactivity was detected with fluorescein (FITC)-conjugated goat antibody against human IgG. Results: Ten sera from neuro-Behçet’s patients and 10 age-matched control sera were screened for immunoreactivity. We detected specific immunoreactivity to both parenchymal and vascular brain structures in the patients’ sera. Parenchymal vessel immunopositivity was detected in 8 of 10 patients, whereas only two of control sera showed no significant parenchymal vascular immunoreactivity (p=0.025). In addition to vascular immunoreactivity, filamentous and reticular immunopositive structures were detected in brain sections of 5 out of 10 patients. No such immunoreactivity was detected in sections incubated with control sera (p=0,016). Conclusion: We detected a specific immunoreactivity against vascular and parenchymal filamentous structures in neuro-Behçet patients’ sera. Humoral autoimmunity may play a role in the pathogenesis of neuro-Behçet’s disease in addition to cellular immune response. Findings of this preliminary study will be evaluated with a large number of patients and controls, to determine whether it is the cause or the result and, further studies are underway to disclose the nature of epitope to which the immunoreactivity was directed against and to develop a diagnostic laboratory method for investigating central nervous system involvement in Behçet’s patients. (Archives of Neuropsychiatry 2014; 51: XX) Key words: Behçet’s Disease, Neuro-Behçet’s Disease, Autoimmunity, Immunohistochemistry U N C O R R ÖZET Giriş: Behçet Hastalığı çoklu sistem tutulumu ile giden, etyolojisi ve fizyopatolojisi bilinmeyen, kronik, inflamatuar bir hastalıktır. Hastalığın tanısının klinik bulgulara dayanan kriterlere göre konulması ve özellikle diğer bulguların eşlik etmediği, nörolojik tutulumla başlayan hastalarda tanının belirlenmesindeki güçlükler, özgül bir laboratuvar testinin eksikliğine dikkati çekmektedir. Yöntem: Bu çalışmada, immün sistem bozukluğuna bağlı geliştiği düşünülen durumlarda uygulanan, indirekt immünfloresan boyama tekniği kullanarak, SSS tutulumu olan Behçet hastalarının serumlarında, SSS’e karşı otoantikor varlığı araştırılmıştır. Önce hasta ve kontrol serumları, özgül olmayan boyanmayı önleyebilmek için kobay karaciğeri ile preabsorbsiyona tabi tutulmuşlardır. Takiben fare beyin dokusu ile inkübe edilerek, floresan (FITC) ile konjuge, insan IgG’sine karşı keçide hazırlanmış IgG ile işaretlenmiştir. Beyin kesitleri floresan mikroskop ile değerlendirilmiştir. Bulgular: On nöro-Behçet hastası ve 10 yaş uyumlu kontrol bireyin serumları immünreaktivite açısından incelenmiştir. Hasta serumları ile fare beyin dokusunun inkübasyonu sonucunda hem parankimal hem de vasküler yapılara karşı özgül immünreaktivite tespit edilmiştir. 10 hastanın 8’inde parankimal vasküler boyanma varken, kontrollerin sadece 2 tanesinde hastalarla karşılaştırıldığında çok belirgin olmayan immünreaktivite görüldü (p=0,025). Vasküler immünreaktiviteye ek olarak, 10 hastanın 5’inde filamentöz ve retiküler yapılarda immünreaktivite gözlenirken, kontrollerin serumlarıyla yapılan inkübasyonlarda, hiçbirinde benzer bir boyanma saptanmamıştır (p=0,016). Sonuç: SSS tutulumu olan Behçet hastalarının serumlarında, hem parankimal hem de vasküler yapılara karşı özgül immünreaktivite tespit edilmiştir. Bu bulgular, Behçet hastalığı SSS patogenezinde hümoral otoimmünitenin rolü olabileceğini düşündürmektedir. Daha çok sayıda hasta ve kontrolün dahil edileceği bir çalışma ile, bu ön çalışmada tespit edilen bulguların, bir sebep mi yoksa sonuç mu olduğu araştırılacaktır. Bu tespit edilen özgün immünoreaktivitenin ne tür bir epitopa ait olduğu incelenerek, Behçet Hastalığının SSS tutulumu için klinikte kullanılabilecek bir laboratuvar yöntemi geliştirilmeye çalışılacaktır. (Nöropsikiyatri Arflivi 2014; 51: XX) Anahtar kelimeler: Behçet Hastalığı, Nöro-Behçet Hastalığı, Otoimmünite, İmmunhistokimya Çıkar çatışması: Yazarlar bu makale ile ilgili olarak herhangi bir çıkar çatışması bildirmemişlerdir. Conflict of interest: The authors reported no conflict of interest related to this article. Yaz›flma Adresi/ Correspondence Address Dr. Ayşe İlksen Çolpak, Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi, Nöroloji Anabilim Dalı, Ankara, Türkiye Gsm: +90 532 694 59 96 E-mail: [email protected] Geliş tarihi/Receive: 30.11.2012 Kabul tarihi/Accepted: 01.01.2013 © Nöropsikiyatri Arşivi Dergisi, Galenos Yayınevi taraf›ndan bas›lm›flt›r. / © Archives of Neuropsychiatry, published by Galenos Publishing. Çolpak ve ark. Nöro-Behçet Hastalarının Serumlarında Beyin Dokusu ve Beyin Damarlarına Karşı Otoantikor Varlığı Giriş Yöntem Hacettepe Üniversitesi Nöroloji ve Romatoloji A.D polikliniklerinde takip edilen, Behçet hastalığı tanısı uluslararası Behçet çalışma grubunun belirlediği kriterlere göre konan ve SSS tutulumu olan 10 nöro-Behçet hastasından, 10 sağlıklı bireyden ve 1 seropozitif nöromyelitis optika (NMO) hastasından bildirilmiş yazılı olur alınarak, 10’ar ml kan elde edildi. Çalışma esnasında hastalardan ve sağlıklı kontrollerden yazılı olur ile serum alınması ve hayvan beyinlerinde yapılan deneysel işlemler Hacettepe Üniversitesi Etik Kurulu tarafından FON 06/40 kayıt numarası altında onaylandı. Alınan kan örnekleri 30dk oda sıcaklığında bekletildikten sonra, 4000 rpm de santrifüj edilerek serumlar ayrıştırılıp, immünfloresan boyamalar yapılana kadar -20 ºC’de saklandı. Deneyler için, 22-34 gr ağırlığındaki Swiss albino farelerin beyinleri kullanıldı. Fareler yüksek doz kloral hidrat anestezisi ile uyutularak dekapite edildi. Beyinler özenle çıkarılarak, beyin sapı ve korteksi birbirinden ayıracak şekilde diensefalon altından ikiye bölündü. -26 0C’de dondurulan beyinlerden kriyostat ile 10μm kalınlığında horizontal kesitler alındı. Aynı lam üzerine birisi beyin sapından, diğeri hemisferden geçen iki kesit yerleştirildi. Hazırlanan lamlar immünfloresan boyamalar yapılana kadar -20 0C’de saklandı. Boyamalar oda sıcaklığında (+23 0C ile +25 0C) yapıldı. Denaturasyon; proteinlerin primer yapısının bozulmadan, sıcaklık değişimi, pH değişimi gibi çevre koşullarındaki değişimler sonucunda üç boyutlu yapılarını kaybetmesi olup, denatürasyon varlığını test edebilmek için +37 0C’de ve +4 0C’de deneyler tekrarlandı. Preabsorpsiyon Serum örnekleri özgül olmayan antikorlar içermektedirler. Deneylerde kullanılan immünfloresan boyama tekniği gerçekleştirilmeden önce, bu antikorlar nedeni ile ortaya çıkabilecek özgül olmayan işaretlenmeleri önlemek amacı ile kobay karaciğeri (KC) ile preabsopsiyon gerçekleştirildi. Bu tür uygulamalar benzer inceleme yöntemlerinde yaygın olarak kullanılarak, özgül olmayan boyanmanın ortadan kaldırılmasını sağlamaktadır. Bu amaçla immünfloresan boyamaların öncesinde hasta serumları, kobay karaciğerinden elde edilen özüt ile literatürde tarif edildiği şekilde, muamele edildi (28,29). İmmünfloresan Boyamalar Önceden alınmış kesitlerin çevreleri Pappen (Zymed) adı verilen sıvı akışını engelleyen bir kalem ile çizildi ve tüm boyamalar oda sıcaklığında gerçekleştirildi. PBS ile hazırlanmış %10’luk formol solüsyonu ile 4 dk süreyle dokuların fiksasyonu gerçekleştirildi. Kesitler PBS ile yıkandıktan sonra, PBS ile hazırlanmış %1’lik CHAPS solüsyonu (AppliChem) uygulandı. Yıkamayı takiben %10’luk normal keçi serumunda 1 saat bekletildi. Ardından kesitler hasta veya kontrol serumu ile inkübe edilerek bekletildi. U N C O R R EC Behçet Hastalığı, karakteristik olarak tekrarlayıcı oralgenital aftlar ve göz tutulumu ile seyreden sistemik inflamatuar bir hastalıktır. Çoklu sistem tutulumu görülebildiği gibi, en sık cilt, eklemler, göz, santral sinir sistemi (SSS) ve gastrointestinal sistem (GİS) etkilenir. Küçük, orta ve büyük çaptaki arter ve venleri etkileyebilir (1). Kesin olarak etyoloji bilinmemekle birlikte, genetik yatkınlığı olan bireylerde çevresel etmenler ile tetiklenen otoimmün bir hastalık olduğu düşünülmektedir (2). Hastalık her yaşta görülebilmesine rağmen sıklıkla 2035 yaş arasında ortaya çıkar. Erkeklerde ve hastalığın erken yaşlarda başladığı kişilerde ciddi komplikasyonlar ve ölüm daha sık görülmektedir (3,4,5). Behçet hastalığında nörolojik tutulum sıklığı %2,2 ile %47 arasında değişmektedir (6,7,8). Bir çalışmada yaşarken %10 oranında nöro-Behçet tanısı almış olan 170 hastanın, otopsi serilerinde %34 oranında SSS tutulumu olduğu görülmüştür. Bu değişkenlik muhtemelen sadece etnik ve coğrafi farklılıkla değil, nörolojik tutulumun nasıl tanımlandığı ile de ilişkilidir. Ayrıntılı sorgulanmayan başağrısı, nörolojik tutulumun sıklığı konusunda karışıklığa yol açabilmektedir (9). Türkiye’de prospektif bir çalışmada nörolojik tutulum çoğu çalışmaya benzer şekilde % 5.3 olarak bulunmuştur (10,11,12). Behçet hastalığının etiyolojisi ve patogenezini araştırmaya yönelik yapılan çalışmalarda genetik yatkınlık, infeksiyöz ajanlar, ısı şoku proteinleri, hümoral ve hücresel immünite değişiklikleri, endotel fonksiyonlarında bozukluk, koagülasyon ve fibrinolitik sistem bozuklukları gibi değişik faktörlerin etkisi öne sürülmüş, ancak bu faktörlerden hiçbirisinin hastalık gelişimindeki rolü tam olarak ortaya konamamıştır (13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24). Behçet hastalığının tanısı, uluslararası Behçet çalışma grubunun belirlediği klinik bulgulara dayanan kriterlere göre konulmaktadır (25). Ancak tanı için özgül bir laboratuvar testi bulunmamaktadır. Hastalığın erken dönemlerinde henüz klinik bulguların tanı kriterlerini tam olarak karşılayamadığı ya da nörolojik tutulum ile başlayan olgularda (26), laboratuvar desteğine ihtiyaç duyulmaktadır. Behçet hastalığında, parankimal ve non-parankimal olmak üzere ikiye ayrılan SSS tutulumu daha çok görülürken, periferik sinir sistemi tutulumu oldukça nadir görülür ve genellikle tedavide kullanılan ilaçlara bağlı olarak ortaya çıkar. SSS tutulumu hastaların %80’inde, sinir sisteminin tümünde yaygın ve hafif bir inflamasyon ile birlikte, daha çok parankimal yapılarda hakim, fokal tutulum şeklindedir (27). Beyin sapı, bazal ganglion, diensefalik yapılar, internal kapsül en sık tutulan bölgelerdir. Nöro-Behçet olan hastaların klinik ve görüntüleme bulgularından elde edilen bilgiler hastalığın SSS’de bazı bölgeleri tutma eğiliminde olduğunu göstermektedir. Bu durum bize o bölgelere ait bir antijenik uyaranın söz konusu olabileceğini düşündürmektedir. Bu çalışmada; SSS tutulumu olan Behçet hastalarının serumlarında, otoantikor varlığının gösterilmesi ve hastalardan alınacak serum örneklerinin hayvan dokuları ile etkileşimi (reaktivitesi) test edilerek olası hedef yapılar ve/ veya proteinlerin tespit edilmesi amaçlanmıştır. TE D 292 Çolpak ve ark. Nöro-Behçet Hastalarının Serumlarında Beyin Dokusu ve Beyin Damarlarına Karşı Otoantikor Varlığı (Hasta ve kontrol serumları konulmadan önce preabsorpsiyon aşamasından geçirilmişti). Tekrar PBS ile muamele edilen kesitler sekonder antikor olarak; insan IgG’sine karşı keçide hazırlanmış, floresan (FITC) ile konjuge, Anti-Human IgG (Jackson immunoresearch) (1:500) ile 70 dk inkübe edildi. PBS yıkamalarının ardından kesitlere Hoechst solüsyonu (Hoechst 33258, Molecular Probes, 10 mg/ml distile suda çözünmüş şekilde) damlatılıp lamel ile kapatıldı. İşlemler tamamlandıktan sonra kesitler floresan mikroskopta (Nikon Eclipse E600) incelendi. Kesitler, hastaların ve kontrollerin kimliklerini bilmeyen tek bir okuyucu tarafından (Y.G-Ö), farklı zamanlarda olmak üzere 2’şer kez değerlendirildi. Boyamalar, kantitatif olarak değil, immünreaktivite var ya da yok olarak belirlendi. Hücre çekirdekleri floresan mikroskopta 330-380 nm dalga boyunda, diğer ışımalar 450490 nm dalga boyunda değerlendirildi. Nikon ACT programı ile immünfloresan görüntülemeler kaydedilip, incelemeler yapılarak Adobe Photoshop 6.0 programı yardımı ile şekiller oluşturuldu. İstatistiksel Yöntem İmmünfloresan görüntülemelerden elde edilen bulgular, hasta ve kontroller için parankimal damar, parankimal filament, non-parankimal damar ve non-parankimal epandim tutulumu olmak üzere Tablo 2’deki gibi işaretlendi. İstatistiksel işlemler için SPSS 11.0 programı kullanılarak, beklenen frekansı 5’ten küçük göz olduğunda Fisher kesin Ki-Kare, beklenen frekanslar 5’ten büyük olduğunda Yates düzeltmeli Ki-Kare testi uygulandı. P <0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. 293 O R R EC TE D 6’sı erkek, 4’ü kadın ve ortalama yaşları 32.1 (±6.9)’idi. Behçet hastalığı tanı süresinin ortalama 9,6 (±4.9) yıl, nörolojik tutulum süresinin ise ortalama 3,9 (±3.4) yıl olduğu ve hastaların yarısında beyin sapı tutulumuna ait bulguların varlığı gözlendi. Non-parankimal tutulum 2 hastada gözlenirken, 8 hastada parankimal tutulum olduğu saptandı (Tablo 1). Sistemik bulgular açısından bakıldığında, hastaların hepsinde tekrarlayan oral aft, genital aft, cilt tutulumu, üveit öyküsü vardı ve serumların alındığı dönemde tüm hastalar remisyon dönemindeydi. Hastalardan ve kontrol bireylerden alınan serumlar, olası immünolojik hedef tespiti için, fare beyin dokusu ile inkübe Bulgular N C Toplam 10 adet nöro-Behçet tanısı alan hasta, 10 adet sağlıklı kontrol birey ve 1 adet NMO hastasından serumlar alındı. NMO hastasının serumu, literatürde tarif edilen yöntemin uygun şekilde tekrar edilebildiğini göstermek amacı ile kullanıldı ve pozitif kontrol olarak kabul edildi (Şekil 1). Behçet hastalarının 6 tanesi erkek, 4 tanesi kadın ve ortalama yaşları 37.7 (±7.3), sağlıklı kontrol bireylerin ise Şekil 1. Beyin sapından alınan kesitlerde, NMO hastasının serumu ile, yoğun damarsal immünoreaktivite görülmektedir. Üst kolonda 100, alt kolonda ise 400 büyütme ile alınan resimler gösterilmiştir. Oklar 400 büyütmede görülen damarlardan bazılarını ve bunların Hoechst boyamasındaki çekirdeklerini işaret etmektedir. Literatürde NMO hastaları için tarif edildiği gibi, tüm damarsal yapılarda immünfloresan işaretlenme mevcuttur ve AQP4’e karşı immünoreaktivite paternine uygundur. Tablo 1. Nöro-Behçet tanısı alarak çalışmaya dahil edilen hastaların klinik ve demografik özellikleri Hasta Yaş Cins Behçet Hastalığı Süresi Nörolojik Tutulum Süresi Nörolojik Tutulum 31 K 14 yıl 2 yıl Subkortikal beyaz cevher 36 E 5 yıl 4 yıl Beyin sapı Hasta 3 34 E 10 yıl 2 yıl Beyin sapı Hasta 4 47 E 17 yıl 13 yıl Subkortikal beyaz cevher -bazal ganglion Hasta 5 28 K 13 yıl 3 yıl Beyin sapı-talamus Hasta 6 32 E 6 yıl 5 yıl Spinal kord Hasta 7 47 K 4 yıl 4 yıl Beyin sapı Hasta 8 48 E 15 yıl 2 yıl Beyin sapı Hasta 9 34 K 4 yıl 1 yıl Sinüs ven trombozu Hasta 10 40 E 8 yıl 3 yıl Sinüs ven trombozu U Hasta 1 Hasta 2 294 Çolpak ve ark. Nöro-Behçet Hastalarının Serumlarında Beyin Dokusu ve Beyin Damarlarına Karşı Otoantikor Varlığı TE D immünoreaktivite dikkati çekti (Şekil 3 ve 4). Kontrol hastalarının serumları ile yapılan inkübasyonlarda bu filamentöz immünoreaktivite saptanmadı ve hastalar ile kontroller karşılaştırıldığında fark Fisher kesin Ki-Kare testiyle istatistiksel olarak anlamlı bulunarak (p=0,016), hastalık için özgül olarak yorumlandı. Non-parankimal damar tutulumu incelendiğinde ise, arteriyal özellik gösteren yapılarda işaretlenme görüldü. Bu tür işaretlenme hasta serumları ile inkübasyonu takiben 10 hastanın 7’sinde saptanırken, 3 kontrol serumunda da benzer bulgular tespit edildi ve sonuçlara Yates düzeltmeli Ki-Kare uygulandı. Epandimal immünreaktivite, 10 hastanın 4’ünde, kontrollerin ise 1’inde saptandı. Fisher kesin Ki-Kare testiyle sonuç değerlendirildi. Nonparankimal tutulum (damar ve epandim tutulumu), hastalarda daha fazla görülmekle birlikte, kontrollerden istatistiksel olarak anlamlı fark bulunmadı (p=0,18, p=0,15). Her boyama sırasında, hasta serumu ve/veya sekonder antikor kullanılmadan yapılan işaretlemeler, tekniğin spesifitesinin kontrolü oldu. Bu şekilde yapılan işaretlemelerde herhangi bir immünoreaktivite tespit edilmedi. Parankimal immünoreaktivite tüm hastalarda hem kortikal (Şekil 3) hem de derin beyin yapılarında benzer boyanma R EC edildi. Serumlarla inkübasyonu takiben, beyin kesitleri parankimal tutulum (damar tutulumu ve filamentöz tutulum) ile non-parankimal tutulum (büyük damar ve epandim tutulumu) açısından incelenerek, immünreaktivite şiddetine göre değerlendirildi (Tablo 2). Parankimal damar tutulumu, beyin dokusu içerisinde yer alan büyük ve küçük çaplı damarlar etrafındaki görsel olarak saptanan yoğun floresan işaretlenme olarak kabul edildi. Beyin dokusu içinde, damar dışında görülen, filamentöz yapıdaki tüm diğer immünfloresan işaretlenmeler de parankimal tutulum olarak değerlendirildi. Non-parankimal damar tutulumu ise, beyin dokusu dışında yer alan, yüzeyel arter ve venlerdeki pozitif immünfloresan işaretlenme olarak kabul edildi. Beyin dokusunu ve ventrikülleri kaplayan ependimal işaretlenmeler de non-parankimal olarak değerlendirildi. Parankimal damarlar açısından bakıldığında; 10 hastanın 8’inde pozitif immünfloresan işaretlenme tespit edilirken, kontrol grubunda sadece 2 bireyde hafif şiddette pozitif işaretlenme görüldü ve gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı fark Yates düzeltmeli Ki-Kare testiyle saptandı (p=0,025). Tutulan damarlar çoğunlukla venöz karakterdeydi (Şekil 2). Parankimde damar dışındaki diğer yapılar değerlendirildiğinde, herhangi bir hücresel boyanmaya rastlanmadı. Buna karşın 5 hastada beyin dokusu içinde dendrit benzeri yapıları takip eden filamentöz Tablo 2. Nöro-Behçet hastalarının ve sağlıklı kontrol bireylerin serumlarında tespit edilen immünoreaktiviteler Parankimal Hasta 1 - Hasta 2 - Hasta 3 + Hasta 4 + Hasta 5 + Filament Damar Epandim + + + - + - + + - - - + - + + O R Damar N C Serum kodu Non-parankimal + + + - Hasta 7 + - + - Hasta 8 + - + - Hasta 9 + + - + Hasta 10 + + - - U Hasta 6 Kontrol 1 - - + - Kontrol 2 - - - - Kontrol 3 - - - - Kontrol 4 - - - - Kontrol 5 - - - - Kontrol 6 + - - - Kontrol 7 + - - + Kontrol 8 - - - - Kontrol 9 - - + - Kontrol 10 - - + - Şekil 2. Hasta serumları ile yapılan inkübasyonlarda parankim içinde filamentöz ve noktasal paterne ek olarak vasküler yapıların etrafında yoğun immünfloresan işaretlenmeler dikkati çekmektedir.Üst sırada kontrol serumu ile yapılan işaretlemeler görülmektedir. Aynı floresans şiddeti ile alınan görüntülerde, kontrol serumları ile yapılan inkübasyonlarda zeminde ve damar etrafında çok hafif bir boyanma zaman zaman tespit edilmekle birlikte, sol kolonda da görüldüğü gibi sıklıkla negatif bir immunoreaktivite mevcuttu. Buna karşın, hasta serumları ile yapılan inkübasyonlar sonrasında damar etrafında yoğun immünfloresan işaretlenme görülmüştür. Orta ve alt sırada; sol kolonda hasta serumları ile yapılan işaretlemeler, sağ kolonda ise çekirdek boyası Hoechst ile yapılan işaretlemeler yer almaktadır. Oklar damarları işaret etmektedir, orta ve alt sıra sol kolonda ise damarların Hoechst ile işaretli iğsi çekirdeklerini göstermektedir. 200 büyütme ile alınan resimler. 295 TE D Çolpak ve ark. Nöro-Behçet Hastalarının Serumlarında Beyin Dokusu ve Beyin Damarlarına Karşı Otoantikor Varlığı EC Şekil 4. Striatumdan alınan kesitlerde filamentöz ve/veya noktasal immünoreaktivite görülmekle birlikte, kontrol serumları ile yapılan inkübasyonlarda boyanma tespit edilmemektedir. Serumlar ile yapılan işaretlemeler sol kolonda, çekirdek boyası Hoechst ile yapılan işaretlemeler sağ kolonda yer almaktadır. 200 büyütme ile alınan resimler. Şekil 6. Hasta serumu ile immün işaretlenme sonrası konfokal mikroskop yardımı ile striatumdan alınan, ardı sıra 0.2 μm’lik kesitler görülmektedir. Noktasal ve filamentöz yapı dikkat çekmektedir. U N C O R R Şekil 3. Hasta ve kontrol serumları ile yapılan immünfloresan görüntülemeler. Görüntüler hippokampusdan geçen kesitlerden alınmıştır. Serumlar ile yapılan işaretlemeler sol kolonda, çekirdek boyası Hoechst ile yapılan işaretlemeler sağ kolonda yer almaktadır. Sol kolondaki resimlerde, hasta serumlarının noktasal ve/veya filamentöz immün işaretlemeler gösterdiği, buna karşın kontrol serum ile yapılan incelemelerde pozitif işaretlenme olmadığı izlenmektedir. Hücre gövdeleri ile çekirdeklerin, hasta ve kontrollerde işaretlenmediği görülmektedir. Sağ kolonda ise Hoechst boyaması ile kesitlerde yer alan hücre çekirdekleri görüntülenmiştir. Ok başları hipokampal hücre tabakalarına işaret etmektedir. 100 büyütme ile alınan resimler. Şekil 5. Serebellumdan alınan kesitlerde, hasta serumları ile yapılan inkübasyonlarda, diğer beyin bölgelerindeki işaretlenme paternine benzer veriler tespit edildi. Parankim içerisinde filamentöz veya noktasal, dendritik yapıları takip eden boyanmalar mevcuttu. 100 büyütme ile alınan resimler. Şekil 7. A) Şekil 6’daki kesitlerin X ekseninde 3 boyutlu olarak üst üste bindirilmesi ile elde edilen görüntülemede, filamentöz yapılar net bir şekilde seçilmektedir. B) Şekil 6’daki kesitlerin Z ekseninde 3 boyutlu olarak rekonstrüksiyonu. Görüntülenen beyin dokusu 2.2 um kalınlığında olup, striatumdan geçen bir alandır. Filamentöz yapının ağ benzeri yapılanmasının olduğu ve derine ilerlediği görülmektedir. Çolpak ve ark. Nöro-Behçet Hastalarının Serumlarında Beyin Dokusu ve Beyin Damarlarına Karşı Otoantikor Varlığı aday antikorlar olarak daha önceki çalışmacılar tarafından ortaya atılmış ancak hiçbiri özgül olmamış ve küçük gruplarda gösterilebilmiştir (30,37,38,39). Mikroorganizmalarda ya da hayvan dokularında bulunan immün reaktif proteinlerden olan ısı şoku proteinleri-‘heat shock proteins’(HSP) ile ilgili olarak da, uzun zamandır Behçet hastalarında çalışmalar yapılmaktadır. HSP-60, HSP-65, HSP-70 ve alfa B-crystallin daha önceki çalışmalarda bildirilmiş HSP’lerdir. Son yıllarda yapılan çalışmalarla aday antijenik hedefler arasına HSP ailesinin bir üyesi olan stresle indüklenen fosfoprotein-1 de eklenmiştir. Ancak romatoid artrit hastalarında da bildirilmiş olması nedeniyle Behçet hastalığı için özgüllüğü konusunda soru işaretleri vardır (19,40,41,42,43,44). NMO, SSS’de seçiciliği olan, immün sistem bozukluğuna bağlı geliştiği düşünülen bir durumdur. Lennon ve arkadaşları bu hastalığa özgül otoantikor varlığını, geliştirdikleri bir yöntemle göstermişlerdir (28,45). Yöntemin esası, NMO hastalarının serumlarının, fare beyin dokusu ile inkübasyonunu takiben, floresan işaretlenmesine dayanmaktadır. Bu grup, çalışmaları sonucunda NMO’da gelişen otoantikorun AQP4’e karşı olduğunu tespit etmişlerdir. Nöro-Behçet olan hastaların klinik ve görüntüleme bulgularından elde edilen bilgiler de, hastalığın SSS’de bazı bölgeleri tutma eğiliminde olduğunu göstermektedir. Bu durum bize o bölgelere ait bir antijenik yapılanmanın sözkonusu olabileceğini düşündürmektedir. Bu çalışmada, Lennon ve arkadaşlarının kullandığı teknik kullanılarak, nörolojik tutulumu olan Behçet hastalarının serumlarında beyin dokusuna spesifik olası otoantikor varlığı araştırılmıştır. Çalışmamızda, literatürde tarif edilen çeşitli preabsopsiyon yöntemleri ile yapılan denemeler sonucunda, kontrol serumlarıyla görülen özgül olmayan boyanmayı en aza indiren yöntem seçilerek işlemlere devam edilmiştir. Yöntemin güvenilirliğini test edebilmek için, serumların +37 0C’de veya +4 0C’de uygulandığı durumlarda tekrarlanan deneylerde, oda sıcaklığında hasta serumlarıyla görülen immünoreaktivitenin gerçekleşmediği görülmüştür. Gözlediğimiz immünoreaktivitenin, sıcaklık değiştirerek yaptığımız deneylerde kaybolması, hasta serumlarındaki özgül IgG’lerin denatürasyonuna bağlı olduğunu düşündürmüştür. Dolayısıyla, bu durum saptadığımız boyanmanın özgül olduğunu telkin etmektedir. Preabsorbsiyon sonrası rezidüel nonspesifik boyanmanın da, sekonder antikorun dilüsyonunun artırılması ile ortadan kalktığı görülmektedir. Ayrıca pozitif kontrol olarak, kullanılan yöntemin doğruluğunu test etmek amacı ile klinik olarak NMO tanısı almış (optik nevrit, transversmyelit ve NMO IgG antikoru pozitifliği) bir hastanın serumu ile deneyler yapılarak, literatürde tarif edilene benzer şekilde, yoğun damarsal immünoreaktivite elde edildi ve yöntemin taklit edilebildiği gösterildi. Bu nedenlerle, uzun çalışmalar ve tekrarlayan denemeler sonucunda elde edilen immünfloresan işaretlemelerin özgüllüğünün güvenilir olduğunu düşünüyoruz. Yapılan immünfloresan işaretlemeler sonunda, kontrol serumları ile inkübasyonlarda çok seyrek olarak parankimal vasküler boyanma varken, hastalarda daha yoğun parankimal vasküler boyanma görülmüştür. Filamentöz yapılardaki EC paterni göstermiştir (Şekil 4). Damarsal tutulum paterni açısından, Behçet hastaları ve NMO hastasının farklı özellikler taşıdığı saptandı. NMO hastasında literatürdekine benzer ve Behçet hastalarındaki immünoreaktivite ile karşilaştırıldığında, daha yoğun damar tutulumu olduğu ve kapillerlerin de tutulduğu görülmektedir (Şekil 1 ve 2). Bu tutulum literatürde tariflenen AQP4’e karşı immünoreaktivite paternine uymaktadır. Beyin sapı ve serebelluma ait kesitler incelendiğinde de benzer bulgular elde edilmiştir (Şekil 5). Boyanan filamentöz yapıları daha detaylı incelemek amacı ile konfokal mikroskop yardımıyla görüntülemeler yapıldı. Bu tür görüntüleme, boyanan yapıların bize 3 boyutlu yapısı hakkında fikir verdi. Bu amaçla, 2,2 mikron kalınlığında bir kesit 0,2 mikron aralıklarla tarandı. Şekil 6’da bu taramalar tek tek kesitler halinde görülmektedir. Noktasal ve filamentöz yapılar dikkat çekmektedir. Şekil 7A’da, Şekil 6‘da alınan ardı sıra kesitlerin X eksenindeki, Şekil 7B’de ise Z eksenindeki 3 boyutlu rekonstrüksiyonu görülmektedir. Filamentöz yapının büyük akson lif demetlerinde görülmediği, buna karşın diğer alanlarda yaygın boyandığı ve zaman zaman birleşerek ağ benzeri bir yapı oluşturduğu dikkati çekmektedir. R Tartışma N C O R Bu çalışmada, SSS tutulumu olan Behçet hastalarının serumları kullanılarak fare beyinlerinde yapılan indirekt immünfloresan boyamalarda, hem parankimal hem de vasküler yapılara karşı özgül immünreaktivite tespit edilmiştir. Behçet hastaları için henüz dokuya özgül antikor veya biyolojik belirteç tanımlanmasa da, bu çalışmanın sonuçları nöroBehçet hastalarında ortak bir epitopun varlığını ve hastalıktan sorumlu bir antikorun gösterilebileceği düşüncesini akla getirmektedir. Uzun zamandır Behçet hastalığı üzerine çalışmalar yapılmaktadır. Ancak halen etyolojisi ve patofizyolojisi hakkında yeterli bilgiye ulaşılamamıştır. Hastalığın tanısının klinik bulgulara dayanan kriterlere göre konulması ve özellikle diğer bulguların eşlik etmediği, nörolojik tutulumla başlayan hastalarda tanının konulmasındaki güçlükler, özgül bir laboratuvar testinin eksikliğine dikkati çekmektedir. Literatürde plazma değişiminden faydalanan hastaların bildirilmiş olması, maternal transplasental antikor geçişi ve sekonder neonatal Behçet hastalığının görülmesi, B hücrelerinin fonksiyonlarında değişiklikler olması, hastaların serumlarında dolaşan immünkomplekslerin gösterilmesi, lezyonların histopatolojik incelemelerinde damar duvarında IgM ve C3 depolanmasının saptanması, Behçet hastalığında hücresel immünitenin yanında hümoral immünitenin aktivasyonu ile de giden bir immünolojik dengesizliğin olduğunu göstermektedir (22,23,24,30,31,32,33,34,35,36). Farklı Behçet hastası gruplarında otoantikor varlığını araştıran birçok çalışma yapılmıştır. Bu çalışmalarda farklı yöntemler kullanılmıştır. Anti-endotelyal hücre antikorları, anti-Saccharomyces cerevisiae antikoru, anti-alfa enolaz antikoru ve PTEN ile indüklenen putative kinaz 1 antikorları Behçet hastalığı için U TE D 296 Çolpak ve ark. Nöro-Behçet Hastalarının Serumlarında Beyin Dokusu ve Beyin Damarlarına Karşı Otoantikor Varlığı TE D of onset and patient’s sex on the prevelance and severity of manifestations of Behçet’s Disease. Ann Rheum Dis 1984; 43:783789. 6. Gürler A, Boyvat A, Türsen Ü. Clinical manifestations of Behçet’s Disease: An analysis of 2147 patients. Yonsei Med J 1997; 38:423427. 7. Krause I, Uziel Y, Guedj D, Mukamel M, Molad Y, Amit M, Weinberger A. Mode of presentation and multisystem involvement in Behçet’s disease: The influence of sex and age of disease onset. J Rheumatol 1998; 25:1566-1569. 8. Krause I, Uziel Y, Guedj D, Mukamel M, Harel L, Molad Y, Weinberger A. Childhood Behçet’s disease: clinical features and comparison with adult-onset disease. Rheumatology (Oxford) 1999; 38:457-462. 9. Aykutlu E, Baykan B, Akman-Demir G, Topcular B, Ertas M. Headache in Behçet’s disease. Cephalalgia 2006; 26:180-186. 10.Serdaroğlu P, Yazıcı H, Özdemir C, Yurdakul S, Bahar S, Aktin E. Neurologic involvement in Behçet’s syndrome: a prospective study. Arch Neurol 1989; 46:265-269. 11. Siva A, Kantarci OH, Saip S, Altintas A, Hamuryudan V, Islak C, Koçer N, Yazici H. Behçet’s disease: diagnostic and prognostic aspects of neurological involvement. J Neurol 2001; 248:95-103. 12.Ashjazadeh N, Borhani Haghighi A, Samangooei Sh, Moosavi H. Neuro-Behcet’s disease: a masquerader of multiple sclerosis. A prospective study of neurologic manifestations of Behcet’s disease in 96 Iranian patients. Exp Mol Pathol 2003; 73:17-22. 13. Direskeneli H. Behcet’s disease: infectious aetiology, new autoantigens, and HLA-B51. Ann Rheum Dis 2001; 60:996-1002. 14.Gül A. Behcet’s Disease: an update on the pathogenesis. Clin Exp Rheumatol 2001; 19(Suppl 24):6-12. 15.Sohn S, Lee ES, Bang D, Lee S. Behcet’s disease-like symptoms induced by the Herpes simplex virus in ICR mice. Eur J Dermatol 1998; 8:21-23. 16.The Behcet’s Disease Research Committee of Japan. Skin hypersensitivity to streptococcal antigens and the induction of systemic symptoms by the antigens in Behcet’s disease-a multicenter study. J Rheumatol 1989; 16:506-511. 17. Çalgüneri M, Kiraz S, Ertenli I, Benekli M, Karaarslan Y, Celik I. The effect of prophylactic penicillin treatment on the course of arthritis episodes in patients with Behcet’s disease. A randomized clinical trial. Arthritis Rheum 1996; 39:2062-2065. 18. Isogai E, Isogai H, Yokota K, Hayashi S, Fujii N, Oguma K, Yoshikawa K, Sasamoto Y, Kotake S, Ohno S. Platelet aggregation induced by uncommon serotypes of Streptococcus sanguis isolated from patients with Behcet’s disease. Arch Oral Biol 1991; 36:425-9. 19. Imamura Y, Kurokawa MS, Yoshikawa H, Nara K, Takada E, Masuda C, Tsukikawa S, Ozaki S, Matsuda T, Suzuki N. Involvement of Th1 cells and heat shock protein 60 in the pathogenesis of intestinal Behcet’s disease. Clin Exp Immunol 2005; 139:371-378. 20.Mege JL, Dilsen N, Sanguedolce V, Gul A, Bongrand P, Roux H, Ocal L, Inanç M, Capo C. Overproduction of monocyte derived tumor necrosis factor alpha, interleukin (IL) 6, IL-8 and increased neutrophil superoxide generation in Behcet’s disease. A comparative study with familial Mediterranean fever and healthy subjects. J Rheumatol 1993; 20:1544-1549. 21. Li B, Yang P, Zhou H, Zhang Z, Xie C, Lin X, Huang X, Kijlstra A. T-bet expression is upregulated in active Behcet’s disease. Br J Ophthalmol 2003; 87:1264-1267. 22.Suzuki N, Sakane T, Ueda Y, Tsunematsu T. Abnormal B cell function in patients with Behcet’s disease. Arthritis Rheum 1986; 29:212219. 23.Ekşioglu-Demiralp E, Kibaroglu A, Direskeneli H, Yavuz S, Karsli F, Yurdakul S, Yazici H, Akoglu T. Phenotypic characteristics of B cells in Behcet’s disease: increased activity in B cell subsets. J Rheumatol 1999; 26:826-832. 24.Lee KH, Chung HS, Kim HS, Oh SH, Ha MK, Baik JH, Lee S, Bang D. Human alpha-enolase from endothelial cells as a target antigen of anti-endothelial cell antibody in Behcet’s disease. Arthritis Rheum N C O R R EC boyanma ise sadece hastalarda tespit edilmiş olup, kontrol grubunda hiç gözlenmemiştir. Bu durum da boyanma paterninin hastalığa özgün olduğunu telkin etmektedir. Tespit edilen özgün boyanmanın ne tür bir yapıya ait olduğu ancak daha ileri çalışmalarla yorumlanabilecektir. Ayrıca filamentöz ve damarsal boyanmanın tek bir epitopa karşı monoklonal bir cevap mı, yoksa farklı epitoplar nedeniyle poliklonal bir reaksiyona mı bağlı olduğu konusu aydınlatılmalıdır. Bulguların bazı yönlerinin ileri çalışmalarla değerlendirilmesi gerekmektedir. Örneğin nöro-Behçet hastalarında klinikte kortikal ve serebellar tutulum daha nadir bir bulgu iken, bizim çalışmamızda bu bölgelerde de immünreaktivite saptanmıştır. Bu durum, deneylerde serumların fare dokusuna uygulanmış olması, rodent ile insan beyninde ifade edilen proteinlerin ve bu proteinlerin dağılım şeklinin türler arasında farklı olmasına bağlı olabilir. Yine NMO hastalarında optik nevrit ve transvers miyelit gibi sınırlı bir klinik tutulum olmasına rağmen, yapılan immünhistokimyasal incelemelerde yaygın bir AQP4 ifadesi bulunmaktadır (45). Değerlendirilmesi gereken bir diğer nokta da, deneylerde insan IgG yapısını tanıyacak sekonder antikor kullanılmış olmasıdır. Oysa Behçet hastalığında dokularda daha çok IgM depolanmasından bahsedilmektedir. Çalışmanın, insan IgM’sine karşı sekonder antikorla da tekrarlanması gerekmektedir. Bugün için nonparankimal ve parankimal tutulumun farklı mekanizmalarla geliştiği düşünülmesine rağmen, bizim çalışmamızda belirgin bir fark gözlenmemektedir. Ancak çalışmada sadece 2 tane non-parankimal tutulumu olan hasta serumu olması nedeniyle bu konuda ileri yorum yapmak zordur. Gelecek deneylerde, öncelikle bulguların bir sebep mi yoksa sonuç mu olduğunun aydınlatılması, bu testin duyarlılığı ve özgünlüğünün tespitinin yapılabilmesi için, mevcut hasta ve sağlıklı birey sayısı artırılacak ve otoimmün hastalığı olan başka hasta grupları da kullanılacaktır. Behçet hastalarında, beyin dokusuna spesifik bir otoantikorun gösterilebilmesi ve hedef yapının tespiti hastalığının patogenezini anlamaya yardımcı olacak ve klinik kriterlere ek olarak, tanı için bir laboratuvar testinin tanımlanmasını sağlayacaktır. Patofizyolojinin detaylı olarak gösterilmesi ise, gen ve protein hedefli, daha az yan etkisi olan ve etkisi daha güçlü olan tedavilerin gelişimine kapı açılmasını sağlayabilecektir. U Kaynaklar 1. Ehrlich GE. Vasculitis in Behcet’s disease. Int Rev Immunol 1997; 14:81-88. 2. Davatchi F, Shahram F, Akbarian M, Gharibdoost F, Nadji A, Chams H, Jamshidi AR. Behcet disease:analysis of 3443 cases. APLAR J Rheumatol 1997; 1:2-5. 3. Yazici H, Başaran G, Hamuryudan V, Hizli N, Yurdakul S, Mat C, Tüzün Y, Ozyazgan Y, Dimitriyadis I. The ten year mortality in Behçet’s Syndrome. Br J Rheumatol 1996; 35:139-141. 4. Kural-Seyahi E, Fresko I, Seyahi N, Ozyazgan Y, Mat C, Hamuryudan V, Yurdakul S, Yazici H. The long term mortality and morbidity of Behçet syndrome: a 2-decade outcome survey of 387 patients followed at a dedicated center. Medicine(Baltimore) 2003; 82:60-76. 5. Yazıcı H, Tüzün Y, Pazarlı H, Yurdakul S, Özyazgan Y, Özdoğan H, Serdaroğlu S, Ersanlı M, Ülkü BY, Müftüoğlu AÜ. Influence of age 297 Çolpak ve ark. Nöro-Behçet Hastalarının Serumlarında Beyin Dokusu ve Beyin Damarlarına Karşı Otoantikor Varlığı 33.Lewis MA, Priestley BL. Transient neonatal Behcet’s disease. Arch Dis Child 1986; 61:805-806. 34.Fam A.G, Siminovitch K, Carette S, From L. Neonatal Behcet’s syndrome in an infant of a mother with the disease. Ann Rheu Disease 1981; 40:509-512. 35.Gupta RC, O’Duffy JD, McDuffie FC, Meurer M, Jordon RE. Circulating immune complexes in active Behcet’s disease. Clin Exp Immunol 1978; 34:213-218. 36.Abdallah MA, Ragab N, Khalil R, Kamel N. Circulating immune complexes in various forms of Behcet’s disease. Int J Dermatol 1995; 34:841-845. 37.Fresko I, Ugurlu S, Ozbakır F, Celik A, Yurdakul S, Hamuryudan V, Yazici H. Anti-Saccharomyces cerevisiae antibodies (ASCA) in Behçet’s syndrome. Clin Exp Rheumatol 2005; 23(Suppl 38):67-70. 38. Lee J.H, Cho S.B, Bang D, Oh S.H, Ahn K.J, Kim J, Park Y.B, Lee S.K, Lee K.H. Human anti-alpha-enolase antibody in sera from patients with Behçet’s disease and rheumatologic disorders. Clin Exp Rheumatol 2009; 27(Suppl 53):63-66. 39.Vural B, Demirkan A, Ugurel E, Kalaylioglu-Wheeler Z, Esen B.A, Gure A.O, Gül A, Ozbek, U. Seroreactivity against PTEN-induced putative kinase 1 (PINK1) in Turkish patients with Behçet’s disease. Clin Exp Rheumatol 2009; 27(Suppl 53):67-72. 40.Birtas-Atesoglu E, Inanc N, Yavuz S, Ergun T, Direskeneli H. Serum levels of free heat shock protein 70 and anti-HSP70 are elevated in U N C O R R EC 2003; 48:2025-2035. 25.International Study Group for Behçet’s Disease. Criteria for diagnosis of Behçet’s Disease. Lancet 1990; 335:1078-1080. 26. Akman-Demir G, Serdaroglu P, Tasci B. Clinical patterns of neurological involvement in Behçet’s disease: evaluation of 200 patients. The Neuro-Behçet Study Group. Brain 1999; 122:2171-2181. 27.Sugihara H, Mutoh Y, Tsuchiama Y. Neuro-Behçet’s disease: report of two autopsy cases. Acta Pathol Jap 1969; 19:95-101. 28.Lennon VA, Wingerchuk DM, Kryzer TJ, Pittock SJ, Lucchinetti CF, Fujihara K, Nakashima I, Weinshenker BG. A serum autoantibody marker of neuromyelitis optica: distinction from multiple sclerosis. Lancet 2004; 364:2106-2112. 29.Jarius S, Franciotta D, Bergamaschi R, Wright H, Littleton E, Palace J, Hohlfeld R, Vincent A. NMO-IgG in the diagnosis of neuromyelitis optica. Neurology 2007; 68:1076-1077. 30.Dinc A, Takafuta T, Jiang D, Melikoglu M, Saruhan-Direskeneli G, Shapiro SS. Anti-endothelial cell antibodies in Behcet’s disease. Clin Exp Rheumatol 2003; 21(4 Suppl 30):27-30. 31.Briani C, Doria A, Marcolongo R, Tognon S, Ruggero S, Toffanin E, Ermani M, Ghirardello A, Zampieri S, Semenzato G. Increased titres of IgM anti-heparan sulfate antibody in Behcet’s disease. Clin Exp Rheumatol 2006; 24(Suppl 42):104-107. 32. Weedon David. Skin Pathology Textbook. 2nd Edition. Elsevier Health Sciences ; 2002. TE D 298