S6. Sıçanlarda Lokal Midkin Tedavisinin Yara İyileşmesine Etkisi
Transkript
S6. Sıçanlarda Lokal Midkin Tedavisinin Yara İyileşmesine Etkisi
SIÇANLARDA LOKAL MİDKİN TEDAVİSİNİN YARA İYİLEŞMESİNE ETKİSİ Anıl Alpsoy, Sema Atasever, Kaan İlter, Ece Özbeser, Arınç Öztürk Danışmanlar: Doç. Dr. Nuray Yazıhan, Prof. Dr. Nimet Ünay Gündoğan ÖZET: Yara iyileşmesi, hasarlanmadan itibaren başlayıp, aylar hatta yıllar süren bir dizi karmaşık olay dizisinden oluşur. Normal iyileşme süreci hemostaz, enflamatuar, proliferatif ve yeniden yapılanma dönemlerinden oluşur. Enflamatuar aracı moleküller ve büyüme faktörlerinin bu basamaklarda yer aldığı bilinmektedir. Bu çalışmada lokal midkin uygulamasının sıçan derilerinde oluşturulan tam kat doku yaralanmasında etkisinin değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Yetişkin erkek Wistar sıçanlar kontrol (n=7/grup) ve midkin tedavi edilmiş (n=7/grup) olmak üzere 2 gruba ayrılmıştır. Kontrol grubuna saf su s.c. enjekte edilmiştir. Midkin tedavisi deney grup prosedürüne uygun olarak 10 ng s.c. günaşırı uygulanmıştır. Deney sonunda anestezi altında yara bölgesinden alınan doku örnekleri proenflamatuar sitokinler (TNF-α, IL-6), apoptosis (caspase-3 aktivitesi) ve vaskularizasyon (VEGF düzeyi) açısından değerlendirilmiştir. Lokal midkin tedavisi yara yileşmesini hızlandırmış, özellikle 7. günde enflamatuar cevabı belirgin olarak azaltmıştır. Midkin uygulanan grupta VEGF düzeyi kontrole göre yüksek bulunmuştur. Midkin uygulaması apoptosisi azaltmıştır. Yara iyileşmesindeki olumlu bulgularımızın yanı sıra midkin uygulanan alanda kıl uzaması hızlanmış ve yara alanında daha az iz, daha sağlıklı deri ve kıllar gözlenmiştir. Çalışmamızın sonuçları lokal midkin uygulamasının yara iyileşmesinde etkin yeni bir tedavi seçeneği olabileceğini göstemektedir. Bunun yanı sıra kıl gelişimi üzerindeki etkilerini değerlendirmek üzere ileri çalışmalar yapılarak kellik gibi saç gelişim bozukluklarında umut verici sonuçlar alınabileceği düşünülmektedir. Anahtar Kelimeler: Midkin, yara iyileşmesi, enflamasyon, apoptosis, VEGF GİRİŞ: Yara, normal anatomik yapı ve fonksiyonel bütünlüğün bozulmasıdır. Yaralanmayı takiben dokuda fonksiyonların korunmasına ve kaybedilen fonksiyonların geri dönüşümünü sağlamaya yönelik mekanizmalar aktive olur. Deride yaralanma; inflamatuar hücre infiltrasyonu, hücre proliferasyonu ile yeni doku oluşumu, matriks ve dokunun yeniden şekillenmesini içeren bir dizi olayı başlatır. Bu süreç, yaralanmış bölgede kısmi yenilenmeye neden olur. Tamir süreci, yaralanmayı takiben salınımları artan çeşitli büyüme faktörleri, sitokinler ve düşük molekül ağırlıklı maddeler tarafından başlatılır. Son yıllarda yapılan çalışmalarda yara iyileşmesi sürecinin hücresel ve moleküler temeli açıklanmaya çalışılmıştır. Normal yara iyileşmesinde, tedavi edici uygun yöntemin planlanmasında ve geliştirilmesinde klinik, hücresel ve diğer faktörlerin etkileşiminin değerlendirilmesi önem taşır. Bu kapsamda farklı tedavi yöntemleri denenmekte, iyileşme sürecinin hızlanması, aşırı enflamasyon ve enfeksiyonun önlenmesi, iyileşme sürecini takiben sekel kalmasını engellemeye yönelik yeni tedavi arayışları devam etmektedir (1,2) Yara iyileşmesi, klinik olarak yaralı deri bölgesindeki kapanmasının tamamlanması olarak tanımlanır. Parankimal hücrelerin, ekstrasellüler matriksin, kan hücrelerinin ve çeşitli çözünebilir mediatörlerin katıldığı dinamik ve interaktif bir süreçtir. Hemostaz, enflamasyon hücresel proliferasyon, matriks sentezi ve yeniden şekillenme, anjiojenesis ve granülasyon dokusu oluşumu safhalarını içerir. Yara iyileşmesi sürecinde aktive olan enflamasyonun sınırlanması yaranın prognosu ve iyileşme süreci açısından da önem taşır. TNF-alfa ekspresyonunda artışın yara bölgesinde kollajen sentezini inhibe ettiği gösterilmiştir (3). Midkin; çoğu hücrede büyüme, proliferasyon, migrasyon ve yaşam sürecini kontrol eden bir moleküldür. Fetal dönemde organogenezde rolü olduğu bilinen midkin ekspresyonu yetişkin dönemde pek çok organda yapılmaya devam edilmektedir. pek çok hastalığın oluşum ve iyileşme sürecinde yer almaktadır (4, 5). Midkin hücrelerde anti-apoptotik etkisi bilinen ve mitojenik aktivite gösteren, hücre farklılaşmasında rol alan bir büyüme faktörüdür. Midkin, farklı dokularda onarımı ve yeni hücrelerin gelişimini kontrol altında tutmakta ve nötrofillerin hasarlı bölgeye göçüne neden olmaktadır. Erken dönemde enflamasyonu arttırıyor gibi görünmesine rağmen enflamatuar ve immun yanıtı düzenleyici rol oynamaktadır (5). Ayrıca midkin, ekstraselüler matriks moleküllerinin sentezini artırmakta ve hücre iskeletini oluşturan temel yapıların yeniden oluşumunu, hücrelerin migrasyonunu sağlamaktadır (6,7) . Midkinin patojenlere karşı koruyucu ve antibiyotik aktiviteye sahip olduğu bildirilmiştir (8). Midkin endotel fonksiyonları ve yeni damar oluşumunda da önemlidir. Yang ve ark (2008) midkinin anjiogenezi uyaran genler arasında tanımlamışlardır (9). Farklı hastalık modellerinde midkinin hücre proliferasyonunun arttırarak rejenerasyon sürecini hızlandırdığı gösterilmiştir (6). Deride midkinin epidermis ve kıl follikülleri ve ter bezleri gibi dermal eklerde eksprese edildiği gösterilmiştir. Subdermal konnektif dokuda bulunan mast hücrelerinde midkin sekresyonu ve depolanması olmaktadır. Yanıkları takiben subdermal konnektif dokuda midkin depolanması artmakta, midkin pozitif hücre migrasyonu olmaktadır. Yanık sonrası iyileşmeyi takiben yaralanmış bölgede midkin düzeyi de kademeli olarak düşmektedir. Bu durum midkinin deri fonksiyonunun sürdürülmesi ve yaralanmalarında rolü olabileceğini düşündürmektedir (10). Midkin uygulamasının deri yara iyileşmesi modelinde etkilerinin değerlendirildiği bir çalışma henüz bulunmamaktadır. Bu çalışmada sıçanlarda deride yara modeli oluşturularak midkin uygulanacak deri iyileşme sürecine etkisi histolojik olarak ve buna ek olarak yara bölgesindeki apoptosis ve enflamatuar sitokinlerdeki değişim ile değerlendirilmiştir. Bu çalışmada proliferatif ve antiapoptotik etkisi bilinen midkinin sıçanlarda oluşturulacak yara modelinde apoptotik sürece (caspase-3 düzeyi), anjiogenezde önemli rolü olan vasküler endotelial büyüme faktörü (VEGF) ve proenflamatuar sitokinlerden TNF-α ve IL-6 düzeylerindeki değişime etkisinin belirlenmesi amaçlanmıştır. GEREÇ VE YÖNTEM: Çalışma Başkent Üniversitesi, Deney Hayvanları Üretim ve Araştırma Merkezi’nde gerekli etik onay alındıktan sonra gerçekleştirilmiştir. Çalışma Başkent Üniversitesi Araştırma Fonunca desteklenmiştir (Proje no: DA12/02). Çalışmada 28 adet ortalama 250-300 gram ağırlıklarında, hemen hemen birbirine yakın ağırlıklarda erkek Spraque-Dawley sıçanlar kullanılmıştır. Sıçanlar anestezi altında (ketamin HCL 60 mg/kg, Xylazine 10 mg/kg) ile traş edilip kıl ve tüylerden uzaklaştırılmıştır. Traş işlemi sonrası bölge betadin ile dezenfekte edilip 4 mm’lik steril punch biyopsi kitiyle, bir karenin köşelerinden 4 adet düzgün daire biçiminde deri biyopsileri alınmıştır. Sıçanlar randomize olarak kontrol ve midkin ile tedavi edilenler olmak üzere 2 gruba ayrılmıştır (n=14). Her iki grupta yer alan hayvanların yarısı yara oluşumunun 7. gününde yarısı ise 14. gününde anestezi altında deney sonlandırılarak doku örnekleri değerlendirilmeye alınmıştır (n=7). Kontrol grubuna steril su, midkin tedavi grubuna ise 10 ng/kg midkin 4 yaranın orta bölgesine subkutan enjekte edilmiştir. Yara oluşumunun ve tedavi sürecinin her gün fotoğrafları çekilerek takipleri yapılmıştır. Belirlenen takip süreleri bittikten sonra, caspase-3, midkin, VEGF, TNF-α ve IL-6 düzeyleri belirlenmiştir. Apoptosis değerlendirilmesi: Deri örneklerinde apoptosis değerlendirilmesi caspase-3 aktivitesi ölçümüyle yapılmıştır. Doku protein düzeyi Bradford yöntemi ile ölçülerek; 100 µg protein içeren doku örneği, caspase-3 düzeyi için değerlendirilmiştir. Deney sonunda doku örnekleri assay tamponu ile lizize uğratılmıştır (50 mM HEPES, pH 7.4, 100 mM NaCl, % 0.1 CHAPS, 10 mM DTT, 2 mM EDTA, 2 mM EGTA, %0.1Triton X-100). Caspase-3 florimetrik ölçüm kiti asetil AspGlu-Val-Asp 7-amido-4-metilkumarinin (Ac-DEVD-AMC) Caspase-3 ile hidrolize olmasına dayanır. AMC nin ekzitasyon emisyon dalga boyları 360 nm ve 460 nm dir. AMC nin farklı konsantrasyonlarının değerlendirilmesiyle elde edilen kalibrasyon eğrisi kullanılarak ortama salınan AMC miktarı öçülerek caspase-3 düzeyi belirlenmektedir. Doku örneklerinden midkin, VEGF, TNF-α ve IL-6 düzeylerinin ölçümü VEGF, TNF-α ve IL-6 düzeyleri ELISA yöntemi ile değerlendirilmiştir. Doku örnekleri tartılarak proteaz inhibitörü içeren (aprotinin, leupeptin, pepstatin, PMSF- her birinden 2 mg/ml) birj 150 lizis solüsyonu (tris 1 M, EDTA 0.5 M, NaCl 5M, % 10 brij 96, % 10 NP40 suda) içinde homojenize edilmiştir (Powergen homojenizatör 125, Fisher Scientific). Ölçümler yapılıncaya kadar homojenatlar –80 ° C de dondurucuda saklanmıştır. TNF-α, IL-6, VEGF (R&D ELISA kiti) ve midkin (Peprotech-duo set-development kit) ölçümü ELISA yöntemiyle kit prosedürlerine uygun olarak yapılmıştır. İstatiksel analiz: Değişkenlerin normal dağılıma uyumu Shapiro-Wilk testi ile kontrol edilmiştir. Grup varyanslarının homojenliği Levene’s testi ile incelenmiştir. Caspase 3 değişkeni haricinde tüm gruplarda parametrik testlerin ön şartlarının yerine geldiği görülmüştür. Caspase 3 değişkeni bakımından parametrik testlerin ön şartları yerine gelmediğinden söz konusu değişkene logaritmik transformasyon uygulanmıştır. Grup ortalamalarının karşılaştırılmasında Faktöriyel düzende varyans analizi ve ardından çoklu karşılaştırma testlerinden Bonferroni testi kullanılmıştır. p<0.01 düzeyi istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir. Veri analizi SPSS 17.0 (SPSS Ver. 17.0 Chicago IL, USA) istatistik yazılımı ile gerçekleştirilmiştir. BULGULAR Deney süresinde ve deney sonunda hiçbir hayvanda yara bölgesinde enfeksiyon veya oluşturlan işleme bağlı ölüm gözlenmemiştir. Yara oluşturulmuş hayvanlar gün aşırı izlenmiştir. Midkin tedavisi uygulanmış sıçanlarda 3., 7. ve 14 günlerde yarada iyileşme daha hızlı gerçekleşmiş ve tüylerde uzama daha belirgin gözlenmiştir. Midkin uygulanan grupta 14. günde tüyler enjeksiyon alanında daha belirgin olmak üzere diğer alanlarda da hemen hemen normal haline dönmüştür (şekil 1). 3.gün 7.gün 14.gün Şekil 1. Midkin tedavisi uygulanmış grupta 3., 7. Ve 14 günlerde yara bölgesinin görüntüsü Kontrol grubunda 3 ve 7. günlerinde traş alanında belirgin enflamatuar reaksiyonlar izlenmiş, hiperemik ve tahriş alanları gözlenmiştir. 14. günde hala yara izleri, kabuklaşma devam etmektedir. Yara alanında tüyler düzensiz uzamış, ve traş alanı hala çok belirgin olarak diğer kısımdan farklıdır (Şekil 2) 3.gün 7.gün 14.gün Şekil 2. Tedavi uygulanmamış (Kontrol) grubunun 3., 7. ve 14 günlerde yara bölgesinin görüntüsü Sıçanlarda deri örneklerinde sitokin, midkin ve VEGF düzeyleri deney öncesi, 7. gün ve 14. günlerde ELİSA yöntemiyle değerlendirilmiştir. Deney öncesinde her iki grupta yer alan sıçan deri örneklerinde midkin düzeyinde fark gözlenmezken 14. günde deri midkin düzeylerinde midkin uygulanmayan grupta belirgin azalma gözlenmiştir (Şekil 3). Şekil 3. Sıçan derisinde midkin düzeylerinin değerlendirilmesi. Sonuçlar ortalama±SEM olarak verilmiştir. * kontrol grubu ile midkin tedavisi uygulananlar arasındaki p<0.01 istatiksel anlamlılığı ifade etmektedir. Yara iyileşmesi süresince deri dokusundaki enflamatuar süreç, proenflamatuar sitokinlerden TNF-α ve IL-6 düzey değişimlerinin ölçümüyle değerlendirilmiştir. Deney öncesinde her iki sitokinin düzeyinde gruplar arasında fark bulunmazken 7. Günde her iki grupta da TNF-α ve IL-6 düzeyleri artmıştır. Bu artış midkin tedavisi almayan grupta 14. Günde de devam etmiştir. Midkin uygulaması yara oluşturulmasını takiben 7. Gündeki enflamatuar süreci kontrol grubuna göre anlamlı baskılamıştır (Şekil 4A-B) A B Şekil 4 A-B. Midkin uygulamasının yara dokusunda TNF-α ve IL-6 düzeylerine etkisi. Sonuçlar ortalama±SEM olarak verilmiştir. * kontrol grubu ile midkin tedavisi uygulananlar arasındaki p<0.001 istatiksel anlamlılığı ifade etmektedir. Yara iyileşmesi sürecince midkin uygulamasının apoptotik sürece etkisi caspase-3 düzey ölçümü ile belirlenmiştir. Caspase-3 düzeyi enflamasyonun artmış olduğu 7. Günde tedavi almamış grupta daha belirgin olmak üzere deney öncesine göre artmış bulunmuştur. Apoptoz 14. Günde kontrol grubunda artmış şekilde devam ederken midkin uygulanan grupta azalmıştır (p<0.001, şekil 5) Şekil 5. Midkin uygulamasının yara dokusunda caspase-3 düzeyine etkisi. Sonuçlar ortalama±SEM olarak verilmiştir. kontrol grubu ile midkin tedavisi uygulananlar arasındaki p<0.001 istatiksel anlamlılığı ifade etmektedir. Yara iyileşmesi sürecince dokudaki vaskülarizasyonun belirteci olarak vasküler büyüme faktör (VEGF) düzeyi ölçülmüştür. Çalışmamız sonucunda midkin uygulanan grupta belirgin olmak üzere 7. Günde VEGF düzeyleri artmıştır. Bu artış 14. Günde de devam etmiştir. Midkin uygulaması kontrol grubuna göre VEGF düzeyini anlamlı arttırmıştır (p< 0.001, Şekil 6) Şekil 6. Midkin uygulamasının yara dokusunda VEGF düzeyine etkisi. Sonuçlar ortalama±SEM olarak verilmiştir. * kontrol grubu ile midkin tedavisi uygulananlar arasındaki p<0.001 istatiksel anlamlılığı ifade etmektedir. TARTIŞMA VE SONUÇ: Bu çalışmada daha önceden proliferatif, antiapoptotik etkisi, doku rejenerasyonunda ve gelişiminde önemli rol aldığı bilinen midkinin deride yara iyileşmesi sürecindeki etkisi değerlendirilmiştir. Sıçanlarda deride doku kaybıyla giden açık yara modeli oluşturularak deri iyileşme sürecine etkisi histolojik olarak ve buna ek olarak yara bölgesindeki iyileşme süreci apoptosis, vaskulogenez ve enflamatuar sitokinlerdeki değişim ile değerlendirilmiştir. Midkin tedavisi uygulanan ve uygulanmayan hayvanlarda deride oluşturulan yara modelinde apoptotik süreç caspase-3 düzeyi, anjiogenez VEGF düzeyi ve pro-enflamatuar sitokinlerden TNF-α ve IL-6 düzeylerindeki değişime etkisi belirlenmiştir. Midkin uygulanması sıçanlarda yara iyileşme sürecini belirgin hızlandırmıştır. Midkin uygulaması 7 günde belirgin artan enflamatuar süreci de baskılamıştır. Tedavi edilen grupta VEGF düzeyinin de artttığı da gözlenmektedir. Enflamasyon organizmada enfeksiyon ve fiziksel ya da kimyasal etmenlerin neden olduğu doku hasarına karşı oluşan cevaptır. Aynı zamanda enflamasyon, hasarlayıcı etkeni ve ürünlerini ortadan kaldırmak, zararlı faktörü oluştuğu yerde sınırlı tutmak ve kontrol sağlandıktan sonra hasarlanan dokuların tamirini ve yenilenmesini sağlamak amacıyla gerçekleşir. Yara bölgesinde enflamasyonun artışının iki yönlü etkisi mevcuttur. Artmış enflamasyon ile dokuda hücre ve molekül infiltrasyonun artışı yaranın iyileşme sürecini olumsuz etkilemesinin yanısıra aynı zamanda yara bölgesine immun hücre migrasyonunu arttırarak enfeksiyon gelişimini engelleyici etkisi de mevcuttur. Fagositer hücreler bakterileri ve ölü hücreleri yok eder, trombositler dokuyu onarmak için kapillerlerden dışarı çıkar. Yara iyileşmesi sürecinde her faz farklı günlerde devreye girer (1,2). Bu nedenle yara iyileşme sürecinin farklı fazlarının gerek enflamatuar süreç gerekse proliferasyon açısından ayrı çalışmamızda enflamasyonun ayrı değerlendirilmesi artmasının beklendiği gerekmektedir. 7. gün ve Bu 14. nedenle günlerde değerlendirmeler yapılmıştır Dokularda midkin düzeyinin enflamasyon, doku tamiri ve neoplastik transformasyon durumlarında arttığı gösterilmiştir (5,11). İmmün hücrelerde midkin yapımı mevcut olup hücrelerin bakteriyel ürünlere cevaplarında artış göstermekte ve immun hücre cevabında önemli rol almaktadır (12). Nötrofil ve makrofaj göçünde, IL-8 indüksiyonunda, transforme edici büyüme faktörü(TGF), monosit kemotaktik protein-1 (MCP-1) ve makrofaj enflamatuar protein 2(MIP-2) ekspresyonunda katkısı olduğu belirlenmiş olup bakterisidal ve fungisidal özelliklerinin olduğu gösterilmiştir (8,13,14). Çalışmamızda midkin uygulanması immunmodulatuar etki göstererek yara iyleşme sürecinde enflamatuar cevabı düzenlemiştir. Yara iyileşmesi sürecinde yeniden damar yapısının oluşması, hasarlanmış doku alanının beslenmesi açısından çok önemlidir. Anjiogenez enflamasyonla yakın ilişkilidir (15). Yara bölgesinde monosit/makrofaj birikmesi kapiller düzenleme ve kollateral oluşumu için anahtar oyunculardandır. Bu enflamatuar hücreler MCP-1, TNF-α, bFGF, ve MMPs gibi bir seri anjiogenik sitokin ve büyüme faktörü oluşumuna aracılık ederler (16). Myokardial enfarktüsün midkin ekspresyonu azalmış farelerde iyileşme sürecinin bozulduğu ekzojen midkin uygulamasının ventriküler yeniden yapılanmayı düzelttiği, anjiogenezi uyardığı gösterilmiştir. Aynı çalışmada akut ve subakut enflamatuar dönemde midkin ekspresyon paterni ve anjiojenik uyarımda enflamasyonla paralel bulunmuştur (17). Bunun yanısıra midkinin anjiogenik genler arasında yer alması nedeniyle VEGF ekspresyonundaki artış doğrudan bir etki de olabilir (9). Midkinin invitro kollajen yapımını arttırdığı, kemik yaralanmalarında ve korneal ülserasyonlarda koruyucu olduğu ve iyileşmeye yardımcı olduğu gösterilmiştir (18,19,20).Bu durum midkinin yara iyileşme sürecindeki etkiyle paralel bir sonuçtur. Normal yara iyileşmesi süreci her zaman beklenildiği gibi olmamakta skar doku gelişimi, iyileşen bölgenin eski özelliklerine kavuşamaması gibi sıkıntılarla sonuçlanabilmektedir. Bunun yansıra diabet gibi bazı patolojik durumlarda yara iyileşme süreci uzamakta, yaralanan dokuda enfeksiyon gelişebilmekte ve ciddi bir sorun haline gelebilmektedir. Yara iyileşmesinde prognozun düzeltilmesine yönelik yeni tedavi arayışlarına yönelik çalışmalar devam etmektedir. Daha kısa sürede ve daha az sekelle sonuçlanan yara tedavisi klinikte önem taşımaktadır. Çalışmanın sonuçları ileride yara iyileşmesinde kullanılabilecek umut vaad eden yeni bir tedavi yöntemi geliştirmeye yardımcı olabilecektir. Bunun yanısıra midkin uygulanan grupta kıl uzamasının hızlanması ve daha düzenli olması kıl folliküllerinin kayıpları veya disfonksiyonları ile giden patolojilerde de uygulanabilecek bir tedavi olduğunu düşündürmektedir. Çalışmamız bulguları midkin uygulamasının gerek yara iyileşmesi sürecinde gerekse kellik tedavisi gibi sorunlarda kullanımı ile ilgili daha sonra yapılacak çalışmalara altyapı oluşturacak ön bulguları da içermektedir. KAYNAKLAR 1. Mutsaers SE, Bishop JE, McGrouther G et al. Mechanisms of tissue repair: from wound healing to fibrosis. Int J Biochem Cell Biol. 1997(1):5-17. 2. Theoret CL. The pathophysiology of wound repair. Vet Clin North Am Equine Pract. 2005; 21(1):1-13 3. Mahdavian Delavary B, van der Veer WM, van Egmond M et al. Macrophages in skin injury and repair. Immunobiology. 2011;216(7):753-62 4. Kaplan F, Comber J, Sladek R et al. The growth factor midkine is modulated by both glucocorticoid and retinoid in fetal lung development. Am J Respir Cell Mol Biol. 2003;28(1):33-41. 5. Muramatsu T. Midkine, a heparin-binding cytokine with multiple roles in development, repair and diseases. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2010;86(4):410-25 6. Kadomatsu K. The midkine family in cancer, inflammation and neural development. Nagoya J Med Sci. 2005;67(3-4):71-82. 7. Takada T, Toriyama K, Muramatsu H et al. Midkine, a retinoic acid-inducible heparin-binding cytokine in inflammatory responses: chemotactic activity to neutrophils and association with inflammatory synovitis. J Biochem. 1997;122(2):453-8. 8. Svensson SL, Pasupuleti M, Walse B et al. Midkine and pleiotrophin have bactericidal properties: preserved antibacterial activity in a family of heparinbinding growth factors during evolution. J Biol Chem. 2010;285(21):16105-15. 9. Yang R, Amir J, Liu H et al. Mechanical strain activates a program of genes functionally involved in paracrine signaling of angiogenesis. Physiol Genomics. 2008 12;36(1):1-14. 10. Iwashita N, Muramatsu H, Toriyama K et al. Expression of midkine in normal and burn sites of rat skin. Burns. 1999;25(2):119-24. 11. Yazihan N; Kacar Kocak M, Akcil IE, Midkine in inflammation and inflammatory diseases. Kitap adı: Midkine: From Embryogenesis to Pathogenesis and Therapy, Editors: Mine Erguven, Takashi Muramatsu and Ayhan Bilir Springer 2012 Basımda 12. Yazihan N, Karakurt O, Ataoglu H. Erythropoietin reduces lipopolysaccharideinduced cell Damage and midkine secretion in U937 human histiocytic lymphoma cells. Adv Ther. 2008;25(5):502-14. 13. Weckbach LT, Muramatsu T, Walzog B. Midkine in inflammation. ScientificWorldJournal. 2011;11:2491-505 14. Nordin SL, Sonesson A, Malmsten M et al. The epithelium-produced growth factor midkine has fungicidal properties. J Antimicrob Chemother. 2012 Apr 25. [Epub ahead of print] 15. Arras M, Ito WD, Scholz D et al. Monocyte activation in angiogenesis and collateral growth in the rabbit hindlimb. J Clin Invest 1998: 101: 40–50, 16. Gerber HP, Condorelli F, Park J et al. Differential transcriptional regulation of the two vascular endothelial growth factor receptor genes. Flt-1, but not Flk-1/KDR, is up-regulated by hypoxia. J Biol Chem. 1997;272(38):23659-67. 17. Takenaka H, Horiba M, Ishiguro H et al. Midkine prevents ventricular remodeling and improves long-term survival after myocardial infarction. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2009;296(2):H462-9. 18. Yamada H, Inazumi T, Tajima S et al. Stimulation of collagen expression and glycosaminoglycan synthesis by midkine in human skin fibroblasts. Arch Dermatol Res. 1997;289(7):429-33. 19. Ohta S, Muramatsu H, Senda T et al. Midkine is expressed during repair of bone fracture and promotes chondrogenesis. J Bone Miner Res. 1999;14(7):1132-44. 20. Marrazzo G, Bellner L, Halilovic A et al. The role of neutrophils in corneal wound healing in HO-2 null mice. PLoS One. 2011;6(6):e21180.