İMMUNOHEMATOLOJİK TESTLER

Klinik mikrobiyoloji uzmanının
sorumluluğunda
kan hizmet birimleri
İMMÜNOHEMATOLOJİK
TESTLER
Dr.A.Esra KARAKOÇ
S.B.Ankara EAH
TKMTD, TKV
KLİMUD-EGE Sürekli Tıp Eğitimi, Sürekli Mesleki Gelişim Etkinliği, 27.3.2012
İmmünohematolojik Testler
Kan gruplama
Çapraz Karşılaştırma
Antikor tarama
Antikor tanımlama
ISBT Kan Gruplama Sistemleri
Adı
ABO
MNS
P
Rh
Lutheran
Kell
Lewis
Duffy
KiddJ
Diego
Cartwright
XG
Scianna
Dombrock
Colton
Landsteiner-Wiener
Chido/Rodgers
Hh
Kx
Gerbich
Cromer
Knops
Indian
Ok
Raph
JMH
Kısaltma
ABO
MNS
P
RH
LU
KEL
LE
FY
K
DI
YT
XG
SC
DO
CO
LW
CH/RG
H
XK
GE
CROM
KN
IN
OK
RAPH
JMH
ABO Kan Grup Sistemi
ABO sistemi iki özellik nedeniyle farklı
• Serumda aglutinin varlığı
• ABH ag’leri bir çok dokuda ve sekresyonlarda bulunur
• Serumda antikor gösterilme prensibine dayanan karşıt
gruplamanın yapıldığı tek kan grup sistemi
Eritrosit Transfüzyonu
Plazma Transfüzyonu
KAN GRUPLARININ
BELİRLENMESİ
7
REVERSE
FORWARD
KAN GRUPLARI
8
Kan Gruplarının Saptanması
1. Hemaglütinasyon
•
•
•
•
Lam (Slide) yöntemi
Tüp yöntemi
Jel Santrifügasyon yöntemi
Mikroplak yöntemi
2. RİA
3. EİA
4. PCR
9
Hemaglütinasyon Sonuçlarını
Etkileyen Faktörler
1.
Fiziksel Koşullar

İnkübasyon ısısı

IgM tipi antikorlar……4-27ºC (oda ısısı)

IgG tipi antikorlar……30-37ºC (inkübatör)

İnkübasyon süresi

Santrifüj hız ve süresi

Ortam: pH, LISS solüsyonu, enzimler, makromoleküller
2.
Eritrositler


3.
Yüzey antijenlerinin tipi, sayısı, lokalizasyonu ve immünojenitesi
Homozigot veya heterozigot olmaları
Serum: Protein içeriği ve antikorların yapı ve türleri
10
Hasta Örneği
11
TÜP YÖNTEMİ
12
13
14
Aglütinasyonun Değerlendirilmesi
Aglütinasyon
Değerlendirme
++++
Bir tek büyük küme, serbest hücre yok
+++
Birkaç büyük küme, serbest hücre yok
++
Çok sayıda büyük ve küçük küme, serbest hücre yok
+
Çok sayıda küçük küme, zeminde serbest hücre var
Mikroaglütinasyon
Makroskobik negatif, mikroskobik bazı alanlar 6-8 hücreli kümeli
Şüpheli
Makroskobik negatif, çok nadir mikroskobik 6-8 hücreli küme
Rulo Oluşumu
Mikroskobik olarak kümeler para dizisi şeklinde
Negatif
Makroskobik ve mikroskobik küme yok
Mixed Field
Çok sayıda büyük ve küçük küme, zeminde serbest eritrosit var
15
Forward Gruplama
16
Temiz ve etiketli test tüplerine birer damla
anti-A, anti-B, anti-AB, anti-D ve hasta
serumu damlatılır
17
Her bir tüpe bir damla test edilecek eritrositlerin en
az 3 kez yıkanmış % 2-5’lik süspansiyonundan
(SF, serum veya plazma ile hazırlanmış) damlatılır
18
Tüp içerikleri yavaşça karıştırılır ve yaklaşık
900-1000 x g’de 15-30 sn santrifüj edilir
(Alternatif olarak tüpler santrifüj edilmeden 1 saat
oda ısısında bırakılır)
19
Tüplerin dibindeki eritrosit birikintileri tekrar
yavaşça süspanse edilir ve makroskobik olarak
aglütinasyon açısından incelenir. Test sonuçları
okunur, yorumlanır ve kaydedilir
20
hemoliz
agglütinasyon
21
Reverse Gruplama
22
Reverse gruplama
Hasta serumu
Test eritrositleri
23
hemoliz
agglütinasyon
24
SONUÇLANDIRMA
Forward
Reverse
A Ag pozitif
D Ag negatif
Anti-B Ab pozitif
A grubu Rh negatif
A grubu
25
JEL YÖNTEMİ
26
27
28
29
Aglütinasyonun
Değerlendirilmesi
+4
+3
+2
+1
0
30
31
MİKROPLAK YÖNTEMİ
32
Mikroplak ABD Gruplama
33
ÇAPRAZ KARŞILAŞTIRMA
(Cross-Match)
36
Transfüzyon sırasında veya sonrasında
oluşabilecek Ag-Ab reaksiyonunun laboratuvar
ortamında yapılan ön denemesidir.
Alıcı serumuyla verici eritrositleri karşılaştırılır
• Alıcı ve verici ABO uyumunun son kez doğrulanması
• Panel dışı Ab varlığı durumunda bu Ab’ların belirlenmesi
Majör CRM; alıcı serumu →
verici eritrositleri
Minör CRM; verici serumu →
alıcı eritrositleri
37
Çapraz Karşılaştırma
• ABO ve Rh sistemleri
dışında bulunan kan
grupları nedeniyle önemli
• Kan transfüzyonu öncesi
yapılması gerekir
• Lewis; Lea - Le - Leb
• MN; M - N - S - s U
• P; P1 - P2 - p
• Luteren; Lua - Lub
• Kell; K - k
• Duffy; Fya - Fyb
• İi; İ - i
Çapraz Karşılaştırma
• ABO – Rh uygun kan % 98 uyum
• Antikor tarama -tanımlama
• Çapraz karşılaştırma
• % 2 ek uygunluk
Çapraz Karşılaştırma
Aglutinasyon yok ~ uyumlu
Aglutinasyon ~ uyumsuz
Verici Eritrositi
Hasta Serumu
42
Çapraz Karşılaştırma
Acil Cross-Match (Immediate Spin)
Klinisyene göre, normal CRM prosedürünün uygulanması
için geçecek süre hayati bir zaman kaybına neden
olacaksa → IS CRM
Acil durumlar dışında kullanılmamalıdır
Acil bir durumda IS CRM yapılarak kan kliniğe
gönderildiğinde, mutlaka standart CRM işlemi de
yapılıp sonuç klinisyene bildirilmelidir!..
44
Aglütinasyonun
Kolaylaştırılması
1.
Eritrositler arası uzaklığı kısaltma





2.
Proteolitik enzimler (papain, bromelin, ficin, neuroaminidase,
trypsin vs)
Albümin: Muhtemelen eritrosit yüzeyindeki negatif yükü nötralize
etmekte
Polikatyonlar (polybrene, protamine): Ortamın katyon yoğunluğunu
artırarak eritrosit yüzeyindeki negatif yükü nötralize ederler
LISS (Low Ionic Strength Solution): Ortamdaki iyon sayısını azaltır
Santrifüj: Santrifüj gücü ile eritrositler birbirine yaklaşır
İki eritrosit arasında köprü oluşturma: Coombs serumu
45
ANTİGLOBULİN TESTLER
46
Doğal ve İmmün Eritrosit
Antikorlarının Özellikleri
Doğal Antikorlar
İmmün Antikorlar
Eritrositlerin karbonhidrat
antijenlerine yönelik
Eritrositlerin protein antijenlerine
yönelik
Komplet
İnkomplet
Soğuk
Sıcak
Genellikle IgM
Genellikle IgG
Plasentadan geçmez
Plasentadan geçer
Komplet ve İnkomplet Antikorlar
İzotonik tuzlu su ortamında eritrositleri kümeleştirebilen antikorlara
“komplet”, kümeleştiremeyenlere “inkomplet” adı verilir.
47
48
Antiglobulin Testler
• Direkt Antiglobulin Test (DAT, Direkt Coombs
Testi): Otoimmun hemolitik anemi, ilaca bağlı hemoliz,
yenidoğanın hemolitik hastalığı ve yakın zamanda
yapılmış kan transfüzyonuna bağlı alloimmünizasyon
araştırılır
• İndirekt Antiglobulin Test (İAT, İndirekt Coombs
Testi): Antikor tarama ve tanımlama, kan gruplama ve
uygunluk testlerinde kullanılır
49
DAT POZİTİFLİK
• Eritrosit antijenlerine karşı oluşmuş otoantikorların
komplemanla birlikte veya tek başına eritrosit yüzeyini
kaplaması
• Transfüzyon sonrası alıcı antikorların donör eritrosit
yüzeyini kaplaması
• Verici plazmasındaki antikorların alıcı eritrositlerin
yüzeyini kaplaması
DAT
51
DAT
52
DAT
•Hasta eritrositlerinden SF içerisinde %2-5’lik eritrosit süspansiyonu hazırlanır.
•Bu süspansiyondan bir damla test tüpüne konur.
•SF ile eritrositler 4 kez yıkanır.
•Üstteki süpernatan tamamen döküldükten sonra 1-2 damla polispesifik AHG reageni ilave edilir
53
DAT
•1000 x g’de 1 dak. santrifüj edilir.
•Santrifüj sonrası aglütinasyon değerlendirilir ve sonuçlar kaydedilir
54
DAT
55
İAT
56
İAT
57
•
Bir tüpe 2-3 damla hasta
serumu konur.
•
Üzerine bir damla %2-5’lik test
eritrosit süspansiyonu ilave
edilir.
•
Ortalama 30-60 dk. Benmaride
inkübe edilir
•
İnkübasyon sonrası 1000 x
g’de 1 dak. santrifüj edilir
•
Santrifüj sonrası tüpler hemoliz
yönünden kontrol edilir. Daha
sonra dibe çöken eritrositler
resüspanse edilir, aglütinasyon
olup olmadığı değerlendirilir
58
• Aglütinasyon yoksa eritrositler
%0.9 SF ile en az 4 kez
yıkanır. Böylece eritrositlere
bağlanmamış antikorlar ve
serumda
bulunan
diğer
proteinler uzaklaştırılmış olur.
• Yıkanmış eritrositlerin üzerine
2 damla AHG reageni eklenir
59
• 1000 x g’de 1 dak. santrifüj edilir
ve aglütinasyon değerlendirilir.
• Negatif AHG testini konfirme
etmek için IgG kaplı kontrol
eritrositlerinden 1 damla tüplere
ilave edilir. 1000 x g’de 1 dak.
santrifüj edilir. Santrifüj sonrası
aglütinasyon değerlendirilir, en az
2+ aglütinasyon görülmelidir
60
Jel Yöntemi ile İAT
61
Jel Yöntemi ile İAT
62
Enzim
63
Enzim
64
Antikor Tarama - Tanımlama
• Antikor Tarama Testi
Eritrosit antijenlerine karşı antikor
olup olmadığını saptamak için yapılır
• Antikor Tanımlama Testi
Varolan antikorun hangi kan grup sistemi ile ilişkili
olduğunu ve hangi eritrosit antijenine karşı geliştiğini
saptamak için yapılır
Antikor Tarama
•
Klinik önemi olan antikorlar mutlaka araştırılmalı
•
Klinik önem
–
Antikorun 37oC’de reaktif olması
–
Hemoliz yapması
–
Eritrosit yaşam süresini azaltması
Hücreler
Fenotipik yapısı (tercihan homozigot) 2 veya 3
farklı donörden alınmış test hücreleri tarama,
daha fazla sayıda test hücreleri ise tanımlama
testlerinde kullanılmalı
IAT
1
2
3
1 damla hücre
+

2 damla hasta serumu
ANTİKOR TARAMA (IAT-ET)
I
++++
II
III
+++
++
I
II
+
-
III
-
Test Hücrelerinin
Hazırlanması
( I, II, III )
Hücreler resüspanse edilerek
oda ısısına getirilir
I
II
III
I
II
Dağıtım
III
50 µL etiketine uyan test hücresi
25 µL hasta serumu veya plazma
Test Hücrelerinin
Hazırlanması
( IP, IIP, IIIP )
Hücreler resüspanse edilerek
oda ısısına getirilir
İnkübasyon
37 °C’de 15 Dakika
Santrifüj
10 Dakika
Değerlendirme
Test hücreleri ekindeki tablo
değerlendirmede kullanılır.
Hücre ve
tablonun Lot numarası aynı
olmalıdır.
ANTİKOR TARAMA - CA
I
++++
*
III
I
+++
++
+
II
III
-
-
*
I
Test Hücrelerinin
Hazırlanması
( I, II, III )
II
Hücreler resüspanse edilerek
oda ısısına getirilir
II
III
I
II
Dağıtım
III
50 µL etiketine uyan test hücresi
25 µL hasta serumu veya plazma
İnkübasyon
4 °C’de 15 Dakika
Santrifüj
10 Dakika
* Normal Hücre ve Nacl / Enzym / Cold Aglutinin Kartı
Kullanılır
Değerlendirme
Test hücreleri ekindeki tablo
değerlendirmede kullanılır.
Hücre ve
tablonun Lot numarası aynı
olmalıdır.
Test Hücreleri
Tüpte Antikor Tanımlama
1
2
3
4

5
6
7
1 damla hücre
+

2 damla hasta serumu
8
9
10
11
ANTİKOR TANIMLAMA - IAT
1
++++
2
+++
3
4
++
5
-
+
7
6
-
++++
8
+++
9
++
10
+
11
-
Test Hücrelerinin
Hazırlanması
( 11’li Normal Panel Hücresi )
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Hücreler resüspanse edilerek
oda ısısına getirilir
Dağıtım
50 µL etiketine uyan test hücresi
25 µL hasta serumu veya plazma
İnkübasyon
37 °C’de 15 Dakika
Santrifüj
10 Dakika
Değerlendirme
Test hücreleri ekindeki tablo
değerlendirmede kullanılır.
Hücre ve
tablonun Lot numarası aynı
olmalıdır.
ANTİKOR TANIMLAMA – ET
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Adı Soyadı
Tarih
++++
+++
++
-
+
-
++++
+++
++
+
-
Test Hücrelerinin
Hazırlanması
( 11’li Enzimli Panel Hücresi )
Hücreler resüspanse edilerek
oda ısısına getirilir
1
2
3
4
5
7
8
9
10
11
6
Dağıtım
50 µL etiketine uyan test hücresi
25 µL hasta serumu veya plazma
İnkübasyon
37 °C’de 15 Dakika
Santrifüj
10 Dakika
Değerlendirme
Test hücreleri ekindeki tablo
değerlendirmede kullanılır.
Hücre ve
tablonun Lot numarası aynı
olmalıdır.
ANTİKOR TANIMLAMA – CA
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Adı Soyadı
Tarih
++++
+++
++
-
+
-
++++
+++
++
-
+
*
*
Test Hücrelerinin
Hazırlanması
( 11’li Normal Panel Hücresi )
Hücreler resüspanse edilerek
oda ısısına getirilir
1
2
3
4
5
7
8
9
10
11
6
Dağıtım
50 µL etiketine uyan test hücresi
25 µL hasta serumu veya plazma
İnkübasyon
4 °C’de 15 Dakika
Santrifüj
10 Dakika
* Normal Hücre ve Nacl / Enzym / Cold Aglutinin Kartı
Kullanılır
Değerlendirme
Test hücreleri ekindeki tablo
değerlendirmede kullanılır.
Hücre ve
tablonun Lot numarası aynı
olmalıdır.
Değerlendirme
Antikor Tanımlama
Anti-E