Kullanma Kılavuzu

S.pyogenes
DNA İzolasyonu ve
Q-PCR Tespit Kiti
500 Test
engy-spyo-1201
Kullanma Kılavuzu
S.pyogenes DNA İzolasyonu ve Q-PCR Tespit Kiti
500 Test
engy-spyo-1201
Kullanma Kılavuzu
Kullanılan İşaretler
Kitin son kullanma tarihini belirten sembol
Kitin toplu üretim kodunu belirten sembol
Kitin toplu üretim tarihini belirten sembol
Üreticinin iletişim bilgilerini gösteren sembol
Kitin katalog numarasını belirten sembol
Güneş ışığına maruz bırakmayınız.
Kitin saklanması gereken sıcaklık aralığını gösteren
sembol
Kuru yerde saklayınız.
Kullanmadan önce kullanım talimatlarını okuyunuz.
Steril değildir.
In vitro tıbbi tanı cihazı
Kısaltmalar
Kit
ENGY S.pyogenes DNA İzolasyonu ve Q-PCR Tespit
Kiti
S.pyogenes
Streptococcus pyogenes
AGBHS
A Grubu Beta Hemolitik Streptokoklar
CT
Eşik döngü sayısı
Tm
Erime sıcaklığı
PCR
Polimeraz zincir reaksiyonu
QPCR
Gerçek zamanlı kantitatif PCR
DNA
Deoksiribonükleik asit
!
Kullanım Amacı
Kit, AGBHS farenjiti olgularının tanısına yardımcı olmak amacıyla, boğaz sürüntü numunelerinde
S.pyogenes tespiti için kullanılan, kalitatif bir in vitro tıbbi tanı cihazıdır. Tespit, boğaz
sürüntülerinden toplam DNA izolasyonu ve S.pyogenes genomuna özgü bir bölgenin Q-PCR ile
çoğaltılması ile gerçekleştirilmektedir.
Test Prensibi
Kit boğaz sürüntü numunelerinde hızlı bir DNA eldesi ve ardından S. pyogenes genomuna özgü
oligonükleotidler ile DNA izolatında bulunan S. pyogenes pirojenik ekzotoksin B (speB) gen
bölgesinin çoğaltılması ve tespitine dayanır. İlk aşama DNA materyalinin ortaya çıkarılmasıdır. Bu
da uygun tampon içerisinde ısı ile parçalama ve peptitler ile inhibitör bloklama yöntemi esas
alınarak tasarlanmıştır. Özel olarak geliştirilen PCR inhibitörü bloke edici peptitler sayesinde, 10
dakika içerisinde eküvyondan Q-PCR’da kullanabilecek kalitede DNA izolasyonu mümkün
olmaktadır.
PCR, hedef DNA molekülünün enzimatik bir şekilde, hedef DNA’ya özgün oligonükleotidler
kullanılarak çoğaltılmasıdır. Kitte S. pyogenes’e özgü DNA’ların PCR ile spesifik olarak çoğaltılması
için speB genini hedefleyen oligonükleotidler kullanılmıştır. Numuneden kaynaklanan inhibisyon
etkisinin tespiti için kit, pozitif kontrol DNA’sı olarak speB genini de içermektedir.
Q-PCR kantitatif sonuç verebilen bir PCR yöntemidir. Klasik PCR’den farklı olarak, floresan boyalar
yardımıyla DNA çoğalmasının eş zamanlı olarak izlenmesine olanak tanır. Kitte floresan ışıma için
bir yüksek çözünürlükte erime (HRM) boyası olan EvaGreen kullanılmıştır. 35 döngü yapılan PCR
sonucunda speB gen bölgesinin tespiti yüksek çözünürlükte yapılan erime eğrisi analizi ile
gerçekleştirilmektedir.
Kit Hakkında Teknik Bilgi
Akut tonsillofarenjit yaygın ve sık görülmesi, iş gücünde kayba yol açması ve akılcı olmayan
antibiyotik kullanımına neden olmasından ötürü önemli bir sağlık sorunudur.1 Akut tonsillofarenjit
olgularının yaklaşık % 40’ından virüsler, %20-40’ından bakteriler ve %20-30’undan bilinmeyen
etkenler sorumludur. S.pyogenes (AGBHS) ise hastalığın çocuklarda %15-30, erişkinlerde ise %5-15
oranında rastlanan en sık bakteriyel nedenidir.2
Akut tonsillofarenjit antibiyotik tedavisine ihtiyaç duyulmadan tedavi edilebilmektedir.3 AGBHS
tespitine dayalı tanısal yaklaşımların temel amacı S.pyogenes pozitif çocuk hastalarda akut
romatizmal ateş veya akut glomerülonefrit gibi komplikasyonların antibiyotik (çoğunlukla
penisilin) kullanılarak önlenmesi, diğer etkenlere bağlı durumlarda ise gereksiz antibiyotik
kullanımından doğan bakteriyel direnç, yüksek maliyet ve yan etkilerin önüne geçilmesidir.4
AGBHS tespitinde “altın standart” olan boğaz kültürü ile sonuç en erken 24 saatte alındığı için,
tonsillofarenjit teşhisi konulan hastaların ancak %3-5’ine uygulanmaktadır. Bu durum, hastalarının
yaklaşık %75’ine gereksiz antibiyotik uygulanmasına neden olmaktadır.5 Hızlı streptokok antijen
testleri (HSAT) ile 5-10 dk gibi kısa sürelerde tanı konulabilmesine karşın, HSAT’ın S.pyogenes
farenjiti olgularında %35’e varan oranlarda yalancı negatif sonuç verdiği bildirilmiştir.6, 7 Bu
nedenle HSAT ile elde edilen negatif sonuçların boğaz kültür ile doğrulanması gerekmektedir. DNA
izolasyonu ve sonrasında S.pyogenes genomuna özgü bölgelerin çoğaltılması ve tespitine dayalı
yöntemler ile yüksek hız, duyarlılık (>%93) ve özgüllük (>%95) ile AGBHS tespiti yapılabilmekte ve
negatif sonuçların boğaz kültür ile daha ileri doğrulanmasına gerek kalmamaktadır.8, 9 Bu
yöntemler IDSA (Infectious Diseases Society of America) rehberlerine de girmiştir.10, 11
DNA izolasyonu ve sonrasında S.pyogenes genomunun speB bölgesinin Q-PCR ile çoğaltılması ve
tespitine dayalı “ENGY S.pyogenes DNA İzolasyonu ve Q-PCR Tespit Kiti” Boğaziçi Üniversitesi BUN
Teknopark’ta faaliyet gösteren ENGY Çevre ve Enerji Teknolojileri Biyoteknoloji Ar-Ge Ltd. Şti.
tarafından, etik kurulu onaylı bir proje ile geliştirilmiştir. Kit ile boğaz sürüntü numunelerinde
S.pyogenes tespiti kültüre dayalı testlere eş değer bir duyarlılık (%100, n=687), özgüllük (%97,
n=687) ve maliyetle 1 saatten kısa sürede tamamlanabilmektedir. Kitin düşük maliyet ve yüksek
hız, duyarlılık ve özgüllüğe sahip olması, AGBHS farenjiti olgularının Türkiye’de hızlı ve rutin
tespitine imkan tanımaktadır. Bu nedenle, “24 Aralık 2014 Tarihli ve 29215 Sayılı Resmî Gazete”de
yayınlanan “Sosyal Güvenlik Kurumu Sağlık Uygulama Tebliğinde Değişiklik Yapılmasına Dair
Tebliğ” kapsamında SUT eki “EK-2/B Listesi”ne “Strep.pyogenez hızlı polimeraz zincir reaksiyon
testi” işlemi, “908045” işlem kodu ile girmiştir.
Kitin test reaktivitesi S. pyogenes ATCC 49399 ve 12344 suşları kullanılarak belirlenmiştir. Kitin bu
suşlar kullanılarak tespit edilen analitik duyarlılığı 240 kob/testtir.
Kitin analitik özgüllük testleri Acinetobacter baumannii, Aeromonas hydrophila, Arcanobacterium
haemolyticum, Bordetella bronchiseptica, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans,
Citrobacter freundii, Corynebacterium diphtheria, Corynebacterium pseudodiphtheriticum, Enterococcus
faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Haemophilus influenza, Homo sapiens, Klebsiella
oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Lactococcus lactis, Legionella pneumophila, Listeria monocytogenes,
Moraxella catarrhalis, Morganella morganii, Myxococcus stipitatus, Neisseria pharyngis, Neisseria
meningitidis, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus
epidermidis, Stenotrophomonas maltophilia, Streptococcus agalactiae, Streptococcus anginosus,
Streptococcus bovis, Streptococcus canis, Streptococcus dysgalactiae (subspecies equisimilis),
Streptococcus equinus, Streptococcus intermedius, Streptococcus mitis, Streptococcus mutans,
Streptococcus pneumoniae, Streptococcus salivarius, Streptococcus suis, Streptococcus uberis,
Streptococcus sp. viridans tipi organizmaları üzerinde yapılmış ve kitin özgül olarak sadece
S.pyogenes‘i tespit ettiği gösterilmiştir.
Tekrarlanabilirlik çalışmaları dört farklı Q-PCR cihazına sahip, dört farklı laboratuvarda
gerçekleştirilmiştir. Çalışma kapsamında şu cihazlar kullanılmıştır: Biorad CFX Connect (Bio-Rad
Laboratories, USA), LightCycler 480 (Roche Applied Science, USA), StepOne Plus (Life Technologies,
USA) ve Xxpress (BJS Biotechnologies, UK). Tekrarlanabilirlik çalışmalarında laboratuvarlar %99
(59/60) uyumlu sonuçlar vermiştir. Kit ile 24 numunenin toplam analiz süresi, kullanılan Q-PCR
cihazının özelliklerine bağlı olarak 39-58 dk arasında değişmektedir.
Kitin klinik performansı, akut tonsillofarenjit tanısı konulan 687 çocuk (5-12 yaş) hastadan alınan
çift kör örneklerde boğaz kültürü (altın standart) ve HSAT ile karşılaştırmalı olarak tespit edilmiştir.
HSAT’ın duyarlılık ve özgüllügü sırasıyla %69,4 ve %97 saptanırken, Q-PCR testinin duyarlılık ve
özgüllüğü sırasıyla %100 ve %96,4 olarak saptanmıştır.
!
Kit canlı/ölü bakteri ayırımı yapamamaktadır. Kit AGBHS taşıyıcıları ve enfekte hastaları ayırt
etmemektedir. Bu nedenle kit ile elde edilen sonuçların klinisyenler tarafından yorumlanması
gerekmektedir.
Kaynaklar
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Smeesters, P. R., Campos, D., Van Melderen, L., de Aguiar, E., Vanderpas, J., Vergison, A. (2006). Pharyngitis in low-resources
settings: a pragmatic clinical approach to reduce unnecessary antibiotic use. Pediatrics, 118(6), e1607-e1611.
Isaacs, D. (2008). Evidence-based pediatric infectious diseases. John Wiley & Sons.
Centor RM. 2009. Expand the pharyngitis paradigm for adolescents and young adults. Ann. Intern. Med. 151:812– 815.
Shulman ST, Bisno AL, Clegg HW, Gerber MA, Kaplan EL, Lee G, Martin JM, Van Beneden C. 2012. Clinical practice guideline
for the diagnosis and management of group A streptococcal pharyngitis: 2012 update by the Infectious Diseases Society of
America. Clin. Infect. Dis. 55:e86 – e102.
Övet, G., Balcı, Y. I., Polat, Y., Ersoy, E., & Çövüt, İ. E. (2009). Akut tonsillofarenjit tanısı alarak antibiyotik başlanan
hastaların ne kadarından a grubu beta hemolitik streptokoklar sorumludur. Tıp Araştırmaları Dergisi, 7(3), 122-5.
Cohen, J. F., Chalumeau, M., Levy, C., Bidet, P., Thollot, F., Wollner, A., ... & Cohen, R. (2012). Spectrum and inoculum size
effect of a rapid antigen detection test for group A streptococcus in children with pharyngitis. PLoS One, 7(6), e39085
Forward KR, Haldane D, Webster D, Mills C, Brine C, Aylward D. 2006. A comparison between the strep A rapid test device
and conventional culture for the diagnosis of streptococcal pharyngitis. Can. J. Infect. Dis. Med. Microbiol. 17:221–223.
Uhl, J. R., Adamson, S. C., Vetter, E. A., Schleck, C. D., Harmsen, W. S., Iverson, L. K., ... & Cockerill, F. R. (2003). Comparison of
LightCycler PCR, rapid antigen immunoassay, and culture for detection of group A streptococci from throat swabs. Journal
of clinical microbiology, 41(1), 242-249.
9.
Thenmozhi, R., Balaji, K., Kanagavel, M., & Karutha Pandian, S. (2010). Development of species-specific primers for
detection of Streptococcus pyogenes from throat swabs. FEMS microbiology letters, 306(2), 110-116.
10. Anderson, N. W., Buchan, B. W., Mayne, D., Mortensen, J. E., Mackey, T. L. A., & Ledeboer, N. A. (2013). Multicenter clinical
evaluation of the illumigene group A Streptococcus DNA amplification assay for detection of group A Streptococcus from
pharyngeal swabs. Journal of clinical microbiology, 51(5), 1474-1477.
11. Henson, A. M., Carter, D., Todd, K., Shulman, S. T., & Zheng, X. (2013). Detection of Streptococcus pyogenes by Use of
Illumigene Group A Streptococcus Assay. Journal of clinical microbiology, 51(12), 4207-4209.
Kit Bileşenleri ve Özellikleri
Kit bileşenleri, miktar ve adetleri, içerikleri, kullanım amaçları ve saklama koşulları Tablo 1’de
verilmiştir. -20 °C’de saklanan kit bileşenleri soğuk zincirde transfer edilmelidir.
Tablo 1. Kit bileşenleri, özellikleri ve saklama koşulları
Tüp İsmi
Miktar
Adet
Saklama
İçerik
Kullanım Amacı
Oligo GAS
1 mL
11
-20 °C
Reaksiyon Tamponu, HRM
boyası, oligonükleotidler,
PCR inhibitor bloklayıcısı
S.pyogenes speB geni
hedefli reaksiyon
tamponu
RXN
75 µL
2
-20 °C
5 U/µL Rekombinant DNA
Polimeraz,
Enzimatik DNA
çoğaltılması
PZT
Kontrol
550 µL
1
-20 °C
speB geni
Pozitif kontrol DNA
DNA
Tamponu
250 mL
1
Oda
Sıcaklığı
0,1 M Tris-HCl pH 8.0,
10mM peptit kompleksi,
12mg/ml BSA, 40 mg/ml
PEG 400, %1 Tween 20
DNA İzolasyonu
Uyarılar
•
•
•
•
•
Tüm reaktifler in vitro tıbbi tanı amaçlı kullanım içindir.
Örneklerin enfeksiyöz ajanları bulaştırma riski göz önünde bulundurulmalı, + 95 °C’de 10
dk’lık inkübasyon adımına kadar Biyogüvenlik seviye 2 (BSL-2) için iyi laboratuvar
uygulamaları takip edilmelidir
Oligo GAS güneş ışınlarına maruz bırakılmamalıdır
Kit bileşenleri sterilize edilmemelidir
Laboratuvar ortamını hedef DNA ile kontamine etmemek için, Q-PCR’ı tamamlanmış Q-PCR
tüpleri laboratuvarda açılmadan bertaraf edilmelidir.
Risk ve Güvenlik Uyarıları
Bu ürün ile ilgili bilinen bir tehlike yoktur
Kitin Raf Ömrü
Kitin raf ömrü 3 yıldır. Üretim tarihinden sonra 3 yıl geçmesine rağmen açılmamış olan kit
bileşenleri kullanılmamalıdır.
Kullanıcı Tarafından Sağlanacak Ekipman ve Sarflar
Kullanıcı tarafından sağlanacak ekipman ve sarflar Tablo 2’de verilmiştir.
Tablo 2 Kullanıcı tarafından sağlanacak ekipman ve sarflar
Ekipman/Sarf
Özellik
Vorteks
2500 RPM'e çıkabilmelidir
Mikrosantifüj Cihazı
14000 RPM'e kadar çıkabilmelidir
Real Time PCR cihazı
470/510 nm Ekzitasyon/Tespit Kanalına sahip olmalıdır; Ortalama "Ramp
Rate"i ≥ 4 olmalıdır
Mikropipet
100-1000 µl ,10-100 µl, 0.5-10 µl hacim kapasiteli
Isıtıcı Blok
1,5 ml santrifüj tüpleriyle uyumlu olmalı, 95 °C'de çalışabilmelidir
Mikrosantifüj Tüpü
1,5 ml hacimli, nükleaz içermeyen, steril, tercihen vida kapaklı
Mikropipet ucu
100-1000 µl ,10-100 µl, 0.5-10 µl hacim kapasiteli, nükleaz içermeyen,
steril
Mikroplate, tüp ya da
kapiller
Sahip olunan Q-PCR cihazına göre seçilmeli
Eldiven
Lateks , pudrasız eldiven
!
Uygun Numune Materyali ve Saklanması
Kit, numune olarak steril pamuklu/naylon/rayon eküvyon ile alınan boğaz sürüntüleri için
tasarlanmıştır. Numune alınırken boğaz sürüntü numuneleri için standart prosedür uygulanmalı,
herhangi bir kontaminasyon olmamasına özen gösterilmelidir. Numune, bademcik ve arka yutağa
eküvyon iyice sürtülerek alınmalıdır.
Numuneler alındıktan sonra besi yeri içeren taşıma tüplerine konulmamalı, kuru olarak taşıma
tüplerinde laboratuvara transfer edilmelidir. Numuneler alındıktan sonra 3 saate kadar oda
sıcaklığında bekletilebilirler. Daha uzun süreli numune saklanacağı durumlarda numuneler -20
°C’de muhafaza edilmelidirler.
Uygulama Protokolü
1- AGBHS tonsillofarenjiti şüphesi olan hastalardan numune, bademcik ve arka yutağa eküvyon
iyice sürtülerek alınır.
2- Numuneler alındıktan sonra besi yeri içermeyen taşıma tüplerinde laboratuvara transfer
edilir.
3- Numuneler laboratuvara teslim edilir. Laboratuvar tarafından 1 saat içerisinde sonuçların
hastane bilgi sistemine yükleneceği bilgisi verilir.
4- 1,5 ml mikrosantrifüj tüpünün içerisine 400 µl DNA tamponu eklenir
a. DNA tamponu içeren tüpler önceden hazırlanıp,
saklanabilir.
oda sıcaklığında 1 yıla kadar
5- Eküvyon numune kabından çıkartılır, 1,5 ml mikrosantrifüj tüpünün içine yerleştirilir, tüpten
taşan kısım kesilir, tüpün kapağı kapatılır ve 1 dk 2500 RPM’de vorktekslenir.
!
6- Tüp 10 dak 95 °C’de inkübe edilir.
a. Kullanılan mikrosantrifüj tüpleri vida kapaklı değilse, bu aşamada tüp kapaklarının
basınçla açılıp tüp içindeki sıvının uçmaması için gerekli önlemler alınmalıdır.
7- Tüp 14000 RPM’de 5 sn santrifüj edilir. Tüpte oluşan üst sıvı faz, bir sonraki adımda
belirtilen şekilde, kalıp DNA olarak kullanılır.
a. Bu tüp - 20 °C’de 1 ay süreyle saklanıp, tekrar analiz edilebilir.
8- Tablo 3’te belirtilen şekilde reaksiyonlar hazırlanır
Tablo 3. Q-PCR’ın kurulması
Reaksiyon bileşeni
Oligo GAS
RXN
PZT Kontrol
Kalıp DNA
Toplam
Rxn GAS
8,9 µL
0,1 µL
1 µL
10 µL
Rxn GAS +
8,9 µL
0,1 µL
1 µL
1 µL
11 µL
Rxn 8,9 µL
0,1 µL
9 µL
a. Kontaminasyon riskini en aza indirmek için bütün pipetleme işlemleri temiz ortamda
yapılması tavsiye edilmektedir. En ideal ortamlar PCR kabinleri ya da
laboratuvarlarda sadece PCR işleminin yapıldığı bölümlerdir.
b. - 20 °C’den çıkartılan reaksiyon bileşen stokları kullanılmadan önce pipet veya
vorteks ile karıştırılmalıdır
c. Reaksiyon bileşenlerinin ana stoklarının gereğinden fazla oda ısısında kalması ve
kullanılmadığı zaman kapağının açık bırakılmasından kaçınılmalıdır.
9- Q-PCR cihazı, üretici talimatları ve kullanma kılavuzuna göre Tablo 4’te verilen şekilde
programlanır.
Tablo 4. Q-PCR koşulları
Program
Döngü
Sayısı
Ön
İnkübasyon
1
Adım
Sıcaklık
°C
Süre
sn
Hız
°C/s
Denatürasyon
98
60
4<
Denatürasyon
95
5
60
25
76
1
90
1
Çoğalma
35
Bağlanma ve
uzama
Erime Eğrisi
1
Erime
4<
0,5
Floresan okuma
(470 / 510 nm)
(Ekzitasyon / Tespit)
Adım sonunda, tek
okuma
76-90 °C arası
sürekli okuma
10- Q-PCR cihazının yazılımı kullanılarak, cihaz yazılımına özel üretici talimatlarına göre Tm
değerleri hesaplanır.
11- Sonuçlar Tablo 5’e göre yorumlanır
!
Tablo 5. Q-PCR sonuçlarının yorumlanması
Örnek 1
Örnek 2
Örnek 3
Örnek 4
Reaksiyon Tipi
82-85 °C
arası Tm
Sonuç
Rxn GAS
Evet
AGBHS +
Rxn GAS +
Evet
Rxn -
Hayır
Rxn GAS
Hayır
Rxn GAS +
Evet
Rxn -
Hayır
Rxn GAS
Evet
Rxn GAS +
Evet
Rxn -
Evet
Rxn GAS
Hayır
Rxn GAS +
Hayır
Rxn -
Hayır
AGBHS -
DENEYİ TEKRARLA:
Tüm reaksiyon bileşenlerinin yeni
stoklarını kullan
Yeni pipet seti ve filtreli uçları
kullan
DENEYİ TEKRARLA:
Testi RXN bileşeni 0,2 µL DNA
kalıbı 0,5 µL olacak şekilde tekrar
et
İmalatçı Bilgileri
ENGY Çevre ve Enerji Teknolojileri Biyoteknoloji Ar-Ge Ltd. Şti. (ENGY),
Boğaziçi Üniversitesi Kuzey Kampüs, BÜN Teknopark Bebek/İSTANBUL
Üretim Yeri
MyFarma İlaç Sanayi ve Ticaret Anonim Şirketi, Tuzla, İstanbul