Kromatografik yöntemler ile ilgili lab demosu

Transkript

KROMATOGRAFİ
Kromatografi, bir karışımda bulunan maddelerin, biri
sabit diğeri hareketli faz olmak üzere birbirleriyle
karışmayan iki fazlı bir sistemde ayrılması ve
saflaştırılması yöntemidir.
KROMATOGRAFİ
İlk kez Rus botanikçi Mikhail Tsvett (1903)
tarafından geliştirilen bir yöntemdir.
Tsvett bu yöntemi bitki pigmentlerinin
renkli bileşenlerini ayırmakta kullanılmıştır.
Kullandığı
kolonda
renkli
bandlar
oluştuğundan,
bu
ayırma
yöntemine
kromatografi adını vermişti
KROMATOGRAFİ
Bir parça kağıt şeridin aşağı hizasından
1 cm kadar yukarısına bir damla siyah
mürekkep damlatınız.
Kağıt şeridi, mürekkep damlattığınız
kısım su hizasının üstünde kalacak
şekilde su tankına batırınız ve dik bir
şekilde tutunuz. Su,kapiler etkisiyle
kağıt üzerinde yukarı doğru yürürken
mürekkebi çözer ve sürüklemeye
başlar. Mürekkebin içindeki bileşenler
kağıt üzerinde farklı hızlarda ilerleyerek
ayrılmış olur.
KROMATOGRAFİ
KROMATOGRAFİ
Kromatografi, bir karışımda bulunan maddelerin, biri
sabit diğeri hareketli faz olmak üzere birbirleriyle
karışmayan iki fazlı bir sistemde ayrılması ve
saflaştırılması yöntemidir.
Çeşitli maddelerin hareketli faz yardımıyla, sabit faz
üzerinde, değişik hızlarla hareket etmeleri veya
sürüklenmeleri esasına dayanır.
Kromatografi ‘nin Sınıflandırılması

Ayrılma Mekanizmalarına Göre

Uygulama Biçimine Göre

Faz Tiplerine Göre

• Adsorpsiyon kromatografisi
• Partisyon kromatografisi
• İyon değiştirme kromatografisi
• Jel filtrasyon (Moleküler eleme) kromatografisi
• İyon çifti kromatografisi
• Afinite kromatografisi

- Düzlemsel kromatografi
Kağıt kromatografisi
İnce tabaka kromatografisi (TLC)
- Kolon kromatografisi
Gaz kromatografisi (GC)
Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC)

Faz Tiplerine Göre
- Sıvı kromatografisi
Sıvı-Katı kromatografisi
Sıvı-Sıvı kromatografisi
- Gaz kromatografisi
Gaz-Katı kromatografisi
Gaz-Sıvı kromatografisi

• Adsorpsiyon kromatografisi
• Partisyon kromatografisi
• İyon değiştirme kromatografisi
• Jel filtrasyon (Moleküler eleme) kromatografisi
• İyon çifti kromatografisi
• Afinite kromatografisi
Ayrılma Mekanizmasına Göre
¾ Adsorpsiyon Kromatografisi
Adsorpsiyon, bir karışımda bulunan sıvı veya gaz halindeki maddelerin katı
faz üzerine tutunmasıdır. Adsorpsiyon kromatografisi ise örnek bileşenlerinin
dolgu maddesinin yüzeyinde farklı olarak tutunmaları sonucu meydana gelen
bir ayırma işlemidir.
Adsorpsiyon kromatografisinde; maddeler katı olan sabit faz ile sıvı veya gaz
olan hareketli faz arasında etkileşir.
Faz tiplerine göre adsorpsiyon kromatografisi sıvı-katı
gaz-katı
Sabit faz
kromatografisidir.
: Durgun veya hareketsiz fazdır
Hareketli faz : Sabit faz üzerinde hareket ederek numune bileşenlerinin
ayrılmasını sağlayan fazdır
¾ Adsorpsiyon Kromatografisi
Sabit faz
z
Ayrılması gereken maddeleri parçalamamalı
z
Ayrılması beklenen maddeler ile kimyasal reaksiyon vermemeli
z
z
Adsorpsiyon kapasitesi yüksek olmalı
Adsorpladıkları maddeleri kolaylıkla geri vermeli
¾ Dağılma (Partisyon) Kromatografisi
Dağılma kromatografisinde; maddeler sıvı olan sabit faz ile sıvı veya gaz
olan hareketli faz arasında dağılır.
Birbiriyle karışmayan iki sıvıdan, yani iki fazdan oluşan bir faz sistemi içine
konulan madde bu sıvılardaki çözünürlüğüne bağlı olarak iki faz arasında
dağılır ve dengeye ulaşır. Böyle bir sistemde maddelerin dağılması sabit olup
dağılma katsayısı ile ifade edilir ve Kd ile gösterilir. Böylece Kd değerleri
birbirinden farklı olan maddeler kromatografik sistem içersinde farklı hızlarda
ilerleyerek birbirlerinden ayrılırlar.
Kd = C1/C2
C1 : Maddenin 1. fazdaki derişimi
C2 : Maddenin 2. fazdaki derişimi
Faz tiplerine göre partisyon kromatografisi sıvı - sıvı
sıvı - gaz
kromatografisidir.
Destek:Dağılma kromatografisinde, sıvı sabit fazın adsorplandığı materyaldir.
¾ İyon Değiştirme Kromatografisi
Maddelerin iyonik grupları ile iyon değiştiricideki iyonik grupların eşdeğer
miktarlarının karşılıklı yer değiştirmesi esasına dayanır.
İyon değiştirme kromatografisi, kullanılan iyon
değiştiricinin anyon veya katyon aktarmasına
göre sırasıyla anyon değiştirme kromatografisi
veya katyon değiştirme kromatografisi olarak
adlandırılır.
Anyon
Değiştirici
ICl-
Cl- ve I- karışımının nitrat bağlanmış anyon
değiştirici RNO3 ile bileşenlerine ayrılmasında
geçerli dengeler aşağıdaki biçimdedir:
Cl- + RNO3
RCl + NO3-
I-
RI
+ RNO3
R: Çözünmeyen Matriks
+ NO3-
RNO3 : Anyon Değiştirici
İnorganik iyon değiştiriciler :
Na2Al2Si4O12
⇒
Ca2+ Fe2+ Mn2+ Mg2+
Na2P
Organik iyon değiştiriciler:
Anyonik, Katyonik ve Amfoter Reçineler
İyon değiştirmeyi etkileyen faktörler
Hareketli faz derişimi
Hareketli faz pH’sı
Kompleks oluşturucu etki
İyon değiştirme kromatografisinin uygulanması
Ayrılmaları güç olan bazı iyonları ve asitlerin
Aminoasitler
Seyreltik iyon çözeltileri deriştirmede
Asit ve baz elde edilmesinde
NaCl ↔ NaOH + Cl-
¾ Jel Filtrasyon (Moleküler Eleme) Kromatografisi
Karışımdaki moleküllerin molekül büyüklüklerinde göre ayrılması esasına
dayanır.
¾ İyon Çifti Kromatografisi
Bu teknik, özellikle iyonlaşabilen asidik veya bazik maddelerin ayrılmasında
kullanılır. Hareketli faza ilave edilen iyon çifti reaktif sabit faz tarafından
adsorplanır ve iyonize olmuş maddeler bu iyon çiftleri ile iyonik etkileşime
girerek birbirinden ayrılır.
¾ Afinite Kromatografisi
Seçiciliği
fazla
olan
bu
yöntem,
kromatografi tekniklerinin en yenisidir.
Antijen – Antikor
Enzim – Substrat
Reseptör – İlaç
gibi
oldukça
dayanır.
spesifik
etkileşimlere

- Düzlemsel kromatografi
Kağıt kromatografisi
İnce tabaka kromatografisi (TLC)
- Kolon kromatografisi
Gaz kromatografisi (GC)
Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC)
Düzlemsel Kromatografi
Düzlemsel Kromatografi
UV Lambası
Kolon Kromatografisi
1903 yılında Tsvet bitki pigmentleriyle çalışırken
kolon dolgu maddesi olarak kireç kullanmıştı.
Günümüzde ise çoğunlukla silika jel ve alumina
kullanılmaktadır.
Gaz Kromatografi (GC)
Yüksek Performanslı Sıvı
Kromatografi (HPLC)
Gaz Kromatografi
(GC)
Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografi
(HPLC)
YÜKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFİSİ
HPLC
Sıvı Kromatografisi: Sıvı kromatografisi düzlemsel yüzeylere ve kolonlara uygulanabilen
bir kromatografi türüdür.
Normal Faz Sıvı Kromatografisi:
Polar sabit faz ve apolar veya düşük polariteye sahip hareketli faz
Ters Faz Sıvı Kromatografisi:
Sabit faz apolar, hareketli faz ise polardır
HPLC
- Polar molekül
- Apolar molekül
Tanecik
Apolar faz Hareketli faz
Kolon
Normal-faz
Ters-faz
Sabit Faz Polaritesi
Yüksekten ortaya
Ortadan düşüğe
Çözücü Polaritesi
Ortadan düşüğe
Yüksekten ortaya
Örnek Çıkış Yeri
Apolar önce
Polar önce
HPLC
Ters faz
C18
C8
C2
Normal faz
Ters faz kromatografisinin avantajları
1. Normal faz kromatografide, sıvı fazın kontrolü çok önemli ve kritiktir.
Hareketli faz bileşimindeki küçük değişiklikler kromatogramda belirgin
farklılıklara neden olabilir.
2. Dengeye ulaşma normal faz kromatografide çok yavaştır.
3. Normal faz kromatografide polar maddelerin elüsyonu çok yavaştır ve
yayvan piklere sebep olur.
4. Apolar çözücüler çok pahalıdır, ayrıca nemden uzak tutmak zordur.
Sıvı kromatografisi yönteminin özel bir uygulaması olan yüksek performanslı
sıvı kromatografisi (HPLC) yönteminde, sabit faz olarak kullanılan dolgu
maddelerinin tanecik boyutunun küçültülmesi sonucu hareketli faz ile etkileşen
sabit faz yüzey alanı büyür ve böylece kolonun etkinliği arttırılmış olur. Çok sıkı
olarak doldurulmuş kolondan hareketli fazın belirli bir hızla geçebilmesi için
basınç uygulanması gerekir.
3 bar
HPLC’nin avantajları
•
HPLC kolonu, rejenerasyon gerekmeksizin pek çok kez
kullanılabilir.
•
HPLC tekniği kullanıcının becerisine daha az bağımlıdır ve
tekrarlanabilirlik daha yüksektir.
•
Nicel analiz kullanılabilir.
•
Analiz süresi kısadır.
•
Duyarlık yüksektir.
HPLC Cihazı
•
Kolon
Pompa
Hareketli faz
rezervuarı
Enjektör
Dedektör
Kromatografide Temel Parametreler
Alıkonma Zamanı ve Alıkonma Hacmi
Alıkonma Zamanı ve Alıkonma Hacmi
Dedektör
cevabı
tr1
t0
Zaman veya Hacim
t0 = Hareketli fazın alıkonma zamanı
tr = Alıkonma zamanı
Kapasite Faktörü
Alıkonma hacmi = VR = Vm + KVs
k' = (VR – V0) / V0
k' = K Vs / Vm
Akış hızı sabitse
tr – t0
k′ = t
0
1 < k′ < 10
Etkinlik
2
2
16 t r
5 . 55 t r
=
N = N2 =
2
2
σ
w
w1 2
tr
w1/2
1/2h
t0
w
tr
2
h
Seçicilik
İki maddeye ait kapasite faktörü oranına
α = k'2 / k'1 = (tR2 – t0) / (tR1 – t0)
Seçicilik, esas olarak sabit faz özelliklerine bağlıdır
ancak hareketli faz bileşimi de seçiciliği etkiler.
Ayırıcılık
R=0.50
t0
R≥1
R=0.75
zaman
R=1.00
t0
t0
zaman
R=1.50
zaman
t0
zaman
Ayırıcılık
R = 2 (t R2 – t R1) / (w1 + w2)
Nicel Analiz İçin HPLC’de Kullanılan Kalibrasyon Teknikleri:
Doğrudan Kalibrasyon Tekniği:
Alan
veya
Pik Yüksekliği
S1
S2
S3
S4
Derişim (ppm)
Alan
10
20
30
40
101
212
305
410
Cx
Derişim
İç Standart Tekniği:
IS
Concentration
N
0
2
4
6
time
8
10
12
Yüksek kesinlik elde edilir; çünkü bu metot ile numune enjeksiyonu,
akış hızı ve kolon şartlarındaki değişmelerle oluşan belirsizlikler en
aza indirilir.
Derişim
Alan
Derşim
IS
Derişim
oranı
5
25,00
0,20
1881
16129
0,12
10
25,00
0,40
4495
17126
0,26
30
25,00
1,20
13430
15940
0,84
50
25,00
2,00
25001
16846
1,48
100
25,00
4,00
50141
16557
3,03
Numune
IS
Alan oranı
Bu metotta, standart ve numune çözeltilerinin her birisine dikkatle
ölçülmüş miktarda bir iç standart (IS) katılır.
y = 0,0307x - 0,0515
R2 = 0,9998
4
3
3
2
2
1
1
0
0
20
40
60
80
100
120
Derişim
Alan oranı
Alan oranı
4
3
3
2
2
1
1
0
y = 0,7681x - 0,0515
R2 = 0,9998
0
1
2
Derişim oranı
3
4
5
Standart Ekleme Tekniği:
Alan
600
500
400
300
200
100
0
y = 980x + 152
R2 = 0,9996
0
0,1
0,2
0,3
Derişim (M)
0,4
0,5

Kromatografik yöntemler ile ilgili lab demosu

Transkript

Benzer belgeler

KROMATOGRAFİ METODU

Sıvı Kromatografisi

HPLC

IPhO 2016 - Experiment

enstrumental analiz ders notları

Proteinlerin Kromatografik Yöntemlerle Saflaştırılması

Kısa Broşür (TR)