diskografisi Pagliaro

İmmünohematolojik Testler
Dr. İshak Özel TEKİN
ZKÜ Tıp Fakültesi
İmmünoloji A.D.
Clin Chem Lab Med 2010;48(8):1053–1054
Pasqualepaolo Pagliaro
İmmünolog lamba cini
Đmmünohematolojik Testler
Kan gruplama
Çapraz Karşılaştırma
Antikor tarama
Antikor tanımlama
Serolojik testler:
Ag-Ab birleşmesi
tepkimelerinin
görülebilir,
gözlemlenebilir,
ölçülebilir
hale getirilmesi temelli
tanısal yöntemlerdir.
Aglutinasyon
Hemaglutinasyon
Eritrosit Serolojisi
• Hemaglutinasyon
- Lam (slide)
- Tüp
- Jel Santrifügasyon
- Mikroplak yöntemleri
Eritrosit Serolojisi
•
•
•
•
•
•
RIA
EIA
PCR
Moleküler baskılama
Çoklu analit ölçümleri
….
Karl Landsteiner
• 1900 yılında ABO kan
gruplarını tanımlaması
kan transfüzyonlarında
dönüm noktasıdır
• İmmünohematolojik testlerin
geliştirilmesi Landsteiner’ın ilk
bulgularıyla doğrudan ilgilidir
-Eritrositlerin farklı bireylerin
serum/plazması ile aglutinasyonu
-Bireylerin kanında diğer kan
gruplarındaki eritrositleri kümelendiren
doğal antikorların varlığı
Eritrosit Transfüzyonu
Plazma Transfüzyonu
Biyolojide Redüksiyonizm
“Karmaşık sistemlerin
basit bileşenleri
içinde analizi”
Eritrositlere İmmün Yanıt
•
•
•
•
Allojenik eritrositlerin yıkımı
Otolog eritrositlerin yıkımı
Fetal ve yenidoğan eritrositlerin yıkımı
Transplant dokularının yıkımı
ABO Kan Grup Sistemi
ABO sistemi iki özellik nedeniyle farklıdır.
• Serumda aglutinin varlığı
• ABH ag’leri bir çok dokuda ve sekresyonlarda bulunur.
• Serumda antikor gösterilme prensibine dayanan karşıt
gruplamanın yapıldığı tek kan grup sistemidir.
ABO-Rh Direkt Gruplama
Numune Hazırlanması
İnkübasyon
Numune Dağıtılması
Santrifüj
( % 0,8’lik Eritrosit
Süspansiyonu )
18-25 °C’de 5-10 Dakika
Her mikrotüpe 25 µL
% 0.8’lik Eritrosit Süspansiyonu
10 Dakika
0,5 ml. Diluent-I (1 basım)
50 µL Tam Kan veya 25 µL sediment
Değerlendirme
ABO Karşıt Gruplama
Test Hücrelerinin
Hazırlanması
( A1, A2, B, 0,I,II )
Hücreler resüspanse edilerek
oda ısısına getirilir
Hücrelerin Dağıtılması
İnkübasyon
Her mikrotüpe 50 µL
18-25 °C’de 5-10 Dakika
etiketine uyan test hücresi
pipetlenir.
Hasta Serumunun Dağıtılması
Her mikrotüpe 50 µL
hasta serumu veya plazması
pipetlenir.
Santrifüj
10 Dakika
Değerlendirme
ABO Karşıt Gruplama
Type
A1 cells
B cells
O
+
+
A
0
+
B
+
0
AB
0
0
ISBT Kan Gruplama Sistemleri
Adı
ABO
MNS
P
Rh
Lutheran
Kell
Lewis
Duffy
KiddJ
Diego
Cartwright
XG
Scianna
Dombrock
Colton
Landsteiner-Wiener
Chido/Rodgers
Hh
Kx
Gerbich
Cromer
Knops
Indian
Ok
Raph
JMH
Kısaltma
ABO
MNS
P
RH
LU
KEL
LE
FY
K
DI
YT
XG
SC
DO
CO
LW
CH/RG
H
XK
GE
CROM
KN
IN
OK
RAPH
JMH
Antikor Tarama - Tanımlama
• Antikor Tarama Testi
Eritrosit antijenlerine karşı antikor
olup olmadığını saptamak için yapılır
• Antikor Tanımlama Testi
Varolan antikorun hangi kan grup sistemi ile
ilişkili olduğunu ve hangi eritrosit
antijenine karşı geliştiğini saptamak için
yapılır
Antikor Tarama
• Klinik önemi olan antikorlar mutlaka araştırılmalı
• Klinik önem
– Antikorun 37oC’de reaktif olması
– Hemoliz yapması
– Eritrosit yaşam süresini azaltması
DAT
Direkt Coombs Testi
DAT
on
y
i
s
k
a
Re
er
l
i
c
i
r
i
d
güçlen
(A n
AH
ti H
um
an
G
Glo
bül
in
)
Tüpte DAT
DAT
++++
+++
++
+
Hasta Eritrosit Süspansiyonu
Hazırlanması
( % 0,8’lik Eritrosit Süspansiyonu )
1 ml. Diluent-II (2 basım)
10 µL Hasta Kanı
-
-
++++
+++
Numune Dağıtılması
Santrifüj
Her mikrotüpe 50 µL
% 0.8’lik Eritrosit Süspansiyonu
10 Dakika
++
+
-
-
Değerlendirme
37
DAT POZİTİFLİK
• Eritrosit antijenlerine karşı oluşmuş
otoantikorların komplemanla birlikte veya
tek başına eritrosit yüzeyini kaplaması
• Transfüzyon sonrası alıcı antikorların
donör eritrosit yüzeyini kaplaması
• Verici plazmasındaki antikorların alıcı
eritrositlerin yüzeyini kaplaması
DAT
39
Antikor Tarama
Hücreler
Fenotipik yapısı (tercihan homozigot) 2 veya 3
farklı donörden alınmış test hücreleri tarama,
daha fazla sayıda test hücreleri ise tanımlama
testlerinde kullanılmalıdır.
IAT
1
2
3
1 damla hücre
+
2 damla hasta serumu
ANTİKOR TARAMA (IAT-ET)
I
++++
II
III
+++
++
I
II
+
-
III
-
Test Hücrelerinin
Hazırlanması
( I, II, III )
Hücreler resüspanse edilerek
oda ısısına getirilir
Test Hücrelerinin
Hazırlanması
( IP, IIP, IIIP )
Hücreler resüspanse edilerek
oda ısısına getirilir
I
II
III
I
II
III
Dağıtım
İnkübasyon
Santrifüj
50 µL etiketine uyan test hücresi
25 µL hasta serumu veya plazma
37 °C’de 15 Dakika
10 Dakika
Değerlendirme
Test hücreleri ekindeki tablo
değerlendirmede kullanılır.
Hücre ve
tablonun Lot numarası aynı
olmalıdır.
ANTİKOR TARAMA - CA
I
++++
*
II
III
I
+++
++
+
II
III
-
-
*
I
Test Hücrelerinin
Hazırlanması
( I, II, III )
Hücreler resüspanse edilerek
oda ısısına getirilir
II
III
I
II
III
Dağıtım
İnkübasyon
Santrifüj
50 µL etiketine uyan test hücresi
25 µL hasta serumu veya plazma
4 °C’de 15 Dakika
10 Dakika
Değerlendirme
Test hücreleri ekindeki tablo
değerlendirmede kullanılır.
Hücre ve
tablonun Lot numarası aynı
olmalıdır.
* Normal Hücre ve Nacl / Enzym / Cold Aglutinin Kartı
Kullanılır
IAT Etkileyen Faktörler
•
•
•
•
•
İnkübasyon süresi ve sıcaklık
pH
İyonik konsantrasyon
Antikorun afinite sabiti
Antijen ve antikor oranı
İnkübasyon Süresi ve Sıcaklık
• Aglütinasyonun ilk safhasında
veya sensitizasyon fazını etkiler
• Klinik olarak önemli antikorlar,
genellikle 30-37°C arasında reaksiyona girer
• Çoğu antikorlar, tuz ve albuminli test ortamları
kullanıldığı takdirde ortalama 30 dakikalık bir
inkübasyon süresi gerektirir
• Zayıf antikorlar için sürenin uzatılması gerekebilir
pH
• 6.8-7.2 fizyolojik pH uygundur
İyonik Güç
• Serum fizyolojikli ortamda Na+ (negatif yük
etrafında) Cl- (pozitif yük etrafında) iyonları
antikor ve antijenin etrafında kümelenir
• Zıt yüklü moleküller arasındaki çekme gücü
azalınca antikorun antijenle bir araya gelmesi
engellenir
• Düşük iyon gücüne sahip solüsyonlar (LISS)
kullanıldığında ortamdaki iyon sayısı azalır,
pozitif ve negatif yükler ortaya çıkar
• LISS inkübasyon süresini kısaltır
(37°C’de 10-15 dakika)
Antikorun Afinitesi
• Afinite, eritrositin herhangi bir antikora karşı
özgül olarak sahip olduğu karakteristik
bağlanma özelliğidir
• Genelde denge sabiti ne kadar yüksekse
antijen –antikor reaksiyonunun duyarlanma
fazında antikorların birleşmesi o kadar
yüksektir
Antijen-Antikor Oranı
• Reaksiyon hızı, ortamdaki antikor miktarı ve eritrosit
antijenlerinin sayısına bağlıdır
• Antikor miktarını artırmak, test duyarlılığını artırabilir.
• Nadiren, önemli antikor fazlası prozon fenomeninin
oluşmasına neden olur.
Test Hücreleri
Tüpte Antikor Tanımlama
1
2
3
4
5
6
7
1 damla hücre
+
2 damla hasta serumu
8
9
10
11
ANTİKOR TANIMLAMA - IAT
1
++++
2
+++
3
4
++
5
-
+
7
6
-
++++
8
+++
9
++
10
+
11
-
Test Hücrelerinin
Hazırlanması
( 11’li Normal Panel Hücresi )
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Hücreler resüspanse edilerek
oda ısısına getirilir
Dağıtım
İnkübasyon
Santrifüj
50 µL etiketine uyan test hücresi
25 µL hasta serumu veya plazma
37 °C’de 15 Dakika
10 Dakika
Değerlendirme
Test hücreleri ekindeki tablo
değerlendirmede kullanılır.
Hücre ve
tablonun Lot numarası aynı
olmalıdır.
ANTİKOR TANIMLAMA – ET
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Adı Soyadı
Tarih
++++
+++
++
-
+
-
++++
+++
++
+
-
Test Hücrelerinin
Hazırlanması
( 11’li Enzimli Panel Hücresi )
1
2
3
4
5
7
8
9
10
11
6
Hücreler resüspanse edilerek
oda ısısına getirilir
Dağıtım
İnkübasyon
Santrifüj
50 µL etiketine uyan test hücresi
25 µL hasta serumu veya plazma
37 °C’de 15 Dakika
10 Dakika
Değerlendirme
Test hücreleri ekindeki tablo
değerlendirmede kullanılır.
Hücre ve
tablonun Lot numarası aynı
olmalıdır.
ANTİKOR TANIMLAMA – CA
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Adı Soyadı
Tarih
++++
+++
++
-
+
-
++++
+++
++
-
+
*
*
Test Hücrelerinin
Hazırlanması
( 11’li Normal Panel Hücresi )
1
2
3
4
5
7
8
9
10
11
6
Hücreler resüspanse edilerek
oda ısısına getirilir
Dağıtım
İnkübasyon
Santrifüj
50 µL etiketine uyan test hücresi
25 µL hasta serumu veya plazma
4 °C’de 15 Dakika
10 Dakika
Değerlendirme
Test hücreleri ekindeki tablo
değerlendirmede kullanılır.
Hücre ve
tablonun Lot numarası aynı
olmalıdır.
* Normal Hücre ve Nacl / Enzym / Cold Aglutinin Kartı
Kullanılır
Değerlendirme
Antikor Tanımlama
Anti-E
Elüsyon
• Eritrosite bağlı antikorların
ayrıştırılıp tanımlanmasına yönelik
–Isı ile
–Kimyasal yollar ile
Çapraz Karşılaştırma
• ABO ve Rh
sistemleri dışında
bulunan kan grupları
nedeniyle önemli
• Kan transfüzyonu
öncesi yapılması
gerekir
• Lewis; Lea - Le - Leb
• MN; M - N - S - s U
• P; P1 - P2 - p
• Luteren; Lua - Lub
• Kell; K - k
• Duffy; Fya - Fyb
• İi; İ - i
Çapraz Karşılaştırma
Aglutinasyon yok ~ uyumlu
Aglutinasyon ~ uyumsuz
Verici Eritrositi
Hasta Serumu
Çapraz Karşılaştırma
Hasta Eritrosit Süspansiyonu
Hazırlanması
Dağıtım
( % 0,8’lik Eritrosit Süspansiyonu )
1 ml. Diluent-II (2 basım)
10 µL Hasta Kanı
Donör Eritrosit Süspansiyonu
Hazırlanması
( % 0,8’lik Eritrosit Süspansiyonu )
1 ml. Diluent-II (2 basım)
10 µL Donör Kanı
A
B
D
Enz.
AHG
AHG
Donör E.S.
50 µL
50 µL
50 µL
50 µL
50 µL
-
Hasta E.S.
50 µL
50 µL
50 µL
-
-
50 µL
-
-
-
25 µL
25 µL
25 µL
25 µL
25 µL
25 µL
25 µL
-
-
Hasta Serumu
Diluent-I
İnkübasyon
Santrifüj
37 °C’de 15 Dakika
10 Dakika
Değerlendirme
Çapraz Karşılaştırma
Çapraz Karşılaştırma
•
•
•
•
ABO – Rh uygun kan % 98 uyum
Antikor tarama -tanımlama
Çapraz karşılaştırma
% 2 ek uygunluk
Elektronik Çapraz Karşılaştırma
• Ölçülebilir olanı ölç,
ölçülemeyeni
ölçülebilir hale getir.
Galileo Galilei
• Genomics
• Proteomics
• Glucomics
Genotip Belirleme
Fetal kan gruplarının belirlenmesi (YDHH)
Otoantikor varlığı (DAT+)
Yakın dönemde çoklu kan transfüzyonu
Nadir ve zayıf antijen eksprese edenler
Hasta ya da vericide antijen gösterilemediğinde
Antijen negatif kan tiplerinde , çıplak ve yeni
allel tanımlamada
• Antikor tanımlama için verici tiplendirmede
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
PCR-SSP
PCR-RFLP
Taqman
…
"lab on a chip"
SNP Saptama Sistemleri
SNP Saptama Sistemleri
Technology Acceptance Model (TAM)
Algılanan
Kullanışlılık
Dış
Değişkenler
Kullanıma
Karşı
Tutum
Kullanım
Niyeti
Gerçek
sistem
kullanımı
Algılanan
Kullanım
Kolaylığı
Davis, F. D., Bagozzi, R. P., and Warshaw,
P. R. "User Acceptance of Computer
Technology: A Comparison of Two
Theoretical Models," Management
Science, 35, 1989, 982-1003.
Performans
beklentisi
Unified Theory of
Acceptance and Use of
Technology (UTAUT)
Efor
beklentisi
Kullanım
niyeti
Kullanım
davranışı
Sosyal
etki
Kolaylaştırılmış
Şartlar
Cinsiyet
Yaş
Deneyim
Gönüllü
kullanım
Venkatesh, V., Morris, M.G., Davis, F.D., and Davis,
G.B. “User Acceptance of Information Technology:
Toward a Unified View,” MIS Quarterly, 27, 2003,
425-478
Çoklu Analiz Sistemleri
Birçok biyobelirteç ve hücre içi sinyal sisteminin
çoklu saptanması avantajı
Antijen ya da antikorlar ELISA daki gibi bir zemine
sabitlenirse ‘’planar array’’,
mikrokürelere sabitlenirse ‘’Süspansiyon ya da bead
array’’olarak adlandırılırlar.
Planar Array
Bead Array
Array
• Dizi
• Nesnelerin sistematik düzenlenmesi
• Genellikle satır ve sütünlar kullanılır
Planar Array
• Avantaj:Kompleks setler oluşturabilmek
• Problem:
-Antijen üç boyutlu yapısının bozulabilmesi
-Sterik engellenme
Bead Array
Avantaj:Esneklik (Cihaz,taşıyıcı küre…)
Sterik engellenme sorunu yok
Problem:?
Antikor Temelli Protein Array
1.Plak ya da membrana sabitlenmiş antikor arrayde
çözünür örneğin inkübasyonu
1
2
3
4
5
6
2. Aynı antijen setine özgül işaretli çözünür
antikor eklenmesi
1
2
3
4
5
6
Veri seti
3. Kantitatif sinyal oluşumu
1
2
3
4
5
6
Multipleks Kitlerin
Avantajları
Tek örnekte 20’den fazla
analitin eş zamanlı ölçümü
Aynı anda 20’den fazla
analitin bireysel
karşılaştırılması
Sadece 25 µl örnek
hacmiyle 20’den fazla
analit ölçümü
Geniş standart aralığı
96-çukurlu plak ya da
tüplerde kolay uygulama
Flow cytometry ve özel
Luminex cihazlarda ortak
kullanım
Mikroküreler
1. Antikor kaplı küre
2. Antikor analiti tutar
Laser
A
3. Floresan işaretli raportör
antikora bağlanan analite
bağlanır
4. Küre ve raportör laser ışıkla
sayılır
Laser
B
Kırmızı lazer küreyi
okur
Yeşil lazer hedef
miktarını belirler
Yazılım analizi anında
gerçekleştirir
1 saatten az sürede
10000 adet sonuç
analizlenir.
Teknolojik Değişim
Serolojide teknolojiye paralel ilerlemeler:
– Multipleks ve paralel analizler
Test tüpleri
Mikrokuyucuklar
Mikroaray
Mikroküre temelli
xMap
Akan Hücre Ölçer
Ön açı saçılımı PMT
Işık kaynağı
Floresan PMT
Geniş açı saçılımı PMT
Emisyon
Filtre
blok
Örnek girişi
Floresan PMT
Emisyon
Filtre
blok
Floresan PMT
Oynar Ayna
Oküler
Mikroskop
objektifi
Mikroskop Uyarım filtre
objektifi
bloğu
Oynar Ayna3
Oküler
Ön açı saçılımı PMT
Işık kaynağı
Floresan PMT
Geniş açı saçılımı PMT
Emisyon
Filtre
blok
Örnek girişi
Floresan PMT
Emisyon
Filtre
blok
Floresan PMT
Oynar Ayna
Oküler
Mikroskop
objektifi
Mikroskop Uyarım filtre
objektifi
bloğu
Oynar Ayna3
Oküler
Side Scatter (SSC)
90° sapma
~ Hücre yapıları
Forward Scatter
(FSC)
< 10° sapma
~ hücre büyüklüğü
Laser
Y
Floresan ve antijen
yoğunluğu
• Aynı anda kaç parametre çalışabilirsiniz?
• 60 parametreye ne dersiniz?
• Florokromlar ve ilişkili sorunlar da
olmasa
Dr. Olga Ornatsky
Dr. Scott D. Tanner
CyTOF™
Mass
Cytometry
CyTOF
• Inductively Coupled Plasma Time-of-Flight
Mass Spectrometer (ICP-TOF MS)
-Kompleks matrikslerden stabil izotopların
kantitatif ölçümü
CyTOF kütle sitometri şematik gösterimi
Analytical Chemistry, Vol. 81, No. 16, August
15, 2009
Antikora metal içeren polimer takılması
O. Ornatsky et al. / Journal of
Immunological Methods 361 (2010) 1–20
KG1a (A) and Ramos (B) hücre serilerinin
Mass Cytometry analizi (Flow-jo yazılımı ile)
O. Ornatsky et al. / Journal of
Immunological Methods 361 (2010) 1–20
Konjugat kullanmadan özgül antikor
varlığını nasıl gösteririz?
AFM
Atomik Kuvvet
Mikroskopu
Moleküler Baskılama
Ağı nereye atacağınızı bilmeniz dileğiyle