Chromosome Bands and In Situ Hybridisations TR

Kromozom bantları ve in situ
hibridizasyon
Rasime Kalkan,PhD
Yöntemler
Konvasiyonel sitogenetik analiz
Kromozomlar büyüklük, sentromer pozisyonu ve bantlama
paternine göre ayrılmaktadır
1 kromozom bandı : 5-10 Mega baz çifti(Mbp).
Visualizing Metaphase Chromosomes (Banding)
Sayısal anomaliler
Yapısal anomaliler
High resolution karyotype
Avantajlar
Tüm genomu
taramak
Rölatif olarak
daha ucuz
Dezavantajları
5 mb kadar
anomali
saptamaktadır
Klasik sitogenetiğin limitleri
Kromozom bantlama tekniklerine bağlı olarak hassastır
İyi kromozom morfolojisi ve bölünen hücrelere
ihtiyaç vardır
5 Mb rezolüsyon limiti
Konvansiyonel sitogenetiğin avantaj ve
dezavantajları
Avantajları
• 1 defada tüm genomun taranmasına imkan tanır.
• Spesifik anomali bilindiğinde saptanması ( ör KML de
Philadelphia) ve ek kromozomal anomalilerin saptanması
Dezavantajları
• Majör yapısal anomalilerin saptanması 1band = 5mb of
DNA ~ 150 gen ).
Kromozomal anomali endikasyonları
•
•
•
•
•
•
•
•
Kromozomal anomali süpesi
Mukonjenital anomali ve gelişim geriliği
Mental reterdasyon
Gonadal disgenezi
Infertilite
Düşükler
Ölü doğum öyküsü
Malignensiler
Hangi durumlarda FISH önerilir?
• Metafaz kromozom elde edilememesi halinde
– Başarısız kültür
– hastadan alınan dokunun kültüre edilmesinin uygun olmaması
(preimplantation analysis, rapid prenatal examinations,
examinations of solid tumors or autopsy material)
• Komplike kromozomal anomalilerin analizi
• Marker kromozomun tanımlanması
• Sub mikroskobik, kriptik anomalilerin saptanması
– Mikrodelesyon sendromları
– Malignansilerde tümör baskılayıcı ve onkogenkerin
amplifikasyonu
Fluorescence in situ hybridization
(FISH)
• In situ hybridization spesifik nükleotid sekanslarının hücre
süspansiyonu yada dokulardan saptanması. İlgili gen
bölgesine spesifik prob un hücre yda doku süspansiyonuna
hibridizasyonu prensibine dayanmaktadır.
Fluorescence in situ hybridization
(FISH)
• In situ teknikler anomalinin
görüntülenmesi için tanı amacı ile
kullanılmaktadır veya hastalığa neden
olan endojen veya ekzojen DNA veya
RNA molekülünün saptanması için
kullanılmaktadır.
Moleküler sitogenetik:
Fluorescence in situ Hybridization (FISH)
• RNA ve DNA yapılarının, sayı ve
lokasyonlarının yerlerinin hücrede ve in situ
olarak tanımlanmasına dayanmaktadır
• FISH :
– Morfolojik olarak korunmus kromozom
preperatlarında kullanılmaktadır (Metafaz).
– Fikse hücre veya dokular (Interfaz)
• Spesifik kromozom anomaliler
görüntülenmektedir
– delesyon, amplifikasyon, translokasyon
Fluorescence in situ hybridization
(FISH)
Bölünen(metaphase) ve bölünmeyen (interphase nuclei) hücrelerdeki
seçili genetik değişikliğin saptanması
ISH hücresel ve moleküler seviyede bilgi veren bir metoddur.
FISH hematolojik malignensilerin orjin ve progresyonunu belirlemek için
kullanılabilmektedir
FISH Analysis
Aavantajları
Çok specific (100 kb)
Microdelesyon/Microduplikasyon
Dezavantajları
Çok specific
500-600 proba ihtiyaç vardır tüm
genomu tarayabilmek için
Hedef- Target
•
•
•
•
Metafaz kromozomları
Interfaz nukleusu
Entire Cells/RNA
Doku kesitleri
• FISH deneyleri yeterli uzunkluktaki ve ilgili DNA dizisine
komplementer floresan işaretli DNA/RNA probları ile yapılmaktadır.
FISH analizinde kullanılabilecek
dokular
• Periferik kan
• Fibroblasts biyopsisi
• Epitel hücreler, buccal smear
• Kemik iliği (hemoblastosis)
• Solid tumor biyopsisi
Interpfaz FISH’in avantajları
• Hücre kültürene ihtiyaç yoktur ve metafaz için
hücrelerin bölünme stimüayonuna ihtiyaç yoktur
– interphase FISH metafaza göre daha hızlıdır
– Fikse edilmiş hücrelerin ve bölünmeyen hücrelerin analizine izin
verir.
• Mikroskop kullanılarak FISH ile 200–500 analiz
edilebilir
– Metafaz prosedürlerine göre daha hassasdır
• Kemik iliği transplantasyonunda rezidüel hastyakığın
moniterize edilmesinde kullanılabilir.
Moleküler Sitogenetiğin Kullanımı
 Kromozom tanımlama
 Aneploidi saptama
 Sentromer analizi
 Marker kromozom kökenini belirleme
 Tüm kromozom analizi, whole chromosome analysis
(chromosome painting)
 Kromozom translokasyon analizi
Benzersiz –unique- sekansların analizi (single-copy sequence)
Mikrodelesyon analizleri
Gen amplifikasyon analizleri
FISH PROSEDÜRÜ
•
•
•
•
•
Kromozom denatürasyonu
Prob denatürasyonu
Hibridizasyon
Floresan boyma
Slide ların analizi
Fluorescent in situ Hybridization
(FISH) kullanımı
Sayısal ve yapısal krozom anomlilerinin tanımlanması ve
karekterizasyonu
Mikroskobda görülemeyen delesyonların saptanamsı
Sub relomerik anomalilerin saptanması.
Prenatal tanı,bilinen sayısal kromozomlar için(interphase
FISH).
FISH limitleri
• Probun bağlandığı bölgeler dışındaki anomaliler
saptanamaması
• İnterfaz fısh için hücre preparasyonu önemlidir
– to permeabilize the cells for optimal probe target interaction
– to maintain cell morphology.
Küçük mutasyonlar saptanamaz
Uniparental dizomi saptanamaz.
Inversiyonlar saptanamaz
Tüm kromozomal bölgeler için problar tivcari olarak
yoktur
• Pahalı bir yöntemdir
•
•
•
•
Problar
Fluorescein
Biotin
• Hedef nükleik asit
dizisinin komplamenteri
• Problar floresan
boyalar ile
işaretlenmektedir
biotin, fluorescein,
Digoxigenin
• Büyüklükleri20-40 bp
to 1000bp
Indirect Probe labeling, antikorlar aracılığı ile FISH
prosedürü tamamlanmaktadır Haptens---BiotindUTP, digoxigenin-dUTP
• Labeling-İşaretleme teknikleri:
a) Nick translation
b) Random priming
c)PCR (Polymerase chain reaction)
•
•
Direct Probe labeling, problar direkt olarak
SpectralGreen veya SpectralOrange gibi florokromlar
ile işaretlenmişlerdir One-step hybridization.
DNase I makes nicks DNA Polymerase adds dNTP, labeled dUTP at 3’ and remove dNTP at 5’
5‘
3‘
5‘
3‘
5‘
3‘
Principle of Nick Translation
+※++※+
+※++※
++※+++
3‘
5‘
Denaturation
Faktörler
Stringency
Seviye
Stringency
Sonuçlar
(if
inappropriate)
Isı
Yüksek
Düşük
Yüksek
Düşük
Düşük
verim
Yüksek
arkaplan
Tuz çözeltisi
(SSC)
konsantrasyonu
Yüksek
Düşük
Düşük
Yüksek
Yüksek
arkaplan
Düşük
verim
Formamid
Konsantrasyonu
Yüksek
Düşük
Yüksek
Düşük
Düşük
verim
Yüksek
arkaplan
Prob Tipleri
Sentromer Probları
• Alpha ve Satellite
III probes
• Sentromer gibi
tekrarlayan dizilerde
bulunmaktadırlar
• Sentromer bölgeleri
parlak boyanmaktadır
Telomer
Telomer bölgelerine spesifiktir
Kromozom uçlarındaki 300 kb locus
spesifiktir
Tüm Kromozom Probları
• Tüm kromozom boyuna
bağlanan prob
kombinasyonlarının toplamıdır
• Multiple probe labels are
used
• Tüm kromozom boyuna
hibridiza olmaktadırlar
Lokus
Delesyon
Translokasyon probları
Gen saptanama & lokalizasyon
Gen amplifikasyon probları
Denatürasyon & Hibridizasyon
Denatürasyon
Isı veya alkali metodu ile olabilir
 Prob ve hedef DNA
denatürasyonu Hibridizasyon için ön
koşuldur
Hibridizasyon
 İki komplementer nükleotid
sekanısının dupleks oluşturmasıdır
 • DNA-DNA
• DNA-RNA
• RNA-RNA
Arasında l olabilmektedir
Detection & Visualization
Saptama-Detection
• Direct İşaterleme:
 Prob direkt floresan isaretlidir
 Daha az hassastır
• Indirect İşaretleme:
 Saptanması için ek basamaklara
ihtiyaç vardır
 Alkalin fosfotaz gibi konjuge
antiboylere ihtiyaç vardır
Sinyal amplifikasyonu ile
saptanabilir
Hibridizasyon
• Floresan prob
hibridizasyon sırasında
hedef sekansa
bağlanmaktadır
• Bu uygun filtreler ile
mikroskopta
görüntülenebilmektedir.
Kromozomal sekansların
sınıflandırılması
•
•
•
•
•
Beta satellite
Alpha satellite
Classical satellite
Telomeric sequences
Unique gene sequences
Spesifik kromozom yapılarına özel
Problar
•
Kromozom spesifik sentromer probları(CEP)
– Sentromer bölgelerine hibridize olmaktadır
– İnterfaz ve metafazda anoploidilerin saptanması için kullanılmaktadır
•
Chromosome painting probes (WCP)
– Tüm kromozoma hibridize olan problardır
– Metafaz üzerinde yapısal kromozom anomalilerin saptanması için kullanılmaktadır
•
Unique DNA sequence probes (LSI)
– Benzersiz DNA dizilerine hibridize olmaktadır
– Gen yeniden düzenlenmeleri, delesyon ve gen amplifikasyonlarının saptanması için
kullanılmaktadır
• Telomere-specific probes (TEL)
– Subtelomerik bölgelere hibridize
olmaktadır
– Subtelomerik delesyon veya
yenidendüzenlenmelerin saptanması için
kullanılmaktadır
α-satellite DNA – centromeres
Sayısal anomalilerin saptanması, marker kromozomun
sentromer orjininin belirlenemsi, kemik iliği
transplantasyonu sonrası hücre görüntülemesi (opposite
sex of donor and recipient)
Locus specific DNA probes:
Kromozom üzerindeki genlerin görüntülenmesi ve yapısal
kromozom anomalilerinin saptanması (translocations, deletions)
trizomi-21 kız fetus
chromosomes 13
(green), and 21
(red)
chromosomes 18
(aqua), X (green),
and Y (red).
X–ckromozomu için
Satellite (centromeric) probe
Karyotip?
45,X or 46,XY
X- and Y-centromeric probes
Green = X
Red = Y
Determine probable karyotype.
46,XY
Interfaz FISH ile yapısal anomaliler LSI
Probe (Fusion Probe) ile saptanmaktadır
Interfaz FISH ile yapısal anomaliler LSI Probe
(Break Apart Probe)
Dual color break-apart
probes


0.6–1.5 Mb
Translokasyonu saptamaktadır
• Translokasyon kırık
noktalarına spesifik olarak
tasarlanmıştır.
• Traslokasyon olması
halinde prob birbirinden
ayrılmakta ve sinyal
vermektedir
FISH kullanılan mikrodelesyon
sendromları
Syndrome
Chromosome
Location
Probe/Gene Locus
DiGeorge
22q11.2
D22S75
Velocardiofacial
22q11.2
D22S76
Miller-Dieker
17p13.3
D17S379
Smith-Magenis
17p11.2
D17S29
Prader-Willi
15q11.2
SNRPN
Angelman
15q11.12
D15S10
Williams
7q11.23
Elastin
Cri du chat
5p15.2
D5S23
Wolf-Hirschhorn
4p16.3
D4S96
Microdeletion konfirmasyonu
(1 kırımızı sinyalin kaybı)
Deleted chromosome
– red signal absent
Red signal –
TUPLE1 (HIRA)
locus
normal
chromosome –
red signal on
HIRA locus is
present
Green signal –
ARSA locus
(control probe)
Microdeletion 22q11.2 is associated with
DiGeorge syndrome.
Chromosome painting probes:
İlgili kromozom bölgesi veya tüm kromozama komplementer sekans hey contain
sequences from whole chromosomes or chromosomal parts (partial probes) yapısal
yenidendüzenlenmelerin saptanması (translocations and deletions of large extent),
veya marker kromozomun kökeninin belirlenmesi için kullanılmaktadır
der 5
der 5
9
9
SpectrumGold
WCP 5
+
SpectrumRed
WCP 9
der 5
9
5
Multicolor FISH - mFISH
her kromozm çifti için farklı florersan kombinkeri
kullanılmakta ve her kromozm çifti farklı floresan
vermektedir
Hematolojik malignensilerde kompleks kromozom
anomalilerin saptanmasına imkan tanımaktadır
kompleks yapısal anomaliler saptanabilmektedir
Spectral karyotyping and multifluor FISH paint each human chromosome in one of 24
colors (SKY)
Multicolor banding with high resolution
- mBAND
Klasik bant tekniklerine oranla daha yüksek
çözünürlükte kromozom kırık noktaları saptanmaktadır
Kromozom 4 de küçük bir
terminal delesyon var mı?
Hematolojide sitogenetik ve moleküler
sitogenetiğin önemi
Diyagnoz
karyot,ip hakkında bilgi
* Tanının spesifikleşmesi
*prognoz hakkında bilgi
* Tedavinin izlenmesi
Sık kullanılan florokromların Absorption
Spectrası
Fluorochrome
Absorption
Emission
Cascade Blue
Fluorescein
Rhodamine
Texas Red
Cy5
400
494
570
595
650
420
518
590
615
670
Diagnostic Potential For Karyotype, FISH, and Chromosomal Micro- array Analysis (CMA) For
Selected Disorders
Condition
Locus
studied
Karyotype
Disease
specific FISH
Telomere FISH
CMA
Aneuploidy
various
~100%
Not detected
Detected by
karyotype
~100%
Large deletions, large
dupllications, translocation of
large segments
various
~100%
Not detected
Detected by
karyotype
Karyotype
better for
present
Cryptic
Rearrangements of telomeres
various
Not
detected
Not detected
~100%
1p36 deletion
1p36.3
Few
~99%
>95%
~99%
Wolf-Hirschhorn
4p16.3
Most
~99%
>95%
~99%
Cri-du-chat
5p15.2
Most
~99%
>95%
~99%
Williams-Beuren
7q11.2
Almost
none
~99%
Not detected
~99%
Prader-Willi
15q11-q13
Unreliable
~70%
Not detected
~70%
Angelman
15q11-q13
Unreliable
~70%
Not detected
~70%
Miller-Dieker lissencephaly
17p13.3
Few
>90%
Some detected
>90%
Smith-Magenis
17p11.2
Some
>95%
Not detected
>95%
Velocardiofacial/DiGeorage 1
22q11.2
Rarely
>95%
Not detected
>95%
~100% for
unbalanced
FISH vs. Karyotyping
Case 1
• 2 yaşında, MR
erkek
• Inborn cardiac
defect –
supravalvular aortic
stenosis.
Abnormal fenotipik özellikler mevcut
Case 1
hypertelorism
low set ears
open mouth,
thick lip
irides
stellatae
abnormal teeth
„elfin face“
Case 1
Case
2
• Williams-Beuren syndrome çağrıştırmakta
• Microdeletion sendromu, 7q11.23
• %95 microdeletion FISH ile
tanımlanabilmektedir
• Öncelikle konvansiyonel sitogenetik
önerilmiştir
Kromozom 7 microdeletion tanımlamak için hangi
prob kullanılmalıdır?
Case 1 - karyotype
Normal
sonuç:
46,XY
Microdeletion
FISH analizi
ile konfirme
edilmelidir
7q11.23 MICRODELETION MOLECULAR
SİTOGENETİK ANALİZ
180 kb
ELN
CENTROMERE
 LOCUS SPECIFIC PROBE FOR
THE CRITICAL REGION
ELN/LIMK/D7S613
– (labeled with the Spectrum
Orange, red signal)
 CONTROL PROBE D7S522
– (labeled with the Spectrum
Green, green signal)
LIMK1
D7S613
TELOMERE
Case 1 –molecular cytogenetic
ardından sonuç
• 7q11.23
microdelesyon
doğrulandı
• Tanı: WilliamsBeuren syndrome
Case 2
• Turner syndrome?
• 11 yaşında, 128 cm-kısa boy, zayıf okul
performansı
• Doğumda :900 gr
• Hormon seviyeleri:
*FSH :106,1 uU/mL
*LH: 21.38 uU/mL
*UE: <5,00
*G6PD: 0,4u/g Hb.
• 128 cm
• 35,5 kg.
Fenotipik Değerlendirme :
• Dismorfik özellikler:
*simian çizgisi-her iki elde mevcut
*klinodaktili-sağ elde
*kısa ve hipoplastik tırnaklar
*düşük ense saç çizgisi
*düşük yerleşimli gözler
* hipertelorizm
*basık burun
*uzun filtrum
• Abdominal USG yumurtalıklar
gözlenmedi
Testler
• Karyotip analiz;
*G/LTB
*C-Bantlama
*NOR Bantlama
• Karyotip:
45,X [95]/46,X,+mar[5] (5%)
• Moleculer Cytogenetic Tests:
– Multicolor FISH
– LSI AR and LSI SHOX and XIST
Androgen Receptor / SHOX gene/
XIST
SHOX:sp red
Cep X: Sp aqua
SHOX:sp red
Cep X: Sp aqua
XIST, Xq13.2
AR, Xq11.2Xq12