MALDI TOF-MS Performans ve Yenilikler

MALDI TOF-MS
Performans ve Yenilikler
Dr. Görkem Yaman
Düzen Laboratuvarlar Grubu
İstanbul
Sunu Kapsamı:
1. MALDI TOF-MS cihazlarının performansı
2. MALDI TOF-MS ile mikobakteri
identifikasyonu
3. Yakında…
 Küf mantarlarının identifikasyonu
 Kan kültürlerinden direk çalışma
4. Gelecekte…
 Antibiyotik direnci?
MALDI TOF-MS
 Hızlı ve güvenilir sonuçlar
 Kolay (ama kritik!) hazırlık ve yükleme
 Tekrarlanabilir
 Yüksek ayrım gücü
 Mikrobiyolog onayı sonrası rapor
MALDI TOF-MS cihazlarının performansı
 Yapılan çalışmalarda genel olarak
%90’ın üzerinde tür düzeyinde
identifikasyon, %98 cins düzeyinde
identifikasyon ve <%1 hatalı
identifikasyon
 Fenotipik identifikasyon ile Bruker
MS/Vitek MS paralel çalışması
*Murray, P.R. What is new in clinical microbiology – Microbial identification by MALDI-TOF MS. The
Journal of Molecular Diagnostics. 15(5), 419-423.
Bruker MS/Vitek MS paralel çalışması
 Çoğunlukla yoğun bakım hastalarından izole
edilen fenotipik olarak identifiye edilmiş
toplam 1148 suş ve 37 standart suş
 257 Enterobacteriacea, 292 non-fermentatif,
372 Gram pozitif kok, 117 Candida, 110 diğer
 Direk transfer metodu, sonuç alınamazsa
asetonitril-formik asid ekstraksiyonu
 Matrix olarak CHCA
 Merkezlerin yaptığı fenotipik yöntemle MALDI
uyumu cins düzeyinde %95, tür düzeyinde %92
olarak bulundu.
Bruker MS/Vitek MS paralel
çalışması
 Bruker MS - Vitek MS birbiriyle
tür düzeyinde uyum %97
 Her ikisi de %96 tür düzeyinde
identifikasyon
 Vitek MS 3 yanlış ID, 12 ID yok
(%1).
 Bruker MS 6 yanlış ID, 9 ID yok
(%1).
Yanlışlar:
Fenotipik
Vitek MS
Bruker Microflex
S.boydii
E.coli
E.coli
Sphingomonas paucimabilis
A.baumannii
ID yok
S.pneumoniae
S.pneumoniae
S.salivarius
C.jeikeum
ID yok
C.mucifaciens
Brevundimonas diminuta
ID yok
ID yok
Leuconostoc mesenteroides
ID yok
S.pettenkoferi
Aeromonas sobria
A.hydrophilia/caviae/sobria
ID yok
ID yok
Dermobacter hominis
Corynebacterium amycolatum
C.albicans
C.albicans
C.tropicalis
P.aeruginosa
P.gingivalis
P.aeruginosa
Bruker vs VITEK MS
 Yanlış sonuçlar ya sistemin limitasyonlarına ya
da izolatın veritabanında bulunmaması veya
yetersiz sayıda veriye bağlı
 Rutin bakteri ve maya izolatları için her iki
sistem de iyi analitik performans, anlamlı fark
bulunamamıştır.
 Birbirine yakın (S.mitis/oralis) veya bakteri
kompleksinde yer alan (A.baumannii complex,
E.cloacae complex) izolatlarda Vitek MS
garantici, Bruker cesur.
MALDI TOF ile Mikobakteri ID
 Mikobakteri identifikasyonu zor




(fenotipik zahmetli, yetersiz;
moleküler zahmetli, pahalı)
Direk transfer metodu veya basit
ekstraksiyon mikobakteriler için
yetersiz
Silika boncukların kullanıldığı yeni
inaktivasyon ve hazırlama
prosedürü optimizasyonu ile
kaliteli spektrum
Mikobakteriler LJ veya direk MGIT
şişesinden
Ortalama 90 dakika sonra ID
Bruker MS – Mikobakteri ID
 56 mikobakteri izolatı rutin kullanılan
veritabanı ile yeni preparasyon metodu:
 Tümünde iyi spektra
 15’inde (%27) cins düzeyinde güvenilir (skor >1,7)
sonuç
 11’inde (%19) doğru isimlendirmesine rağmen
güvenilir olmayan sonuç (skor<1,7)
 26 (%46) suş doğru tanımlanmış
 Skor > 1,7 olan 15 suşun 13’ü doğru (%87)
 1 M.tuberculosis – Arthrobacter castelli
 1 M.scrofloceum – M.fortuitum
Bruker MS – Mikobakteri ID
 56 mikobakteri yeni preparasyon ve yeni
mikobakteri veritabanı ile:
 13 (%23) tür düzeyinde doğru
 20 (%36) cins düzeyinde doğru
 12 (%22) doğru isimlendirmesine rağmen güvenilir
olmayan sonuç (skor<1,7)
 44 (%79) suş doğru tanımlanmış.
 Skor >2 olan 13 suşun 12’si (%92) doğru
 1 M.fortuitum/M.senegalense – M.farcinogenes
 Skor >1,7 olan 33 suşun 31’i (%94) doğru
 1 M.fortuitum/M.senegalense – M.farcinogenes
 1 M.gordonae – M.senegalense
Bruker MS yeni Mikobakteri Database
 Doğru tanımlama
 %46’dan %79’a
 Tür düzeyinde güvenilir sonuç
 %0’dan %23’e
 1,7 skorun üstündeki değerlerde
doğru tanımlama
 %87’den %94’e
MALDI ile Küf Mantarlarının ID
 Küf ve multisellüler mantarların
identifikasyonu klinik mikrobiyoloji,
hijyen ve gıda laboratuarları için
zorlu bir süreçtir.
 Germinasyon süreci ve spor
formasyonu dengeli bir fizyolojik
durum sağlamayı zorlaştırdığından
MALDI ile identifikasyon bakteri ve
mayalara göre güvenilir değil.
 Penicillium, Aspergillus, Fusarium vb
kendi preparasyon metodları (bead
beating) ve kendi veritabanları ile
%92-98 identifikasyon
Croxatto A, Prod’hom G, Greub G. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic
microbiology. FEMS Microbiol Rev 36(2012), 380-407
MALDI ile Küf Mantarlarının ID
 Standardizasyon ve homojen
spektrum için rotatorde sıvı SD
besiyerinde inkübasyon
 Bu verilerle yeni filamantöz
mantar kütüphanesi (henüz
denemedik, yayınlanmış veri yok)
>110 tür
>40 cins
MALDI TOF ile Direkt örnekten ID
 Kan, idrar, BOS, plevral sıvı, periton sıvısı,
sinoviyal sıvı
 En önemli limitasyon örnekteki
mikroorganizma sayısı
 MALDI TOF ile yeterli spektrum elde etmek
için solüsyonda min. 5-10 x 106 hücre/ml
olması gerekiyor.
 Kan kültür şişeleri sinyal verdiğinde 106-108
CFU/ml
*Evason DJ, Claydon MA, Gordon DB. Exploring the limits of bacterial identification by intact cell
mass spectrometry. J Am Soc Mass Spectrom 2001, 12:49-54.
Kan kültürleri ve MALDI TOF-MS
 Sepsis, endokardit, kan dolaşımı enfeksiyon
mortalite-morbidite yüksek
 Kan kültürleri için hızlı identifikasyon ve
antibiyogram hayat kurtarıcı olabilir.
 MALDI ile pozitif sinyal veren kan kültür
şişelerinden direk çalışma
 Problem: şişelerde nonmikrobiyal hücreler,
serum proteinleri, sıvı kültür besinlerinin
uzaklaştırılması
Kan kültürleri ve MALDI TOF-MS
 Ön hazırlık (santrifüj, lizis, yıkama) ve
ekstraksiyon metoduyla %80’in üzerinde doğru
identifikasyon
 Sinyalden <1 saat sonra identifikasyon
 Çalışmalarda %62-89 doğru identifikasyon
 Kapsüllü bakteriler, kömür içeren şişeler, az
sayıda üreme identifikasyonu zorlaştıran
faktörler
 Hangi etken olduğunu bilerek daha efektif
antibiyogram şansı
MALDI ile antibiyotik direnci mümkün mü?
 Dirençli mikroorganizmaların
saptanabilmesi için değişik çalışmalar
 MSSA-MRSA ayrımı
 Flukonazole dirençli C.albicans suşlarında farklı
proteomik profil değişiklikleri
 Antibiyotik tedavisine verilen metabolik cevap
 Ampisilin – Beta laktamaz
 Meropenem - Karbapenemaz
MALDI TOF-MS ile direnç saptama
ß-laktamazlar için fonksiyonel bir yöntem?
ß-laktam halkasının ß-laktamazlar ile yıkımı
+ 18 Da
- 44 Da
Bu MALDI-TOF MS ile monitorize edilebilir mi?
19
[Mhydr.+2Na]+
[M+2Na]+
[Mhydr.+Na]+
[M+Na]+
[Mhydr.+H]+
Intens. [a.u.]
[M+H]+
[Mhydr.-CO2+H]+
Ampisilin – E.coli
3000
2500
E. Coli /
Amp yıkan suş
2000
1500
1000
Intens. [a.u.]
500
0
6000
4000
E. Coli /DH5a
2000
0
320
330
340
350
360
370
380
390
400
410
420
m/z
20
Teşekkürler…
Bruker Microflex – BioTyper 3,0
VITEK MS - Myla