BİTKİ PİGMENTLERİNİN İNCE TABAKA KROMOTOGRAFİSİ

BİTKİ PİGMENTLERİNİN İNCE TABAKA KROMOTOGRAFİSİ
DİKKAT : Bu çalışmada kullanılan çözücüler kolayca
ateş alabildiklerinden , deney süresince her türlü
ateşten uzak durulmalıdır.
AMAÇ
Bu çalışmanın amacı, kalitatif ve kantitatif analizlerin ikisini de kullanarak değişik bitki dokularındaki pigment
moleküllerinin tanımlamasını yapılabilmektir. Ispanak yaprakları ve havuçtan pigmentler ekstrakte edilecek ve sonra ince tabaka
kromotografisinde ( TLC ) bu pigmentler ayırt edilecektir. Böylece, bitki dokularında bulunan mevcut pigmentler tanımlanacaktır.
ÖN BİLGİLER
PİGMENTLER
Pigmentler
çözücülerde
polar
ya
da
nonpolar
olabilir. Polar
pigmentler
suda
çözünür , nonpolar
pigmentler
organik
çözünürler. Polar pigmentler çoğunlukla merkezi vakuolde ; nonpolar pigmentler ise plastid membranında
bulunurlar. Plastidlerin yeşil olanları kloroplast, farklı renkler de olup da yeşil olmayanları kromoplast ve renksiz olanları ise
lökoplast adını alır. Kromoplast ve lökoplastlar kloroplastlardan gelişirler ya da protoplastidler olarak adlandırılan öncüllerden
gelişirler.
Bütün yüksek bitkilerin kloroplastları fotosentezde ışık enerjisini etkin şekilde absorblayan iki temel pigmente sahiptir.
Bunlar yeşil renkli klorofiller (a,b,c,d) ve kırmızı, sarı ya da portakal renkli karotenoidlerdir.
Klorofil moleküllerinden en yaygın olanları klorofil a ve b molekülleridir. Klorofiller; fotosentez için gerekli güneş ışınlarını
toplayan pigmentlerdir. Klorofil molekülü, porfirin ve fitol yan zinciri olmak üzere iki kısımdan oluşur. Porfirin, azot (N) içeren
dört pirol halkasının N atomları yardımı ile ortada Mg2+ ile şelat oluşturacak şekilde birbirleri ile bağlanması sonucu oluşmuş bir
yapıdır. Porfirinin dördüncü halkası 20 karbon atomu içeren bir alkol (fitol) ile esterleşmiştir. Klorofil molekülünden Mg2+ iyonu
uzaklaşmasıyla, fotosistemde elektron alıcısı olarak görev alan feofitin oluşur. Klorofil a ve b arasındaki tek farklılık ikinci pirol
halkası üzerindedir. Klorofil a bu pozisyonda bir metil (-CH3 ) grubuna sahipken, klorofil b bir aldehid grubu (-CHO) taşır. Bu
küçük farklılık ; ışığın farklı dalga boylarındaki düşük miktarlarının absorblanmasına ve onların birbirinden ayrılmasına yardımcı
olur. Molekül yapısındaki bu küçük farklılığa karşın klorofil a ve b hem mavi hem de kırmızı ışık spektrumu bölgelerinde farklı
dalga boylarında ışık absorbsiyonu yaparlar.
Klorofil pigmentleri gibi karotenoidler de kloroplastlarda yerleşmişlerdir. Karotenoidler bir bitkide farklı şekilde
www.hasanunal.net
bulunabilirler. İki esas tipi vardır: karotenler ve oksijenlenmiş karotenler (= ksantofiller). Karotenoidler 40 karbon (C)
atomundan oluşan saf hidrokarbonlardır. Karotenin 3 temel alt grubu bulunur; α, β, γ Karotenoidlerin başlıcası, turuncu renkli
olan β-karotendir. Sarı renkli karotenoidler olan ksantofillerin terminal halkasında oksijen bulunur. Yeşil yapraklarda bulunan bazı
ksantofillere örnek olarak kriptoksantin, lutein, zeaksantin, violaksantin ve neoksantin verilebilir. Aksesuar pigment olarak da
adlandırılan bu pigmentlerin iki önemli görevi vardır. Birincisi, klorofilin ışık absorbsiyonu yapmadığı dalga boylarında ışık
absorbsiyonu yapmak. İkicisi güneş ışığı altında klorofil moleküllerini oksijenin zararlı etkilerinden korumaktır.
TLC
Bileşiklerin ayrılma, saflaştırılma ve tanınmaları için en çok uygulanan işlemlerden biri de kromotografidir. Kromotografi,
bir karışımdaki maddelerin biri sabit diğeri hareket eden iki faz arasında moleküllerin farklı dağılmaları esasına dayanan bir
yöntemdir. Hareketli faz sabit faz üzerinden hareketi sağlar. Moleküller iki faz arasındaki farklı dağılım oranlarına bağlı olarak
hareketli fazda hareket edeceklerdir. Bu yöntem önceleri renkli maddelerin ayrılmasında kullanıldığından kromotografi adını
almıştır.
TLC bir adsorbsiyon kromotografisi tipidir. Organik moleküllerin ayrımında kullanılır. Silisik asidin bir formu olan silika jel
[ Si(OH)4] bu deneyde adsorbant olarak kullanılmıştır. Silika jel çözünür olmayan, polar bir materyaldir. Yaklaşık 0.25 mm
kalınlığında alüminyum tabaka üzerine yayılmıştır. TLC’de iyon değiştiriciler, jel filtrasyon ajanları da fiziksel adsorbant olarak
kullanılabilir. Kapiler etkisi ile çözücü plakta yükselirken pigmenti de birlikte taşır. Daha az polar olan pigment daha hızlı hareket
eder, çünkü silisik aside bağlanma eğilimi azdır. Plağın görüntülenmesinde pigmentler renkli olduğu için özel bir boyama
gerektirmez. Lipidler TLC’de ayrıldığında rhodamin ya da iyot buharı ile boyanır. Amino asitler ise ninhidrin ile görüntülenir.
Kromotografi işlemi sonrasında çözücü ve ayrılan maddeler belli noktalara gelmiş olur. Böylece her madde için uygulama
koşulları belirtilerek karakteristik bir değer verilebilir. Bu değer Rf olarak ifade edilir.
Maddenin ilerlediği yol
Rf = ------------------------------Çözücünün ilerlediği yol
Rf değeri moleküllerin tanımlanması ve değerlendirilmesinde bir kriter olarak kullanılabilir.
www.hasanunal.net
DENEY
PİGMENTLERİN ELDESİ
A-ISPANAK YAPRAKLARINDAN PİGMENT ELDESİ
Araç / Gereç
•
Taze ıspanak yaprağı
•
Parçalanmış buz
•
90ml Methanol, 10ml Diethyl Ether
•
Doygun NaCl çözeltisi
•
70ml Methanol, 30ml Diethyl Ether
•
Petroleum Ether (30-600C)
•
Süzgeç kağıdı
•
Çeşitli boyutlarda beher ve erlen
•
Sıcak su banyosu ( veya evaporatör)
•
Ayırma hunisi
YÖNTEM
1-
Ispanak yaprakları 10 gram olacak şekilde tartılır. Distile suda yıkanır ve 100 ml distile su içeren bir beher içerisinde 2
dakika kaynamaya bırakılır.
2-
Karışım buzda oda sıcaklığına kadar soğutulur. Yapraklar altta kalacak şekilde sıvı kısım boşaltılır.
3-
Yapraklar 90ml Methanol ve 10ml Diethyl ether içeren çözücü içerisinde ekstrakte edilir. UYARI! BU SÜRE İÇERİSİNDE
LABORATUVARDA ATEŞ YAKMAYIN! Ekstrakt huniden süzülür ve sıvı kısım atılır.
4-
Yaprakları 70ml Methanol ve 30ml Diethyl ether içeren çözücüde 200 ml beherde karıştırılır. Ekstrakt ayırma hunisinden
süzülür ve sıvı kısım atılır.
5-
Ayırma hunisindeki ekstrakta 100ml Petroleum Ether (30-600C) ve 100ml doygun NaCl (40 gram/100ml) eklenir.
6-
Karışım iyice sallanır ve tabakaların ayrılmasını gözlenir. Arada bir ayırma hunisinin kapağını açarak basınç düşürülür.
Tabakalar iyice belirginleştiğinde alt tabakayı uzaklaştırılır.
7-
Üst tabaka (yeşil sıvı) 100ml distile su ile çalkalanır tabakaların ayrılması gözlenir ve üstteki yeşil ekstrakt büyük bir erlende
8-
Bu ekstrakt tekrar 100 ml distile su ile ayırma hunisinde çalkalanır ve yeşil renkli ekstrakt tekrar toplanır.
toplanır.
9-
Petroleum Ether ile birlikte olan ekstrakt sıcak su banyosunda evapore edilerek kurutulur. Ekstrakt bir evaporatöre transfer
edilir ve 400C’nin altında bir sıcaklıkta konsantre edilir. Alternatif olarak, ekstrakt 250ml’lik bir behere alınarak 400C’lik su
banyosunda bekletilirken 500ml’lik bir hava alma flask tuzağı ile bir su aspiratörüne bağlanarak konsantre edilir. Buhar
banyosundaki buharlaşmanın hızlı olması ve büyük beher kullanımının getirdiği yüzey artışı daha etkin bir konsantrasyon
sağlayacaktır. Fakat bu metot pigmentlerde bazı değişimlere neden olabilir ve yürüme sırasında değişik fraksiyonların
gözlenmesine yol açabilir. Eğer kuru ekstraktın depolanması zorunlu ise, vakum altında, karanlıkta ve soğukta bekletilerek
pigment yapılarının bozulması önlenebilir.
B-HAVUÇTAN KAROTEN PİGMENTİNİN ELDESİ
ARAÇ / GEREÇLER
•
Taze havuç
•
%95’lik Ethanol
•
Petroleum Ether (30-600C)
•
%85’lik Ethanol
•
Süzgeç kağıdı veya tülbent benzeri bir bez parçası
•
Bıçak
www.hasanunal.net
•
Ayırma hunisi
•
Su banyosu
•
Blender
•
Erlen
YÖNTEM
1.
Parçalanmış 10 gram (kabukları soyulmamış) havuç bir blender yardımı ile iyice parçalanır (alternatif olarak sıvı azotta
2.
Parçalanmış havuç 30 dakika 250ml’lik bir erlen içerisinde 100ml %95’lik sıcak ethanol (700C) ile ekstrakte edilir. Bu işlem
3.
Sarı ekstrakt süzgeç kağıdından hunide süzülür. Ekstrakttaki ethanol konsantrasyonunu %95’den % 85’e değiştirmek için
parçalanır). Her öğrenciye 10 gram parçalanmış havuç ayrılır.
su banyosunda gerçekleştirilebilir.
100 ml ekstrakta 11.8ml distile su eklenir. Ekstrakt oda sıcaklığına kadar soğutulur.
4.
Ekstrakt 250ml’lik bir ayırma hunisine boşaltılır ve 50ml petroleum ether (30-60oC) ile çalkalanır. Tabakaların ayrılması
beklenir. En üstteki sarı turuncu petroleum ether tabakası karotenleri taşır; ethanol tabakası ise ksantofilleri taşımaktadır.
5.
Ayırma hunisinin en üst kısmındaki sarı-turuncu tabaka mümkün olduğunca ayrıldığında bu kısım bir behere toplanır.
6.
Ayırma hunisinde kalan tabakalar 5ml petroleum ether (30-60oC) ile yıkanır. Çalkalanarak tabakalar ayrılana kadar beklenir
ve üstteki küçük faz bir önceki basamaktaki behere alınır.
7.
6. Basamak petroleum ether tabakası renksizleşene kadar tekrarlanır. Bu noktada alttaki ksantofil tabakası altta kalacak
şekilde huni boşaltılır.
8.
Karotenlerin petroleum ether ile birleşmiş ekstraktı ayırma hunisine boşaltılır. Arta kalan ksantofilleri uzaklaştırmak için
9.
Petroleum ether ekstraktı büyük bir behere(200-400ml) boşaltılır.
15ml %85’lik ethanol eklenir ve tabakalar ayrılana kadar beklenir ve alttaki faz uzaklaştırılır.
10. Karışım ekstraktı evapore edilerek kurutulur. 40oC’de evapore edilebilir veya 40oC’lik sıcak su banyosunda ağzı açık
bırakılarak bu işlem gerçekleştirilebilir. İnce tabaka kromotografisi için yükleme yapılmak istendiğinde kurutulmuş karoten
bir miktar (1ml-3ml) aseton ile çözülür. Asetonun fazlası (bu yükleme yapılan mikropipet ile alınabileceği kıvam olarak
belirlenebilir) uçana kadar ağzı açık bırakılır.
ÖRNEKLERİN İNCE TABAKA LEVHASINA UYGULANMASI
1-
Levhalar uygulanacak örnek sayısına göre eşit şekilde kurşun bir kalemle işaretlenir. Örneklerin uygulanacağı yerler kurşun
2-
Örnekler bu noktanın tam ortasına gelecek şekilde 5 μl yüklenir. Bu işlem en az 4 kez tekrar edilir. Tekrar etmeden önce
kalem ile belirlenir. (Levhanın sağından ve solundan 1 cm içeri, alt kısımdan da 2 cm olacak şekilde)
yüklenen örneklerin tam olarak kuruması beklenir bu işlem için kurutma makinesi kullanılabilir.
3-
Hareketli faz siklohekzan:aseton:petroleum eter’den (5:3:2) taze olarak hazırlanır.
4-
Yürütme çözeltisi (hareketli faz) kromotografi tankının içine boşaltılır. İnce tabaka levhası düzgün şekilde bu tankın içine
yerleştirilir. Örneklerinizin sıvı içinde kalmamasına özen gösteriniz.
5-
Yürütme sonunda çözücünün ve örneklerin aldıkları yollar hızlı bir şekilde metrik bir cetvelle ölçülür. Orjinin orta noktası ile
yürümüş olan örneğin orta noktası arasındaki mesafe ölçülür (örneğin aldığı yol). Çözücünün aldığı yol için, orjinin ortası ile
çözücünün ulaştığı nokta ölçülür (çözücünün aldığı yol).
6-
Rf değerlerini hesaplayın ve tartışın.
SORULAR
1-
Kromotografi plakları ile çalışırken neden plaklara elle dokunulmaması gerekir?
2-
İnce tabaka kromotografisinde durgun ve hareketli fazlar hangileridir?
3-
Yürüttüğünüz pigment karışımındaki pigmentlerin hareketli ve durgun faza ilgilerini tartışınız.
www.hasanunal.net
4-
Bu deney sisteminde kullanılan çözücüyü değiştirdiğinizde ne tür bir sonuçla karşılaşabilirsiniz?
5-
Hızlı çalışırsanız neden daha iyi ekstrakt elde edersiniz?
6-
Klorofil en önemli fotosentetik pigment ise fotosentezde bir bitkiye en yararlı ışınların hangileri olduğunu düşünürsünüz?
7-
En polar olan pigment hangisidir? Pigmentleri polarlık derecelerine göre büyükten küçüğe sıralayınız?
8-
Bazı bitkilerin yaprakları yeşil değildir. Bu bitkilerin hangi pigmentleri içerdiğini nasıl bulabilirsiniz?
9-
Su altına en kolay geçen ışık spekturumun mavi bölgesindeki ışınlardır. Deniz bitkileri neden çoğunlukla sarı kahverengidir?
10-
Kromotogramdan her pigment bandını kazıyarak boş bir tüpe aktarın. Üzerine yürütme çözücüsünden bir miktar koyarak
tekrar pigmentleri çözün. Görünür bölge içerisinde yer alan 400 nm’den başlayarak 700 nm’ye kadar dalga boyunu keyfi
olarak 20’şer nm artırarak bu dalga boylarına karşılık gelen absorbans değerlerini kaydedin. Absorbansa karşılık dalga boyu
(nm) grafiğini çizin. Pigment çözeltinizin ışığı maksimum absorbladığı dalga boyunu bulun.
Elektromanyetik Spektrum
www.hasanunal.net