S8. Silimarin Meme Kanseri Hücrelerinde (MCF-7)

Silimarin Meme Kanseri Hücrelerinde (MCF-7)
Doksorubisinin Etkisini Arttırır Mı?
Nil Bahar Atasoy, Elif Bengisu Bilgin, Ahmet Ozan Kaleci,
Mete, Cansu Ünsal, Alperen Kutay Yıldırım
Danışman: Doç. Dr. Erkan Yurtcu
Çınar
AMAÇ: Doksorubisin birçok neoplazmda kullanılan antrasiklin grubu bir
kemoterapötiktir. Ancak sınırlı sayıda hastanın fayda görmesi doksorubisin
içeren kombinasyon kemoterapi rejimleri arayışlarına yol açmıştır. Binlerce
yıldır hepatoprotektif etkisi bilinen Silimarin, deve dikeni (Silybum
marianum) özütünden elde edilen bir flavolignindir. Antikarsinojenik ve
antioksidan etkilerinin olması sebebiyle kemoterapi alan hastalarda en sık
kullanılan ajanlar arasındadır. Silimarin, Avrupa ve Asya’da LegalonTM ve
Silipide IdB1016 adı altında klinik olarak da kullanılmaktadır. Bu çalışmada
silimarinin meme kanseri hücreleri üzerinde doksorubisinin etkinliğini
arttırıp arttırmadığının belirlenmesi amaçlanmıştır.
YÖNTEM: MCF-7 hücreleri standart koşullar altında kültüre edildi.
Hücrelerin canlılıkları Tripan Mavisi atma, protein düzeyleri Bradford,
uygulanacak doksorubisin dozu XTT yöntemiyle değerlendirildi. Silimarin
dozu, oral yolla kullanıldığı zaman ulaştığı en yüksek plazma
konsantrasyon değeri (300 ng/ml) olacak şekilde belirlendi. Hücrelere
doksorubisin ve silimarin tek tek ve birlikte olacak şekilde 24 ve 48 saat
süreyle uygulandı. Genotoksik hasar tek hücre jel elektroforez (Comet
Yöntemi) ile belirlendi.
SONUÇ: 24 ve 48 saat uygulama ile DNA hasarını anlamlı derecede
artıran doksorubusinin silimarin ile kombine edildiğinde bu hasar tek
başına uygulandığından daha yüksek değerlere ulaştı (p<0.05). Silimarin
tek başına uygulandığında 24 saatte hasar oluştururken (p<0.05) 48
saatte oluşturmadı (p>0.05).
İn vitro koşullarda silimarinin konvansiyonel kemoterapötiklerle kombine
edildiğinde bu ajanların etkinliğini artırdığının gösterilmesi kombinasyon
kemoterapileri için iyi bir aday olduğunu düşündürmektedir. Silimarinin
etkinliğini değerlendirecek daha detaylı araştırmalara ihtiyaç vardır.
Anahtar
Kelimeler:
Genotoksisite
Doksorubisin,
Silimarin,
Meme
Kanseri,
GİRİŞ
Meme kanseri, dünyada tüm kanser türleri arasında %25 oranla ikinci
sırada yer almaktadır, Türkiye’de ise kadınlar arasında %45,1’lik oranla ilk
sırada yer almaktadır (1,2). Hastalığın tedavisinde cerrahi, radyasyon
tedavisi,
endokrin
tedavi
ve/veya
kemoterapi
uygulanmaktadır.
Kemoterapide sıklıkla doksorubisin, siklofosfamid, metotreksat ve
florourasil gibi ilaçlar kullanılmaktadır. İçerisinde doksorubisinin de
bulunduğu antrasiklinler, oksijen serbest radikalleri, hidroksil radikalleri ve
hidrojen peroksit radikalleri içeren reaktif oksijen molekülleri oluşturarak
DNA, mRNA, protein ve lipid hasarı yapar. Oluşan lipid peroksidasyonu bu
ilaç grubunun kalp kası toksisitesi için karakteristiktir (Öktem 2005).
Doksorubisin S. Peucetius’tan mutajenik uygulamayla elde edilen
Streptomyces peucetius var. Caesius bakterisinden elde edilen antrasiklin
grubu bir antibiyotiktir (Malla 2010). En büyük sitotoksik etkisini
topoizomeraz II aktivitesini olumsuz etkileyerek gösterir. Ayrıca DNA’da
baz çiftlerinin arasına girerek DNA replikasyonunun ve transkripsiyonun
bozulmasına neden olurlar. Sonuçta DNA onarım sistemi bozulur ve DNA
kırıkları oluşur. Bu durumda hücre döngüsü durdurularak hücre apoptozise
yönlendirilir. Ancak çeşitli meme kanseri olgularında doksorubisin gibi
anti-kanser ajanlara direnç geliştiği bilinmektedir (Ergin 2011).
Doksorubisin, suda çözünebilmesine rağmen nonpolar organik çözücülerde
çözünmemektedir. Klinikte, meme, yumurtalık, mesane, akciğer, tiroid,
mide kanserleri ve nöroblastoma, yumuşak doku sarkoması, multiple
myeloma, Hodgkin's lenfoma gibi hastalıkların tedavisinde de yaygın bir
kemoterapötik olarak kullanılan doksorubisinin bu özelliği, tercih
edilmesini sağlamıştır (Arcamone 2000, Malla 2010). Doksorubisin gibi
sistemik toksisite yaratabilen ilaçların normal dokulara zarar vermeden
kanserli dokuya etki edecek dozda uygulanamadığı belirtilmiştir. Bu
nedenle normal dokulara zarar vermeden ilacın etkili olmasını sağlayacak
kombinasyon terapileri kullanılması uygun görülmüştür (Rastegar 2013,
Ramakrishnan 2009).
Flavanoidler, meyvelerde, bitkilerde ve diğer bitkisel ürünlerde bulunan
anti-oksidan aktiviteye sahip bileşiklerdir. Bugüne kadar 4000’den fazla
flavanoid tanımlanmıştır (Liu 2004). Normal hücrelerde flavonoidler
genellikle
anti-oksidan
karakter
göstermelerine
rağmen
kanser
hücrelerindeki redoks dengesizliği sebebiyle pro-oksidan özellikleri ortaya
çıkmaktadır. Pro-oksidanlar başta DNA olmak üzere plazma zarını da
içeren diğer hücresel zarlarda ve yapılarda hasara yol açmaktadır
(Schwartz 1996).
Silimarin deve dikeni (silybum marianum) bitkisinden elde edilen ve
silychristin, isosilychristin, silydianin, silybin A ve B, isosilybin A ve B
içeren bir flavonoiddir (Abouzid 2012, Hadaruga 2009). İyi tolere
edilebilen, düşük toksisite ve oldukça az yan etkilere sahip olan silimarin
2000 yıldan beri hepatit ve siroz tedavisi başta olmak üzere ve karaciğeri
toksik ajanlardan koruma amacıyla kullanılmaktadır (Kalla 2014, Zhu
2001, Zi 1998, Hadaruga 2009). Silimarinin in vivo ve in vitro koşullarda
antioksidatif, antilipid peroksidatif, antikanser, antifibrotik, antiinflamatuar
ve immünomodülatör özelliklere sahip olduğu görülmüştür (Kalla 2014, Zi
1998). Silimarin antikarsinojenik etkileri sebebiyle kemoterapi alan
hastalar arasında tamamlayıcı ve alternatif tedavi amacıyla en sık
kullanılan ajandır (Ramasamy 2008). Son 30 yıldır silimarinin ticari
formları (Legalon™ ve Silipide IdB1016) Avrupa ve Asya’da klinik olarak
da kullanılmaktadır (Huber 2008).
Tek hücre jel elektroforezi (Comet Assay) tekniği hücre düzeyinde DNA
hasarını saptamak ve miktarını belirlemek için uygulanan non-invaziv, hızlı
ve hassas bir floresan mikroskobik yöntemdir. Yaşlanma, moleküler
epidemiyoloji, klinik ve genetik toksikoloji alanlarında önemli uygulamaları
olan ‘‘Comet Assay’’ son yıllarda giderek artan bir sıklıkta apoptozis,
oksidatif stres, antioksidan çalışmalarında da yer almıştır (Dinçer 2010).
Bu çalışmada silimarinin meme kanseri hücreleri üzerinde doksorubisinin
etkinliğini arttırıp arttırmadığının belirlenmesi amaçlanmıştır.
GEREÇ VE YÖNTEM
Bu çalışmada MCF-7 (ATCC), insan meme kanseri hücreleri kullanıldı.
Hücreler standart kültür koşularında ve %10 FBS içeren RPMI 1640
besiyeri içerisinde 370C sıcaklıkta ve %5 CO2 içeren inkübatörde (Heraeus,
Hanau, Almanya) inkübe edildi. Doksorubusin ve Silimarin MCF7 ve
silimarin hücrelere tek tek ve birlikte olacak şekilde 24 ve 48 saatlik
sürelerle uygulandı.
Hücre canlılığı tryphan blue atma tesit ile değerlendirildi. %95 ve üzerinde
canlılık gösteren kültürler çalışmaya dahil edildi.
Hücre proliferasyonu
Doksorubisinin MCF-7 hücrelerinin proliferasyonu üzerine etkileri
kolorimetrik
olarak
3-(4,5-dimethyl-2-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H
tetrazolium bromidin (XTT-Sigma-Aldrich) biyokimyasal indirgenmesi ilem
değerlendrildi. Canlı hücrelerin mitokondrial aktivitesi sonucu oluşan
formazan kristallerinin 540 nm'de spektrofotometrik olarak ölçüldü (Biotek
Instrument ELx800, Winooski, Vermont, ABD). Hücre inhibisyonu, IC50
dozları ve IC50 dozunun yarı konsantrasyonu (metnin geri kalanında yarı
doz olarak ifade edilecektir) proliferasyon grafiklerinin logaritmik
eğrileriyle hesaplandı.
Comet Assay (Alkali Tek Hücre Jel Elektroforezi)
Genotoksik hasarın belirlenmesi amacıyla uygulanan yöntem kısaca şu
basanakları içermektedir. Tüm uygulama yapılan hücreler %0.5’lik düşük
erime sıcaklığına sahip agaroz (LMPA; Sigma-Aldrich) ile karıştırıldıktan
sonra 1%‘lik (w/v) normal erime sıcaklığına sahip agarozla (NMPA; SigmaAldrich) kaplı lamlara yayıldı. Lamlar lizis solüsyonu içinde karanlıkta 4oC
sıcaklıkta 2 saat boyunca inkübe edildikten sonra yüksek pH dereceli
ortamda elektroforeze tabi tutuldu. Elektroforez sonrası Etidium bromür
(EtBr) ile boynanarak flouresans mikroskopta değerlendirildi. (Yurtcu
2012). Tüm uygulamalar en az üçer defa tekrar edilerek her grup için her
uygulama grubunda en az 100 hücre sayıldı. Hücrelerin nükleusları kuyruk
ve baş oranlarına göre gözlemciler tarafından 0, +1, +2, +3, +4 olmak
üzere değerlendirildi (Resim 1) (İşeri 2013).
Resim1: Comet skorları
Oluşan DNA Hasarlarına Göre Comet Skorları
0
+1
+3
+2
+4
İstatistiksel Analiz
24. ve 48. saatler arası bağımlı iki grup ortalamalarının karşılaştırmaları
için parametrik test varsayımları sağlandığından karşılaştırmalar
Eşleştirilmiş t-testi ile yapılmıştır. Ancak 24. saatin ve 48. saatin kendi
içlerindeki
bağımlı
6
grup
bakımından
küresellik
varsayımı
sağlanmadığından parametrik olmayan istatistik analiz yöntemlerinden
Friedman testi ile ve ardından Bonferroni-Dunn çoklu karşılaştırma
yöntemi ile grup ortancaları karşılaştırılmıştır. p<0,05 düzeyi istatistiksel
olarak anlamlı kabul edilmiştir. Veri analizi SPSS 17.0 (SPSS Ver.17.0,
Chicago IL, USA).
BULGULAR
Doksorubusinin IC50 dozu
24 saat ve 48 saat uygulama sonrasında MTT yöntemi ile belirlenen
doksorubusin dozları sırasıyla 70 µM ve 40 µm olarak belirlendi (Resim 2)
Resim 2: Doksrubisine ait IC50 konsantrasyonu
DNA hasarı
24 saatlik uygulama sonucunda; Doksorubisin IC50 konsantrasyonunda
uygulamasına bağlı olarak ortaya çıkan DNA hasarı kontrol grubuna göre
anlamlı derecede yüksekti (p<0.05). Doksorubisin IC50 dozunun 24 saat
uygulanmasıyla gözlenen DNA hasarı aynı zamanda silimarinin tek başına
kullanıldığı grup, Doksorubisinin yarı dozunun uygulandığı grup ve
doksorubisinin yarı dozunun silimarin ile kombine edilerek uygulandığı
gruptan daha yüksekti. Doksorubisinin yarı dozunun kullanıldığı grupta
elde edilen DNA hasarı kontrol grubundan anlamlı olarak farklı değildi.
Doksorubisinin yarı dozunun silimarin ile kombine edilerek uygulandığı
gruptan elde edilen DNA hasar değeri doksorubisinin IC50 dozunu içeren
gruplardan ve silimarinin tek başına uygulandığı gruptan daha azdı ancak
bu grubun doksorubisinin yarı dozunun tek başına uygulandığı gruptan
daha fazla DNA hasarı oluşturduğu belirlendi. Silimarinin tek başına
uygulandığı grupta gözlenen DNA hasarı doksorubisinin yarı dozunun
uygulanmış olduğu gruptan daha yüksekti. Doksorubisinin IC50 dozuyla
birlikte silimarinin uygulandığı grupta 24 saatlik uygulama sonrasında en
yüksek düzeyde DNA hasarı gözlendi (Tablo 1).
48 saatlik uygulama sonucunda silimarinin tek başına kullanıldığı grup
hariç bütün gruplarla kontrol grubunun arasında anlamlı bir fark
gözlemlenmedi (p<0,05). Silimarinin tek başına kullanıldığı grup bütün
gruplardan daha düşük DNA hasarına yol açtı. Doksorubisinin yarı dozunun
kullanıldığı grup, doksorubisinin yarı dozuyla birlikte silimarin kullanılan
grup ve doksorubisinin IC50 dozunun uygulandığı grup birbirleriyle
istatistiksel olarak anlamlı fark oluşturmadı (p>0,05). Doksorubisinin IC50
dozu ile silimarinin beraber kullanıldığı grup en yüksek DNA hasarına yol
açan grup olarak belirlendi (Tablo2 ve 3).
24 SAAT
Kontrol
Kontrol Silimarin
p<0.05
Silimarin
Dox
IC50
Dox IC50+
Silimarin
Dox
IC50/2
Dox
IC50/2+
Silimarin
p<0.05
p<0.05
p>0.05
p<0.05
p<0.05
p<0.05
p<0.05
p<0.05
p<0.05
p<0.05
p<0.05
p<0.05
p<0.05
Dox IC50
Dox IC50+Silimarin
Dox IC50/2
p<0.05
Comet Standart
Skoru Sapma
25,33 (± 3,78)
94 (± 8,54)
119 (± 26,51)
140 (± 13,74)
36,33 (± 14,5)
81,66 (± 8,73)
Dox IC50/2+Silimarin
Tablo1: 24 saat uygulama sonrası elde edilen Comet Skorları
Dox
IC50/2
Dox
IC50/2 +
Silimarin
p<0.05 p<0.05
p<0.05
p<0.05
Silimarin
p<0.05 p<0.05
p<0.05
p<0.05
43,33 (± 20,84)
Dox IC50
p<0.05
p>0.05
p>0.05
135,33 (± 16,86)
p<0.05
p<0.05
168,66 (± 5,5)
p>0.05
108,33 (± 30,66)
48 SAAT
Kontrol
Dox IC50+Silimarin
Dox IC50/2
Dox IC50/2+Silimarin
Kontrol Silimarin
p>0.05
Dox
IC50
Dox IC50+
Silimarin
Comet Standart
Skoru Sapma
21 (± 5)
111,33 (± 25,02)
Tablo2: 24 saat uygulama sonrası elde edilen Comet Skorları
Uygulama/Süre
24 h
48 h
25,33
21
Silimarin
94*
43,33
Doksorubisin IC50
119
135,33
Doksorubisin IC50+Silimarin
140
168,66
Doksorubisin IC50/2
36,33
108,33
Dox IC50/2+Silimarin
81,66*
111,33
Kontrol
*p<0.05
Tablo 3: 24 ve 48 uygulamalar sonrası elde edilen Comet skorları
TARTIŞMA
Doksorubisin kemoterapi protokollerinde oldukça sık yer almakla birlikte
tek başına yüksek dozda ya da uzun sürelerle kullanılması sistemik
birikime yol açarak kardiyomiyopati, hipotansiyon, taşikardi, kardiyak
dilatasyon, ventriküler yetmezlik gibi olumsuz yan etkiler oluşturur. Bu
olumsuz yan etkilerini engellemek amacıyla çeşitli kombinasyon
kemoterapi rejimleri arayışları ortaya çıkmıştır (Jose 2002). Kombinasyon
terapilerinde kullanmak amacıyla bitkisel kaynaklı kimyasal bileşikler
araştırmaların konusu olmuştur (Riddick 2005, Jin 2010 ve Rastegar
2013). Danz ve arkadaşları kırmızı şarapta bulunan bir stilbene olan
resveratrolün neonatal rat ventrikül miyositlerinde
doksorubisin
kullanımına bağlı olarak ortaya çıkan kardiyomiyosit ölümünü inhibe
ettiğini göstermişlerdir (Danz 2009).
Silimarin deve dikeni bitkisinden elde edilen bir flavolignan olup en büyük
biyoaktif bileşeni silibinindir. Binlerce yıldır hepatit ve siroz tedavisi başta
olmak üzere alkol ve mantar gibi karaciğer hasarı oluşturan kimyasallara
karşı hepatoprotektif ajan olarak kullanılmaktadır (Lee, 2011).
Silimarinin normal hücreleri oksidatif hasara karşı koruyucu etkisinin
olması ötesinde (Yurtcu, 2012) oral yolla alındığı zaman eriştiği en yüksek
plazma konsantrasyonunda (300 ng/ml) doksorubisinin hepatosellüler
karsinoma hücreleri üzerinde sitotoksik ve genotoksik etkilerini artırdığı in
vitro olarak gösterilmiştir (Yurtcu, 2014).
Daha önceki raporlarda çoğunluğu meme kanseri hücreleri olmak üzere
kolon ve prostat kanseri gibi bazı hücre dizilerinde silimarin ve aktif
bileşeni silibininin doksorubisin ile sinerjestik etkili olduğu gösterilmiştir
(Rastegar 2013, Sadava 2013, Colombo 2011, ve Tyagi 2002 ve 2004).
Ayrıca buna benzer etkilerin naringenin, quercetin ve resveratrol gibi diğer
bitkisel kaynaklı kimyasallarla da elde edildiği çeşitli çalışmalarla
gösterilmiştir (Zhang 2009, Václavíková 2008 ve Kim 2013). Ancak Rifki
ve arkadaşlarının yaptığı başka bir çalışmada güçlü bir flavonoid olan
hesperidinin doksorubisin ile birlikte kombine edildiğinde her iki ajanın tek
baçlarına gösterdikleri apoptotik etkiyi gösöstermediği belirtilmiştir (Rifki
2014).
Bu çalışmada silimarinin, doksorubisinin MCF-7 hücreleri üzerinde
genotoksik etkilerini arttırıp arttırmadığı değerlendirilmiştir. Bu amaçla
doksorubisin ve silimarin MCF7 meme kanseri hücrelerine hem tek
başlarına hem de birlikte 24 ve 48 saat sürelerle uygulanmıştır. Gerek 24
gerekse
48
saat
uygulama
sonrasında
oluşan
DNA
hasarı
değerlendirildiğinde, doksorubisinin uygulama yapılmamış kontrol grubu
hücrelere göre genotoksik hasarı istatiksel açıdan anlamlı olarak artırdığı
belirlenmiştir (Tablo 2,3). Doksorubisinin her iki uygulama süresinde
görülen bu etkisi silimarin ile birlikte uygulandığında istatiksel açıdan
anlamlı olacak şekilde daha da artmıştır. Rastegar ve arkadaşları MCF7
hücrelerinde doksorubisinin silimarin ile birlikte uygulandığında canlılığı
yalnız başına uygulandığından daha fazla düşürdüğünü göstermişlerdir.
Ancak bu çalışmada hücrelere uygulanan doksorubisin dozları bizim XTT ile
belirlediğimiz dozun altında, silimarin dozu ise ulaşılabilir plazma düzeyinin
oldukça üzerindedir (Rastegar 2013).
Tyagi ve arkadaşları silimarinin aktif bileşeni olan silibininin çeşitli
kemoterapötiklerle olan ilişkisini MCF7 meme kanseri hücreleri üzerinde
değerlendirmişlerdir. Bu çalışmanın sonuçlarına göre silibinin en yüksek
sinerjik etkiyi doksorubisin ile göstermektedir ve birlikte uygulanmaları
ajanların tek başlarına uygulandıkları zaman gösterdikleri apototik etkiden
daha yüksek bir etki göstermektedir (Tyagi 2004). Ramakrishnan ve
arkadaşlarının yaptığı bir çalışmada 24 saat silimarin uygulanmış HepG2
hücrelerinde hücre proliferasyonunun ve hücre döngüsünün inhibe edildiği,
hücrelerin apoptoza yönlendirildiği görülmüştür (Ramakrishnan 2009).
Bizim sonuçlarımız da bu çalışmaların sonuçlarını destekler nitelikte olup
iki ajanın bir arada kullanılması tek başlarına kullanıldıklarından daha
yüksek genotoksik hasar oluşturmuştur.
Zhang ve arkadaşları doksorubisinin çeşitli flavonoidlerle kombinasyonu
sonrasında ortaya çıkan sitotoksisiteyi inceledikleri çalışmada silimarinin
bu etkinliği artırdığını göstermişlerdir. Silimarinin bu etkisinin altında yatan
mekanizma Pgp proteini ile olan etkileşimidir. Silimarin MCF7 meme
kanseri hücrelerinde ATPaz bağımlı bu hücresel pompaya bağlanarak onu
inhibe
etmekte
böylece
sitoplazmadan
dışarı
madde
atımını
engellemektedir. Böylece sitotoksik ajanın sitoplazmada birkimini
sağlayarak daha etkin bir sonuç alınmasına yol açmaktadır (Zhang 2003).
Çalışmamızda değerlendirmeye çalıştığımız bir diğer nokta doksorubisinin
doz bağımlı etkinliğidir. Bu amaçla hücrelere XTT yöntemi ile belirlediğimiz
IC50 dozunun yarı konsantrasyonunu da uyguladık. Sonuçlarımıza göre
yarı doz doksorubisin 24 saat uygulama sonrasında kontrol grubuna göre
genotoksik hasarı anlamlı derecede artırmazken, uygulama süresi 48
saate çıkarıldığında anlamlı derecede artış sağlamaktaydı (Tablo 2, 3).
Uygulama süreleri ve gruplar kendi içinde değerlendirildiğinde; 24 saat
uygulama sonrasında yarı doz doksorubisin uygulamasına bağlı artışın tam
doz uygulamasından anlamlı derecede düşük olduğu gözlendi. Elde
ettiğimiz bu sonuç Öktem ve arkadaşlarının spheroid hücre kültürleri
üzerine yaptıkları bir başka çalışmada da buldukları doksorubisinin artan
dozlarıyla orantılı olarak ortaya çıkan sitotoksisitenin arttığı sonucunu
destekler niteliktedir (Öktem 2005). İlginç bir nokta olarak yarı doz
doksorubisin silimarin ile kombine edildiğinde ortaya çıkan değer kontrol
grubundan anlamlı derecede yüksekti. Bu sonuç silimarinin diğer
kemoterapötiklerle birlikte uygulandığında daha kısa sürede ve daha az
konsantrasyonda etki ortaya çıkmasını sağladığını göstermiştir. Abncak
uygulama süresi uzatıldığında (48 saat) silimarinin bu katkısı ortadan
kalkmaktadır.
Bu çalışmada ayrıca doksorubisin etkinliği süre bağımlı olarak da
değerlendirilmiştir. Ancak doksorubisinin tek başına ve kombine
uygulandığı hiçbir grupta zaman artışına bağlı olarak ortaya çıkan
genotoksik hasarlarda anlamlı bir fark belirlenememiştir. Bu yüzden
doksorubisine bağlı hasarın sadece doz bağımlı olduğunu düşünüyoruz. AlGhamdi doksorubisinin etkinliğini göstermesi için en az 24 saate ihtiyaç
olduğu ve hücrelerin %50 sini öldürmesi için gereken zamanın 40 saat
olduğu belirtilmiştir. (Al-Ghamdi 2008).
Çalışmamızda ayrıca silimarin hücrelere yalnız başına da uygulanarak
ortaya çıkan genotoksik hasar değerlendirilmiştir. 24 saat uygulama
sonrasında silimarin uygulamasına bağlı oluşan genotoksik hasar kontrol
grubuna göre ve yarı doz doksorubisin uygulmasına göre anlamlı derecede
yüksekti. Agarwal ve arkadaşları da yaptıkları bir çalışmada silimarinin
A431 epidermoid karsinom hücrelerinde büyümeyi güçlü bir şekilde inhibe
ettiği ve apoptoza yönelime neden olduğu gözlemlemişlerdir (Agarwal
2002). Ancak uygulama süresi 48 saate çıkarıldığında oluşan hasar kontrol
grubunda belirlediğimiz hasara göre yüksek değildi. Bulduğumuz bu sonuç
Yurtcu ve arkadaşlarının yaptıkları bir çalışmada 48 saatlik uygulamada
silimarinin HepG2 hücreleri üzerinde etkinliğinin 24 saatlik uygulamaya
göre azaldığı yönündeki sonuçlarını destekler niteliktedir (Yurtcu 2014).
Silimarinin bioactive komponenti olan silibinin metal iyonları varlığında
prooxidant etki gösterir (Riddick 2005 ve Vacek, 2014). Prooksidant çevre
bu iyonların etkisi ile superoksit anyonu (O2·-) ve hidrojen peroksitten
(H2O2)
hydroksil
radikalleri
(HO·)
oluşumunu
hızlandırır.
Lipid
peroksidasyonu gibi olayların başlaması ise serbest radikal yürütülü
hasarın ilk basamaklarından birisidir. Sonuçta DNA, lipid ve proteinler
kovalent olarak modifiye olur (Riddick 2005 ve Fritz, 2011). Kanser
hücrelerindeki bozuk redoks potansiyeli ve antioksidan enzim savunma
system kusurları bu hücreleri prooksidan hasarına duyarlı hale
getirmesinin bulduğumuz sonuçları açıklar nitelikte olduğunu düşünüyoruz.
Çalışmamızın sonuçlarını toplu olarak değerlendirdiğimizde i) silimarin
doksorubusinin genotoksik hasar oluşturma potansiyelini artırdığını ii)
silimarin kullanılan doksorubisin dozu azaltıldığında halde bile
doksorubisinin etkinliği artırdığını iii) silimarin tek başına uygulandığında
süre bağımlı olarak genotoksik hasar oluşturduğunu belirledik. Tüm bu
noktalar göz önüne alındığında normal hücrelerde kemoterapötiklerin
oluşturduğu toksik hasarı azaltan, kanser hücrelerinde seçici olarak
etkinliği artıran silimarinin kombinasyon tedavileri için uygun bir aday
olabileceğini düşünüyoruz. Ancak silimarinin gerçek potansiyelinin açığa
çıkarılabilecek daha detaylı moleküler ve in vivo çalışmalara da ihityaç
bulunmaktadır.
KAYNAKLAR
AbouZid S. (2012). Silimarin, Natural Flavonolignans from Milk Thistle,
Phytochemicals - A Global Perspective of Their Role in Nutrition and
Health, Dr Venketeshwer Rao (Ed.), ISBN: 978-953-51-0296-0
Agarwal R, Rana P.Singh, Anil K.Tyagi, Jifu Zhaoand, Silymarin inhibits
growth and causes regression of established skin tumors in SENCAR mice
via modulation of mitogen-activated protein kinases and induction of
apoptosis. Carcinogenesis vol.23 no.3 pp.499–510, 2002
Arcamone F, Cassinelli G, Fantini G, Grein A, Orezzi P, Pol C, Spalla C.
Adriamycin, 14-hydroxydaunomycin, a new antitumor antibiotic from S.
peucetius var. caesius. Reprinted from Biotechnology and Bioengineering,
Vol. XI, Issue 6, Pages 1101-1110 (1969). Biotechnol Bioeng. 2000 Mar
20;67(6):704-13.
Danz, E.D., Skramsted, J., Henry, N., et al., 2009. Resveratrol prevents
Doksorubisin cardiotoxicity through mitochondrial stabilization and the
Sirt1 pathway. Free Radic. Biol. Med. 46, 1589–1597.
Darcansoy İşeri Ö, Yurtcu E, Haberal M. et al. Corchorus olitorius (jute)
extract induced cytotoxicity and genotoxicity on human multiple myeloma
cells (ARH-77). Pharm Biol. 2013 Jun; 51(6):766-70
Dinçer Y, Kankaya S. DNA Hasarının Belirlenmesinde Comet assay,
Türkiye Klinikleri J Med Sci 2010;30(4):1365-73
Hadaruga
D.I.
and
Hadaruga
N.G.,
Antioxidant
Activity
of
Hepatoprotective Silimarin and Silybum marianum L. Extract Chem. Bull.
"POLITEHNICA" Univ. (Timisoara) Volume 54(68), 2, 2009
Huber A, Thongphasuk P, Erben G, et al. Significantly greater antioxidant
anticancer activities of 2,3-dehydrosilybin than silybin. Biochem Biophys
Acta 1780(5): 837-847, 2008
Jin C, Li H, He Y, et al. Combination chemotherapy of doksorubisin and
paclitaxel for hepatocellular carcinoma in vitro and in vivo. J Cancer Res
Clin Oncol 136(2): 267-274, 2010.
Jose´ L. Quiles , Jesu´ s R. Huertas , Maurizio Battino , Jose´ Mataix ,
M.Carmen Ramı´rez-Tortosa Antioxidant nutrients and adriamycin toxicity
Toxicology 180 (2002) 79/95
Kim TH1, Shin YJ, Won AJ, Lee BM, Choi WS, Jung JH, Chung HY, Kim HS.
Resveratrol enhances chemosensitivity of doksorubisin in multidrugresistant human breast cancer cells via increased cellular influx of
doksorubisinBiochim Biophys Acta. 2014 Jan;1840(1):615-25. doi:
10.1016/j.bbagen.2013.10.023
Lee DG1, Kim HK, Park Y, Park SC, Woo ER, Jeong HG, Hahm KS. Grampositive bacteria specific properties of silybin derived from Silybum
marianum. Arch Pharm Res. 2003 Aug;26(8):597-600
Lee YS, Jang KA, Cha JD. Synergistic antibacterial effect between silibinin
and antibiotics in oral bacteria. J Biomed Biotechnol. 2012;2012:618081
Liu RH. Potential synergy of phytochemicals in cancer preventi-on:
mechanism of action. J.Nutr. 2004 Dec;134(12 Suppl):3479S-3485S.
Malla S. , Niraula N.P., Singh B, Liou K. , Sohng J.K. Limitations in
doksorubisin production from Streptomyces peucetius Microbiological
Research Volume 165, Issue 5, 20 July 2010, Pages 427–435.
Öktem G, Ayla Ş, Tuna S et al. Doksorubisinin Spheroid Hücre
Kültürlerinde MCF-7 Hücreleri Üzerine Etkisi Türkiye Klinikleri J Med Sci
2005, 25: 337-342
P. K. Kalla, S. Chitti, S. T. Aghamirzaei et al. Anti-Cancer Activity of
Silimarin on MCF-7 and NCIH-23 Cell Lines, 2014;Advances in Biological
Research 8 (2): 57-61
Ramakrishnan G1, Lo Muzio L, Elinos-Báez CM et al. Silimarin inhibited
proliferation and induced apoptosis in hepatic cancer cells. Cell Prolif.
2009Apr;42(2):229-40
Ramasamy K, Agarwal R. Multitargeted therapy of cancer by silimarin.
Cancer Lett 269(2): 352-362, 2008
Rastegar H, Ahmadi Ashtiani H, Anjarani S. et al. The Role Of Milk Thistle
Extract İn Breast Carcinoma Cell Line (MCF-7) Apoptosis With
Doksorubisin. Acta Med Iran. 2013 Sep;51(9):591-8.
Riddick DS, Lee C, Ramji S, et al. Cancer chemotherapy and drug
metabolism. Drug Metab Dispos 33(8): 1083-1096, 2005.
Rifki F, Dyaningtyas Dewi P.P, Nunuk A. N. et al. Hesperidin as a
preventive resistance agent in MCF-7 breast cancer cellsline resistance to
doksorubisin Asian Pac J Trop Biomed 2014; 4(3): 228-233
Schwartz JL. The dual roles of nutrients as anti-oxidants and pro-oxidants:
their effects on tumor cell growth.. J Nutr. 1996 Apr;126(4 Suppl):1221S7S.
Tyagi AK, Agarwal C, Chan DC, et al. Synergistic anti-cancer effects of
silibinin with conventional cytotoxic agents doksorubisin, cisplatin and
carboplatin against human breast carcinoma MCF-7 and MDA-MB468 cells.
Oncol Rep 11(2): 493-499, 2004.
Tyagi AK, Singh RP, Agarwal C, et al. Silibinin strongly synergizes human
prostate carcinoma DU145 cells to doksorubisin-induced growth inhibition,
G2-M arrest, and apoptosis. Clin Cancer Res 8(11): 3512-3519, 2002.
Ergin V, Doğan İ, Cumaoğlu A. et al. MCF-7 meme kanseri hücre hattında
doksorubisin ve monensinin hücre çoğalması ve sağ kalım ile ilişkili gen
ifadelenme düzeyleri üzerine etkisi. Journal of Experimental and Clinical
Medicine 28 (2011) 59-63
Václavíková, R., Kondrová, E., Ehrlichová, M., et al., 2008. The effect of
flavonoid derivatives on Doksorubisin transport and metabolism. Bioorg.
Med. Chem. 16, 2034–2042.
Yurtcu E, Işeri O, Sahin F. Genotoxic and cytotoxic effects of doksorubisin
and silimarin on human hepatocellular carcinoma cells. Hum Exp Toxicol.
doi: 10.1177/0960327114529453, 2014
Zhang S1, Morris ME. Effects of the flavonoids biochanin A, morin,
phloretin, and silimarin on P-glycoprotein-mediated transport.J Pharmacol
Exp Ther. 2003 Mar;304(3):1258-67
Zhang, F.Y., Du, G.J., Zhang, L., et al., 2009. Naringenin enhances the
anti-tumor effect of Doksorubisin through selectively inhibiting the activity
of multidrug resistanceassociated proteins but not P-glycoprotein. Pharm.
Res. 26, 914–925.
Zhu W., Zhang JS., Young CY. Silimarin inhibits function of the androgen
receptor by reducing nuclear localization of the receptor in the human
prostate cancer cell line LNCaP. Carcinogenesis. 2001 Sep;22(9):1399403
Zi X, Feyes D. K. and Agarwal R. Anticarcinogenic effect of a flavonoid
antioxidant, silimarin, in human breast cancer cells MDA-MB 468:
induction of G1 arrest through an increase in Cip1/p21 concomitant with a
decrease in kinase activity of cyclin-dependent kinases and associated
cyclins. Clin Cancer Res 1998 4:1055-1064.
Al-Ghamdi S. S. Time and Dose Dependent Study of Doksorubisin Induced
du-145 Cytotoxicity. Drug Metabolism Letters, 2008, 2, 000-000
1. http://globocan.iarc.fr/Pages/fact_sheets_cancer.aspx, (Son Erişim
Tarihi: 11.05.2014)
2. http://sbu.saglik.gov.tr/Ekutuphane/kitaplar/istaturk2012.pdf
Erişim Tarihi: 11.05.2014)
(Son