Prenatal Tanıda Yeni Ufuklar - Non İnvaziv Prenatal Test

Prenatal Tanıda Yeni Ufuklar - Non İnvaziv Prenatal Test

Prenatal Tanıda Yeni Ufuklar
Non İnvaziv Prenatal Test
Dr İsrael Aruh,
Kent hastanesi IVF Ünitesi
Direktörü
PRENATAL TEST: NIPT TEKNOLOJİSİNE
BAKIŞ
Kromozom Anomalilerinin Prenatal Görülme Sıklığı
Percent of Reported Chromosome Abnormalities
16
T21
T18
5
8
53
5
Major fetal
aneuploidies
T13
45,X
Sex trisomy
13
Other rare
Data adapted from Wellesley, D, et al., Rare chromosome abnormalities, prevalence and prenatal diagnosis rates from
population-based congenital anomaly registers in Europe. Eur J of Hum Gen, 11 January 2012.
PRENATAL TARAMA SEÇENEKLERİ – RISK SCORE
Down Syndrome Testing with 5% Screen Positive Rate
Detection Rate
(%)
1st Trimester
64-70
1st Trimester
82-87
2nd Trimester
69
2nd Trimester
81
Integrated
Screen
94-96
Serum
Integrated
85-88
ACOG Practice Bulletin No. 77, January 2007
.
GÜNÜMÜZDEKİ TANI SEÇENEKLERİ
KARYOTYPE
Trimester - Test
Sensitivity
Specificity
1st – CVS
99.25%1
98.65%1
2nd - Amniocentesis
99.4%2
99.5%2
Kesin cevap, ancak girişimsel olup anne ve fetus için risk taşır.
Tarama testlerindeki yüksek yanlış pozitif oranlarından dolayı, çoğu
zaman gereksiz yere uygulanır.
1.
Hahnemann JM, Vejerslev LO. Accuracy of cytogenetic findings on chorionic villus sampling (CVS)--diagnostic consequences of CVS mosaicism and
non-mosaic discrepancy in centres contributing to EUCROMIC 1986-1992. Prenat Diagn. 1997 Sep;17(9):801-20.
2.
Mid-trimester amniocentesis for prenatal diagnosis. Safety and accuracy. JAMA. 1976 Sep 27; 236(13): 1471-6.
.
PRENATAL TEST SPEKTRUMU
TARAMA
Risk skorları biyokimyasal analiz
ve populasyon istatistikleri
kullanılarak elde edilir.
TANI
Sonuçlar tamamen genetik
faktörlere bağlıdır.
Serum
Screening
CVS
Combined Serum
Screens, NT, Ultrasound
SCREENING
NIPT
Amnio
DIAGNOSTIC
NIPT’NİN HEDEFLERİ NELERDİR?
Fetal,
maternal
riski
azaltmak
Tüm
gebelere
kolay
uygulanır
olması
Yalancı
pozitifleri
azaltmak
Yüksek
tespit
oranı
sağlama
MATERNAL KANDA FETAL DNA’NIN
İKİ KAYNAĞI:
• Fetal hücreler
• Tüm hücre popülasyonunun
milyarda biri
• İzolasyonu için mekanik ve
biyokimyasal yöntemler gerekir
• Cell-free DNA (cfDNA)
• Anne kanında maternal ve fetal
cfDNA birarada mevcuttur
• Total cfDNA’nın %2–20’si fetus’a
aittir
.
MATERNAL KANDA FETAL cfDNA
Gebelikte güvenli analiz edilebilen bir komponenttir
• Apoptosis sonucu salınır
• Fetal cfDNA plasentanın cytotrophoblastic
hücrelerinden salınır
• Kan dolaşımına küçük DNA
fragmentleri(150-200bp) olarak karışır
• 7+ gebelik haftasında güvenle tespit edilir
• Postpartum saatler içinde dolaşımdan
kaybolur
.
NIPT Metodları
COUNTING
SNPs
MPSS
DANS+FORTE
Targeted Sequencing
Massively Parallel
Shotgun Sequencing
Digital Analysis of Selected Regions+
Fetal Fraction Optimized Risk of Trisomy Evaluation
NIPT Metodları
Massively
Parallel
Shotgun
Sequencing
Sequenom
MaterniT21
Targeted
Sequencing
Verinata
Verifi
COUNTING
Ariosa
Harmony
Targeted
Sequencing
Natera
Panorama
SNPs
Sayarak
Chrom 21
Chrom 3
Sayarak
Expected Amount:
Observed Amount:
Chrom 21
20%
25%
Chrom 3
80%
75%
Sayma Metodu
Collect (MPSS, Targeted)
Sequence
Assign/Map with Reference
Calculate ratio
Observed:Expected
Create result
Confidential and Privileged
Cell free DNA ve Fetal Fraksiyon
cfDNA comes from
apoptytic cells derived
from:
•Maternal
• Adipocytes
• Hematopoetic
system
•Fetal
• Placenta
(trophoblasts)
Fetal DNA
Fetal Fraction =
Fetal DNA + Maternal DNA
Cell free DNA (cfDNA)
Chromosome 21 is 1.5%
of genome equivalents
(0.75 per chromo)
Difference of 0.03%
At 10% fetal DNA:
[1.5% x (90% maternal)]
+
[1.5 + 0.75 =2.25%] x (10%
fetal)]
= 1.575%
At 5% fetal DNA:
[1.5% x (95% maternal)]
+
[1.5 + 0.75 =2.25%] x (5%
fetal)]
= 1.530%
Kromozoma bağlı amplifikasyon
değişimleri
Adapted from: Fan, Quake et al. 2008 PNAS
Average
Counting
Sensitivity1,2,3,4
SNP
Sensitivity5
Trisomy 21
99.67%
>99%
Trisomy 18
98.5%
>99%
Trisomy 13
86.4%
>99%
-“Özellikle G ve C’nin çok düşük veya fazla olduğu kromozomlarda,
amplifikasyon aşaması daha geniş varyasyonlara yol açar.”6
Sayma metodu DNA’daki bilgilerden ziyade DNA miktarına dayanır ve bu
nedenle bu varyasyonlardan daha çok etkilenir.
- SNP metodu ile kromozomdan kromozoma amplifikasyon değişimi elimine
edilerek, trizomi 13 ve seks kromozomlarındaki azalmış sensitivite ve
spesifisite sorunu önlenir.”6
1 Palomaki 2011
2 Bianchi 2012
3 Ashoor 2212
4 Ashoor 2012
5 Nicolaides, 2013
6 Boon & Faas 2013
SNP’ler:
Genomdaki herhangi bir nükleotidin A,T,G ve C’nin DNA
sekanslarındaki dizilimindeki varyasyonlarından dolayı
değişimine SNP adı verilir. SNP’ler toplumlardaki doğal
genetik varyasyonların bir parçasıdır.
SNP-Bazlı Yaklaşım
19,488 SNP simultane hedeflenir
SNP
Sequencing
Plasma =
Maternal + Fetal
DNA
Maternal
blood
SNP
Sequencing
Buffy coat =
Maternal
DNA
Maternal +
Fetal Genotype
Fetal
Genotype
Maternal
Genotype
SNP (NATUS) Algoritması kullanılarak
Next-generation Anöploidi Testi
Genotypic Data
from Mom +/Dad
Multiple hypotheses for
each chromosome
+
Sub-hypotheses with
different crossover
points
Data from Human
Genome Project
(HapMap)
Maksimum Olasılık Tahmini
Doğru Hipotezi Belirler
Sequencing
Measurements
from Maternal plasma
Compare
Maksimum Olasılık Tahmini
Doğru Hipotezi Belirler
Sequencing
Measurements
from Maternal plasma
Compare
Maksimum Olasılık Tahmini
Doğru Hipotezi Belirler
Sequencing
Measurements
from Maternal plasma
Compare
Her koşul için
kişiselleştirilmiş risk
skoru
SNP profilinin çözülümü
Disomy
Trisomy
Mother AA, Fetus AA
Mother AA, Fetus AAA
Mother AA, Fetus AB
Mother AA, Fetus AAB
Mother AB, Fetus AAA
Mother AB, Fetus AA
Mother AB, Fetus AAB
Mother AB, Fetus AB
Mother AB, Fetus ABB
Mother AB, Fetus BB
Mother AB, Fetus BBB
Mother BB, Fetus AB
Mother BB, Fetus ABB
Mother BB, Fetus BB
Mother BB, Fetus BBB
NATUS Algoritma Özeti
• Anne ve babadan fetüse geçen, ilgili
kromozomlardaki (21,18,13,X,Y) tüm crossover’lar dahil milyonlarca olası sonuç hipotezleri
bilgisayar tarafından oluşturulur.
• Olası tüm sonuçlar fetüsün fragmente SNP
profilleri ile karşılaştırılır
• Sonucu verebilmek için tüm eşleşmeler toplanıp
maksimum olasılık bayesian analizi kullanılır
• Özelleştirilmiş risk skoru elde etmek için, SNP
sayıları,, fetal fraksiyon,maternal yaş ve diğer
örneğe bağlı faktörler kullanılır.
SNP-bazlı Yaklaşımın Avantajları
• Tüm otozomlarda daha tutarlı tespit
oranı
– Düşük veya yüksek GC içeriğinden
kaynaklanan kromozom amplifikasyonu
önyargısından bağımsız
• Referans kromozoma ihtiyaç yok
• Düşük hata oranı
• Triploidiyi tespit edebilme
Taken from http://wdic.net/word/snp
• Düşük fetal fraksiyonlarda daha
hassas performans
Neden Sayma Metodu Triploidiyi
Tespit Edemez?
No difference
Triploidi Tespiti
• Sayma metodu triploidiyi tespit edememektedir
– Sayma metodu uygulanan 8 olgu ‘’etkilenmemiş olarak”
raporlanmıştır (Bianchi 2012, Futch 2013)
– 2 kör çalışmada, 5 paternal triploidi olgusunun tamamı SNP
metoduyla tespit edilmiştir.
Triploidi Tipleri
Extra
haplotypes
Placenta
Fetus
Biochemistry
Other findings
DIGYNIC
Maternal
DIANDRIC
Paternal
Small, normal
Growth-restricted,
often abnormal
Large, cystic
Less affected
Very low free βhCG and PAPP-A
free β-hCG 10X higher
than normal
Partial Molar - Maternal
complications
Vanishing Twin/Triploidi
Sonucunu Alındığında Takip
• Vanishing twin/ Triploidi
– Eğer ikinci sak yok ve/veya anormal plasenta
bulgusu mevcut ise, girişimsel tanı testi önerilir
Düşük Fetal cfDNA Fraksiyonu
Tespit Oranını Düşürür
40
9-14. gebelik haftasında anne
adaylarının %25’inde fetal fraksiyon oranı
%4-8 arasında saptanmıştır. (2,3)
Counting
Down
Syndrome
Sensitivity1
Panorama
Down
Syndrome
Sensitivity2
30
Fetal Fraction (%)
% Fetal
DNA
Fraction
35
25
20
15
10
>8%
>99%
>99%
5
4-8%
75%
>99%
0
8
10
12
14
16
18
20
Gestational Age (weeks)
1.Palomaki GE et al DNA sequencing of maternal plasma to detect Down syndrome: an interntional clinical validation
study. Genet Med 2011 Nov; 13(11):913-2
2. Natera Internal Data
3. Norton ME et al. Non-Invasive Chromosomal Evaluation(NICE) Study: results of a multicenter prospectgive cohort
study for detection of fetal trisomy 21 and trisomy 18. AJOB 2012;1.e1-1.e8
22
24
Fetal Fraksiyonun Önemi
“Son 1.5 yıl içerisinde, anöploidi tespiti için
Dünya’da 100,000’den fazla DNA testi uygulanmış
olup, test performansını etkileyen faktörler daha
belirginleşmiştir. cffDNA’nın relatif oranı yani fetal
fraksiyonun önemi kriktir.”
-- Lyn Chitty and Diana Bianchi
Prenatal Diagnosis 2013, 33, 511–513
Fetal Fraksiyon Aralıkları
Fetal Fraction too
low to report
Intermediate fetal
Fetal fraction adequate to
fraction – decreased
achieve best performance
sensitivity with
counting methodology
Fetal fraksiyonun %4’ten düşük olduğu durumda puzzle’daki resim
What is this a picture of?
aşağıdaki gibi gözükür. Sonuç alınamaz.
Edges are minimum ff – so no call is made by anyone
<4% fetal fraction
Confidential and Privileged
63
4-8% fetal fraksiyonda sayma metoduyla, puzzle’da halen eksik parçalar
Missing rağmen,
moderate
amount
of pieces, but still making call
bulunmasına
resim
daha belirginleşti.
Photo of car and highway
4-8% fetal fraction, single
Confidential and Privileged
rejection test
64
SNP metoduyla 4-8% fetal fraksiyonda puzzle parçaları daha
Still yerleşerek
have same amount
of pieces,
but now they are the right pieces
doğru
resim daha
nettir.
-BUFFALO walking in the street
4-8% fetal fraction with metrics
Confidential and Privileged
66
Reporting
Reporting
Method
Sequenom
MaterniT21
Plus
Verinata
Verifi
Ariosa
Harmony
Natera
Panorama
Positive
Negative
Detected
Not Detected
Suspected
Risk score
(mat age, fetal
fraction,
1 metric)
Risk Score
(mat age, fetal
fraction, multiple
metrics)
Confidential and Privileged
Confidential and Privileged
Confidential and Privileged
Confidential and Privileged
Confidential and Privileged
Low Risk Report
High Risk Report for Trisomy 21
FETAL FRACTION: 9.2%
Confidential and Privileged
Unable to Report – Low Fetal Fraction
FETAL FRACTION: 3.2%
Unable to Report –
Redraw Recommended
•
Spesifik bir örnekteki DNA
fragmentlerine bağlı bir durum olduğu
düşünülüp, yeni bir örneğin daha
hassas bir sonuç verebileceği
ihtimalinde tekrar bir kan örneği
alınması istenebilir.
•
Böyle bir sonucun gelmesi, gebelikte
herhangi bir sorun olduğunu
göstermez.
•
Redraw önerilmesinin amacı daha
hassas ve güvenilir bir sonuç
alınabilmesini hedefler.
•
Redraw önerildiğinde, 2. bir örneğin
alınmasıyla %90 ihtimalle sonuç alınır.
•
DÜŞÜK FETAL FRAKSİYON
– <3.5% fetal fraksiyon
– Algoritmayla yüksek güvenirlikte
sonuç alınamaz.
– Not:Diğer NIPT metodlarında fetal
fraksiyon cutoff değeri %4’tür.
•
DOES NOT PASS QUALITY METRICS -– DNA daha az bilgi verici ise
("noisy" data)
– Algoritmanın yüksek güvenirlikte
sonuç vermesinde güçlük
olduğunda.
– Bunlar, total DNA miktarı
(kombine maternal ve fetal DNA),
okuma sayısı ve de hassas ve
tutarlı sonuçlar elde etmek için iyi
kalitede veri sağlıyan diğer kontrol
ölçümlerini içerir.
Unable to report –
Redraw NOT recommended
• Uninformative DNA
Pattern
– Vakaların <1%
– DNA yorumlanamıyorsa
– Bu hasta için klinik öykü
tekrar dikkate alınıp
takip ve/veya daha ileri
tetkik seçenekleri
önerilebilinir
• Fetal mozaisizm
• Maternal kromozom
anomalileri veya mozaisizm
• Beklenenden fazla
seviyedeki homozigosite
(Haploblock)
• Egg donor or surrogate
NIPT IS A
INVASIVE PROCEDURE UPDATE BY MONTH
(7/2010 THROUGH 3/2013)
NIPT’yi öneren kurumlar
Nisan 2013, TJOD İstanbul Şubesi
• Maternal Kanda Hücre Dışı Fetal DNA (cffDNA) ile Non-Invasive Prenatal Test (NIPT)
• Uzman Görüşü
• Raporu onaylayanlar (soyadı sırasına göre); BAKSU Başak, BAŞARAN Seher,
BAŞGÜL Alin, BATUKAN Cem, ERMİŞ Hayri, GEDİKBAŞI Ali, GÜL Ahmet, HAS
Recep, KALELİOĞLU İbrahim, PEKİN Oya, POLAT İbrahim, ŞAHİNOĞLU Zeki,
ULUDOĞAN Mehmet, TUĞRUL Semih, YAZICIOĞLU Fehmi, YILDIRIM Gökhan,
YÜKSEL Atıl)
• cffDNA ile NIPT'nin olası kullanım alanları:
*
*
*
*
*
Maternal yaşın 35 ve üstünde olması.
Trizomi tarama testlerinin pozitif olması durumunda.
Trizomi 21 ve 18 için spesifik ultrason belirteçlerinin varlığında.
Trizomi 21 ve 18’li fetus / bebek öyküsünde.
Parental dengeli robertsonian Trizomi 21 ve Trizomi 13 translokasyonu.
The performance of screening for trisomy 21 and trisomy 18 by NIPT using
chromosome-selective sequencing in a routine population is as effective as
previously reported in high-risk groups with DR 99% and FPR 1%.
Daha önce bildirilen yüksek risk gruplarındaki %99 tespit oranı ile %1’lik
yalancı pozitif oranı, trizomi 21 ve trizomi 18’in taramasında kromozom-selektif
sekanslama kullanılarak uygulanan NIPT performansı, rutin popülasyonlarda
da eşit derecededir.
Am J Obstet Gynecol 2012;207:374.e1-6.
On the basis of existing data, NIPT can potentially be used in universal
screening for trisomies 21 and 18 in all singleton pregnancies and the main
limiting factor for such widespread application of the test at present is the
associated cost.
Mevcut verilere göre, NIPT potansiyel olarak , tüm tekil gebeliklerin
trizomi 21 ve trizomi 18 açısından taramasında üniversal
kullanılabilinir. Günümüzde, yaygın uygulamayı sınırlayıcı esas
faktör testin maliyetidir.
Am J Obstet Gynecol 2012;207:374.e1-6.
Validation of targeted sequencing of single-nucleotide
polymorphisms for non-invasive prenatal detection of
chromosomes 13, 18, 21, X, and Y
K.H. Nicolaides, A. Syngelaki, M. Gil, V. Atanasova and D. Markova
This blinded validation study has demonstrated that cfDNA testing
in maternal blood using targeted sequencing of SNPs at
chromosomes 13, 18, 21, X and Y and use of the NATUS algorithm
holds promise as an accurate method for detecting fetal
autosomal aneuplodies, sex chromosome aneuploidies and
triploidy in the first trimester of pregnancy.
Bu kör doğrulama çalışması, gebeliğin birinci trimestrinde
maternal kanda cfDNA testiyle, 13,18,21,X ve Y kromozomlarındaki
SNP’lere yönelik hedeflenmiş sekanslama ve NATUS algoritması
kullanımının fetal otozomal anöploidileri, seks kromozom
anöploidileri ve triplodiyi tespitte, gelecek vaad eden kesin bir
metod olduğunu göstermiştir.
Prenatal Diagnosis 2013 June, 33(6): 575-579
NIPT
DAHA GÜVENLİ PRENATAL TANI
1. NIPT kadınlar için mevcut prenatal test opsiyonları
spektrumunu genişletmiştir
2. Tarama sonucunun pozitif olduğu durumda, invaziv tanı
testi yerine, NIPT, kadınlar için bir alternatiftir.
• T18 and T21 için yüksek sensitivite ve spesifisite. (T13
performansı nispeten daha düşük)
NIPT
DAHA GÜVENLİ PRENATAL TANI
3. İnvaziv tanı testlerini kabule yanaşmayan kadınlar için, NIPT
güven verici ve rahatlatıcı bir seçenektir.
4. NIPT, girişime bağlı riski ortadan kaldırarak kadınların bu tip
testleri reddetme ihtimalini düşürür.
GELECEK UFUKLAR
• Düşük risk popülasyonlarda geniş kapsamlı çalışmalar
• Çoğul gebeliklerde çalışmalar
• Sub-kromozomal anomalilerin tespiti
• cfDNA ve gebelik komplikasyonları
• Tek örnekte NIPT + Maternal taşıyıcılık taraması
• Genetik sendromların tedavisi (Down v.s)
Teşekkürler!
Dr İsrael Aruh,
Kent hastanesi IVF Ünitesi Direktörü