MAHMUT CARIN - Transplantasyon İmmunolojisi ve Genetiği

BÖBREK TRANSPLANTASYON
İMMUNOLOJİSİNDE
GÜNCEL DURUM
ve
NGS HLA
Prof.Dr. Mahmut Nezih ÇARİN
Gayrettepe Florence Nightingale Hastanesi
İmmünoloji Bölüm Başkanı
5. ULUSAL TRANSPLANTASYON
İMMUNOLOJİSİ ve GENETİĞİ
KONGRESİ
16 – 19 NİSAN 2015
Böbrek Naklinde İmmunolojik Parametreler
• Kan Grubu
• Doku Grubu
• PRA
Tarama
Tanımlama
Single Antigen Beads
•DSA
•C1q
• CDC Crossmatch
T hücre
B hücre
• Flow Cytometry
Crossmatch
T hücre
B hücre
Auto
İstenmeyen Durum
HLA Uyumunun Avantajları
 Yüksek greft survisi
 Yüksek greft fonksiyonu
 İmmunosupresyonun azaltılması
Bir alıcı ve verici arasında,
doku uygunluğu ne kadar fazla ise,
greftin ömrü
o kadar uzun olacaktır.
Transplantasyonun başarılı sonuçları
tam HLA uyumlu donörler ile sağlanır, ancak ;
 Her hasta için tam uyumlu donör bulmak, HLA
sisteminin çok polimorfik olması nedeniyle zordur.
 Birçok hasta bu nedenle mismatch’li (uyumsuz)
greft ile transplante edilmektedir.
Ancak ... Her HLA uyumsuzluğu, aynı yıkıcı immun
yanıta neden olmamaktadır.
FHJ Claas
MHC Polimorfizmin
Özellikleri
1. Her lokusta birçok alel olması
2. Dominant alel olmaması
( Kodominant aktarım )
3. Alellerin aminoasit değişiklikleri
göstermesi
HLA molekülleri yüksek oranda polimorfiktir.
1800
1800
HLA ALELLERİ
1600
1400
Class I 3822
1193
Class II 1159
1200
1000
829
2006 - 2007
902
800
600
400
112
200
141
0
HLA-A
HLA-B
HLA-C
HLA-DR HLA-DQ HLA-DP
G. Opelz, CTS
Figure 1: Graft survival rates in relation to the number of HLA-A,-B,-DR
mismatches for transplants of deceased donor (p<0.001)
Anti-HLA antikorları
yabancı HLA moleküllerine
maruz kalınması sonucu gelişir.
•Hamilelikler
•Kan transfüzyonları
•Daha önceki nakiller
HLA specific antikor tespiti ve
karakterizasyon belirleme
Lymphocytotoxicity (CDC)
Flow Cytometry
HLA specific antikor tespiti ve
karakterizasyon belirleme
Lymphocytotoxicity (CDC)
Flow Cytometry
Single Antigen Beads (Luminex-SAB)
HLA spesifik antikorlar ile klinik bulguların
ilgisi
Hyper acute
rejection
Acute humoral/cellular
rejection
Low risk
“Allograftlar hücrelerin değil
antikorların etkisiyle rejekte olur.
Antikorları üreten hücrelerdir
ama grefti yıkan antikorlardır.”
IgG tipi
Humoral Theory of Transplantation
Paul I. Terasaki
HİPERAKUT REJEKSİYON
AKUT REJEKSİYON
KRONİK REJEKSİYON
HUMORAL TEORİNİN
SONUÇLARI VE ÖNERİLER
ANTİKOR
ANTİKOR VARLIĞI
ANTİKORLARIN ETKİSİ
ANTİKOR ÖZELLİĞİ
ANTİKOR SAPTANMASI
DESTEKLEYİCİ YAYINLAR
Terasaki ve ark; 2003;Am J Transplant
Antikor endotele bağlanır ve
bir hasar-onarım döngüsü oluşturur. Bu onarım
aylar, yıllar boyunca sürebilir.
Damar intimasındaki
kalınlaşma yavaş
seyirlidir ve
ilerleyicidir.
Kısaca hasar onarımdan daha hızlıdır.
Anerji
Hücre yüzey molekülleri
ve ikincil sinyaller
Sitokinler
Lokal / Merkezi
Etkili
T Hücre Tanıması
Humoral
Teori
İmmunsupresif
Tedavi
Eğer HLA antikorları rejeksiyona neden oluyorsa
rejeksiyondan önce saptanmalıdır.
Grefti fonksiyone olan hastaların
yaklaşık %30’unda antikor vardır
ancak bu durum “Hümoral Teori”yi çürütmez.
Çünkü teori hasarın ilerleyici olduğunu ve
antikor varsa bir gün mutlaka
organ yetmezliği olacağını savunmaktadır.
Terasaki ve ark; 2004;Am J Transplant
Anti-HLA Antikor Spesifitesi
Greft rejeksiyonunda serumda
saptanan antikorlar
çoğunlukla donöre karşı değildir.
Çünkü rejeksiyon sırasında
donöre yönlenmiş antikorların
greft tarafından emildiği düşünülmektedir.
Lee ve ark; 2002; Transplantation
“Transplantasyonun
Hümoral Teori’si 40-50
yıldan bu yana
Üç Ana Basamakta
uygulanmaktadır’’
Transplantation 2012;93:751-756
1) Boya Testi (Dye exclusion test)
 Canlı hücreler trypan blue ile boyanmaz. Antikor ve
kompleman tarafından öldürülmüş olan hücreler mavi
boyanır
Papenheimer AM, J Exp Med, 1917
 Aglutinasyon testi antijen ayrımında kullanılır.
Van Rood JJ et al, Nature, 1958
2) Microlymphocyte Cytotoxicity Test
‘Böbrek naklinde pozitif cross-match
testinin önemi’
Komplemana bağlı sitotoksisite (CDC) testi,
nakil öncesi donör spesifik antikor (DSA)
tespitinde altın standart olmuştur.
Antikor aracılı hiperakut rejeksiyon
Patel & Terasaki, N Engl J Med, 1969
3) Single Antigen Bead test
 HLA moleküler yapısının tanımlanması sadece tek bir
HLA spesifikliği ile sağlanmıştır
Bjorkman PJ et al, Nature, 1987
 Bir tek HLA antijen ile kaplı Bead’ler tüm anti-HLA
antikor spesifikliğinin tanımlanmasını sağlar
Pei R et al, Transplantation, 2003
Bu yeni teknoloji aynı zamanda
anti-HLA antikor test stratejisini de belirler
Bray & Gebel, Curr Opin in Organ Transpl, 2009
FLOW SİTOMETRİ-TEK ANTİJEN BONCUKLAR
Spesifik PRA’dan en önemli farkı boncukların
tek bir HLA antijeni ile kaplı olmasıdır.
FL2
FL2
FL1
FL1
Yazılıma ihtiyaç yoktur, yazılıma bağlı hatalar ortadan kalkar.
Solid faz test sistemleri
Flow sitometri
ELISA
Lumineks
HLA antikoru
Ortalama kanal kayması
OD değerleri
Ortalama floresan
yoğunluğu (MFI)
Tek antijen paneli maskelenmiş
antikor spesifitelerini ortaya çıkarır.
Antikorlar
Maskelenmiş antikorlar
Pei et al.Transplantation,2003
SAB tekniği ile S1, S2, S3, S4 örneklerinde spesifik test
sonuçlarına ek olarak saptanan yeni HLA antikorları
SAB tekniği ile S3 örneklerinde elemine olan antikorlar
parantez içinde gösterilmiştir.
Single human leukocyte antigen flow cytometry beads for accurate identification of human leukocyte
antigen antibody specificities. Pei R, Lee JH, Shih NJ, Chen M, Terasaki PI. Transplantation. 2003
Jan 15;75(1):43-9
Deneyimimiz .... Bir olgu....
HASTA HLA TYPE
A*01, A*26 B*52, B*55 DRB1*14, DRB1*15
DONOR (BABA) HLA TYPE
A*03, A*26 B*35, B*55 DRB1*14, DRB1*04 DQB1*3(8)-DQB1*05
CDC-XM- 22/01/2014
NEGATIF
Flow Cytometry XM- 22/01/2014
T FCXM- B FCXM- Auto FCXM : NEGATIF
CDC-XM- 02/07/2014
NEGATIF
Flow Cytometry XM- 02/07/2014
T FCXM- B FCXM- Auto FCXM : NEGATIF
Deneyimimiz .... Bir olgu....
CDC-XM- 04/11/2014
NEGATIF
Flow Cytometry XM- 04/11/2014
T FCXM- B FCXM- Auto FCXM : NEGATIF
Antibody Identification; LUMINEX- 04/11/2014
Class I: 62% POSITIF A2(MFI:5125)-A24(MFI:2215)-A36(MFI:2889)-A66(MFI:2174)A68(MFI:1999)-B13(MFI:3010)-B45(MFI:5125)-B47(MFI:1401)-B48(MFI:1580)-B49(MFI:1999)B55(MFI:1469)-B57(MFI:4345)-B58(MFI:2174)-B59(MFI:979)-B60(40)(MFI:2215)B61(40)(MFI:1810)-B63(15)(MFI:3055)-B71(70)(MFI:1843)-B72(70)(MFI:4682)B77(15)(MFI:2215)-B81(MFI:1061)-B82(MFI:1999)-Cw7(MFI:2963)
Class II: 60% POSITIF DQ2(MFI:1303)-DQ3(7)(MFI:13282)-DQ3(8)(MFI:11440)DQ3(9)(MFI:12211)-DR4(MFI:731)-DR7(MFI:976)
Single Antigen Bead
DQ3(8)(MFI:6101)
DR4(MFI:481)
DSA (17.07.2014)
Class I: NEGATİF
Class II: POZİTİF (MFI:2089)
DSA (24.12.2014-Nakil Öncesi)
Class I: NEGATİF
Class II: POZİTİF (MFI:808)
Bu Olgu İçin Test Parametreleri
• Kan Grubu
• Doku Grubu
• PRA
Tarama
Tanımlama
Single Antigen Beads
•DSA
•C1q
• CDC Crossmatch
T hücre
B hücre
• Flow Cytometry
Crossmatch
T hücre
B hücre
Auto
Protocol for desensitisation
Rituximab, MMF, Septrin
FK, prednisolone, ranitidine and viral
prophylaxis
Plasmapheresis
Transplant
Plasmapheresis
Protocol biopsies
Day -28
Day -14
Day -7, -5, -3,-1
Day 1,3,5
Day 7 and 14
• Requirement to render the CDC crossmatch negative prior to transplantation.
• If this is not achieved after 4 plasmapheresis sessions then further treatment
will be required and the transplant delayed.
• At each session 1 to 1.5 plasma volumes processed.
June 2014 Craig Taylor
Hassasiyet
Boncuk tabanlı florometrik testler > kolorimetrik ELISA
(Flow sitometri tek antijen boncuklar, Lumineks)
Tek antijen boncuklarla tespit edilen antikor
sıklığı ELISA ile tespit edilenin iki katıdır.
Zachary et al. Human Immunol, 2009
«Ayrıca belirtmek gerekir ki
kalitatif sonuç vermek üzere geliştirilen
Luminex tabanlı kitler yarı kantitatif
sayısal sonuçlar da verebilir»
Transplantation Volume 95, Number 1, January 15, 2013
Tek antijen boncuklarla tespit edilen antikorların ‘gücünün’
klinik anlamlılık ile ilişki olduğu belirtilmiştir.
Tanımlanan bir HLA antikorunun ‘gücü’
XM’in önemli bir göstergesidir.
Antikorların gücünün belirlenmesi
Ortalama floresan yoğunluğu=Mean Floresence Intensity (MFI)
Bir antikorun gücünü belirlemede iki analiz tipi vardır:
Anti-HLA antikorunu tanımlayan
tek bir antijen boncuğunun MFI’sı
DSA MFI’sının pozitif kontrol MFI’sı ile
bölünmesi sonucu oluşan oran
Morris GP et al. Hum Immunol, 2010
MFI<2000 ya da MFI oranı <0.2 olan
zayıf reaksiyon veren
DSA’lar pozitif XM ile sonuçlanmaz ve
transplantasyon için kontraendikasyon
olmayabilir.
Ancak, bu testlerdeki cut-off değerler
için standart bir uygulama yoktur.
Her laboratuar
kendi internal kalite kontrol testleri ve
test içi kontrollerle
en uygun cut-off değeri belirlemelidir.
Morris GP ve ark. Hum Immunol, 2010
Ortalama Floresan Yoğunluğuna (MFI) göre
kabul edilemeyen antijenlerin belirlenmesi
DSA varlığı/kabul edilemeyen
antijenlerin belirlenmesi
basit bir EVET/HAYIR cevabı değildir.
•Spesifite
•Ig sınıfı
•Güç
•Zamanlama
•Komplemanı fikse etme durumu
Tambur et al.Am J Transpl, 2009
Donöre özgü HLA antikorlarının klinik etkilerini değiştirebilecek
potansiyel patojenik faktörler
Hafıza
T-hücresi
Humoral hafıza yanıtının
büyüklüğü ve devamlılığı
Hafıza
B-hücresi
Plazma hücresi
Kompleman
Anti-HLA antikorları
HLA
ekspresyon
yoğunluğu
HLA-DSA’nın hedef epitopa bağlanma gücü
HLA-DSA’nın komplemanı aktive etme kapasitesi
Donör-HLA
Endotelyal hücrelerin koruyucu özellikleri
Günümüzde,
transplantasyon merkezlerinin
karşı karşıya kaldığı en önemli konu
yüksek oranda sensitize hastaların
transplantasyonudur.
Bu hastalar gebelikler, kan transfüzyonları
ve daha önceki nakiller nedeniyle çok sayıda
HLA antijenine karşı antikor geliştirmiş olup,
bekleme listelerinde uzun süreler beklerler.
Yüksek oranda sensitize hastaya yaklaşım
Yüksek oranda
sensitize
hastaların
2) antikorları temizleyip,
nakil
olabilirliği
DSA varlığına
rağmen,
hastaya nakil yapmak
artırılmalıdır !!!!
1) cross-match negatif bir
donör bulma şansını artırmak
Virtual cross-match (vXM) terimi
kullanıma yeni girmiş olmasına rağmen,
uzun süredir uygulamada olan bir yaklaşımdır.
Preliminer cross-match ve hiperimmün plaklar
Eurotransplant
Kabul edilebilir uyumsuzluklar
(Acceptable mismatches)
+
UNOS
Kabul edilemeyen uyumsuzluklar
(Unacceptable mismatches)
The acceptable mismatch program of
Eurotransplant
Frans Claas
Eurotransplant Reference Laboratory
Leiden University Medical Center.
Leiden, the Netherlands
Sensitize hastalardaki temel problem:
Donör Spesifik Antikorların hiperakut retler için belirleyici olmasıdır.
antikorlar
süre
Patel & Terasaki (1969): 30 hastadan 24 hiperakut
red vakada donör spesifik antikor gözlemlemiştir.
Hastada verici dışlanmasına yolaçan donör spesifik antikor tesbit edilmesi
için yapılan serolojik uyum testleri, hiperakut redleri önleyecektir.
Yüksek sensitize hastalarda sıklıkla pozitif uyumsuzluk
gözlenmektedir
Bu nedenle yüksek sensitize hastaların sayısı organ bekleme
listesinde güngeçtikçe artmaktadır.
Yüksek sensitize hastaların Eurotransplant içindeki durumu:
verici nüfusunun %85den fazlasının HLA anijenleri hasta ile
uyumludur.
Organ verici nüfusundaki hedef antijenlerin frekansı HLA antikorları
ile ilgili fakat antikor taramasındaki %PRA oranı ile ilgili değildir.
Eurotransplant web sitesinde yer alan donör reaktif antikor
hesaplama programı farklı merkezlerdeki yüksek sensitize hastaların
da katıldığı 30.000 organ vericisinin HLA tipleme verilerine
dayanmaktadır.
48
49
Eurotransplant Böbrek Tahsis Merkezi sensitize
hastalara öncelik vermektedir
Puanlama sistemi farklı parametrelere bağlıdır:
• HLA uyumu
• Prognostik uyum indeksi
yüksek sensitize hastalara ve nadir HLA fenotiplerine
ektra puanlama
• Bekleme süresi
• Bölgesel verici (soğuk iskemi dönemi)
• Ülkesel dengesi
50
Bu önceliklere rağmen sensitize hastaların nakil şansı çok
düşüktür
% nakil yapılan
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
ET-KAS
0
3
6
9
12
15
Bekleme süresi (ay)
18
21
24
Alternatif bir yaklaşım gerekliliği
• Eurotransplant standart politikası kabul edilmeyen HLA
uyumsuzluklarını kaydederek böbrek vericilerinin donör
spesifik antikor hastalar için tahsis edilmesini
önlemektir.
Amaç: pozitif CDC uyumsuzluğunu önlemektir
• Problem: Çok fazla HLA antijeni olduğu için tüm HLA antikor
özelliklerinin yüksek sensitize hasta ihtimaline karşı kaydedilmesi
imkansızdır.
52
"Acceptable Mismatch" Programı
• Dayanak: hastada hiç oluşmamış antikorların HLA antijenlerini tesbit
etmek ve verici seçimini buna göre yapmak.
• Amaç: Negatif CDC uyumsuzluğu öngörmek
• Yöntem: Alıcı merkezinde geniş çaplı antikor tarama yaparak hastanın
antikorları ile etkileşime girmeyecek HLA antijenlerini tesbit etmek.
Sonuçların validasyonu Eurotransplant referans laboratuvarında
yapılacaktır.
53
Hastanın HLA sı ile uyumlu olabilecek uygun bir HLA ve "Acceptable
Mismatch" ile uygun böbrek verici tahsisi
HLA Hasta: A24, A31, B27, B51, DR4
AM:
A25, A26, B44
Tahsis edilecek HLA
fenotipi
Uyumlu böbrek vericisi: A25, A31; B27, B51; DR4
A26, A31; B27, B51; DR4
A24, A25; B27, B51; DR4
A24, A26; B27, B51; DR4
A24, A31; B44, B51; DR4
A24, A31; B27, B44; DR4
A25, A31; B44, B51; DR4
A26, A31; B44, B51; DR4
A25, A31; B27, B44; DR4
A26, A31; B27, B44; DR4
A24, A25; B44, B51; DR4
A24, A26; B44, B51; DR4
A25, A31; B27, B44; DR4
54
Negatif uyumsuzluğa sahip organ nakli için daha yüksek şans
% nakil yapılan
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
AM
ET-KAS
0
3
6
9
12
15
Bekleme süresi (ay)
18
21
24
"Acceptable Mismatch" hastalarının yaşama şansı sensitize
hastalarınki kadar yüksek olmaktadır.
% graft survival
Nakil sonrası (ay)
Mevcut Durum
•
"Acceptable Mismatch" (AM) programı yüksek sensitize hastalara
nakil imkanı sunan bir uygulamadır.
•
Buna rağmen bekleme listesindeki özellikle nadir HLA fenotipli
hastaların bir grubu bundan fayda bulamamışladır.
•
Bu hastalar için çözümler:
• Hassasiyeti yoketme: donör spesifik antikorları yoketmek.
• Daha geniş bir verici havuzu: Avrupa çapında büyük bir "Acceptable
Mismatch" Programı havuzu oluşturmak.
57
YENİ NESİL DİZİLEME
NGS-HLA
Yapmamıza imkan
hasıl olan işleri
yapmazsak,
tarih bizi
tenkit eder.
1928 (Hakkı Tarık Us, Ayın Tarihi, Atatürk’ün Vefatları, N : 60, 1938, S. 150)