gram boyama

GRAM BOYA METODU
Genel Bilgi:
Birkaç modifikasyonu olmakla beraber Gram boyama yönteminde temel ilke Olarak, tesbit
edilmiş preparatın üzerine kristal viyole boyası ve gram iyot eriyiği (lugol) uygulandıktan
sonra %95’lik etil alkol ile renksizleştirme işlemi yapılır ve sonra zıt bir boya eriyiği ile (sulu
fuksin veya safranın gibi) uygulanarak yöntem tamamlanır. Bakterilerin büyük bir çoğunluğu
bu boyama ile gram (+) veya gram (-) olmak üzere iki gruba ayrılırlar. Gram boyama
yönteminde önce uygulanan kristal viyole ve mordan olarak kullanılan iyot eriyiğinin
uygulanmasından sonra preparattaki boyanabilir tüm bakteriler boyayı alırlar. Mordanlar
boyaların nüfuz kabiliyetini artırır ve daha iyi boyanmalarını sağlarlar.
Alkol ile yapılan renksizleştirme işleminde gram (+) bakterilere aldıkları boyayı bırakmazlar.
Gram (-)’ler ise boyayı bırakarak renksizleşirler. Bunlarda son uygulanan zıt boya (sulu
fuksin vs.) ile boyanırlar. Bu suretle gram (+) bakteriler mor, gram (-)’ler zıt boya renginde
(sulu fuksin ile pembe-kırmızı) boyalı olarak görünürler. Bazı bakteriler gram (+) oldukları
halde eskiyen kültürlerinde gram (-) varyantlar oluştururlar. Bazıları ise gram (+) oldukları
halde alkolün biraz fazlaca uygulanması ile boyalarını bırakabilirler. Bunlara gram değişken
bakteriler denir.
Gram (+) mekanizması olayının bakterilerin hücre çeperi yapısına bağlı olduğu
bilinmektedir. Gram (+) bakterilerin hücre duvarları gram (-)’ den farklıdır. Bunlardaki
peptidoglikan katmanı daha kalındır. Bu şekilde tüm hücre çeperinin %50'si peptidoglikandan
ibarettir. Ayrıca çoğunda gram (-)'lerde bulunmayan teikoik asit bulunur. Gram (-)’lerin hücre
duvarında ise farklı olarak bir lipopolissakkarit katmanı vardır. Bunlarda peptidoglikan yapı
incedir. Her iki grup bakteride kristal moru ve lugolun hücre duvarını geçerek hücrenin içine
girdikleri, gram (+)’larda bu boyaların hücre çeperi ile zor ayrılabilen bileşikler yaptığı
bilinmektedir.
Kristal Viyoletin Hazırlanması :
Kristal viyolet
1g.
Asit – Fenik kristali (fenol kristali)
2 g.
Etil alkol (% 96)
10 mL.
Distile su
100 mL.
Kristal viyolet ve fenol kristali porselen havanda ezilir ve etil alkol yavaşça eklenir.
Lugol solusyonunun hazırlanması:
Gram boyama yönteminde mordan olarak kullanılır.
İyot
1 g.
veya
İyot
5 g.
KI
2 g.
veya
KI
10 g.
Distile su
300 cc.
veya
Distile su
100 cc.
İyot ile KI havanda iyice ezilir. Sonra distile su yavaş yavaş katılır ve iyice karıştırılır. Sonra
şişeye aktarılır. Kahverengi şişelerde saklanır.
Bazik Fuksin (Stok Solüsyon)
Bazik Fuksin
10 g
%95 lik Etil alkol
100 ml
Bazik fuksin havanda ezilir ve alkolle eritilir, 370 °C’de bir gece bekletildikten sonra filtre
kağıdında süzülür ve cam kapaklı şişelerde saklanır.
Sulu Fuksin Solüsyonu
Bazik fuksin (stok)
10 ml
Distile su
100 ml
Fuksin distile suda iyice karıştırılır ve filtre kağıdında süzülür.
(Tıbbi Laboratuvar Mikrobiyolojik Preparat Hazırlama, MEB,Ankara, 2011)
Deneyin Yapılışı:
1) Sıvı ve katı kültür ortamından öze ile alınıp lam üzerine yayılan bakteri kültürünün havada
kuruması sağlanır. 3 defa alevden geçirilerek fiziksel tesbit yapılır.
2) Lam ( préparât ) boya kabına konarak, kristal viyole ile 1 dakika boyanır.
3) 1 dakika sonra kristal viyole boya kabına dökülür.
4) Lam üzerinde kalan boya üzerine lugol ilavesi yapılır. 1 dakika beklenir.
5) 1 dakika sonra boya kaba dökülerek, % 95' lik Etil Alkol ve su ile boya akmayıncaya kadar
yıkama İşlemi yapılır.
6) Bu işlemden sonra lam üzerine (preparat) safranin dökülerek 15-20 saniye dakika beklenir.
Boya dökülüp, lam yıkanarak kurulanır. Bir damla immersiyon yağı damlatılarak mikroskopla
incelenir ( 100 x ). Objektif sahasında görülen mor renkli bakteriler Gram (+), pembe renkli
olanlar ise Gram ( - ) olarak adlandırılır.
Gram boyama değerlendirme çizelgesi
İşlem
Yöntem
İlk boya
Lugol (mordan)
Renk giderme
Zıt boyama
Kristal viole ile 1-2 dk
Lugol ile 1 dk
%95’lik alkol ile 20-30 sn
Sulu fuksin ile 20-30 sn
Sonuç
Gram (+)
Mor renk
Mor renk
Mor renk
Mor renk
Gram (-)
Mor renk
Mor renk
Renksiz
Pembe renk (sulu fuksinin rengi)
Sonuç; gram (+)’ler ilk boya olan kristal violenin rengi olan mor renk, gram(-)’ler zıt boya
olan sulu fuksinin rengi pembe renge boyanır.