deneysel diyabetik kardiyomiyopatide hücre içi serbest iyon

Transkript

i
TÜRK YE CUMHUR YET
ANKARA ÜN VERS TES
SA LIK B L MLER ENST TÜSÜ
DENEYSEL D YABET K KARD YOM YOPAT DE
HÜCRE Ç SERBEST YON DER
M
Murat AYAZ
B YOF Z K ANAB L MDALI
DOKTORA TEZ
DANI MAN
Prof. Dr. Belma TURAN
Bu tez, Ankara Üniversitesi Bilimsel Ara tırma Projeleri müdürlü ü 2003-08-09-098
numaralı proje ile desteklenmi tir.
2004 – ANKARA
ii
Ç NDEK LER
Kabul ve Onay
çindekiler
ii
iii
Önsöz
vi
Simgeler ve Kısaltmalar
vii
ekiller
ix
Çizelgeler
x
1.G R
1.1.Kalp Kası ve Hücre Zarının Yapısı
1.2. Kalp Kasındaki Elektriksel Olaylar
1.2.1. Ventrikül Aksiyon Potansiyeli
1.2.2. Ventriküler Aksiyon Potansiyelinde Rol Alan yonik Akımlar
1.2.3. Uyarılma-Kasılma Çiftlenimi ve [Ca2+]i Düzenlenmesi
1.2.4. Hücre içi serbest Çinko Düzenlenmesi
1.3. Deneysel Diyabet
1.3.1. Deneysel Diyabetik Kardiyomiyopati
1.4. Selenyum ve Biyolojik Sistemlerdeki Önemi
1.4.1. Biyolojik Sistemlerdeki Selenyumun Özellikleri
1.4.2. Selenyum ve Kardiyovasküler Hastalıklar
1.4.3. Selenyum ve Diyabet li kisi
1.5. Zn2+ ve Diyabet li kisi
1.6. Çalı manın Amacı
1
2
2
3
6
7
8
9
10
10
12
13
14
16
2. YÖNTEM VE GEREÇLER
2.1. Deneysel Diyabet Modeli ve Deney Gruplarının Olu turulması
2.2. Papiller Kas Kasılması ve Aksiyon Potansiyelinin Kaydedilmesi
2.3. Kardiyomiyositlerin izolasyonu
2.4. yon Kanal Akımlarının Kaydedilmesi
2.4.1. Potasyum kanal akımlarının kaydedilmesi
2.4.2. L tipi Ca2+ kanal akımlarının kayıt edilmesi
2.5. Hücre içi serbest Ca2+ ve Zn2+ spektroflorometrik olarak ölçülmesi
2.6. Biyokimyasal Ölçümler
2.6.1. Lipit perokdidasyon
2.6.2. Süperoksit Dismutaz
2.6.3. Total Glutatyon
2.6.4. Redükte Glutatyon
2.6.5. Okside Glutatyon
2.6.6. Glutatyon Redüktaz
2.6.7. Glutatyon Peroksidaz
2.6.8. Nitrik Oksit Türevleri Ölçümü
2.6.9. Metallothionein Protein Ölçümü
17
18
20
20
20
22
22
24
25
25
26
26
26
26
27
27
27
iii
2.6.10. nsülin ve Selenyum konsantrasyonlarının Tayin edilmesi
2.7. statistiksel Analizler
2.8. Kullanılan Kimyasallar
28
28
28
3. BULGULAR
3.1. Genel Bulgular
3.2 Kalbin Elektriksel Aktivitesi le lgili Bulgular
3.2.1. Papiller Kas Aksiyon Potansiyeli
3.2.2. Potasyum Akımları
3.2.3. L tipi Kalsiyum Akımları
3.3. Kalbin Mekanik Aktivitesi le lgili Bulgular
3.3.1. Papiller Kas Kasılma Sonuçları
3.4. Hücre çi Serbest yon Deri imi le lgili Bulgular
3.5. Hücre çi Serbest Zn2+Deri imi ve Metallothionein Seviyesi
3.6. Antioksidan Savunma Sistemi le lgili Bulgular
29
30
30
32
34
39
39
39
46
46
4. TARTI MA
49
5. SONUÇ VE ÖNER LER
55
ÖZET
57
SUMMARY
58
KAYNAKLAR
59
ÖZGEÇM
67
iv
ÖNSÖZ
Ankara Üniversitesi Bilimsel Projeleri destekleme fonu tarafından desteklenen bu
doktora tezinin, danı manlı ını üstlenen ve tezin her a amasında hiçbir fedakarlıktan
kaçınmayan sayın Prof. Dr. Belma Turan’a te ekkür ederim.
Tez çalı masının kalsiyum transient aksiyon potansiyeli kayıtlarının analiz edilmesi
a amasında kullanılan Excel programının geli tirilmesindeki katkılarından ötürü
sayın Prof. Dr. Ongun Onaran ve Uzm. Dr. Kemal Sayar’a te ekkür ederim.
Ayrıca, tez çalı masının biyokimyasal ölçümler kısmı için desteklerini esirgemeyen
Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı ö retim üyeleri sayın Doç.
Dr. Hakan Aydın ve Uzm. Dr. Handan Boyar’a te ekkür ederim.
Hayatımın her a amasında oldu u gibi, yine bu tez süresince de hiçbir maddi ve
manevi desteklerini esirgemeyen AYAZ ailesinin her ferdine te ekkür ederim.
Murat AYAZ
Kasım 2004
v
Bildi im iyi olan her eyi ondan
ö rendi im biricik anneannem
Ümmü Gülsüm YÜKSEL anısına…
vi
S MGELER VE KISALTMALAR
AP
Aksiyon potansiyeli
APD25
AP repolarizasyon fazının % 25’ine inmesi için gerekli süre
APD50
APD75
APD90
PT
Tepe gerim (peak tension)
TP
Tepe gerime ula ma süresi (time to peak)
RT50
Kasılmanın gev emesi fazının % 50’sine inmesi için gerekli süre
DT50
Transientlerinin geri alınım süresinin % 50’sine dü mesi için gerekli süre
GSH
ndirgenmi glutatyon
GSSG
Okside glutatyon
GR
Glutatyon redüktaz
GSHPX
Glutatyon oksidaz
NOPs
Nitrik oksit ürünleri
Se
Sodyum selenit
STZ
Streptozotocin
[Ca+2]i
Hücre içi serbest kalsiyum iyon konsantrasyonu
[Zn+2]i
Hücre içi serbest çinko iyon konsantrasyonu
[Na+1]i
Hücre içi serbest sodyum iyon konsantrasyonu
NCX
Sodyum kalsiyum de i -toku cusu
Ito
Geçici dı arı do ru potasyum iyon kanal akımı
Iss
Kararlı durum potasyum kanal akımı
IK1
çeri do rultucu potasyum kanal akımı
ICaL
L tipi kalsiyum kanal akımı
SERCA
Sarkoplazmik kalsiyum pompası
vii
EK LLER
ekil 1.1: Ventrikül aksiyon potansiyelinin evreleri ve onlara kar ılık gelen iyon
akımlar. Daire içinde yer alan rakamlar aksiyon potansiyelinin farklı fazlarını
simgelemektedir. Zar potansiyelinin bulundu u de erden daha pozitif de ere hareketi
depolarizasyon, bu noktadan dinlenim zar potansiyeline geri dönü ü ise repolarizasyon
olarak adlandırılmaktadır. Alt kısımda ventrikül AP’e olu umunda rol alan iyonik akımlar
(kısaltmalar ve detaylı bilgi için metine bakınız) (Ravens ve ark., 1996).
ekil 1.2: Ventrikül hücrelerinde Ca2+ düzenlenmesi. Çerçeve içindeki küçük ekil AP,
geçici Ca2+ de i imi (Ca2+ transient) ve kasılmanın zamansal de i imlerini göstermektedir.
Kısaltmalar; NCX, Na+/Ca2+ de i -toku u; ATP, ATPaz; PLB, fosfolamban; SR,
sarkoplazmik retikulum (Bers, 2002).
ekil 1.3: Hücre içi reaktif oksijen üretimi ve temizleme yolakları. Kullanılan kısaltmalar
hidrojen peroksit (H2O2), redükte (GSH) ve okside (GSSG) glutatyon (Droge, 2002).
ekil 2.1: Aksiyon potansiyeli ve kasılmalar için ölçülen de erlerin gösterilmesi. A) Sol
ventrikül papiller kasından kaydedilen bir aksiyon potansiyeli e risi üzerinde ölçülen
parametrelerin gösterimi. Kalın çizginin e riyi kesti i nokta tepe de eri ve Em dinlenim
potansiyeli olmak üzere, çizgiden sa a do ru repolarizasyon evresinin maksimum de erinin
%25, 50, 75 ve 90’ına dü mesi için geçen süreler gösterilmektedir. B) Sol ventrikül papiller
kasından kaydedilen bir kasılma e risi üzerinde ölçülen parametrelerin gösterimi. Kasılma
e risinin en yüksek de eri genlik, bazal seviyeden tepe de erine ula ma süresi, TP; Tepe
de erin %50’sine ula ması için geçen süre, RT50 gösterilmektedir.
ekil 2.2: Zn2+ için hücre içi minimum ve maksimum floresans oranlarının
belirlenmesi. Maksimum [Zn2+]i için ZnPt (1 µM), minimum de eri için ise TPEN (30 µM)
kullanılarak alınmı tır. Oklar kimyasalların uygulama noktalarını temsil etmek için
kullanılmı tır.
ekil 3.1: Deney gruplarına ait papiller kas aksiyon potansiyellerine ili kin sonuçlar.
Deney gruplarına ili kin kısaltmalar kontrol (kon), diyabet (DM), selenyum enjekte edilmi
diyabet (DM+Se)ve selenyum enjekte edilmi kontrol (Se) olarak kullanılmı tır. AP’ye
ili kin örnek ekiller A’da. Papiller kas AP repolarizasyon evresinin %25, 50, 75 ve 90
(APD25, APD50, APD75, APD90)’ne inme süreleri (ortalama±SEM) B’deki gibidir. *p<0.05 vs
Kon, ve #p<0.05 vs DM .
EK L 3.2: Gruplara ili kin potasyum akımları. Deney grupları için kullanılan
kısaltmalar ekil 3.1’deki gibidir. A’da gruplardan kaydedilen örnek potasyum akımları. Bu
kayıtlar için hücrelerin kapasitans de erleri Kon=103.1 pF, DM=110.3 pF ve DM + Se=
107.3’tür. B’de ise Kon, DM ve DM+Se gruplarının alınan akımların I-V grafikleri. *p<0.05
vs Kon ve #p<0.05 vs DM.
EK L 3.3: Gruplar için Ito akımlarının kinetik analizleri. . Deney grupları için
kullanılan kısaltmalar ekil 3.1’deki gibidir. Gruplardan elde edilen ortalama de erler ve
Boltzman denklemlerinin uygulanması ile çizdirilmi aktivasyon (A) ve inaktivasyon (B)
viii
e rileri. Reaktivasyon (C) e risi için üssel fonksiyon denklemine uydurulmu tur. De erler
ortalama ±SEM olarak verilmi tir *p<0.05 vs Kon
EK L 3.4: Gruplara ili kin L tipi kalsiyum akımları. Deney grupları için kullanılan
kısaltmalar ekil 3.1’deki gibidir. A’da Kon, DM ve DM+Se gruplarına ait birer örnek ICaL
kayıtları. Bu kayıtlar için hücrelerin kapasitans de erleri Kon=90.0 pF, DM=93.2 pF ve DM
+ Se= 92.4’tür. B ise zar potansiyeline göre ölçülen akım yo unluklarının ortalamasından
elde edilen de erlerin de i imini ve akım kayıtları için kullanılan voltaj protokolünü
gösteren grafik (inset). De erler ortalama±SEM ile temsil edilmi tir. *p<0.05 vs Kon
EK L 3.5: L tipi kalsiyum kanallarının kinetik incelenmesi. Deney grupları için
kullanılan kısaltmalar ekil 3.1’deki gibidir. Grupların L tipi Ca2+ kanalı kinetik
parametreleri, noktalara Boltzman denkleminin uydurulması ile elde edilen aktivasyon(A),
inaktivasyon(B). Reaktivasyon (C) e risi için üssel fonksiyon denklemine uydurulmu tur.
De erler ortalama±SEM ile temsil edilmi tir. p< 0.05 vs kon.
ekil 3.6: Kasılma parametrelerine ili kin sonuçlar. Deney grupları için kullanılan
kısaltmalar ekil 3.1’deki gibidir. A’da farklı gruplardan elektriksel uyaranla kaydedilmi
tipik sarsı (kasılma-gev eme) e rilerini, B’de ortalama kasılma kuvvetlerini, ve C’de ise
kasılma (sol) ve gev eme (sa ) fazlarına ili kin kinetik parametreler görülmektedir. Tepe
gerim (PT), tepeye çıkı süresi (TD) ve ini süresinin yarısına dü mesi için gereken
süre(RT50). De erler ortalama±sem olarak sunulmu tur. *p<0.05 vs Kon ve #p<0.05 vs DM .
ekil 3.7: Hücre içi bazal kalsiyum ve çinko deri imleri. Deney grupları için kullanılan
kısaltmalar ekil 3.1’deki gibidir. Hücre içi serbest Ca2+ ve Zn2+ ölçüm de erleri. A’da bazal
Zn2+ ölçümüne olan katkısı kaldırılmadan B’de kaldırılarak (30µM TPEN) alınan bazal
Ca2+ölçümleri. C’de bazal serbest Zn2+ de erleri. *p<0.05 vs Kon ve #p<0.05 vs DM .
ekil 3.8. Hücre içi Ca2+ transientleri. Deney grupları için kullanılan kısaltmalar ekil
3.1’deki gibidir. Bir kontrol kardiyomiyositinden uyaran etkisinde belli bir zaman boyunca
kaydedilen hücre içi Ca2+ transientleri ve hücre uyaranı olarak elektriksel alan uyarısının
uygulama biçimi A’da, B’de ise gruplardan alınan birer örnek transient traseleri
görülmektedir.
ekil 3.9: Hücre içi serbest Ca2+ transientlerinin kinetik de erlerinin 30 µM TPEN
yoklu unda ölçülen de erler. Deney grupları için kullanılan kısaltmalar ekil 3.1’deki
gibidir. Kinetik incelemede tepeye çıkı süresi (TP) (A), tepe de er (maksimum) (B) ve ini
sürecinin yarısı için geçen süre (DT50) (C). *p<0.05 vs Kon ve #p<0.05 vs DM .
ekil 3.10: Serbest Ca2+ transientlerinin kinetik de erlerinin 30 µM TPEN
varlı ında ölçüm de erleri. Deney grupları için kullanılan kısaltmalar ekil 3.1’deki
gibidir. Üstte kontrol grubu sıçanlarına ili kin örnek trase. Kinetik incelemede tepeye
çıkı süresi (TP) (A), tepe de er (maksimum) (B) ve ini sürecinin yarısı için geçen süre
(DT50) (C). *p<0.05 vs Kon ve #p<0.05 vs DM .
ix
Ç ZELGELER
Tablo 1: Hayvanların genel parametreleri
Tablo 2: Grupların bazal [Ca2+]i, [Zn]i ve metallothionein ölçüm de erleri.
Tablo 3: Antioksidan sistem parametrelerine ili kin sonuçlar
1
1. G R
1.1. Kalp Kası ve Hücre Zarının Yapısı
Kalp, damarlar ve kandan olu an dola ım sistemi dokulara oksijen ve besinleri
ta ımanın yanı sıra metabolizma artıklarını da uzakla tırmakla görevlidir. Kalp kası
lifleri, birbirine seri ba lanmı çok sayıda farklı hücreden meydana gelir. Yapı ve
fonksiyonları birbirinden farklı hücre gruplarını bir arada tutan interkale disk adı
verilen yapı, tipik bir iskelet kası gibi görünen kalp kasının daha karma ık bir yapıya
sahip oldu unu göstermektedir. Kalp uyartısının ba laması, ya da yayılması için
kalbin do rudan ba lantılı oldu u bir sinir sistemine ihtiyaç yoktur. Kalbin dı yüzü
epikardiyum ile, atriyum ve ventrikül bo luklarının iç yüzleri ise, endokardiyum ile
kaplıdır. Endokardiyumun altında kollajen yapı, elastik lifler ve rudimenter düz kas
tabakası bulunur. Kalbin esas kalınlı ını olu turan kas tabakası ise, endokardiyum ile
epikardiyum arasındaki miyokardiyumdur (Katz, 1992; Wahler, 1997).
Kalp kası hücreleri sarkolemma adı verilen bir zar ile çevrelenmi tir. skelet
kasından farklı olarak, miyokard hücrelerinin de me bölgelerinde birbirleri içine
geçmi sitoplazmik uzantılar hücrelerin birbirleriyle olan temas yüzeyini arttırırlar.
Miyofibrillerin uzun eksenlerine dik olarak yerle mi gedik kav aklar (gap juction),
dü ük elektriksel empedansları ile elektriksel uyarının doku ve hücrelerin uzunlu u
boyunca yayılımını sa lamakla kalmayıp, hücreler arası mekanik ba lantıyı ve ayrıca
büyük molekül a ırlıklı kimyasal maddelerin bir hücreden di erine geçi ini de
sa larlar. Böylece uyarı bir hücreden di erine kolaylıkla iletilince, geni kalp kütlesi
tek bir birim (fonksiyonel sinsityum) olarak davranabilmekle birlikte, tek hücre için
geçerli olan ya hep ya da hiç yasası tüm fonksiyonel birim için geçerli olmaktadır
(Katz, 1992; Wahler, 1997).
Hücre bütünlü ünün korunmasında önemli rol oynayan ve farklı kimyasal içerikli
ortamları birbirinden ayıran hücre zarları, ~1 µ F/cm2 gibi oldukça büyük bir sı aya
2
sahip olması özelli iyle, farklı elektriksel potansiyellere sahip bölgeleri birbirinden
ayırt edebilmeyi sa lar (Katz, 1992; Wahler, 1997).
1.2. Kalp Kasındaki Elektriksel Olaylar
1.2.1. Ventrikül Aksiyon Potansiyeli
Kalp kası hücrelerinin zarı, yüksek dirençli lipit çift tabakası, içinin dı ına göre
negatif mili voltlar düzeyinde dinlenim zar potansiyeli gibi bazı temel elektriksel
özelliklere sahiptir. Zarda yer alan voltaj – ba ımlı iyon kanallarının özellikleri ve
çe itlili i,
kalbe
kendili inden
çalı abilme
özelli inin
yanı
sıra
aksiyon
potansiyellerinin (AP) biçimini de belirler. Bu AP’leri sadece hücrede kasılmayı
tetiklemekle kalmaz aynı zamanda pek çok hücrenin kasılmasını koordine edip,
kalbin bir pompa gibi çalı masını da garanti altına alır (Katz, 1992).
Di er kas hücrelerine göre daha hızlı bir iletim özelli ine sahip olan
kardiyomiyositlerdeki AP’leri, yakla ık -80mV dinlemin zar potansiyelinden küçük
depolarizasyon ile ba layıp, akabinde hızlı bir depolarizasyonla zar potansiyelinin
yakla ık +30mV’a kadar çıkması ile olu ur ( ekil 1.1). Di er kalp hücreleri ile
kar ıla tırılınca
ventriküllerdeki
AP
süresi
atriyumunkinden
uzun,
His-
Purkinje’ninkinden ise kısadır. Ayrıca ventriküller AP’e özgü erken bir
repolarizasyon fazı da görülür (Katz, 1992).
Ventrikül hücrelerinin dinlenim zar potansiyelinin olu umunda da, sinir ve iskelet
kasında oldu u gibi, K+ iyonları belirleyici rol oynar. Kalp dokularında Cliletkenli inin katkısı ba ıl olarak küçüktür. Bunun yanında, zamandan ba ımsız Na+
geçirgenli inin de dinlenim zar potansiyeline küçük bir katkısı vardır. Kalp kasında,
birkaç farklı türden K+ kanalı bulunur ve dinlenim zar potansiyelini sa layan K+
iletkenlikleri ile (inward rectifier; IK1), repolarizasyonu ba latan K+ (transient
outward; Ito) iletkenlikleri birbirinden farklıdır. Ayrıca bu kanallar için de i ik alt
tipler de tanımlanmı tır (Wahler, 1997).
3
Kalp kaslarında Na+ ve K+ için konsantrasyon gradiyentleri aktif (ATP gerektiren)
elektrojenik Na+/K+ pompası ile kurulur ve sürdürülür. Di er dokularda oldu u gibi
bu pompa, dı arıya çıkardı ı her 3 Na+’a kar ılık, 2 K+’u hücre içine ta ır (Gadsby,
1984) ve böylece küçük bir akım olu turarak zarı polarize etmeye yönelik çalı ır.
Nispeten uzun bir kardiyak AP’ye nazaran, sadece yava bir repolarizasyonun
varlı ı, bir elektrojenik pompanın, repolarizasyonun ya kontrolünde, ya da
ba lamasında önemli bir rol oynayabilece ini gösteren çalı malar mevcuttur
(Gadsby, 1984; Wahler, 1997). Pek çok omurgalıda kalp hücreleri, içerideki
protonları hücre dı ına çıkaran Na+/H+ de i – toku mekanizmasına (Na+/H+exchange) sahiptir. Tıpkı Na+/Ca2+ de i
– toku
mekanizmasında (Na+/Ca2+-
exchange, NCX) oldu u gibi, bu mekanizma da Na+ gradiyentine ba lı olarak çalı ır.
Bu mekanizma hem hücre içi serbest sodyum iyon konsantrasyonu ([Na+]i), hem de
hücre içi pH’nın regülasyonunda rol oynar (Katz, 1992; Wahler, 1997; Bers, 2002).
Ventriküller için ölçülen toplam AP süresi 200 ile 400 ms arasında de i mektedir.
Ayrıca çalı malar çe itli iyon kanallarının özellikleri de i ti i zaman AP süresinin
de i ebildi ini göstermektedir (Magyar ve ark., 1992; Shimoni ve ark., 1998; Ayaz
ve ark., 2004).
1.2.2. Ventriküler Aksiyon Potansiyelinde Rol Alan yonik Akımlar
Ventrikül hücreleri için kaydedilen AP ve altında yatan iyonik mekanizma ekil
1.1’deki gibi özetlenebilir. Zar üzerinde yer alan hızlı Na+ kanallarının aktivasyonu
ile olu an hızlı Na+ akımları (INa), AP’nin ba langıcındaki hızlı depolarizasyon
fazından (faz 0) sorumludur. Bu hızlı aktive olan kanallar aynı zamanda hızlı inaktive
olma özelli ine de sahiptirler (Wahler, 1997).
Kalbin farklı bölgelerinde farklı yo unluklarda geli en ba ka bir K+ kanalı ise faz1
(hızlı repolarizasyon) den sorumlu olan geçici dı arı do ru K+-akımıdır (Ito). Bu K+kanallar depolarizasyonun hemen arkasından aktive olmakta ve geçici akımlar
olu turmaktadır.
4
ekil 1.1: Ventrikül aksiyon potansiyelinin evreleri ve onlara kar ılık gelen iyon
akımlar. Daire içinde yer alan rakamlar aksiyon potansiyelinin farklı fazlarını
simgelemektedir. Zar potansiyelinin bulundu u de erden daha pozitif de ere hareketi
depolarizasyon, bu noktadan dinlenim zar potansiyeline geri dönü ü ise repolarizasyon
olarak adlandırılmaktadır. Alt kısımda ventrikül AP’e olu umunda rol alan iyonik akımlar
(kısaltmalar ve detaylı bilgi için metine bakınız) (Ravens ve ark., 1996).
5
Faz 2 olarak nitelendirilen plato evresinde, L-tipi Ca2+ kanallarının olu turdu u
depolarize edici Ca2+ akımı (ICaL), Na+ kanallarına göre daha yava aktive ve inaktive
olurlar. Depolarizasyon, faz 2’nin ba lamasında önemli rolü olan içeriye-do rultucu
K+ iletkenli inin (gK1) azalmasına neden olmaktadır.
Faz 3’de (repolarizasyonun sonlanması) birkaç olay birlikte gerçekle ir. Kısaca; (i) L
tipi Ca2+ kanalı iletkenli inin (gCaL) zamana ba lı olarak azalması sonucu depolarize
edici yava akım azalması, (ii) depolarizasyonla aktive olan, ba ka bir K kanalı
popülasyonunun (IKs) yava inaktivasyonu, (iii) repolizasyonun artı ı sonucu içeriyedo rultucu K+ iletkenli inin (gKl) yeniden aktive olması bu fazın olu umunda önemli
katkıya sahiptir.
Ventrikül hücrelerinde 4. faz dinlenim potansiyelinin sa lanmasıdır. Zar K+
iyonlarına yüksek geçirgenlik gösterdi inden potasyum denge potansiyeline yakın
bir de er almaktadır. Dinlenim potansiyeli büyük oranda IK1 tarafından
belirlenmektedir.
Tüm bu iyonik mekanizmaya ek olarak AP süresince çalı an çe itli pompalar ve
de i -toku mekanizmaları ise a a ıda sıralanmı tır;
i)
Na+/K+ pompası: Her döngüsünde 3 Na+ dı arı ve 2 K+ içeriye alarak
dı arıya do ru bir akım olu turmaktadır. Uyarımı hücre içi Na+ ve hücre dı ı K+
konsantrasyonlarına ba lıdır. Kardiyak glikositler tarafından inhibe olmaktadır.
ii)
Ca2+ - pompası (sarkolemmal): ATP’ye ba ımlı hücre dı ına Ca2+ ta ınımı
Na+/Ca2+ kar ı ta ınımdan daha az etkilidir.
iii)
Sarkoplazmik retikulum Ca2+ - pompası (SERCA): Sarkoplazmadan,
sarkpolazmik retikulum (SR) içine ATP’ye ba lı bir ekilde Ca2+ ta ınımını sa lar.
6
iv)
Na+/Ca2+ de i – toku cusu (NCX): Her döngüde 1 Ca2+ kar ılık 3 Na+ yer
de i tirilir. Bu i lemde esas amaç Na+ kimyasal gradiyenti kullanılarak Ca2+’un
hücre dı ına atılması sa lamaktır. Ta ınımın zar potansiyeli ile Ca2+ ve Na+ kimyasal
gradiyenti do rultusunda düzenlenmesi; AP’nin ba langıcındaki depolarizasyon
evresinde, Ca2+’un geri alımına ve Na+’un ise hücreden atılımına, bunu takiben
repolarizasyonun ba laması ile Na+’un geri alımına ve Ca2+ atılımına yol açar.
1.2.3. Uyarılma-Kasılma Çiftlenimi ve Hücre çi Serbest Ca2+ Düzenlenmesi
Kalp kası hücresini saran sarkolemmanın elektriksel olarak eksitasyonu ile ba layıp
kalbin kasılması ile sonlanan olaylar zincirine uyarılma-kasılma çiftlenimi
(excitation-contraction coupling) adı verilir. Bir ikincil mesajcı olan Ca2+ hem
kardiyak elektriksel aktivite hem de miyofilamanların do rudan aktivatörü olması
nedeniyle kasılma için gereklidir (Bers, 2002). Hücre içi Ca2+’un miyositler
tarafından normal kontrol edilememesi kontraktil fonksiyon bozukluklarına neden
olabildi i gibi pek çok patofizyolojik durumun sebebi olarak da gösterilmektedir
(Pogwizd ve ark., 2001).
Kardiyak AP sırasında, L tipi Ca2+ kanallarından hücre içine giren Ca2+ SR’dan daha
fazla Ca2+ salınmasını tetiklemektedir (Ca2+ induced Ca2+ release). Salınan ve hücre
dı ından içeriye giren Ca2+ sitoplazmada serbest Ca2+ deri imini ([Ca2+]i) yakla ık
100nM’dan 1µM seviyesine yükseltti inde troponin C’ye ba lanmakta ve kasılma
mekanizmasını tetiklemektedir ( ekil 1.2). Troponin C-Ca2+ kompleksi tropomiyozin
ile etkile erek aktin ve miyozin miyofilamentleri arasındaki aktif bölgelerin açı a
çıkmasını ve çapraz köprülerin olu masını sa lamaktadır. Böylece, sarkomer boyu
kısalmakta ve kasılma gerçekle mektedir. Miyositler için gev eme sürecinin
ba laması ise [Ca2+]i’un azalması ve ba lı bulunan Ca2+’un ayrılması ile
gerçekle mektedir. Uyarılma ile artmı olan [Ca2+]i’un azaltılması dört farklı yolakla
geçekle mektedir. Bunlar; SR Ca2+-ATPaz, NCX, sarkolemmal Ca2+-ATPaz ve
mitokondriyal Ca2+’un tek yönlü (uniport) ta ınımıdır.
7
ekil 1.2: Ventrikül hücrelerinde Ca2+ düzenlenmesi. Çerçeve içindeki küçük ekil AP,
geçici Ca2+ de i imi (Ca2+ transient) ve kasılmanın zamansal de i imlerini göstermektedir.
Kısaltmalar; NCX, Na+/Ca2+ de i -toku u; ATP, ATPaz; PLB, fosfolamban; SR,
sarkoplazmik retikulum (Bers, 2002).
1.2.4. Hücre içi serbest Zn2+ Düzenlenmesi
Çinkonun (Zn2+) hücre için önemli bir element olması, üzerinde çalı ma yapılan pek
çok organizmada eksikli i ile gerçekle en patolojik durumların gözlenmesi ile
anla ılmı tır (Vallee ve Falchuk, 1993). Zn2+’un önemi hücresel sinyal iletiminde
gerçekle en olaylarda önemli yapısal ve/veya düzenleyici rol oynamasından
kaynaklanmaktadır. Memeli hücrelerinde Zn2+’un do rudan bir sinyal molekülü
olarak fonksiyonu oldu unu gösteren sonuçlar mevcuttur (Cuajungco ve Lees, 1997;
Sensi ve ark., 1997).
Zn2+’un düzenleyici fonksiyonunu eksiksiz olarak yerine getirebilmesi hücre içi
serbest çinko deri iminin ([Zn2+]i) ve hücresel da ılımının sıkı kontrolü ile mümkün
olmaktadır. Genel olarak, hücresel Zn2+’un 30-40%’ı çekirdekte, 50%’si sitozol ve
8
sitozolik organellerde, kalan kısmı ise hücre zarına birle mi
ekilde bulunmaktadır
(Vallee ve Falchuk, 1993). Son yıllarda yapılan [Zn2+]i düzenlenmesine ili kin
çalı malarda, serbest Zn2+’un da ılımında rol aldı ı dü ünülen Zn2+ ta ıyıcı
proteinler izole edilmi tir (Gaither ve Eide, 2001). zole edilen bu ta ıyıcı proteinler
hücrede plazma ve vezikül membranlarında bulunmaktadır (Gaither ve Eide, 2001).
Veziküler membranda bulunan bu ta ıyıcı proteinlerin serbest haldeki Zn2+’yu
veziküllere sıkı tırma i levini yaptı ı ileri sürülmektedir (Gaither ve Eide, 2001).
Hücresel serbest Zn2+’nun oldukça dü ük miktarlarda olmasının sebebi proteinler
veya anyonlarla karma ık bir halde bulunmasından kaynaklanmaktadır. Memeli
hücre sisteminde en temel Zn2+ ba layan protein metallothioneindir (MT) ve bu
protein ihtiyaç halinde enzimlere Zn2+ sa lamakla görevlidir (Udom ve Brady,
1980). Bu arada MT’in apoproteini olan thionein ba lanma bölgelerinden Zn2+’u
yüksek bir ilgiyle ba lamaktadır (Maret ve ark., 1999). [Zn2+]i’un kritik bir seviyenin
üzerinde olması hücresel fonksiyonlar için önemli olan pek çok enzimin inhibe
olmasını sa lamaktadır (Beyersmann ve Haase, 2001).
1.3. Deneysel Diyabet
Kan ekerinin kontrolsüz bir ekilde artması olarak tanımlanan Diabetes mellitus’un
(DM) ba lıca iki tipi olup, hastalı ın insanlar arasında görülme olasılı ı giderek
artmaktadır. Tip 1 diyabete insülin yetmezli i neden olurken, tip 2’ de reseptörlerin
insüline kar ı direnç kazanmasıyla patoloji olu maktadır (Zimmet ve ark., 1992).
Kan ekerinin kronik olarak yüksek olması sonucunda ortaya çıkan pek çok ölümcül
komplikasyonun incelenmesi ve tedavisinin geli tirilmesinde deneysel diyabet
modellemeleri önemli bir yer te kil etmektedir. Deneysel diyabet olu umu için çe itli
yollar olmasına kar ın, kimyasal yolla yapılan diyabet modellemeleri daha yaygındır.
Bu modellemede kullanılan en yaygın kimyasal ajanlar streptozotocin (2-deoxy-2[[(methylnitrosamino) carbonyl]amino]-D-lucopyranose) (STZ) ve alloxan’ dır
(Szkudelski, 2001). Her iki kimyasalla da diyabetin tüm ikincil etkileri
9
gözlenebilmesine kar ın, nekrotik geli imler göstermemesi nedeni ile STZ alloxan
kar ısında daha çok tercih edilmektedir (Szkudelski, 2001).
1.3.1. Deneysel Diyabetik Kardiyomiyopati
Diyabetin geç dönem komplikasyonları içinde yerini alan diyabetik kardiyomiyopati,
ya am kalitesini dü üren ve diyabet kaynaklı ölümlerin en temel sebeplerinden
birisidir (Fein ve ark., 1980). Diyabetik kardiyomiyopati’nin deneysel yolla diyabet
yapılmı sıçanlarda aterosklerotik de i ikliklerden ba ımsız bir ekilde kalp kası
hücrelerinde mekanik, biyokimyasal ve morfolojik de i imlerden kaynaklandı ı
gösterilmi tir (Fein ve ark, 1980). Bu bozukluklar, en temelde ventriküler kasılma ve
gev eme sürelerinin uzaması olarak tanımlanmaktadır. Deneysel yolla diyabet
yapılmı sıçanlarda bu bulgular kalbe yüklenim (örne in; egzersiz) sırasında daha da
belirgin bir ekilde gözlenmektedir (Atalay ve Laaksonen, 2002).
Streptozotocin enjeksiyonu sonrası görülen ölümler konjestif kalp yetmezli i ile
orantılı olmaktadır (Atalay ve Laaksonen, 2002). Sıçanlar ateroskleroz geli imine
göreceli olarak dayanıklı olduklarından, STZ ile yapılan diyabet sonunda olu an
patolojinin diyabetik kardiyomiyopatiye benzedi ine inanılmasına kar ın (Öztürk ve
ark., 1996), altında yatan olaylar tam olarak aydınlatılamamı tır. Yapılan çalı malar
ı ı ında kardiyomiyositlerde gözlenen de i imlerin mekanizmasına ili kin bilgiler u
ekilde özetlenebilir;
i)
Elektrofizyolojik De i iklikler: STZ ile yapılan deneysel diyabetik hayvan
model çalı maları ile ilk kez 1980 yılında Fein ve arkada ları, toplam AP süresinin
uzaması, kasılma ve gev eme hızlarının (±dT/dtmax) azalması ve ventriküller AP
genli inin azaldı ını rapor etmi lerdir. Ancak di er ara tırmacılar diyabetik sıçan
ventrikül hücrelerinin dinlenim zar potansiyelinde ve maksimum depolarizasyon
hızında bir de i me gösteremezken, AP süresindeki uzamayı gözlemi lerdir (Magyar
ve ark., 1992).
10
Diyabetli hayvan kalbi ventrikül bölgesinden izole edilen hücrelerden yapılan
kayıtlarda da AP sürelerinin uzadı ı ve dinlenim zar potansiyelinin de i medi i
gözlenmi tir (Shimoni ve ark., 1994; Ayaz ve ark., 2004). Repolarizasyon
evresindeki bu uzamadan zarı repolarize edici K+ akımlarının sorumlu oldu u
gösterilmi tir. De i ik tipleri bulunan bu K+- akımlarından IK1’da hiçbir de i iklik
gözlenmezken, Ito ve Iss akım yo unluklarının azaldı ı gözlenmi tir (Shimoni ve ark.,
1998a; 1998b; 1999).
ii)
Hücre
çi
Serbest Ca2+
olu umundan sonra miyokardiyal Ca
2+’
Homeostazındaki
2+
De i iklikler:
Diyabet
metabolizmasının bozuldu u, SR tarafından
2+
Ca un (Ca ) geri alınımının ise azaldı ı görülmü tür (Ganguly ve ark., 1983;
Lopaschuk ve ark., 1983). Buna ba lı olarak diyabetik sıçanlarda [Ca2+]i florometrik
boyalarla yapılan ölçümlerinde [Ca2+]i’daki de i me süresinin (transientlerin çıkı ları
ve ini leri) uzadı ı bildirilmi tir (Choi ve ark., 2002). Bu uzamanın altında yatan
mekanizmayı açıklamaya yönelik çalı malardan elde edilen sonuçlar: (1) ryanodin
reseptör protein miktarında azalma (Netticadan ve ark., 2001), (2) SR Ca2+-ATPaz
protein miktarında ve Ca2+ geri alınım aktivitesinde azalma (Choi ve ark., 2002;
Ganguly ve ark., 1983; Lopaschuk ve ark., 1983), (3) fosfolamban protein miktarında
artı
ama fosforilizasyon yetisinde azalma(Choi ve ark., 2002), (4) SR Ca2+
depolama yetisinde azalma (Choi ve ark., 2002), (5) ne ICaL ne de kanal protein
miktarında bir de i im olmaması (Choi ve ark., 2002) eklinde özetlenebilir.
1.4. Selenyum ve Biyolojik Sistemlerdeki Önemi
1.4.1. Biyolojik Sistemlerde Selenyum
Selenyum (Se), periyodik tabloda VI A alt grubunda yer alan bir eser (trace)
elementtir. Se bile ikleri havada, suda erimi olarak, toprak ve kayalarda bulunur.
Böylece buralardan bitkilere, mantarlara, bakterilere ve insanlara geçer, ve sonra
tekrar do aya döner. Ba ta karaci er ve böbrek olmak üzere insan ve hayvanların
hemen birçok dokusunda bulunmaktadır (Patrick, 2004). Se yiyeceklerde esas olarak
selenomethionin, metilselenomethionin, selenosistin ve selenosistein gibi organik
11
bile ikler halinde bulunur. Se’un dı arıdan alındı ı durumlarda kullanılan bile i inin
sodyum selenit (Na2SeO3) olması nedeniyle, özellikle deneysel Se çalı maları selenit
metabolizması üzerinde yo unla mı tır (Foster ve Sumar, 1997).
Yıllar boyunca sadece yüksek toksik ve karsinojen özelli iyle bilinen selenyum,
yapılan çalı malar sonucunda biyolojik sistemler için önemli ve faydalı bir element
olarak de erlendirilmi tir (Soriano-Garcia, 2004 ). Selenyumun glutatyon peroksidaz
(GSHPx) enziminin bir ko-faktörü oldu u ve hayvanlar için önemli bir eser element
oldu unun bulunması önemini arttırmı tır (Soriano-Garcia, 2004 ).
Deneysel olarak olu turulan karaci er tümörlerinin insidansında Se bile ikleri
uygulayarak % 50 oranında bir azalma oldu u tespit edilmi tir (Vernie, 1984).
Hayvanlarda gözlenen patolojilerin yanı sıra, insanlarda selenyum eksikli ine ba lı
olarak geli en ve Keshan hastalı ı olarak adlandırılan durumla kar ıla ılmı tır.
Yaygın olarak Çin’de görülen bu juvenil kardiyomyopati pek çok çocu un ölümüne
sebep olmu ve haftada 0,5-1,0 mg Se uygulanmasıyla tamamen tedavi edilmi tir
(Yang ve ark., 1984).
nsanlarda görülen ve Se ile ili kili daha pek çok hastalık mevcuttur. Bunlar arasında
artrit, katarakt, kistik fibrozis, kas distrofisi, fenilketonüri, Down sendromu,
bronkopulmoner displazi, hemolitik anemi, multiple skleroz, gece körlü ü, defektif
immün cevap, malarya, Kwashiorkor ve çocuklarda ani ölüm sendromu (Sudden
infant death) sayılabilir (Foster ve Sumar, 1997).
Selenyum sıçanlarda E vitamini eksikli inde görülen karaci er nekrozunu da
önlemektedir (Alissa ve ark., 2003). Ayrıca, dü ük konsantrasyonda insan ve
hayvanların büyümesi için gerekli olan esansiyel bir elementtir (Alissa ve ark.,
2003). Fakat yüksek konsantrasyonlarda toksik özelliklere sahiptir (Alissa ve ark.,
2003). Solunum sistemi irritasyonu, a ızda metalik tat, pulmoner ödem, nefeste
sarımsak kokusu, terleme ba lıca toksik etki sonuçlarıdır (Navarro-Alarcon ve
Lopez-Martinez, 2000).
12
Selenyumun biyolojik önemi GSHPx enziminin bir ko-faktörü olmasından
kaynaklanmaktadır. Her alt ünitesinde selenosistein eklinde bir adet Se atomu içeren
GSHPx, hücre içinde hidrojen peroksitin (H2O2) suya indirgenmesinde rol
oynamaktadır (Droge, 2001). Se, E vitamini ile etkile erek lipit metabolizması
sonucu olu an peroksitlerin neden oldu u oksidatif hasarlardan hücre membranını
korumaktadır (Gebre-Medhin ve ark., 1984).
1.4.2. Selenyum ve Kardiyovasküler Hastalıklar
Lipidperoksitler, kalp hücresi zarını hasara neden olup, Ca2+ ta ınım mekanizmasını
bozarak, hücrede kontrolsüz Ca2+ birikimine neden olabilmekte, bu ise kalp kası
hücrelerinin fonksiyonunu bozmaktadır (Bryant ve ark., 1980; Guidi ve ark., 1984;
Oster ve Prellwitz, 1990). Se antioksidan sistemde oynadı ı önemli rol nedeni ile
kalpteki patolojilerin yol açtı ı oksidan etkileri önleyebilmektedir. Se’nin, kalbi viral
enfeksiyonlardan, kardiyotoksik elemanlardan ve kardiyotoksik xenobiyotiklerden
koruyabildi i çe itli hayvan deneyleri ile gösterilmi tir (Van Vleet, 1987; Nakano ve
ark., 1989).
Selenyumdan eksik diyetle beslenmi
hayvanlarda, de i ik kalp problemleri
gözlenmi tir (Sayar ve ark., 2000). Sıçan ve koyunlarda dü ük selenyumlu diyet
uygulaması, kan basıncı de i ikli i ve anormal elektrokardiyografik bulguların
geli mesine neden olmu tur (Godwing, 1965).
Poliunsatüre ya
asidinden zengin, Se ve vitamin E’den fakir diyetle beslenen
hayvanlarda, purkinje hücrelerinde dejeneratif ve nekrotik geli imler (Yang ve ark.,
1984) epikardiyal ve miyokardiyal hemorajiler geli mi tir. (Yang ve ark., 1984),
iskelet kası ve miyokardiyumda dejenerasyon geli mi tir (Muth ve ark., 1971).
Keshan hastalı ı olarak bilinen (Chen ve ark., 1980) bir tip endemik ölümcül
kardiyomiyopatinin dı ardan Se uygulamasına cevap verdi i gösterilmi tir. Ayrıca,
Keshan hastalı ının bulundu u bölgelerdeki çocukların sodyum selenitle beslenmesi
13
halinde, hastalık insidansının bariz bir ekilde azaldı ı görülmü tür (Chen ve ark.,
1980).
Kısaca Se, özellikle süperoksit ve hidroksil radikali gibi reaktif oksijen ürünleri olan
H2O2’i ve lipid peroksidazı katalizleyen GSHPx enziminin bir parçasıdır. H2O2 ve
lipit peroksitlerin temizlenmesi, zincirleme oksidasyon reaksiyonunu durdurur. Bu
durum, iskemik ko ullarda ksantin oksidaz tarafından üretilen süperoksit artı ının yol
açabilece i ek oksijen tüketimi ve artan lipit peroksidasyonu açısından önemlidir.
Hücre içi reaktif oksijen üretimi ve temizleme yolakları ekil 1.3’de görülmektedir.
ekil 1.3: Hücre içi reaktif oksijen üretimi ve temizleme yolakları. Kullanılan kısaltmalar
hidrojen peroksit (H2O2), redükte (GSH) ve okside (GSSG) glutatyon (Droge, 2002).
1.4.3. Selenyum ve Diyabet li kisi
Deneysel diyabet modellerinde Se’nin diyabetik hayvanların kan ekerini dü ürdü ü,
ayrıca sıvı tüketimlerini, a ırlık artı larını ve bazı biyokimyasal parametrelerini
normalle tirebildi i bildirilmi tir (McNeill ve ark., 1991; Ghosh ve ark. 1994). Son
yıllarda yapılan in vivo ve in vitro ara tırmalarda selenyumun pek çok insülin
benzeri aktiviteye sahip oldu u gösterilmi tir (Ezaki ve ark., 1990). Bu aktiviteler;
glikoz alımının stimülasyonu, glikolizis ve glikoneogenezis, ya asidi sentezi ve
pentoz fosfat yolu gibi metabolik olayların düzenlenmesi olarak sayılabilir. Bu
etkileri açıklayabilmek için çe itli olası mekanizmalar ileri sürülmü tür. Bunun
yanında Se, bir büyüme faktörü gibi etki göstermekte ve insülinin yaptı ına benzer
14
metabolik de i iklikler yapabilmektedir (Ezaki ve ark., 1990). Bir ba ka deyi le,
insülin yoklu unda da insüline benzer de i iklikler yapabilmekte, ya da insülinin
reseptörünün duyarlılı ını arttırmaktadır (Ezaki ve ark., 1990; Ayaz ve ark., 2002).
Diyabette serbest ya asitleri ve serbest radikal türevli çe itli oksidanların arttı ı, bu
artı ın pek çok sistemik bozukluklara neden oldu u bilinmektedir (Reusch, 2003;
Das, 2002). Serbest radikaller, negatif yüklü elektron sayısının çekirdekteki pozitif
yüklü proton sayısı ile e it olmadı ı moleküllerdir. Olu an bu serbest radikaller
vücutta önemli moleküllere örne in, hücrelerde proteinlere ve genetik materyale
zarar verirler. Bundan ba ka hücre zarının hasarına, geçirgenli inin artmasına ve
sonuçta hücrenin ölümüne kadar giden bir seri olaya yol açabilirler (Penpargkul ve
ark., 1980; Tahiliani ve Mc Neill, 1986). Organizmada meydana gelen serbest
radikalleri sürekli olarak zararsız hale getirmeye çalı an süperoksit dismutaz, katalaz,
GSHPx gibi çe itli enzimler bulunmaktadır. Se’nin antioksidan sistemdeki bilinen
belirgin rolü sayesinde diyabette gözlenen patolojileri düzeltebilmesi olasıdır. Ayrıca
tip 1 diyabetik hastalarda kontrol grubuna göre eritrositlerdeki selenyum
konsantrasyonunun belirgin olarak dü tü ü bildirilmi tir (Kruse-Jarres ve Rukgauer,
2000).
1.5. Zn2+ ve Diyabet li kisi
nsülin miktarının azlı ı tip 1 diyabetin olu umuna neden olmaktadır. nsülin serbest
monomerler eklinde dola ım içindeki kanda bulunup yarılanma ömrü 5-6 dakika
kadar olan bir hormondur. Kanda bulunan insülin, besinler, gastrointestinal ve
pankreatik hormonlar tarafından oldukça sıkı bir koordinasyonla kontrol edilmesine
ra men insanda esas belirgin olan faktör glikozdur (Salgueiro ve ark., 2002). Bir
mikrobesin olan Zn2+ insülin fizyolojisi içinde bulunmasıyla birlikte, ikisi arasında
oldukça yakın bir yapısal ve fonksiyonel bir ili ki vardır. nsülin, Zn2+ atomlarının da
içinde bulundu u hekzamerik kristal yapıdadır ve beta hücreleri tarafından ihtiyaç
oldu unda venöz sisteme degranüle edilmektedir. (Faure ve ark., 1992 ; Arquilla ve
ark., 1978 ; Kinlaw ve ark., 1983 ; Chausmer, 1998 ; Brandao-Neto ve ark., 1995).
Yapılan deneyler, kristal yapıdaki insülin/ Zn2+oranındaki de i imin hormonun
15
antijenik özelliklerini de i tirmi oldu unu göstermektedir. Ayrıca metal kısmın
ayrılması üçüncül yapıda gerçekle en de i imler nedeni ile insülinin immünolojik
etkinli inin azalmasına neden olmaktadır. Di er yandan Zn2+eklenmesi insülinin
reseptörüne ba lanmasını arttırmaktadır (Faure ve ark., 1992 ; Arquilla ve ark.,
1978). Zn2+’un oldukça geni
enzimatik
reaksiyon
için
spektrumlu bir etkisinin varlı ı 200’den fazla
gerekli
bir
ko-faktör
rolü
üstlenmesinden
kaynaklanmaktadır (Brandao-Neto ve ark., 1995; Evans, 1986 ; Coleman, 1992).
Zn2+ özellikle protein, karbonhidrat ve lipit metabolizmalarında rol oynamaktadır.
Glikoz metabolizması açısından bakıldı ı zaman, fruktoz 1-6 difosfat aldolaz
(aktivatör), fruktoz 1-6 difosfataz (inhibitör) (Faure ve ark., 1992), gibi önemli
enzimatik reaksiyonlarda rol oynamaktadır. Ayrıca Zn2+ yoklu u olu turulan sıçan
deneylerinde pürivat kinaz enzim ekspresyonunu azalttı ı yönünde literatürde bilgi
mevcuttur (Kennedy ve ark., 1998).
Diyabetle ilgili yapılan pek çok çalı mada ölçülen fizyolojik Zn2+ miktarının azalmı
oldu u bulunmu tur (Anetor, 2002; Cordova, 1994; Tuvemo ve Gebre-Medhin,
1983). Di er yanda tip 1 diyabetli insan deneklerde hiperzincuria ve Zn2+ emilim
bozuklukları gözlenmi tir. Diyabetli örneklerde gözlenen azalmı Zn2+miktarının
temel sebebi olarak idrar ile kontrolsüz atımı gösterilmektedir (Golik ve ark., 1993 ;
Cunningham ve ark., 1994 ; Honnorat ve ark., 1992 ). Hayvan modelleri ile yapılan
çalı malarda, tip 1 diyabetik farede doku Zn2+ miktarlarının azalmı
oldu u
bulunmu tur (Faure ve ark., 1992). Ayrıca diyabet yapılmı sıçanlarda pankreatik
doku Zn2+ miktarının normal sıçan de erleri ile kar ıla tırılınca azalmı oldu u
bulunmu tur (Levine ve ark., 1983). Hedef dokularda; pankreas, karaci er ve böbrek
gibi, Zn2+/bakır oranının diyabetik sıçanlarda azalmı oldu unun bulunması yapılan
çalı malar arasındadır. Bu oranın diyabetli hastalarda koroner arter hastalıklarının
geli mesinde rolünün olması önem arz etmektedir (Aguilar M. V. ve ark., 1998).
Bir eser element olan Zn2+ bütün dokularda yer alıp, biyolojik moleküllere
ba lanabilmekte ve bu moleküllerin konformasyonunu, dayanıklılık ve aktivitesini
etkilemektedir (Haase ve Maret, 2003). Kardiyomiyosit ve endotel hücrelerine
oksidan stres olu turucu bir ajan uygulandı ında hücre içi serbest Zn2+’un mobilize
16
oldu u gösterilmi tir (Golik ve ark., 1993 ; Johnson ve Canfield, 1985). Turan ve
arkada larının 1997 yılında yaptıkları çalı mada fura-2 yüklenmi
tav an
miyositlerinde sülfhidril reaktif oksidanı olarak bilinen hipoklorik asit (HOCl) ve
selenit uygulaması sonucunda, hücre içi serbest Zn2+ miktarının 30 kat arttı ı
gösterilmi tir. Yapılan bu çalı manın bir di er önemli yanı ise, oksidan stres
durumunda kardiyomiyositlerde fura-2 ile yapılan serbest Ca2+ ölçümlerinde serbest
Zn2+’un ciddi derecede ölçüme etki etti ini göstermi olmasıdır (Turan ve ark.,
1997).
1.6. Çalı manın Amacı
Diyabette oksidan stres olu umu diyabetin ikincil etkilerinin nedeni olarak
gösterilmektedir (Reusch, 2003; Das, 2002). Kardiyomiyositlerde [Ca2+]i homeostazı
kalbin rutin i levlerini yerine getirmesi için oldukça önemli bir rol üstlenmektedir.
Diyabetik kalp dokularında [Ca2+]i ölçülmesine ili kin yapılan deneylerde; bazal
[Ca2+]i diyabetle artmı , azalmı ve de i memi oldu unun rapor edilmesi konunun
halen çeli kili oldu unu göstermektedir (Choi ve ark., 2002; Ganguly ve ark., 1983;
Lopaschuk ve ark., 1983). Konuya diyabette ICaL açısından bakıldı ında ise, bu
akımların ya de i memi ya da azalmı oldu u eklinde çeli kili bilgiler literatürde
mevcuttur (Choi ve ark., 2002; Tomlinson ve ark., 1992). Planlanan çalı mada, bir
antioksidan olan sodyum selenitin in vivo uygulamasının, diyabette bozuldu u ileri
sürülen [Ca2+]i ve ICaL olası etkileri ara tırılacaktır. Serbest Ca2+ ölçümlerinde hücre
içi serbest [Zn2+]i’un ciddi derecede ölçüme etki ederek, serbest Ca2+ ölçümlerinde
bir yanlı de erlendirmeye neden olabildi i gösterilmi tir (Turan ve ark., 1997).
Diyabette oksidan stresin arttı ı ve oksidan stres sonucunda da [Zn2+]i’un arttı ı
gösterilmi olasına ra men, diyabetik kalp dokularında [Zn2+]i henüz ölçülmemi tir.
Bu çalı mada ayrıca diyabetik kalp dokularında hücre içi serbest Zn2+ miktarı
ölçülmü
ve bir antioksidan olan sodyum selenitin in vivo uygulamasının
kardiyomiyositlerde [Zn2+]i de i imine etkileri gözlenmi tir.
17
2. YÖNTEM VE GEREÇLER
2.1. Deneysel Diyabet Modeli Ve Deney Gruplarının Olu turulması
Deneyler için di i-erkek ayırımı gözetmeksizin, a ırlıkları 200-250g arasında olan
yeti kin (2,5-3 aylık) sıçanlar rasgele seçildiler. Sıçanlar deney süresince (be hafta)
kafes ba ına üç hayvandan fazla olmamak ko uluyla cinsiyetlerine göre ayrılıp
standart sıçan yemi ve su ile kısıtlama olmaksızın beslendiler.
Deneysel yoldan diyabet olu turmak için STZ (Sigma) kullanılmı tır. Sitrat tamponu
(pH 4,5 deki 0,1 M) içerisinde eritilen STZ, 50 mg/kg olacak ekilde tek doz
intraperitoneal (i.p.) enjekte edilmi tir (Öztürk ve ark., 1995). Enjeksiyondan yedi
gün sonra MediSense Card Sensor (Roche) ile kan ekeri düzeylerine bakılarak, kan
ekerleri 300 mg/dl ve üstünde olan sıçanlar diyabetik (DM) olarak de erlendirilmi ,
bu kan ekeri de erine ula mamı sıçanlar ise deneye alınmamı tır.
Diyabet grubunun yanı sıra, rasgele seçilen aynı a ırlıktaki sıçanlara sadece sitrat
tamponu tek doz i.p. olarak enjekte edilmi ve enjeksiyondan sonraki be inci hafta
içinde elektrofizyolojik ölçümler deneyler için kullanılarak, bu hayvanlar kontrol
grubu (Kon) olarak kabul edilmi tir.
Çalı manın ikinci bölümünde, daha önce açıklandı ı ekilde, kullanılan kriterlerle
Kon ve DM olmak üzere iki grup sıçan olu turulup, her iki gruba da i.p. olarak
sodyum selenit (5
µ mol/kg/gün)
enjekte edilmi tir. Diyabetik gruba (DM + Se) STZ
enjeksiyonunu takip eden yedi günün sonunda sodyum selenit enjeksiyonuna
ba lanmı tır. Çalı manın bu bölümü için kullanılan kontrol (Se) sıçanlara ise STZ
ta ıyıcısı olan sitrat enjeksiyonunu takiben yedi gün sonra sodyum selenit enjekte
edilmi tir. Sonuçta be inci hafta içinde hayvanlar deneyler için kullanılmı tır.
18
2.2. Papiller Kas Kasılması ve Aksiyon Potansiyelinin Kaydedilmesi:
Sıçanlar heparinli pentobarbital ile (30 mg/kg) anestezi edildikten sonra kalpler hızlı
bir ekilde çıkarılarak önceden gazlanmı (%95 O2 ve % 5 CO2 ile), so uk ve dü ük
Ca2+ içeren içeri i (mM: 119 NaCl, 4,8 KCl, 1,0 CaCl2, 1,2 MgSO4, 1,2 KH2PO4, 20
NaHCO3, 10 glikoz ve pH 7,4) olan modifiye Krebs çözeltisi içerisine alındı. Yine
aynı çözeltiyi bulunduran tabanı mum kaplı petri üzerine konan kalpler aort tabana
gelecek ekilde i ne yardımıyla hem aorttan hem de kalbin apeksinden muma
sabitlendi. Stereomikroskop yardımıyla sol atriyum kesilerek, sol ventrikül duvarı
hilal eklinde açıldı. Herhangi bir fiziksel hasar verilmeden tek ucundan 7/0 ipek
iplikle ba lanan papiller kas özel yapılan organ banyosu içine yerle tirildi. Kas
serbest olan ucundan i ne elektrotla banyo tabanındaki muma sabitlenirken di er uç
bir kuvvet çevirecine (Grass FT03) ba landı ve organ banyosu içinde sürekli dolanan
(%95 O2 ve % 5 CO2) gazlanmı Krebs solüsyonu (mM: 119 NaCl, 4,8 KCl, 1,8
CaCl2, 1,2 MgSO4, 1,2 KH2PO4, 20 NaHCO3, 10 glikoz ve pH 7,4) ile sürekli
perfüze edildi (370C’de) ve kas örneklerinin dengeye gelmesi için 30 dakika
beklendi. Daha sonra maksimum gerilme (kasılma) elde edilinceye kadar gerilen
örneklerinde bir stimülatör (Grass S48) aracılı ı ile kare biçimli e ik uyaranın 2 katı
genlikli, 3 ms süreli ve 0,2 Hz frekansa sahip kare biçimli elektriksel uyaranlarla
kasılmalar elde edildi.
Sol ventrikül papiller kasından bir önceki paragrafta açıklanan ekilde kasılmalar
kaydedilirken, semi-floating cam mikroelektrot (15-20 MΩ dirence sahip, 3M KCl
ile doldurulmu ) ile AP’ler kaydedilmi tir. Mikroelektrot cam kapiller tüpler
kullanılarak (Narishige scientific instruments) pipet çekicide hazırlanmı tır.
Kasılma yanıtları bir ön amplifikatör (Grass P16) aracılı ı ile 1000 kat, AP ise 10 kat
büyütüldükten sonra hem bir osiloskop aracılı ı ile sürekli (on-line) (Gould OSD
1604) gözlenmi , hem de analog sinyaller bir analog-digital çevirici (A/D converter,
Adventech PCL-818 PG) aracılı ı ile ve 10 kHz örnekleme hızında, bir PC
kullanılarak dijital ortama kaydedilirken e zamanlı monitörize edilmi tir.
19
Ardı ardına alınan bu kayıtlar özel olarak yazılan bir TurboPascal programı
yardımıyla Microsoft Excel çalı ma sayfası olarak açılabilecek ekilde çevrilmi tir.
Doku içine her bir dalı neticesinde ard arda elde edilen AP kayıtları arasında önemli
bir farklılık göstermedi inden, bu kayıtların ortalamaları kullanılmı tır. Her bir dalı
için elde edilen ortalama AP kayıtları, hazırlanan bir Excel sayfası aracılı ıyla analiz
edilerek, maksimum depolarizasyon (MD) de eri, dinlenim zar potansiyelinin (RMP)
de eri ve repolarizasyonun %25 (APD25), 50 (APD50), 75 (APD75) ve 90 (APD90)’a
dü mesi için geçen süre gibi AP ile ilgili parametreler hesaplandı ( ekil 2.1A).
Kasılma e rilerinin ise, ba ka bir Excel sayfası kullanılarak maksimum gerim (PT),
maksimum kasılmanın olu ması için geçen (TP) ve tepe de erin %50’ine dü mesi
(RT50) için geçen süre gibi parametreler ölçülmü tür ( ekil 2.1B).
Zar Potansiyeli
A
B
APD25
Tepe
(PT)
APD50
APD75
APD90
Em
Zaman
TP RT 50
ekil 2.1: Aksiyon potansiyeli ve kasılmalar için ölçülen de erlerin gösterilmesi. A) Sol
ventrikül papiller kasından kaydedilen bir aksiyon potansiyeli e risi üzerinde ölçülen
parametrelerin gösterimi. Kalın çizginin e riyi kesti i nokta tepe de eri ve Em dinlenim
potansiyeli olmak üzere, çizgiden sa a do ru repolarizasyon evresinin maksimum de erinin
%25, 50, 75 ve 90’ına dü mesi için geçen süreler gösterilmektedir. B) Sol ventrikül papiller
kasından kaydedilen bir kasılma e risi üzerinde ölçülen parametrelerin gösterimi. Kasılma
e risinin en yüksek de eri genlik, bazal seviyeden tepe de erine ula ma süresi, TP; Tepe
de erin %50’sine ula ması için geçen süre, RT50 gösterilmektedir.
20
2.3. Kardiyomiyositlerin izolasyonu
Be
haftalık deney süresi sonunda deney gruplarında bulunan hayvanlar hafif
anestezi altında iken (30 mg/kg sodyum pento barbitol) kalpleri hız bir ekilde
çıkartılıp so uk ve Ca2+suz çözelti içerisine konuldu. Daha önce kullanılan enzimatik
yöntem ile hücre izolasyonu yapılmı tır (Ayaz ve ark., 2004). Langendorff metodu
yardımıyla aorttan ters perfüzyon edilerek önce içeri i mM olarak NaCl 118; 4,7
KC1, 1,25 CaC12, 1,2 MgSO4, 1,2 KH2PO4, 25 NaHCO3, 10 HEPES ve 10 glikoz,
pH 7,4 olan ve 100% O2 ile gazlanan, Ca2+’suz perfüzyon çözeltisi ile 5 dakika
yıkandıktan sonra, içine kollajenaz (Sigma Boehringer Colleganase A type) (1,1
mg/ml) eklenmi aynı içerikli çözelti ile 25 - 30 dakika perfüze edilerek hücre
izolasyonu yapılmı tır. Enzimatik olarak parçalanan kalpler daha sonra mekanik
olarak küçük parçalara ayrı tırılmı , filtre edilmek üzere bir tübe aktarılması
sa lanmı tır. Tübün içerisinde gene Ca2+’suz ortamda iki kere yıkanmak suretiyle
hem kollajenaz yıkanmı hem de ölü olan doku parçalarından arındırılmı tır. zole
edilen hücreler 37 °C'
de, dı ortamdaki Ca2+ 1,5 mM olacak ekilde dereceli olarak
arttırılmı kayıt i lemlerinden önce bir saat inkübe edilmi tir.
2.4. yon Kanal Akımlarının Kaydedilmesi
Ca2+ ve potasyum akımlarının kayıtları tüm hücre voltaj kenetlemesi ile yapılmı tır.
Akımların kayıtları için dirençleri 1,0-1,5 M
arasında de i en elektrotlar
kullanılmı tır. Tüm kayıtlar oda sıcaklı ında yapılmı
ve detaylı analiz için
bilgisayara kaydedilmi tir.
2.4.1. Potasyum kanal akımlarının kaydedilmesi
Potasyum akımları (Ito ve IK1) bu kanal yo unlu unun kalbin di er bölgelerine göre
daha çok oldu u bilinen apeksten yapılmı tır. Akım kayıtları için içeri i (mM: NaCl
136, KCl 5,5, MgCl2 1,0, HEPES 10, CaCl2 0,5, glikoz 10, pH 7,4) olan banyo
solüsyonu ve içeri i (mM: L-aspartik asit 80, KH2PO4 10, MgSO4 1,0, KCl2 50,
21
HEPES 5, ATP-Na 3, EGTA-K 10, pH 7,4) olan pipet solüsyonu kullanılmı tır.
Potasyum akımları patch amplifikatörü (Model RF-300; Biologic, Claix, France) ile
3 kHz filtrelenmek üzere her 7 saniyede bir kaydedilmi tir. Akım e rileri 5 kHz’de
pclamp 8 software (Axon Instruments, Foster City CA, USA) ile digitalize edilmi tir.
Ca2+ akımlarının blokajı için hücre dı ı kadmiyum (Cd) (250 µM) uygulanmı ve
sodyum akımlarının inaktivasyonu için her depolarizasyon pulsundan önce -50 mV’a
ön depolarizasyon yapılmı ve orda 50 ms beklenmek suretiyle gerçekle tirilmi tir.
Akım kayıtları 0,14 Hz frekansla 600 ms’lik -120 mV’tan +70 mV’a kadar 10’ar
mV’luk adım artı ları ile gerçekle tirilmi tir. Akımlar hücre büyüklü ünün de bir
ölçüsü olarak kullanılan kapasitanslarına oranlanarak normalize edilmi ve de erler
pA/pF eklinde sunulmu tur.
Ito aktivasyon e risinin analizi için her potansiyel farktaki akımın tepe de eri
maksimum de ere (+70 mV) oranlamak suretiyle yapılmı tır. naktivasyon e rileri
ise -85’ten +10 mV’luk adım artı ları ile 200 ms’lik ön pulsun arkasından uygulanan
+50mV’luk 600 ms’lik puls uygulanarak kaydedilmi tir. Aktivasyon ve inaktivasyon
e rileri a a ıdaki Boltzmann denklemlerine uydurulmu tur.
Aktivasyon: I/Imax= [1+exp(V1/2–Vm)/k]-1
naktivasyon: I/Imax= [1+exp(Vm–V1/2)/k]-1
Reaktivasyon e rilerinin kayıtları ise aralarındaki sürenin (20-300 ms) de i tirildi i
50 mV’a 500ms’lik çift puls protokolü ile gerçekle tirilmi tir ve üssel fonksiyon
denklemine uydurulmu tur.
Reaktivasyon: I/Imax = [1-exp(-t/τ)]
22
2.4.2. L tipi Ca2+ kanal akımlarının kayıt edilmesi
Kardiyomiyositlerin ICaL kayıtları için içeri i (mM: 120 CsCl, 6,8 MgC12, 5,0
phosphocreatine-Na2, 5 ATP-Na2, 11 EGTA, 4,7 CaCl2 ,20 HEPES ve pH 7,2) olan
pipet çözeltisi kullanılmı tır. Kayıtlar için içeri i (mM: 5,4 CsCl2, 117 NaCl2, 1,8
CaCl2, 1,7 MgCl2, 10 Glikoz, 10 HEPES ve pH=7,4) olan dı ortam çözeltisi
kullanılmı tır. INa inhibisyonunu sa lamak için -80 mV kenetlenme potansiyelinden 40 mV’a bir rampa ardından ICaL kayıtları, 200 ms'
lik depolarize edici ve her
seferinde 10 mV'
luk adımlarla artıp +50 mV'
a kadar çıkan voltaj basamakları ile
kaydedilmi tir. Akımların akım-voltaj ili kileri, 200 ms’lik depolarize edici pulsun
son 20 ms’lik kısmı tepe de erlerinden çıkarılmak suretiyle çizilmi tir.
Kanalların inaktivasyon durumunu gözlemek için –80 mV ile +20 mV arasında 10
mV adımlarla 200 ms süreli önpuls (prepuls) uyguladıktan sonra 3 ms’lik bir süre
için tekrar –80 mV seviyesine dönülüp, arkasından zar her defasında yine 200 ms
süreyle 0 mV’a kenetlenmi tir. Reaktivasyon ise; -80 mV’taki zar potansiyeli 200 ms
süreyle 0 mV’a kenetlendikten sonra, ba langıçtaki duruma dönülerek 50 ms
beklenmi ve aynı puls tekrar edilerek kaydedilmi tir. Pulslar arasındaki süre olan
∆t=50 ms olmak üzere aynı protokol 500 ms’ye kadar uygulanmı tır.
Bu akımları kinetik analizleri ve parametrelerin elde edilmesi yine yukarıdaki
ba ıntılara göre yapılmı tır .
2.5. Hücre içi serbest Ca2+ ve Zn2+ deri imlerinin spektroflorometrik olarak
ölçülmesi
Hücre içi serbest Ca2+ ve Zn2+ ölçümleri için her iki iyona da duyarlı bir floresans
boya olan fura 2 (AM) kullanılmı tır. Ölçümler için içeri i mM olarak NaCl 118, 4,7
KC1, 1,25 CaC12, 1,8 MgSO4, 1,2 KH2PO4, 25 NaHCO3, 10 HEPES, 10 glikoz ve
pH 7,4 olan dı ortam çözeltisi içinde gerçekle tirilmi tir. zole edilen miyositler
yukarıda bahsedilen bir saatlik inkübasyon süresinin ardından içerisinde 4 µM fura-2
23
olan solüsyona transfer edilip organellere sekestrasyonunu engellemek için oda
sıcaklı ında ve karanlıkta 45 dakika inkübe edildi. nkübasyon süresini takiben, geri
plan (back ground) floresans miktarını mümkün olan en dü ük seviyeye çekmek
amacı ile üç kere yıkandı. Tüm kayıtlar 37 oC’de yapıldı. Gözlenen Ca2+ de i imine
ait sinyallerin ölçümü PTI (Photon Technology Internetional) RatioMaster marka
mikrospektroflorimetre ile yapılarak Felix (PTI) programı ile bilgisayara kaydedilip
de erlendirilmi tir. Transientlerin kinetik analizi Micosoft Excell programı ile
hazırlanan bir analiz algoritması ile gama da ılım fonksiyonuna uydurularak
gerçekle tirilmi tir.
[Zn2+]i tayin edebilmek için Turan ve arkada larının 1997 yılında yayınladıkları
çalı mada kullanılan yöntem temel alınmı tır. Kısaca, [Ca2+]i hesaplamasına Zn2+
katkısını ortadan kaldırmak için, bir Zn elatörü olan N,N,N,N’–tetraksi (2-piridilmetil) etilendiamid (TPEN) (30 µM) varlı ında kaydedilen ı ık iddetleri kullanıldı.
[Zn2+]i hesaplamak için bazal (R), maksimum Zn2+ (RmaxZn) ve Ca2+ (RmaxCa) ve iki
iyonun yoklu unda (Rmin) ölçülen ı ık iddeti de erleri fura 2 yüklü miyositlerden
ölçüldü. Her deneyde geri plan (340 ve 380) (background) ölçümleri kaydedilip her
bir ölçüm de eri, geri plan ölçümleri çıkarılmak suretiyle hesaplanmı tır. Deneylerde
maksimum Zn2+ ölçümleri için Znpritin (ZnPt) (sigma) (1 µM) kullanılarak yapılmı
ve deney grubu hayvanları arasında bir farka rastlanmamı tır ( ekil 2.2). Maksimum
Ca2+ ölçümleri için ise, hücre zarının digitonin (DT) (1 µM) ile delinerek yapılmı ,
minimum ölçümü ise iki iyonun da varlı ını ortadan kaldıran TPEN ve EGTA
(2mM) kullanılarak yapılmı tır. Maksimum Zn2+ ölçümlerinde oldu u gibi
maksimum
Ca2+
ve
2+
minimum
ölçümlerinde
gruplar
arasında
bir
farka
2+
rastlanmamı tır. [Zn ]i ve [Ca ]i hesaplamak için Atar ve arkada larının 1995
yılındaki çalı malarındaki yarı malı (competative) ba lanma ba ıntısı kullanılmı tır.
Rmin + Rmax,Ca [Ca2+] / K’Ca + Rmax,Zn [Zn2+] / K’Zn
R=
(1)
2+
2+
1 + [Ca ] / K’Ca + [Zn ] / K’Zn
24
TPEN
F340/380
1.35
ZnPt
0.85
0.35
0
100 Zaman (ms) 200
ekil 2.2: Zn2+ için hücre içi minimum ve maksimum floresans oranlarının
belirlenmesi. Maksimum [Zn2+]i için ZnPt (1 µM), minimum de eri için ise TPEN (30 µM)
kullanılarak alınmı tır. Oklar kimyasalların uygulama noktalarını temsil etmek için
kullanılmı tır.
[Zn2+]i ve [Ca2+]i hesaplamak için, [Zn2+]i TPEN (30µM) uygulaması ile minimuma
çekilmi geriye kalan floresans miktarı ile hücre içi [Ca2+]i ölçülmü tür. Zn2+ ölçümü
ise TPEN yokken kaydedilen floresans oran iddeti kullanılarak yapılmı tır. Birinci
e itli in yeniden düzenlenmesi e itlik 2 ile serbest Zn2+ ve Ca2+ deri imi
hesaplamaları yapılmı tır.
[Zn2+] = K’Zn (R - Rmin – {[Ca2+]i (Rmax,Ca - R) / K’Ca }) / (Rmax,Zn - R) (2)
Turan ve arkada larının (1997) çalı masında kullanılan kinetik de erleri kullanılmı
ve, K’Ca = 3750 nM ve K’Zn = 1,79 nM olarak alınmı tır. Ölçülen Rmin , RmaxCa ve
RmaxZn de erleri deney grubu sıçanları için bir farklılık göstermedi inden, bu
formülde kullanılmak üzere ölçülen Rmin=0,25 RmaxCa=2,20 ve RmaxZn=1,07 de erleri
kullanılmı tır. Ölçümler daha sonra analiz edilmek üzere bilgisayara kaydedilmi tir.
2.6. Biyokimyasal Ölçümler
Ölçümler için kullanılan hayvanların kalp dokuları tek hücre izolasyonu için
kullanılan kriterler altında çıkarılıp Ca2+’suz ortamda perfüse edildikten sonra hemen
-80 oC’ ye kaldırılmı tır. Dondurulan bu kalpler daha sonra ölçüm esnasında iki
25
kısma ayrılmı lardır.
lk kısım için ayrılan kalp dokuları fosfat tamponu ile
homogenizasyonu takiben 18000xg’de 1 saat santrifüj edilip supernetantlar ölçümler
için tekrar -80 oC’e kaldırıldılar. kinci kısım dokular ise 0,25 M sükroz içerisinde
homogenizasyonu takiben 18000xg’de 20 dakika 4
supernetantları MT ölçümleri için -80
o
C’de santrifüj edilip
o
C’e kaldırılmı tır. Tüm biyokimyasal
ölçümler için oxisresearch test kitleri kullanılarak yapılmı tır. Toplam protein
ölçümleri Lowry metodu kullanılarak yapılmı tır (Lowry ve ark., 1951).
2.6.1. Lipit peroksidasyon Ölçümü
Bu metot kromogenik ajanların, N-metil-2-phenylindole’in 4-hidroksi alkenaller ile
45°C’ de , kimyasal reaksiyonunu temel almaktadır. Dayanıklı ve 586 nm dalga
boyunda maksimum so urma veren boya olu turmak için bir molekül MDA iki
molekül N-metil-2-phenylindole ile reaksiyona girmektedir. Ölçümler standart
kar ısında 586 nm dalga boyunda ölçülen maksimum de erler alınmak suretiyle
yapılmı tır.
2.6.2. Süperoksit Dismutaz Ölçümü
Ölçüm metodu süperoksit dismutaz’la (SOD) sa lanan 5, 6, 6a, 11b-tetrahydro-3, 9,
10-rihydroxybenzo[c]fluorene’in alkali sıvı ortamda kendili inden oksidasyon ile
kromofor olu turma hızına ba lı olarak 525 nM dalga boyunda maksimum
so urganlık esasına dayanmaktadır. Redükte glutatyon gibi kimyasal reaksiyonu
etkileyebilecek
ajanların
eliminasyonu
1-methyl-2
vinylpyridinium’u
ile
sa lanmaktadır. 1-methyl-2vinylpyridinium’un ortamdan uzakla tırılması hızlı
alkalizasyon reaksiyonu ile sa lamaktadır. Kinetik olarak yapılan 525 nM’de
ölçümler
5,6,6a,11b-tetrahydro-3,9,10-rihydroxybenzo[c]fluorine
eklemesinin
arkasından yapılmı tır. SOD aktivitesi, otooksidasyonun SOD varlı ında (Vs) ve
yoklu undaki (Vc) de erlerinin oranı ile bulunmu tur. Vs/Vc oranı ile hesaplanan
SOD aktivitesi, SOD enzim tipinden (Cu/Zn-SOD, Mn-SOD, Fe-SOD) ba ımsız
olarak yapılmı tır (Nebot ve ark., 1993).
26
2.6.3. Toplam Glutatyon Ölçümü
Metot temel olarak kromoforik tiyon olu umu üzerine kurulmu tur. Basamaklı
kimyasal reaksiyonun ilk basama ında örnekler indirgeyici bir ajan olan tris(2carboxyethyl)phosphine (TCEP) (Burns ve ark., 1991) ile muamele edilerek okside
formda bulunan tüm glutatyonlar redükte forma dönü türülmektedir. Örneklerden
alınan 420 nM dalga boyundaki ölçümler direk olarak GSH konsantrasyonu ile
orantılı oldu undan standartlar kar ısında okunmu tur.
2.6.4. Redükte Glutatyon Ölçümü
Redükte glutatyon ölçümü Ellman metodunu temel almaktadır (Elman, 1959).
Özetle, 0,5 ml homogenat 0,15 ml 0,15M KCl ve 3 ml deproteinize solüsyonu
karı tırıldı. Örnekler 3000 rpm’de 10 dakika çevrildikten sonra süpernetanlar
alındıktan sonra 2 ml fosfat solüsyonu ve 0,5 ml DTNB, örneklerin süpernatanının
0,15 ml’sine eklenmi 412 nm’de okunmu standartlarla kar ıla tırılmı tır.
2.6.5. Okside Glutatyon Ölçümü
Okside glutatyon hesapları toplam glutatyon miktarından redükte olan miktarın
çıkarılması sonunda elde edilmi tir.
2.6.6. Glutatyon Redüktaz Ölçümü
Ölçüm tekni i limitli konsantrasyondaki glutatyon redüktazın NADPH’i NADP+’ye
oksidasyonunu katalizlemesini temel almaktadır. Bir ünite aktivite 1 dakikada 1 µM
okside glutatyonun 7,6 pH ve 25 oC’de redükte eden ezim miktarı olarak tarif
edilmektedir. Bir molekül NADPH için bir molekül GSSG indirgenmektedir. Bu
nedenle okside glutatyon redüksiyonu direk olarak NADPH tüketiminin ölçümüyle
gerçekle mektedir. Böylece örnekler üzerinde 340 nm dalga boyundaki zamana göre
azalma enzimin aktivitesinin ölçüsü olarak kullanılmı tır.
27
2.6.7. Glutatyon Peroksidaz Ölçümü
Ölçüm dolaylı olarak hücresel glutatyon peroksidaz (c-GPx) aktivitesi ölçümünü
temel almaktadır. (Paglia and Valentine, 1967) Doku homogenatlarında bulunan cGPx ölçümü için içerisinde glutatyon, glutatyon redüktaz ve NADPH olan küvetin
içine trasfer edilmi ve reaksiyon tert-butyl hidroperoksit konularak ba latılmı tır.
Subsrat eklemesinin ardından 340 nm’de so urganlık okunmu tur.
2.6.8. Nitrik Oksit Türevleri Ölçümü
Ölçüm metodu toplam nitrit ölçümü prensibine dayanmaktadır. Greiss kullanılarak
spektrofotometrik nitrik ölçülmesi oldukça hızlı ve do ru sonuçlar vermesine
ra men, nitrat miktarını ölçmedi inden nitrik oksit ürünlerinin ölçümünde
yanlı lıklara neden olmaktadır. Yanlı ölçüm olasılı ını ortadan kaldırmak için
öneklerdeki nitratların nitrit çevrilmesi için granüller kadmiyum metalleri ile
muamele edilmi tir. Asidik çözelti içerisinde nitritin, nitröz aside (HNO2) çevrilmesi
sa lanmı tır. Bu asit daha sonra N-(1-Naphthyl)-ethylenediamine (NED) ile
reaksiyona sokulmu ve 540 nm dalga boyunda standarta kar ı okunmu tur.
2.6.9. Metallothionein Protein Ölçümü
MT gümü (Ag+) doyurma metodu ile ölçümü di er sitozolik ligantlarla kıyasla
MT’nin yüksek Ag+ ba lama kapasitesi ve ısı dayanıklılı ına dayanır. Örne e
hemoglobin (Hb) eklenmesi MT dı ında di er tüm ligantlarda Ag+’ü ayırır. Isıtma
esnasında hemoglobin-Ag+ çöker. Tekrar eden Hb ilavesi ve ısıtma a ırı Ag+’i ve
di er tüm Ag+ ba layan ligantları uzakla tırır. Bu sebeple ısıtılan süpernatanta Ag+
özellikle temel olarak MT’ye ba lıdır. MT konsatrasyonu final süpernatanttaki Ag+
miktarının ölçülmesiyle hesaplanır. Final süpernatant fraksiyonundaki Ag+ miktarı
MT miktarını gösterir. Bununla beraber izole edilen MT potansiyel olarak 20 mol
Ag/mol proteine ba lanabilir.1 µg Ag 3,55 µg MT’yı göstermesi baz alınarak
hesaplamalar yapılmı tır. Örneklerin Ag+ miktar tayinleri atomik absorpsiyon
28
spektrofotometresi (AA-30/40 Varian atomic absorption spectrometer) kullanılarak
yapılmı tır (Scheuhammer, 1991).
2.6.10. nsülin ve Selenyum konsantrasyonlarının Tayin edilmesi
Deney grubu sıçanlarından toplanan kan örnekleri Kervan ve Girard’ın (1974)
metoduyla
radyoimmünoassay
ile
ölçüldü.
Kalp
dokularındaki
selenyum
konsantrasyonları ise grafit atomik absorpsiyon spektrometresi (AA-39/40 Varian
atomic absorption spectrometer) ile ölçüldü.
2.7. statistiksel Analizler
Tüm deney sonuçları ortalama±s.e.m (standart error of the mean) olarak verilmi tir.
Akımların kinetik analiz (aktivasyon, inaktivasyon, reaktivasyon) parametrelerinin
gruplar arasındaki de i imini de erlendirmek için davranı denklemlerinin bir bütün
olarak kar ıla tırılmasını sa layan F-testi kullanılmı tır. Di er bütün parametreler iki
yönlü t-testi ile kar ıla tırılmı tır.
2.8. Kullanılan Kimyasallar
NaCl, KCl, MgSO4, CaCl2, KH2PO4, HEPES, glikoz, Cs-aspartat, CsCl, MgC12,
fosfokreatin-Na2, ATP-Na2, EGTA, Na2GTP, CdCl2, Na2HPO4, NaH2PO4 ve sodyum
selenit Sigma (SIGMA-ALDRICH Chemie GmbH, Taufkirchen, Germany)’dan satın
alınmı tır. Collagenase A Roche firmasından (Roche Diagnostics GmbH, Manheim,
Germany) ve FURA-2AM ise Molecular Probes (Molecular Probes)’tan satın alınmı tır.
29
3. BULGULAR
3.1. Genel Bulgular
Streptozotocin (STZ) enjekte edilmi sıçanların diyabet olup olmadıkları kan eker
düzeylerine bakılarak karar verilmi olup, de eri kontrol hayvan de erinin 3 katı
(300 mg/dl) ve üstünde olanlar diyabetik kabul edilmi tir. Ayrıca sodyum selenit
enjekte edilmi kontrol ve diyabetik sıçanların kan eker düzeyleri de ölçülerek her
gruba ili kin aritmetik ortalama ve standart hata ortalaması (s.e.m) de erleri Tablo
1’de özetlenmi tir. Ayrıca tablo 1’de STZ uygulamasının I. ve V. haftalardaki, kan
eker de erleri, vücut a ırlıkları, deney sonunda ölçülen, serum insülin ve plazma
selenyum miktar ortalama de erleri ve standart hataları görülmektedir. Tablo1’den
görüldü ü gibi kontrol grubu ve sodyum selenit uygulanmı hayvanlar 4 hafta
boyunca kilo kazanımına devam ederlerken (Kon:237,2±3,3 g; Se: 238,4±1,7 g),
diyabetik hayvanlar anlamlı bir ekilde kilo kaybına u ramı lardır (DM: 196,5±3,6
g). Diyabete 4 haftalık sodyum selenit tedavisi diyabetle gözlenen kilo kaybını
durdurmu tur (DM+Se: 208,8±5,4 g) (Tablo1).
Deney grubu
hayvanlarının
kalp
büyüklüklerinin
bir ölçüsü olan
hücre
kapasitanslarına bakıldı ında anlamlı bir farka rastlanmamı tır (sırası ile Kon, DM,
DM+Se ve Se için de erler; 180,6±13,6 pF (n=15), 189,9±12,2 pF(n=8), 188,7±15,6
pF (n=7) ve 202,1±16,1 pF (n=7) olarak ölçülmü tür). Parantez içindeki n de erleri
bu gruplardaki hayvan sayısını göstermektedir. Bu sonuç bize, deneysel yolla
gerçekle tirilen dört haftalık diyabet süresince kalp dokusunda hipertrofinin
geli medi ini göstermektedir.
Ölçüm yapılan haftalarda deney grubu hayvanların kan
ekeri de erlerine
bakıldı ında; deney süresince Kon grubunda herhangi bir farka rastlanmazken
(100,5±0,8 mg/dL), DM sıçanların kan ekerleri anlamlı derece artmı oldu u
(479,4±10,3 mg/dL) gözlenmi tir. Se grubu sıçanlarında kan ekerini dört haftanın
sonunda Kon grubuna göre anlamlı derece arttırmı (126,1±2,8 mg/dL) olmasına
30
ra men, diyabete aynı doz ve süreyle uygulaması artmı olan kan ekerini anlamlı
derece azaltmı tır (292,9±10,3 mg/dL). Fakat bu azalma Kon grubu dü ünüldü ünde
halen anlamlı bir ekilde yüksektir (Tablo1).
Grupların plazma insülin seviyelerine bakıldı ında, diyabetle anlamlı derece azaldı ı
gözlenirken (Kon: 281,6±57,3 fmol/ml; DM: 76,1±15,9 fmol/ml), 4 haftalık selenit
uygulaması bu seviyeyi daha da dü ürmü tür (58,1±14,9 fmol/ml). Selenit enjekte
edilmi kontrol grubunda ise durum aynı paralellikle insülin seviyesinin dü mesine
neden olmu tur (109,2±15,2 fmol/ml). Diyabette selenit uygulamasının insülin
seviyesine pozitif etkisinin olmayı ı, selenyumun sistem üzerindeki etkisinin insülin
seviyesini arttırmadan yapmakta oldu unu göstermektedir (Tablo1).
Plazma selenyum konsantrasyonların kar ıla tırılması sonucunda dört deney grubu
arasında istatistiksel olarak bir anlamlılı a rastlanmamı tır (Tablo1).
Diyabetin neden oldu u komplikasyonlardan biri olarak ortaya çıkan ve ara tırmayı
amaçladı ımız diyabete özgü bu özel kardiyomiyopati, deneylerimiz için
kullandı ımız STZ dozu ve süresinde gözlenebildi i, kalp dokularının ı ık ve
elektron mikroskobu incelemesiyle de do rulanmı tır (Ayaz ve ark., 2002).
3.2 Kalbin Elektriksel Aktivitesi le lgili Bulgular
3.2.1. Papiller Kas Aksiyon Potansiyeli:
Sıçan kalbi papiller kasından uyarı altında mikroelektrot ile kaydedilen AP’lerine
ili kin sonuçlar ekil 3.1’de özetlenmi tir.
ekilde dört deney grubu sıçanlara ait
örnek AP’lerini gruplardan yöntem ve gereçler kısmında tarif edildi i
ekilde
hesaplanan APD25 APD50 APD75 APD90 de erleri ortalama ve standart hata olarak
sunulmu tur.
31
TABLO 1: Hayvanların genel parametreleri
Vücut A ırlı ı
(g)
Kan ekeri
(mg/dl)
Plazma
nsülin
(x10
fmol/ml)
Plazma
Selenyum
(ng/ml)
Ba langıç
Biti
Ba langıç
Biti
Kon
215,5±2,6
(n=35)
237,2±3,3
(n=35)
100,5±0,8
(n=35)
100,5±0,8
(n=35)
28,2±5,7
(n=9)
113,4±16,5
(n=8)
DM
226,2±2,1
(n=46)
196,5±3,6*
(n=35)
101,6±0,7
(n=46)
479,4±10,3*
(n=35)
7,6± 1,6*
(n=8)
107,1±10,8
(n=8)
DM+Se
227,5±2,4
(n=36)
208,8±5,4*
(n=29)
99,5±0,5
(n=36)
292,9±10,3*#
(n=29)
5,8±1,5*
(n=9)
137,3±8,8
(n=8)
Se
215,9±1,7
(n=30)
238,4±1,7
(n=30)
101,1±0,4
(n=30)
126,1±2,8*
(n=30)
10,9±1,5*
(n=7)
126,7±5,8
(n=7)
Yukarıdaki kısaltmalar kontrol (kon), diyabet (DM), selenyum enjekte edilmi diyabet (DM+Se)ve selenyum enjekte edilmi kontrol (Se) olarak
kullanılmı tır. Gruplarda deneye alınan hayvan sayısı n, deney sürecinin ba langıcında ve sonunda ölçülen a ırlıkları (g) ve kan ekeri düzeyleri
(mg/dl). De erler ortalama±SEM olarak verilmi tir.*p<0.05 vs K ve #p<0.05 vs DM.
32
Dört haftalık deney sürecinin sonunda deney grubu sıçanların papiller kas
AP’lerinden dinlenim zar potansiyelleri arasında (RMP) bir farka rastlanmamı tır
(RMPkon:-82,2±0,7 mV; RMPDM:-81,7±1,3 mV; RMPDM+Se:-79,5±1,5 mV; RMPSe:80,7±1,4 mV). Aynı paralellik içerinde ölçülen AP’lerin maksimum depolarizasyon
(MD) de erleri arasında da bir fark bulunamamı tır (MDKon: 13,59±0,77 mV;
MDDM:11,38±1,24 mV; MDDM+Se:10,01±1,46 mV MDSe:11,35±1,87 mV). Dört
haftalık diyabet sürecinde repolarizasyon süresinin kontrol grubuna göre anlamlı bir
ekilde uzadı ı bulunmu , selenit uygulaması bu süreyi düzeltmi tir. Kontrol grubu
sıçanlarına selenit uygulaması ölçüm yapılan hiçbir AP parametresini istatistiksel
olarak anlamlı seviyede (p < 0,05) etkilememi tir ( ekil 3.1 B).
Diyabet sonrasında gözlenen uzamı AP repolarizasyonu fazının altında yatan iyonik
mekanizmayı anlamaya yönelik yapılan çalı ma sonuçları ise a a ıdaki paragraflarda
verilmi tir.
3.2.2. Potasyum Akımları
Deney grubu sıçan miyositlerinden kaydedilen Ito
ekil 3.2’de görülmektedir.
Diyabet olu umunun ardından ölçüm yapılan potansiyel farkları arasında +30 - +70
mV arasındaki de erler için Ito yo unlu unda anlamlı bir azalma gözlenmi tir. (+ 70
mV potansiyel fark için de erler, Kon: 14,1±1,4 pA/pF; DM:7,7±1,0 pA/pF gibidir.).
( ekil 3.2 B). Ito’un detaylı kinetik analizlerinin sonuçları ekil 3.3’de görülmektedir.
Boltzman da ılımı ile e ri uydurulması sonucu maksimum de erin yarısına ula ması
için gerekli potansiyel faklar (V50) kar ıla tırılmı , diyabetin olu umunu takiben
potasyum akımlarına ili kin de i en tek eyin akım yo unlu u olmadı ı kanalın
inaktivasyonunun da aynı zamanda hızlandı ı (V50kon: -23,0±0,3 mV ve V50DM:27,1±0,4 mV) görülmü tür.
33
A
Kon
50 mV
DM
50 ms
DM+Se
Se
B
150
*
Kon
DM
DM + Se
Con + Se
Zaman (ms)
120
90
60
30
*
*
*
#
#
#
#
0
APD25
APD50
APD75
APD90
ekil 3.1: Deney gruplarına ait papiller kas aksiyon potansiyellerine ili kin sonuçlar.
Deney gruplarına ili kin kısaltmalar kontrol (kon), diyabet (DM), selenyum enjekte edilmi
diyabet (DM+Se)ve selenyum enjekte edilmi kontrol (Se) olarak kullanılmı tır. AP’ye
ili kin örnek ekiller A’da. Papiller kas AP repolarizasyon evresinin %25, 50, 75 ve 90
(APD25, APD50, APD75, APD90)’ne inme süreleri (ortalama±SEM) B’deki gibidir. *p<0.05 vs
Kon, ve #p<0.05 vs DM .
34
Kanalın aktivasyonu ve reaktivasyonu gibi di er kinetik özelli ine ait her hangi bir
farkın olmadı ı bulunmu tur. Daha önce kalbin histopatolojik bulgularında düzelme
gözlemledi imiz diyabete dört haftalık sodyum selenit enjeksiyonu, kalbin apeks
bölgesinden kaydedilen bu azalmı Ito’u düzeltmi tir (DM+Se: 15,2±1,8 pA/pF)
( ekil 3.2 B). Ayrıca akım yo unlu uyla birlikte bozulmu inaktivasyonun da
düzeldi i gözlenmi tir (V50DM+Se= -24,4±0,8 mV) ( ekil 3.3 B). Selenit uygulaması
diyabetle gözlenen kanalın kinetik özelliklerinden, inaktivasyon dı ında her hangi bir
ba ka de i ikli e neden olmadan akım yo unlu unun artmasını sa lamı tır.
Iss akımlarına ili kin, yine be haftalık diyabet süresince akımın tepe de erinin
azalmı oldu u bulunmu tur (+ 70 mV potansiyel fark için de erler, Kon: 7,2±1,2
pA/pF; DM:4,5±0,7 pA/pF gibidir). Azalmı olan bu akım dört haftalık sodyum
selenit uygulaması ile kontrol grubu de erlerine do ru artmı tır (DM+Se:6,3±0,9).
IK1 akımlarının kar ıla tırılması sonucunda, gruplar arasında (-120 mV potansiyel
fark için de erler, Kon: -21,6,±1,5 pA/pF; DM: -18,2±1,0 pA/pF DM+Se: -23,9±3,1
gibidir) anlamlı bir farkın olmadı ı gözlenmi tir( ekil 7B).
Sodyum selenitin kontrol grubu sıçanlarına uygulanması ölçüm yapılan potasyum
akımları üzerine anlamlı bir de i ikli e neden olmamı tır
3.2.3. L tipi Kalsiyum Akımları
Hücre içi serbest Ca2+ düzenlenmesinde rol alan ve literatürde yapılan deneylerde
çeli kili sonuçlar içeren Ca2+ akımına ili kin sonuçlar ekil 3.4’de görülmektedir.
Ölçülen 0mV’taki tepe ICaL kar ıla tırılması sonucunda gruplar arasında önemli bir
farka rastlanmamı tır. (Kon: -11,0±0,9 pA/pF; DM:-10,7±1,1 pA/pF; DM+Se: 9,3±0,4 pA/pF; Se: -10,6±1,6 pA/pF; Se: -10,6±1,6 pA/pF) ( ekil 3.4). Ca2+
kanallarının kinetik incelenmesi için yapılan Boltzman da ılımı e ri uydurulması
sonucunda, tepe de erin yarısı için (V50) gerekli olan potansiyel farkların
kar ıla tırılması sonucunda gruplar (V50Kon: -17,3±1,8 mV; V50DM: -17,6±0,7 mV;
V50DM+Se: -15,9±1,1 mV) arasında bir fark gözlenmemi tir ( ekil 3.5).
35
1 pA
A
Kon
B
100 ms
DM+Se
DM
20
+70 mV
#
#
#
#
-80 mV
#
10
* * *
* *
0
-120
#
-70
-20
30
mV
80
-10
Kon
-20
pA / pF
DM
DM+SE
-30
EK L 3.2: Gruplara ili kin potasyum akımları. Deney grupları için kullanılan
kısaltmalar ekil 3.1’deki gibidir. A’da gruplardan kaydedilen örnek potasyum akımları. Bu
kayıtlar için hücrelerin kapasitans de erleri Kon=103.1 pF, DM=110.3 pF ve DM + Se=
107.3 pF’tır. B’de ise Kon, DM ve DM+Se gruplarının alınan akımların I-V grafikleri.
*p<0.05 vs Kon ve #p<0.05 vs DM.
36
A
Kon
B
100
100
% Aktivasyon
80
DM + Se
60
40
-30
mV
% naktivasyon
DM
80
60 mV
60
-80 mV
40
20
20
0
0
20
-60
70
C
70 mV
-10
mV
100
% Reaktivasyon
80
60
70 mV
40
-80 mV
20
ms
0
0
100
200
300
EK L 3.3: Gruplar için Ito akımlarının kinetik analizleri. Deney grupları için kullanılan
kısaltmalar ekil 3.1’deki gibidir. Gruplardan elde edilen ortalama de erler ve Boltzman
denklemlerinin uygulanması ile çizdirilmi aktivasyon (A) ve inaktivasyon (B) e rileri.
Reaktivasyon (C) e risi için üssel fonksiyon denklemine uydurulmu tur. De erler ortalama
±SEM olarak verilmi tir *p<0.05 vs Kon
40
37
A
Kon
DM+Se
500 pA
DM
100 ms
B
mV
0
-40
-20
0
20
40
60
-2
-4
-6
-8
+60 mV
Kon
DM
-10
Dm +Se
-12
-80 mV
pA.pF
-1
EK L 3.4: Gruplara ili kin L tipi kalsiyum akımları. Deney grupları için kullanılan
kısaltmalar ekil 3.1’deki gibidir. A’da Kon, DM ve DM+Se gruplarına ait birer örnek ICaL
kayıtları. Bu kayıtlar için hücrelerin kapasitans de erleri Kon=90.0 pF, DM=93.2 pF ve DM
+ Se= 92.4 pF’tır. B ise zar potansiyeline göre ölçülen akım yo unluklarının ortalamasından
elde edilen de erlerin de i imini ve akım kayıtları için kullanılan voltaj protokolünü
gösteren grafik (inset). De erler ortalama±SEM ile temsil edilmi tir.
38
B 100
100
DM
80
Dm +Se
60
40
-40
mV
60
40
20
0
0
0
-70
-20
% Reaktivasyon
C 100
80
60
0 mV
40
-80 mV
20
0
40
0 mV
-80 mV
20
-20
20 mV
80
% naktivasyon
Kon
% Aktivasyon
A
240
440 ms 640
EK L 3.5: L tipi kalsiyum kanallarının kinetik incelenmesi. Deney grupları için
kullanılan kısaltmalar ekil 3.1’deki gibidir. Grupların L tipi Ca2+ kanalı kinetik
parametreleri, noktalara Boltzman denkleminin uydurulması ile elde edilen aktivasyon(A),
inaktivasyon(B). Reaktivasyon (C) e risi için ise üssel fonksiyon denklemine uydurulmu tur.
De erler ortalama±SEM ile temsil edilmi tir.
mV 30
39
3.3. Kalbin Mekanik Aktivitesi le lgili Bulgular
3.3.1. Papiller Kas Kasılma Sonuçları
Deney grubu hayvanlarından alınan birer örnek kasılma e rileri ekil 3.6A’da
görülmektedir. ekilde ayrıca deney grubu hayvanlarına ait ortalama PT, TD ve RT50
de erleri ve standart hataları ile verilmi tir. ekilden açıkça görüldü ü gibi diyabetik
grupta kasılma kuvvetinin tepe de erinde anlamlı bir de i iklik gözlenmezken
(PTkon= 400±25 mg; PTDM= 430±16 mg; PTDM+Se= 403±9 mg; PTSe= 378±34 mg),
aynı grubun kasılma süresi (TDkon= 280±10 ms; TDDM= 350±26 ms; TDDM+Se=
310±13 ms; TDSe= 285±38 ms) ve gev eme süresi (RT50kon= 95±5 ms; RT50DM=
110±7 ms; RT50DM+Se= 100±4 ms; RT50Se= 88±12 ms) kontrollere nazaran
istatistiksel olarak anlamlı seviyelerde uzamı tır. Diyabete selenyum uygulaması
diyabetle uzamı olan kasılma ve gev eme sürelerini kontrol grubu de erlerine
yakla tırmı tır. Selenitin kontrol grubu sıçanlarına uygulanması ölçüm yapılan
kasılma parametrelerinden hiçbirisini istatistiksel olarak anlamlı seviyelerde
de i tirmemi tir ( ekil 3.6).
3.4. Hücre çi Serbest yon Deri imi le lgili Bulgular
Deney grubu sıçanlarından izole edilen kalp hücreleri, bir saatlik inkübasyon
süresinin sonunda, Fura 2-AM ile yüklenip bir kısmı ile bazal di er kısmı ile de 0,2
Hz frekanslı (30 V ve 10 ms) uyarı verilerek Ca2+ cevapları (transient) ölçülmü tür.
Bazal ölçümler için yöntem ve gereçler bölümünde verildi i ekilde [Zn2+]i’un Ca2+
ölçümüne olan katkısı varlı ında ve etkiyi 30 µM TPEN kullanarak ortadan kaldırma
yani Zn2+’yu ba lama yoluyla yapılan ölçümlerin sonuçları ekil 3.7 A ve B’de
özetlenmi tir. Kısaca serbest Zn2+ ba lanarak elde edilen Ca2+ ölçümleri üzerinden
hesaplanan [Zn2+]i’da yine ekil 3.7 C görüldü ü gibidir.
40
A
Dm
400 mg
Kon
200 ms
Dm + Se
Se
B
500
Kon
DM
DM +Se
Se
mg
400
300
200
100
0
PT
400
150
C
500
*
*
100
#
ms
ms
300
200
50
100
0
0
TD
RT50
ekil 3.6: Kasılma parametrelerine ili kin sonuçlar. Deney grupları için kullanılan
kısaltmalar ekil 3.1’deki gibidir. A’da farklı gruplardan elektriksel uyaranla kaydedilmi
tipik sarsı (kasılma-gev eme) e rilerini, B’de ortalama kasılma kuvvetlerini, ve C’de ise
kasılma (sol) ve gev eme (sa ) fazlarına ili kin kinetik parametreler görülmektedir. Tepe
gerim (PT), tepeye çıkı süresi (TD) ve ini süresinin yarısına dü mesi için gereken
süre(RT50). De erler ortalama±sem olarak sunulmu tur. *p<0.05 vs Kon ve #p<0.05 vs DM .
41
[Zn2+]i’un ölçüm üzerindeki etkisi dü ünülmeden yapılan kayıtlar sonunda, dört
haftalık diyabet sürecinin sonunda bazal [Ca2+]i de eri Kon grubuna nazaran anlamlı
bir ekilde artmı olarak bulunmu tur. Diyabete selenit uygulaması, artmı olan
de eri azaltmasına ra men, ölçülen bu de er halen Kon grubuna göre yüksek
bulunmu tur. Kon grubu sıçanlarına sodyum selenit uygulaması, ölçülen bazal
[Ca2+]i de erinde her hangi bir anlamlı de i ikli e neden olmamı tır ( ekil 3.7 A).
TPEN varlı ında ölçülmü olan bazal [Ca2+]i’un kar ıla tırılmasından diyabetin bu
de eri anlamlı bir ekilde artmasına neden oldu u gözlenmi tir ( ekil 3.7 C). Dört
haftalık selenit uygulaması artmı olan [Zn2+]i’un kontrol grubu sıçanları için ölçülen
de ere normalize etmi tir. DM+Se grubu için TPEN yoklu unda ve varlı ında
ölçülen bazal [Ca2+]i de er farkının gerçekte serbest Zn2+’ya ait oldu unu
göstermektedir ( ekil 3.7 A ve C). Bu da bize sodyum selenit uygulamasının
diyabetin neden oldu u bazal [Ca2+]i de i imini artmı olan bazal [Zn2+]i’dan daha
fazla oranda etkilemi oldu unu göstermektedir.
Sodyum selenitin kontrol grubu sıçanlarına aynı doz ve süre ile uygulanması bazal
[Zn2+]i düzeyinde anlamlı bir etkiye neden olmamı tır ( ekil 3.7 C).
Hücrelerin sitoplazmaya Ca2+’un salınım ve geri alımının miktarını ve kineti ini
belirleyebilmek (Ca2+ transientleri) için uyarı altında alınan kayıtlara ili kin örnek
traseler ekil 3.8’de görülmektedir. ekil 3.9’da TPEN yollu unda ortalama olarak
her hücre için gama distribüsyonu uydurularak hesaplanan tepe (maksimum), TP ve
DT50 de erleri ortalama ve standart hataları ile birlikte sunulmu tur. Ölçüm yapılan
de erlerin kar ıla tırılmasından, literatür bulgularıyla uyumlu bir ekilde, diyabetik
yapılan sıçanlarda maksimum de erin azaldı ı, TP ve DT50 de erinin ise anlamlı
ekilde uzamı oldu u bulunmu tur. Dört haftalık selenit uygulaması ölçüm yapılan
tüm bu de erleri kontrol grubu sıçanları için bulunan de erlere döndürmü tür.
Selenit uygulaması kontrol grubuna uygulanması ölçüm yapılan de erler için bir
farklılı a neden olmamı tır ( ekil 3.9).
42
A
Kon
2+
Bazal [Ca ]i
100
Dm
*
75
Dm + Se
Se
nM
#
50
25
0
B
70
2+
Bazal [Ca ]i(TPEN)
nM
35
nM
*
C
#
2+
1
0.75
Bazal [Zn ]i
*
#
0.5
0.25
0
0
ekil 3.7: Hücre içi bazal kalsiyum ve çinko deri imleri. Deney grupları için kullanılan
kısaltmalar ekil 3.1’deki gibidir. Hücre içi serbest Ca2+ ve Zn2+ ölçüm de erleri. A’da bazal
Zn2+ ölçümüne olan katkısı kaldırılmadan B’de kaldırılarak (30µM TPEN) alınan bazal
Ca2+ölçümleri. C’de bazal serbest Zn2+ de erleri. *p<0.05 vs Kon ve #p<0.05 vs DM .
43
Bazal kayıtları için kullanılan aynı miktar TPEN ile yapılan ölçümlerde TPEN’siz
ölçümlerle aynı yanıtların elde edilmesi, bize Zn2+ transientlerinin olmadı ı ve/veya
gözlenemedi i sonucunu göstermi tir ( ekil 3.10).
ekilde üstteki e ri orijinal
transient kayıtlarını, alttaki histogramlar ise bu transientlerden ölçülen ortalama
0.2 F340/380
de erleri göstermektedir.
10 s
A
Kon
0.2 F340/380
B
DM + Se
1s
DM
Se
ekil 3.8. Hücre içi Ca2+ transientleri. Deney grupları için kullanılan kısaltmalar ekil
3.1’deki gibidir. Bir kontrol kardiyomiyositinden uyaran etkisinde belli bir zaman boyunca
kaydedilen hücre içi Ca2+ transientleri ve hücre uyaranı olarak elektriksel alan uyarısının
uygulama biçimi A’da, B’de ise gruplardan alınan birer örnek transient traseleri
görülmektedir.
44
B
Kon
DM
DM + Se
0.3
*
Se
TP (s)
0.2
0.4
#
Maksimum (∆ F340/380)
A
0.1
0
0.3
*
0.2
0.1
0
C
0.8
DT50 (s)
0.6
*
#
0.4
0.2
0
ekil 3.9: Hücre içi serbest Ca2+ transientlerinin kinetik de erlerinin 30 µM TPEN
yoklu unda ölçülen de erler. Deney grupları için kullanılan kısaltmalar ekil 3.1’deki
gibidir. Kinetik incelemede tepeye çıkı süresi (TP) (A), tepe de er (maksimum) (B) ve ini
sürecinin yarısı için geçen süre (DT50) (C). *p<0.05 vs Kon ve #p<0.05 vs DM .
45
0.85
A
TPEN
F 340/380
0.65
0.45
0.25
*
TP (s)
C
Kon
DM
DM + Se
Se
0.3
0.2
0.4
Maksimum (∆ F340/380)
B
0.1
#
0.3
*
0.2
0.1
0
0
D
0.8
DT50 (s)
0.6
*
#
0.4
0.2
0
ekil 3.10: Serbest Ca2+ transientlerinin kinetik de erlerinin 30 µM TPEN
varlı ında ölçüm de erleri. Deney grupları için kullanılan kısaltmalar ekil 3.1’deki
gibidir. Üstte kontrol grubu sıçanlarına ili kin örnek trase. Kinetik incelemede tepeye
çıkı süresi (TP) (A), tepe de er (maksimum) (B) ve ini sürecinin yarısı için geçen süre
(DT50) (C). *p<0.05 vs Kon ve #p<0.05 vs DM .
46
3.5. Hücre çi Serbest Zn2+Deri imi ve Metallothionein Seviyesi
Metal ba lama kapasitesi nedeniyle hücre içi serbest metallerin, özellikle [Zn2+]i’un
düzenlenmesine yardımcı en temel yolaklardan biri olan MT protein ölçümlerinin
sonucu Tablo 2’de özetlenmi tir. Ag+ doyurma yöntemiyle ölçülen protein
miktarlarının kar ıla tırılması sonucunda diyabet sonrası ölçümü yapılan protein
miktarının azalmı oldu u bulunmu tur (39.00 ± 1.81 µg/g doku ; 24.36 ± 4.04 µg/g
doku). Dört haftalık sodyum selenit uygulaması azalmı protein miktarını kontrol
grubu de erlerine artmasını sa lamı tır (43.24 ± 6.97 µg/g doku). Kontrol grubuna
sodyum selenit uygulaması, ölçülen MT protein miktarında anlamlı bir farka neden
olmamı tır (Tablo 2).
Tablo 2: Grupların bazal [Ca2+]i, [Zn2+]i ve metallothionein seviyesi ölçüm de erlerinin
kar ıla tırılması.
Deney Grupları
Bazal Ca2+ (nM)
Bazal Zn2+ (nM)
Kon
26,53±3,67
0,52±0,06
DM
49,66±9,03*
0,87±0,05*
DM+Se
23,67±4,34
#
0,69±0,05
Se
24,27±3,78
0,57±0,04
#
Metallothionein
(µg/g doku)
39,00±1,81
(N=9)
24,36± 4,04*
(N=9)
43,24±6,97#
(N=8)
37,68±6,90
(N=9)
Deney gruplarına ili kin kısaltmalar tablo 1’deki gibidir. Tabloda N deneye alınan hayvan
sayısını temsil etmektedir. De erler ortalama±sem olarak ifade edilmi tir. *p<0,05 vs K ve
#p<0,05 vs DM ,
3.6. Antioksidan Savunma Sistemi le lgili Bulgular
Hücresel proteinlere ve genetik materyale zarar vererek yapı ve fonksiyonel
bozukluklara neden olan serbest radikallerin kontrol mekanizmasına ili kin lipit
peroksidasyon (LPO), süperoksit dismutaz (SOD), redükte (GSH)ve okside (GSSG),
glutatyon redüktaz (GR), glutatyon peroksidaz (GSHPx) ve toplam nitrik oksit
ürünleri (NO Ürünleri) ölçümlerinden elde edilen ortalama de erler ve standart hata
47
de erleri tablo 3 de özetlenmi tir. Dört haftalık diyabetin sonucunda kalp dokusunda
LPO, GSSG, ve GSHPx de erlerinin tamamında anlamlı bir artı gözlenirken, SOD,
GSH ve GR de erlerinde azalma gözlenmi tir. Ölçüm yapılan de erler sonucunda
belirtilen süre içerisinde oksidan stres ko ulu diyabet kalp dokusunda gözlenmi tir.
Özellikle antioksidan özelli i ile ön plana çıkan sodyum selenit uygulanması
sonucunda sistemin önemli noktalarında ciddi düzelmeler oldu u gözlenmi tir.
Bunların arasında; artmı olan LPO, GSSG ve GSHPx de erleri kontrol grubu sıçan
de erlerine dönü yapmı tır. Paralel biçimde azalmı olan SOD, GSH ve GR
de erlerinin kontrol seviyelerine yükselmesine neden olmu tur. Kısaca diyabet
olu umuyla gerçekle en patolojik durumu nerdeyse tamamen kontrol seviyelerine
döndürmü tür. Selenitin kontrol sıçanlarını aynı süre ve dozla uygulanması ölçülen
parametreler arasında sadece okside glutatyon ve GSHPx seviyelerinin artmasına
neden olmaktadır. GSHPx enziminin bir parçası olarak bilinen selenitin serumdaki
seviyesinde de i iklik olmadan (Tablo3) bu enzimin aktivitesini arttırması ve okside
glutatyon seviyesinde bir artı a neden olması oldukça do al bir sonuçtur. Deney
gruplarının tümü için nitrik oksit ürünlerinin miktarları açısından istatistiksel anlamlı
herhangi bir farka neden olmamı tır.
0,82±0,18*
0,48±0,07#
0,49±0,07
DM
(n=9)
DM+Se
(n=8)
Se
(n=8)
0,70±0,18
0,72±0,15#
0,48±0,07*
0,67±0,04
SOD
(mU/g
doku)
5,97±0,29
5,71±0,41
4,76±1,20*
6,82±0,36
GSH
(µM/g
doku)
5,40±0,85*
5,16±1,41#
8,69±1,68*
3,17±1,03
GSSG
(µM/g
doku)
2,94±0,16
2,90 ±0,32#
1,88±0,16*
2,58±0,15
GR
(mU/mg
protein)
1,61±0,20*
1,34±0,20#
2,22±0,37*
1,25±0,14
GSHPx
(mU/mg
protein)
1,29±0,23
1,30±0,25
1,98±0,34
1,35±0,19
NO Ürünleri
(µM/mg protein)
Tabloda kısaltmalar lipit peroksidasyon (LPO), süper oksit dismutaz (SOD), indirgenmi glutatyon (GSH), okside glutatyon (GSSG), glutatyon
redüktaz (GR), glutatyon peroksidaz (GSHPx) ve nitrik oksit ürünleri (NO ürünleri)’i temsili için kullanılmı tır.Tabloda n de erleri deneyler için
kullanılan hayvan sayılarını temsil etmektedir, *p<0,05 vs Kon ve # p<0,05 vs DM.
0,49±0,03
Kon
(n=8)
LPO
(µM/g
doku)
Tablo 3: Antioksidan sistem parametrelerine ili kin sonuçlar.
48
49
4. TARTI MA
Bu çalı mada, STZ ile diyabetik yapılmı sıçanlara dört haftalık kronik sodyum
selenit uygulamasının, diyabette gözlenen a ırı derecede kan ekeri artı ını bir miktar
azalttı ı ve kilo kaybını düzeltmese bile kaybı stabilize etti i gösterilmi tir. Konuyu
ara tıran sınırlı sayıdaki literatür bulgusu ile kısmen uyumluluk gösteren bu
sonuçların altında yatan mekanizma tam olarak bilinmiyor olmasına kar ın,
literatürde
bu
etkilerin
“insülin
benzeri”
ve/veya
antioksidan
etkisinden
kaynaklanmı olabilece i eklinde yorumlanmaktadır (McNeill ve ark., 1991; Gosh
ve ark.,1994; Ezaki, 1990). Ayrıca klinik deneylerle de diyabetli hastalarda gözlenen
kardiyomegali, sol ventrikül fonksiyon bozuklu u ve kongestif kalp yetmezli i gibi
bulguların altında yatan nedenin miyokardiyal hücre fonksiyonuna insülin
eksikli inin do rudan bir etkisi sonucu olabilece i ileri sürülmektedir (Regan ve
ark., 1977; D’elia ve ark., 1979).
Diyabet kaynaklı ölümlerin nedenleri arasında gözlenen ikincil etkilerin içinde
kardiyak fonksiyon bozuklukları (diyabetik kardiyomiyopati) en önemli nedeni te kil
etmektedir. Diyabet süresince kalbin elektriksel olarak yeniden modellenmesinin
(remodelling) altında insülin sinyal iletisinin bozulması, iyonik akım bozuklukları ve
uzamı AP gibi de i iklilikler yer almaktadır (Fein ve ark., 1980; Fein ve ark., 1986;
Jourdon ve Feuvary, 1993; Shimoni ve ark., 1994; Wang ve ark., 1995). Tip 1
diyabetle gözlenen uzamı AP baskılanmı K+ akımları ile açıklanabilmektedir
(Jourdon ve Feuvary, 1993; Magyar ve ark., 1992; Shimoni ve ark., 1994; Wang ve
ark., 1995). Bu çalı mada, mikromolar düzeyindeki sodyum selenit uygulamasının
diyabetle ortaya çıkan hem AP’deki uzamayı hem de kasılma-gev eme
fonksiyonundaki bazı parametrelerdeki bozuklukları normalize etti i gösterilmi tir.
Sodyum selenit uygulaması diyabetle azalmı olan K+ akımlarının tepe de erlerini
kontrol de erlerine yakla tırmı tır. Shimoni ve ark (1999) tarafından K+ kanal
proteinlerinin regülasyonunun insülin sinyal iletim yola ı ile ili ki içinde oldu unun
gösterilmesi ve diyabetik K+ akım yo unlu unun insülin inkübasyonu ile normalize
edilmesi bulguları (Shimoni ve ark., 1994; Shimoni ve ark., 1998; Shimoni ve ark.,
1999; Xu ve ark., 2002) selenyumun insülin yolakları ile ili kili bir etkisinin
50
olabilece ini dü ündürmektedir. Buna ek olarak, çalı mamızda selenyum verilmi
diyabetli grupta insülin seviyesinin diyabetlilere göre daha da dü mesi bu savı
do rulamamaktadır. Ancak etkinin do rudan insülin reseptörleri üzerine de il ama
bu yolak üzerinde ba ka a amalarda olabilece ini de dü ündürmektedir.
Diyabetle gözlenen kardiyak AP süresinin uzamasına neden olabilecek bir di er iyon
akımı da L-tipi Ca2+ akımıdır. Bu kanal akımları üzerine yapılan çalı malarda, AP
repolarizasyon süresinin uzamasından ICaL’daki artı ın sorumlu oldu unu ileri
sürülmü (Hayashi ve Noda, 1997) olsa da, bu akımların de i medi ini (Tsuchida ve
ark.,1994; Jourdon ve Feuvray, 1993) ve hatta azaldı ını gösteren çalı malar da
bulunmaktadır (Wang ve ark., 1995). Be
haftalık diyabet sürecinin sonunda
ölçümlerimiz ICaL etkilenmedi ini göstermektedir. Bu bulgular, yaptı ımız diyabet
modeli için gözlenen AP repolarizasyon fazındaki anlamlı uzamadan sadece K+
akımlarının sorumlu oldu u göstermektedir. Bunun yanında, Ca2+ kanalların
aktivasyon, inaktivasyon ve reaktivasyon kinetiklerinin de de i medi ini ortaya
koyan bulgularımız bu sonuçları peki tirecek niteliktedir.
Kardiyak Ito ve ICaL’nin regülasyonu ve modifikasyonu ya , nörohormonal faktörler,
patofizyolojik durum ve kalbin bölgesine ba lı olarak de i im göstermektedir (Oudit
ve ark., 2001; Lacampagne ve ark., 1995; Chiamvimonvat ve ark., 1995).Kayıt
edilen Ito kinetiklerine ili kin, Gallego (2000) akımların inaktivasyonlarının diyabetle
hızlandı ını göstermi olmasına ra men Jourdon and Feuvray (1993) hem potasyum
hem de ICaL’de herhangi bir modifikasyon gözlemleyememi lerdir. Bizim diyabet
modelimizde sadece Ito inaktivasyon zamanı hızlanmı ve dört haftalık sodyum
selenit tedavisi ile sa lıklı hayvanlardan alınan kayıt de erlerine dönmesini
sa lamı tır. Hücre içinde redoks durumun de i mesi, proteinlerin yapı ve
fonksiyonlarını de i tirmesi son derece do al bir sonuçtur. De i en redoks
durumunun proteinler üzerinde neden oldu u de i imlerin en temel nedenleri
arasında amino asit diziliminde yer alan sistin residülerindeki sülfürhidril
modifikasyonları oldu u ileri sürülmektedir (Rozanski ve Xu, 2002). Sodyum selenit
tedavisinin hücre içi redoks durumu sa lıklı ko ullar için alınan de erler yönünde
51
de i tirmesi nedeni ile kanal kinetiklerini de olumlu yönde etkilemi olabilece ini
dü ündürmektedir.
Diyabetin yol açtı ı kontraktil fonksiyonel de i imlerle birlikte sodyum selenit
uygulamasının bu de i imlere olan etkisi, grupların kalplerinden izole edilen sol
ventrikül papiller kas demetleri uyarılarak incelenmi tir. Yapılan deneyler
sonucunda, diyabetin literatürdeki bulgularla benzer ekilde (Ishikawa ve ark., 1999;
Satoh ve ark., 2001; Trost ve ark., 2002) tepe de erde bir fark olmaksızın kasılma
yanıtlarını de i tirdi i (TP ve RT50) gözlenirken, 4 haftalık sodyum selenit
uygulamasının bu parametreleri kontrol grubu de erlerine döndürdü ü bulunmu tur.
Bu pozitif etki, deneylerimizde gözledi imiz Ca2+ transientlerindeki pozitif etki ile
açıklanabilmektedir. Bulgularımız diyabet ile [Ca2+]i homeostazının bozulması
sonucu, kontraktil aktivitenin bozuldu unu, selenium uygulamasının ise [Ca2+]i
homeostazını düzelterek kontraktiliteyi düzeltti ini göstermektedir. Sodyum selenitin
kontrol grubu sıçanlarına verilmesi ölçüm yapılan hiçbir kasılma parametresinde
anlamlı bir de i ime neden olmamı tır.
Diyabetik kardiyomiyositlerde elektriksel alan uyarısı ile kaydedilen Ca2+
transientlerinin genli inin dü tü ü, tepeye çıkı ve ini zamanlarının ise uzadı ı
gösterilmi tir (Choi ve ark. 2002; Norby ve ark., 2004). Bununla birlikte Ye ve ark,
(2003)
genetik
diyabetli
farelerle
yaptıkları
deneylerde
diyabetin
Ca2+
transientlerinin genliklerinin de i meden kinetik parametrelerde uzamaya neden
oldu unu göstermi tir. Bu çalı manın, kalbin temel i levi olan kasılma etkinli i
sırasında [Ca2+]i seviyesinin nasıl de i ti i ve diyabetin bu de i imi nasıl
etkiledi ine ili kin olan kısmında, diyabetle Ca2+ transientlerinin genlik de erlerini
kontrol grubu miyositlerine göre dü ürdü ü, TP ve RT50 sürelerini uzattı ı
görülmü tür. Daha evvel de i mi olan kinetik parametreleri anlamaya yönelik
yapılan çalı malarda azalmı (1) ryanodin reseptör proteini (Netticadan ve ark.,
2001), (2) SERCA protein miktarı ve aktivitesi, (3) fosfolamban fosforilizasyonu ve
(4) SR Ca2+ depolama yetisi (Choi ve ark., 2002) sonuçları ile açıklamalar ileri
sürülmü tür. Bizim çalı mamızla dört haftalık sodyum selenit uygulamasının alan
uyarısı altında alınan Ca2+ transientlerine ili kin hem genli i, hem de kinetik
52
parametreleri düzeltti i tespit edilmi tir. Sodyum selenitin kontrol grubu
hayvanlarına aynı süre ve dozda verilmesi ölçüm yapılan hiçbir de ere etkide
bulunmamı tır. Sodyum selenitin diyabetli sıçanlara dört haftalık uygulaması
sonucunda transientler üzerinde gözlenen iyile tirici etkisinin, diyabetle bozulmu
insülin sinyal iletimin yolaklarında bazı pozitif etkiler ile açıklanabilir (insülin
benzeri etki) (Ezaki ve ark., 1990). Yapılan çalı malarda insülin sinyalizasyon
yolaklarında gerçekle ebilecek bir bozulmanın hücre içi redoks durumunun
de i mesine neden oldu u (Li ve ark., 2003) ve bunun hücre içi serbest iyon
homeostazının bozulmasında rol oynayabilece i gösterilmi tir (Jabr ve Cole, 1993).
Bizim çalı mamızda, hücrenin redoks durumunu düzeltti i gözlenen sodyum
selenitin, diyabetle bozulmu olan iyon regülasyonunu iyile tirmi olması literatür
bulguları ile de uyumludur. Bu da sodyum selenitin diyabette oksidan strese ba lı
komplikasyonları antioksidan özelli iyle iyile tirdi ini dü ündürmektedir.
Diyabet patogenezin olu umunda serbest radikallerin rol aldı ına ili kin pek çok
deneysel çalı ma mevcuttur (Dhalla ve ark., 1998; Sano ve ark., 1998; Winkler ve
Moser, 1992). Diyabet sonrasında gözlenen metabolik stresin otokatalitik döngüsü,
doku hasarları ve ölümleri, serbest radikal üretimi yoluyla, sanki hücrede oksidan
stresi daha da arttırmaktadır (Dhalla ve ark., 1998). Bu açıdan bakıldı ında oksidan
stres
diyabetin
ikincil
komplikasyonu
olarak
da
sayılabilir.
Diyabetik
kardiyomiyopatide oksidan sisteme ve enzimlerine ili kin sonuçlar çeli kiler
içermesine ra men (Dhalla ve ark., 1998; Sano ve ark., 1998; Winkler ve Moser,
1992) diyabet modelleri ve diyabet süreleri esas olarak farklılı ın nedeni olabilir. Bu
çalı mada yapılan diyabet modelinde artmı lipit peroksidasyona azalmı süper oksit
dismutaz aktivitesinin e lik etmesi hücrede serbest oksijen radikallerinin artmasına
neden oldu unu i aret etmektedir. Be haftalık diyabet sürecinde kalbin yeniden
modellenmesinde hücre içi toplam glutatyon miktarı artmasına ra men, bu havuzda
okside formu besleyen glutatyon peroksidaz enzim aktivitesi artması ve redükte
formu besleyen glutatyon redüktaz enzim aktivitesinin ise e zamanlı azalmı olması,
da ılımın okside glutatyon yönünde olmasını sa lamı tır. Bütün bu bulgulara ek
olarak nitrik oksit ürünlerinde artma e ilimi gözlenmesine ra men gruplar arasında
fark anlamlı bulunmamı tır. Modelimizde oksidan stresin varlı ını açıkça ortaya
53
koyan bulgularımız antioksidan özelli inden literatürde sık sözü edilen sodyum
selenitin (Alissa ve ark., 2003; Foster ve Sumar, 1997; Gosh ve ark., 1994) dört
haftalık tedavisi ile kontrol grubu de erlerine döndürdü ü bulunmu tur. Sodyum
selenitin aynı süre ve dozda kontrol grubu hayvanlarına verilmesi sistem üzerinde
önemli farklara neden olmazken, ölçüm yapılan de erler içinde glutatyon peroksidaz
enzim aktivitesinde artı a neden olması bir miktar artmı olan okside glutatyonu
kompanse etmek için oldu unu dü ündürmektedir.
Hücre içinde genellikle ba lı formda bulunan Zn2+’nun oksidan stres ko ulları
altında ba lı bulundu u bölgelerden serbest forma geçebildi i gösterilmi tir (Fliss ve
Menard, 1992; Turan ve ark., 1997). Ayrıca, aynı çalı mada serbest Ca2+ ölçümleri
için sıklıkla kullanılan oransal boya Fura 2’nin serbest Ca2+ ölçümleri için Zn2+’nun
ortamdan uzakla tırılmazsa ölçüm sonuçlarında yanlı lık olabilece i gösterilmi tir.
Turan ve arkada larının (1997) yaptı ı çalı ma göz önüne alınarak yapılan deneyler
sonucunda bazal Ca2+ ve Zn2+ de erleri hesaplanmı diyabet ile [Ca2+]i ve [Zn2+]i
de erlerinin artmı oldu u bulunmu tur. Sodyum selenit uygulaması ise bu artı olan
deri imleri kontrol de erlerine do ru döndürebildi i gözlenmi tir. Kontrol grubu
hayvanlarına selenit uygulaması ise ölçüm yapılan bu de erlerden hiç birisini anlamlı
düzeylerde etkilememi tir. Bazal [Ca2+]i hesaplamasında [Zn2+]i’un katkısı
kaldırıldı ında gruplar arasında gözlenen de i im ili kisinde bir farklılık olmamasına
ra men, hesaplanan [Ca2+]i de erlerinde anlamlı bir azalmaya neden oldu u
bulunmu tur. Her ne kadar deney grupları arasındaki de i im ili kisinde Zn2+ ölçüme
olan etkisi bir farklılık yaratmasa bile, DM+Se grubu için TPEN yoklu unda ve
varlı ındaki bazal [Ca2+]i de er farkının gerçekte serbest Zn2+’ya ait oldu unu
göstermektedir. Buda sodyum selenit uygulamasının diyabetin neden oldu u bazal
[Ca2+]i de i imini artmı
olan bazal [Zn2+]i’dan daha fazla oranda etkilemi
olabilece i eklinde yorumlanmı tır.
Alan uyarısı altında kaydedilen Ca2+ transientlerinin kinetik parametrelerinde
Zn2+’un varlı ının ortadan kaldırılmı olması herhangi bir etkiye neden olmamı tır.
TPEN uygulaması sonrasında transientler üzerinde her hangi etkiye neden olmayı ı
ise, Zn2+ transientlerinin olmadı ı ve/veya gözlenemedi i eklinde yorumlanmı tır.
54
Hücre içi a ır metal zehirlenmesinin önlenmesinde rol alan MT proteini aynı
zamanda ba lı bulundurdu u Zn2+ açısından da önemlidir. Hücrede oksidasyonun
artmasının bu proteinin üzerinde ba lı bulunan Zn2+’un salınmasına neden oldu u
gösterilmi tir (Maret ve Haase, 2004 ). Yedi bivalen iyon ba layan ba lanma
bölgesine oldukça yüksek ilgiyle ile ba lanan Ag+’ün doyurulması prensibine
dayanan MT ölçüm sonuçlarından diyabet süresince miktarın azaldı ı, selenit
tedavisi ile miktarın kontrol de erlerine dönebildi i bulunmu tur. Ayrıca, Maret ve
Haase’in (2004) yaptıkları çalı mada oksidatif stres ko ullarında protein üzerinde
bulunan ba lanma bölgelerinin ba lama kapasitelerinde azalma olabilece ini
göstermi lerdir. Böylece, bizim gözlemlerimizde proteinin miktarında azalma
olabilece i gibi, proteinin kronik olarak oksidatif stres ko ulu altında kaldı ı diyabet
sürecince metal ba lama kapasitesinde azalma oldu u yorumunun yapılabilmesi
olası görünmektedir. Ayrıca literatürde diyabetik kardiyomiyopatide MT protein
ekspresyonunun arttırıldı ı zaman bu tip miyopatik bulguların düzeldi i bilgisi de
mevcuttur (Ye ve ark., 2003). n vitro ko ullar altında yapılan farklı deneylerden
Zn2+ deri iminin arttırılmasının uyarılma-kasılma çiftlenimi içinde yer alan ryanodin
(Wang ve ark.2001), cAMP sinyalizasyonu (Klein ve ark., 2002) gibi bazı üniteleri
negatif etkiledi i gösterilmi tir. Dolayısı ile hücre içi Zn2+ seviyesinin kontrolünün
kaybedilmi ya da bozulmu olmasının diyabetle gerçekle en patolojik bulguların
altında yatan temel mekanizmalardan birisi olabilece i dü üncesini desteklemektedir.
55
5. SONUÇ VE ÖNER LER
Diabetes mellitus uzun yıllardan beri tanınan ve görülme sıklı ı oldukça artan
metabolik bir hastalıktır. Diyabete ikincil geli en komplikasyonların çe itli dokularda
yapı ve fonksiyon de i ikliklerine neden oldu u gösterilmi olmasına ra men bu
patolojilere yol açan mekanizmalar henüz tam olarak aydınlanamamı tır.
Bu çalı manın streptozotocin (STZ) kullanılarak yapılan deneysel diyabetik
kardiyomiyopatinin kalbin elektriksel bulgularını anlamaya yönelik kısmında
diyabetle gözlenen AP repolarizasyon süresinin uzamasının altında yatan iyonik
mekanizmadan geçici dı arı do ru (Ito) ve steady state (Iss) potasyum akımlarında
gerçekle en azalmanın neden oldu u bulunmu tur (Ayaz ve ark., 2004). Diyabette
ölçülen L tipi Ca2+ kanal akımlarında bir farkın olmaması, repolarizasyon fazında
gözlenen uzamadan sadece potasyum kanal akımlarının sorumlu oldu u eklinde
yorumlanmı tır. Selenitin sa lıklı deneklere uygulanması ne AP parametrelerine
nede iyonik akımlar üzerinde herhangi bir de i ime neden olmazken, diyabete
uygulanması ölçüm yapılan AP ve iyonik akımlarda gözlenen de i imleri normalize
etmi tir.
Çalı manın diyabet kaynaklı kontraktil bozulmalara ili kin, be haftalık diyabet
süresince maksimum kasılma kuvvetinde bir de i me olmaksızın, tepeye çıkı ve ini
süresinin anlamlı derecede uzadı ı bulunmu tur. Bozulmu kasılma kinetiklerinin
altında bozulmu olan Ca2+ homeostazı rol almaktadır. Diyabet süresince artmı
bazal Ca2+’a alan uyarısı altında alınan kinetiklerin tepe de er azalması, tepeye çıkı
ve ini süresin sürelerinin azalması e lik etmektedir. Dört haftalık sodyum selenit
tedavisi ölçüm yapılan hücre içi serbest Ca2+’a ili kin bozuklukları düzeltmi tir.
Hücre içinde üstlendi i önemli roller gere i düzenlenmesi oldukça sıkı bir ekilde
kontrol altında tutulan serbest Zn2+ diyabet süresince geli en oksidan stres nedeniyle
ba lı bulundu u bölgelerden serbestle erek hücre içi birikime neden olmu tur.
Zn2+’nun serbest formunun kontrol altında tutulmasında önemli rol alan
metallothionein proteininin miktarının ve/veya Zn2+ ba lama yetisinde gözlenen
56
bozukluklar diyabetik kardiyomiyopatik bulguların mekanizmasında önemli bir
neden te kil etmektedir.
Fura 2 kullanılarak yapılan hücre içi serbest Ca2+ ölçümlerinde Zn2+ ölçüme
getirece i yanılgılar daha önce de gösterildi i gibi bu çalı mada da gösterilmi ama
deney grupları arasında gözlenen fark ili kisine bir etkisi olmamı tır. Her ne kadar
gruplar arası ili kide bir farka neden olmamasına ra men yine de ölçümlere serbest
Zn2+’nun getirebilece i yanılgılara dikkat edilmelidir.
Özet olarak bu çalı ma ile mikromolar seviyesindeki sodyum selenit tedavisi diyabet
sürecinde gözlenen kalbin bozulmu elektriksel ve mekanik fonksiyonları üzerine
anlamlı düzelmelere neden olmu tur. Fakat aynı miktar ve süre sa lıklı deneklere
verilen sodyum selenitin bazı yan etkilere neden olabilece i olasılı ı göz ardı
edilmemelidir. Literatürde oksidan özelli i ile de dikkat çeken sodyum selenitin
uygulanmasında, dozu ve süresi konusunda dikkatli olunması gerekmektedir.
57
ÖZET
Deneysel Diyabetik Kardiyomiyopatide Hücre çi Serbest yon Deri imi
Bu çalı ma, deneysel diyabetik kardiyomiyopatide gözlenen elektrofizyolojik de i imler
sonucunda kalbin yeniden modellenmesinin (remodelling) altında yatan mekanizmayı
aydınlatmayı amaçlamı tır. Diyabetik kardiyomiyopati olarak bilinen ve diyabet sebepli
ölümlerin en temel nedeni olarak gösterilen patoloji uzun süreli diyabete maruz kalan
hastalarda gözlenen do al bir sonuçtur. Diyabette, serbest ya asitleri ve radikal türevli bazı
oksidanların artması sonucu olarak kalp fonksiyonlarında çe itli bozukluklara neden oldu u
bilinmektedir.
Sa lıklı, STZ ile be haftalık diyabetik yapılmı ve her iki gruba günlük kilogram ba ına 5
µmol/kg/gün sodyum selenit uygulanarak kurulan dört farklı gruptan 244 adet Wistar türü
sıçan kullanılmı tır. Klasik mikroelektrot ile alınan aksiyon potansiyeli süreleri diyabet
süresince anlamlı derecede uzamı , bu uzamanın altında yatan iyonik mekanizmanın altında
sadece azalmı potasyum kanal akım yo unlu u oldu u bulunmu tur. Aksiyon potansiyeli
süresinde önemli rol oynayan L tipi Ca2+ akımlarına ili kin her hangi bir farka
rastlanmamı tır.
Diyabetik süreçle gözlenen kasılmalara ili kin, tepe de erde bir fark olmaksızın kasılma
süresinde anlamlı uzamanın altında, kasılma esnasında Ca2+ salınım ve geri alınımında
gözlenen uzamanın neden oldu u gösterilmi tir. Ayrıca diyabetik sıçan miyositlerinde hücre
içi bazal Ca2+ seviyesinin sa lam gruba göre anlamlı sevide yüksek oldu u bulunmu tur.
Enzimlerin yapı ve fonksiyonunda önemli yeri olan serbest Zn2+ kronik diyabet süresince
anlamlı derecede artmı olarak bulunmu tur. Hücre içi serbest Zn2+ regülasyonunda önemli
rolü olan metallotiyonein protein miktarının ve/veya ba lama kapasitesinin azalmı olması
diyabetle gözlenen bozulmu Zn2+ regülasyonunun nedenlerinden birisi olabilece ini
dü ündürmektedir.
Bir antioksidan ajan olan sodyum selenitin deneysel diyabetik sıçanlara verilmesi
hayvanların genel durumuna ili kin (vücut a ırlı ı, kan ekeri vs.) bazı parametreleri sa lıklı
deneklerden elde edilen veriler yönünde iyile tirmi tir. Bu çalı mada in vivo olarak
uygulanan sodyum selenitin, diyabetin neden oldu u uzamı aksiyon potansiyeli süresini
yanında kasılma ve Ca2+ transient sürelerinde de düzelmelere neden oldu u gösterilmi tir.
Sodyum selenit uygulaması ile gözlenen düzelme, antioksidan özelli i ile hücre içi
oksidasyonu azaltması olarak açıklanabilece i gibi, insülin sinyal iletimi yolakları üzerinde
bir etkiye neden olarak ve/veya reseptör sonrasındaki sinyal iletim basamaklarında
düzelmeye neden oldu u seklinde de açıklanabilmektedir.
Sonuç olarak, bu çalı ma ile STZ kullanılarak yapılan tip 1 diyabet sonrası uyarılma-kasılma
çiftleniminde gözlenen de i imler, mikromolar düzeyde sodyum selenit uygulaması ile
sa lıklı deneklerin de erlerine yakla ıldı ı gösterilmi tir.
Anahtar Kelimeler: Diyabet, aksiyon potansiyeli, kasılma, hücre içi kalsiyum deri imi,
hücre içi çinko deri imi, oksidan stress, ve sodyum selenit
58
SUMMARY
Cellular Free Ion Concentration in Experimental Diabetic Cardiomyopathy
Aim of this work is to explain the mechanism of electrophysiological remodeling
seen in experimental diabetic cardiomyopathy. Diabetic cardiomyopathy is the main
causal for diabetes induced mortality in long termed diabetic patients. One of the
well documented facts in diabetes is that increased free fatty acid and free radical
production can cause cardiovascular dysfunctions.
Four experimental groups of (healthy, STZ induced diabetic, sodium selenite treated
healthy and diabetic) 244 Wistar rats were used for the experiments. Depressed
potassium currents were found to be the main ionic mechanism under diabetes
induced prolonged action potential duration (recorded with classical microelectrode).
L type calcium currents (one of the main determinants of action potential duration)
were not affected by diabetes.
Prolongation in Ca2+ release and reuptake (transients) was found to be main
mechanism under the diabetes induced prolonged contractile duration. Together with
the changes in Ca2+ transients, basal Ca2+ concentrations were also found to be
increased when compared with the age matched control group animals.
Zinc, being both structural and functional regulatory ion for enzymes, was found to
be increased by diabetes. Metallothionein protein is one of the most important
reservoirs for the regulation of free cellular zinc concentration. Cellular
metallothionein content and/or changes in binding capacity was an important causal
for diabetes induced [Zn2+]i regulatory dysfunction.
Sodium selenite injection to diabetic rats provides a positive effect on general
parameters of the animals such as body weight and blood glucose. In vivo treatment
of sodium selenite to diabetic rats was reversed the prolonged action potential,
contraction and Ca2+ transient durations. Mechanisms under the selenite induced
positive effects can be explained by both decreased cellular oxidative stress and
insulin like effects on the system.
In summary, micro molar quantities of sodium selenite can restore the altered
parameters which have roles in diabetes-induced excitation-contraction coupling.
Key words: Diabetes, action potential, contraction, intracellular free calcium ion
concentration, intracellular free zinc ion concentration, oxidant stress, and sodium
selenite.
59
KAYNAKLAR
AGU LAR MV, LABORDA JM, MART NEZ-PARA MC, GONZALEZ MJ, MESEGUER
I, BERNAO A, MATEOS CJ. (1998). Effect of diabetes on the tissular Zn/Cu ratio. J
Trace Elem Med Biol. 12(3): 155-8.
AL SSA EM, BAH JR SM, FERNS GA. (2003) The controversy surrounding selenium and
cardiovascular disease: a review of the evidence. Med Sci Monit. 9(1): RA9-18. Review.
ANETOR JI, SENJOB A, AJOSE OA, AGBEDANA EO. (2002). Decreased serum
magnesium and zinc levels: atherogenic implications in type-2 diabetes mellitus in
Nigerians. Nutr Health. 16(4): 291-300.
ARQU LLA ER, TH ENE P, BRUGMAN T, RUESS W, SUG YAMA R. (1978). Effects of
zinc ion on the conformation of antigenic determinants on insulin. Biochem J. 175(1):
289-97.
ATALAY M, LAAKSONEN DE. (2002) Diabetes, oxidative stress and physical exercise. J.
Sports Scienc. Med. 1: 1-14 Review.
AYAZ M, CAN B, OZDEM R S, TURAN B. (2002). Protective effect of selenium
treatment on diabetes-induced myocardial structural alterations. Biol Trace Elem Res.
89(3):215-26.
AYAZ M, OZDEM R S, UGUR M, VASSORT G, TURAN B. (2004). Effects of selenium
on altered mechanical and electrical cardiac activities of diabetic rat. Arch Biochem
Biophys. 426(1): 83-90.
BECKER DJ, REUL B, OZCEL KAY AT, BUCHET JP, HENQU N JC, BR CHARD SM.
(1996). Oral selenate improves glucose homeostasis and partly reverses abnormal
expression of liver glycolytic and gluconeogenic enzymes in diabetic rats. Diabetologia.
39(1): 3-11.
BERS DM. (2002). Cardiac excitation-contraction coupling. Nature. 415(68): 198-205.
Review.
BEYERSMANN D, HAASE H. (2001). Functions of zinc in signaling, proliferation and
differentiation of mammalian cells. Biometals. 14(3-4): 331-41. Review.
BRANDAO-NETO J, MADURE RA G, MENDONCA BB, BLO SE W, CASTRO AV.
(1995). Endocrine interaction between zinc and prolactin. An interpretative review. Biol
Trace Elem Res. 49(2-3):139-49. Review.
BRYANT RW, BA LEY JM. (1980). Altered lipoxygenase metabolism and decreased
glutathione peroxidase activity in platelets from selenium-deficient rats. Biochem
Biophys Res Commun. 92(1): 268-76.
60
CHAUSMER AB. (1998) Zinc, insulin and diabetes. J Am Coll Nutr. 17(2): 109-15. Review.
CHEN JJ, L EN WP, CHANG FZ, WU TL. (1980). Electrophysiologic diagnosis of patients
with sinus node dysfunction: with special reference to a modified method for calculating
sinoatrial conduction time. Jpn Circ J. 44(9): 700-8.
CH AMV MONVAT N, O'
ROURKE B, KAMP TJ, KALLEN RG, HOFMANN F,
FLOCKERZ V, MARBAN E. (1995). Functional consequences of sulfhydryl
modification in the pore-forming subunits of cardiovascular Ca2+ and Na+ channels. Circ
Res. 76(3): 325-34.
CHO KM, ZHONG Y, HO T BD, GRUPP IL, HAHN H, D LLY KW, GUAT MOS M S,
LEDERER WJ, MATL B MA. (2002). Defective intracellular Ca(2+) signaling
contributes to cardiomyopathy in Type 1 diabetic rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol.
283(4): H1398-408.
COLEMAN JE. (1992) Zinc proteins: enzymes, storage proteins, transcription factors, and
replication proteins. Annu Rev Biochem. 61: 897-946. Review.
CORDOVA A. (1994). Zinc content in selected tissues in streptozotocin-diabetic rats after
maximal exercise. Biol Trace Elem Res. 42(3): 209-16.
CUAJUNGCO MP, LEES GJ. (1997). Zinc metabolism in the brain: relevance to human
neurodegenerative disorders. Neurobiol Dis. 4(3-4): 137-69. Review.
CUNN NGHAM JJ, FU A, MEARKLE PL, BROWN RG. (1994). Hyperzincuria in
individuals with insulin-dependent diabetes mellitus: concurrent zinc status and the
effect of high-dose zinc supplementation. Metabolism. 43(12):1558-62.
D’EL A J.A., WE NRAUCH L.A., HEALY R.W., L BERT NO R.W., BRADLEY R.F.,
LELAND O:S. (1979) Myocardial dysfunction without coronary artery disease in
diabetic renal failure. Am. J. Cardiol. 43: 193-199.
DAS UN. (2002). Is insulin an endogenous cardioprotector? Crit Care. 6(5): 389-393.
DHALLA NS, L U X, PANAG A V, TAKEDA N. (1998). Subcellular remodeling and heart
dysfunction in chronic diabetes. Cardiovasc Res. 40(2): 239-47. Review.
DROGE W. (2002). Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol Rev.
82(1): 47-95. Review.
ELLMAN GL. (1959). Tissue sulfhydryl groups. Arch Biochem Biophys. 82(1): 70-7.
EVANS GW. (1986) Zinc and its deficiency diseases. Clin Physiol Biochem. 4(1): 94-8.
Review.
61
EZAK O. (1990). The insulin-like effects of selenate in rat adipocytes. J Biol Chem. 265(2):
1124-8.
FAURE P, ROUSSEL A, COUDRAY C, R CHARD MJ, HAL M S, FAV ER A. (1992).
Zinc and insulin sensitivity. Biol Trace Elem Res. 32: 305-10. Review.
FE N FS, KORNSTE N LB, STROBECK JE, CAPASSO JM, SONNENBL CK EH. (1980).
Altered myocardial mechanics in diabetic rats. Circ Res. 47(6): 922-33.
FE N FS, M LLER-GREEN B, ZOLA B, SONNENBL CK EH. (1986). Reversibility of
diabetic cardiomyopathy with insulin in rabbits. Am J Physiol. 250(1 Pt 2): H108-13.
FL SS H, MENARD M. (1992). Oxidant-induced mobilization of zinc from
metallothionein. Arch Biochem Biophys. 293(1): 195-9
FOSTER LH, SUMAR S. (1997) Selenium in health and disease: a review. Crit Rev Food
Sci Nutr. 37(3): 211-28. Review.
GADSBY, DC. (1984) The Na/K pump of cardiac cells. Annu Rev Biophys Bioeng. 13:37398. Review
GA THER LA, E DE DJ. (2001) Eukaryotic zinc transporters and their regulation.
Biometals. 14(3-4): 251-70. Review.
GALLEGO M, CAS S E, IZQU ERDO MJ, CAS S O. (2000). Restoration of cardiac
transient outward potassium current by norepinephrine in diabetic rats. Pflugers Arch.
441(1): 102-7.
GANGULY PK, P ERCE GN, DHALLA KS, DHALLA NS. (1983) Defective sarcoplasmic
reticular calcium transport in diabetic cardiomyopathy. Am J Physiol. 244(6): E528-35.
GEBRE-MEDH N M, EWALD U, PLANT N LO, TUVEMO T. (1984). Elevated serum
selenium in diabetic children. Acta Paediatr Scand. 73(1): 109-14.
GHOSH R, MUKHERJEE B, CHATTERJEE M. (1994). A novel effect of selenium on
streptozotocin-induced diabetic mice. Diabetes Res. 25(4):165-71.
GODW N KO. (1965) Abnormal electrocardiograms in rats fed a low selenium diet. Q J Exp
Physiol Cogn Med Sci. 50(3): 282-8
GOL K A, COHEN N, RAMOT Y, MAOR J, MOSES R, WE SSGARTEN J, LEONOV Y,
MODA D. (1993). Type II diabetes mellitus, congestive heart failure, and zinc
metabolism. Biol Trace Elem Res. 39(2-3):171-5.
GU D G, SCH AVON R, B AS OL A, PERONA G. (1984). The enzyme glutathione
peroxidase in arachidonic acid metabolism of human platelets. J Lab Clin Med. 104(4):
574-82.
62
HAASE H, MARET W. (2004). A differential assay for the reduced and oxidized states of
metallothionein and thionein. Anal Biochem. 333(1): 19-26.
HAYASH H, NODA N. (1997). Cytosolic Ca2+ concentration decreases in diabetic rat
myocytes. Cardiovasc Res. 34(1): 99-103. Review.
HONNORAT J, ACCOM NOTT M, BROUSSOLLE C, FLEURET AC, VALLON JJ,
ORG AZZ J. (1992) Effects of diabetes type and treatment on zinc status in diabetes
mellitus. Biol Trace Elem Res. 32: 311-6.
ISH KAWA T, KAJ WARA H, KUR HARA S. (1999). Alterations in contractile properties
and Ca2+ handling in streptozotocin-induced diabetic rat myocardium. Am J Physiol.
277(6 Pt 2): H2185-94.
JABR RI, COLE WC. (1993). Alterations in electrical activity and membrane currents
induced by intracellular oxygen-derived free radical stres in Guinea Pig ventricular
myocytes. Circ. Res. 72: 1229-44.
JOHN A. BURNS, JAMES C. BUTLER, JOHN MORAN, GEORGE M. WH TES DES.
(1991). Selective reduction of disulfides by tris(2-carboxyethyl)phosphine. J. Org.
Chem. 56(8): 2648-2650.
JOHNSON WT, CANF ELD WK. (1985) Intestinal absorption and excretion of zinc in
streptozotocin-diabetic rats as affected by dietary zinc and protein. J Nutr. 115(9): 121727.
JOURDON P, FEUVRAY D. (1993). Calcium and potassium currents in ventricular
myocytes isolated from diabetic rats. J Physiol. 470: 411-29.
KATZ, AM. (1992). Physiology of the heart. Raven Press.
KENNEDY KJ, RA NS TM, SHAY NF. (1998). Zinc deficiency changes preferred
macronutrient intake in subpopulations of Sprague-Dawley outbred rats and reduces
hepatic pyruvate kinase gene expression. J Nutr. 128(1): 43-9.
KERVAN A., GIRARD J.R. (1974). J. Endocrinol. 63: 545-51
K NLAW WB, LEV NE AS, MORLEY JE, S LV S SE, MCCLA N CJ. (1983). Abnormal
zinc metabolism in type II diabetes mellitus. Am J Med. 75(2): 273-7.
KLE N C, SUNAHARA RK, HUDSON TY, HEYDUK T, HOWLETT AC. (2002). Zinc
inhibition of cAMP signaling. J Biol Chem. 277(14): 11859-65.
KRUSE-JARRES JD, RUKGAUER M. (2000). Trace elements in diabetes mellitus.
Peculiarities and clinical validity of determinations in blood cells. J Trace Elem Med
Biol. 14(1): 21-7.
63
LACAMPAGNE A, DU TTOZ A, BOLANOS P, PE NEAU N, ARG BAY JA. (1995).
Effect of sulfhydryl oxidation on ionic and gating currents associated with L-type
calcium channels in isolated guinea-pig ventricular myocytes. Cardiovasc Res. 30(5):
799-806.
LEV NE AS, MCCLA N CJ, HANDWERGER BS, BROWN DM, MORLEY JE. (1983).
Tissue zinc status of genetically diabetic and streptozotocin-induced diabetic mice. Am J
Clin Nutr. 37(3): 382-6.
LI S, LI X, ROZANSKI GJ. (2003). Regulation of glutathione in cardiac myocytes. J Mol
Cell Cardiol. 35(9): 1145-52.
LOPASCHUK GD, KATZ S, MCNE LL JH. (1983). Characterization of cardiac
microsomal sarcoplasmic reticulum prepared from control and diabetic rats. J
Pharmacol Methods. 10(3): 199-206.
MAGYAR J, RUSZNAK Z, SZENTES P, SZUCS G, KOVACS L. (1992) Action
potentials and potassium currents in rat ventricular muscle during experimental
diabetes.J Mol Cell Cardiol. 24(8): 841-53.
MARET W, JACOB C, VALLEE BL, F SCHER EH. (1999). Inhibitory sites in enzymes:
zinc removal and reactivation by thionein. Proc Natl Acad Sci U S A. 96(5): 1936-40.
MCNE LL JH, DELGATTY HL, BATTELL ML. (1991). Insulinlike effects of sodium
selenate in streptozocin-induced diabetic rats. Diabetes. 40(12): 1675-8.
MUTH OH, WESW G PH, WHANGER PD, OLDF ELD JE. (1971). Effect of feeding
selenium-deficient ration to the subhuman primate (Saimiri sciureus). Am J Vet Res.
32(10): 1603-5.
NAKANO E, TAKESH GE K, TOSH MA Y, TOKUNAGA K, M NAKAM S. (1989).
Oxidative damage in selenium deficient hearts on perfusion with adriamycin: protective
role of glutathione peroxidase system. Cardiovasc Res.23(6): 498-504.
NAVARRO-ALARCON M, LOPEZ-MART NEZ MC. (2000). Essentiality of selenium in
the human body: relationship with different diseases. Sci Total Environ. 249(1-3): 34771. Review.
NEBOT C, MOUTET M, HUET P, XU JZ, YADAN JC, CHAUD ERE J. (1993).
Spectrophotometric assay of superoxide dismutase activity based on the activated
autoxidation of a tetracyclic catechol. Anal Biochem. 214(2): 442-51.
NETT CADAN T, TEMSAH RM, KENT A, EL MBAN V, DHALLA NS. (2001).
Depressed levels of Ca2+-cycling proteins may underlie sarcoplasmic reticulum
dysfunction in the diabetic heart. Diabetes. 50(9): 2133-8.
NORBY FL, ABERLE NS 2ND, KAJSTURA J, ANVERSA P, REN J. (2004) Transgenic
overexpression of insulin-like growth factor I prevents streptozotocin-induced cardiac
64
contractile dysfunction and beta-adrenergic response in ventricular myocytes. J
Endocrinol. 180(1): 175-82.
OSTER O, PRELLW TZ W. (1990). Selenium and cardiovascular disease. Biol Trace Elem
Res. 24(2): 91-103. Review.
OUD T GY, KASS R Z, SAH R, RAM REZ RJ, ZOBEL C, BACKX PH. (2001). The
molecular physiology of the cardiac transient outward potassium current (I(to)) in
normal and diseased myocardium. J Mol Cell Cardiol. 33(5): 851-72. Review.
OZTURK Y, ALTAN VM, Y LD ZOGLU-AR N. (1996). Effects of experimental diabetes
and insulin on smooth muscle functions. Pharmacol Rev. 48(1): 69-112. Review.
PAGL A DE, VALENT NE WN. (1967). Studies on the quantitative and qualitative
characterization of erythrocyte glutathione peroxidase. J Lab Clin Med. 70(1): 158-69.
PATR CK L. (2004). Selenium biochemistry and cancer: A review of the literature. Altern
Med Rev. 9(3): 239-258.
PENPARGKUL S, SCHA BLE T, Y P NTSO T, SCHEUER J.(1980). The effect of
diabetes on performance and metabolism of rat hearts. Circ Res. 47(6): 911-21.
POGW ZD SM, SCHLOTTHAUER K, L L, YUAN W, BERS DM. (2001).
Arrhythmogenesis and contractile dysfunction in heart failure: Roles of sodium-calcium
exchange, inward rectifier potassium current, and residual beta-adrenergic
responsiveness. Circ Res. 88(11): 1159-67.
RAVENS U, WETTWER E, OHLER A, AMOS GJ, MEWES T. (1996). Electrophysiology
of ion channels of the heart. Fundom Clin. Pharmacol. 10: 321-28.
REGAN TJ, LYONS MM, AHMED SS, LEV NSON GE, OLDEWURTEL HA, AHMAD
MR, HA DER B. (1977). Evidence for cardiomyopathy in familial diabetes mellitus. J
Clin Invest. 60(4): 884-99.
REUSCH JE. (2003). Diabetes, microvascular complications, and cardiovascular
complications: what is it about glucose?. J Clin Invest. 112(7): 986-988
ROZANSK GJ, XU Z. (2002). Sulfhydryl modulation of K+ channels in rat ventricular
myocytes. J Mol Cell Cardiol. 34(12): 1623-32.
SALGUE RO MJ, ZUB LLAGA MB, LYS ONEK AE, CARO RA, WE LL R, BOCC O
JR. (2002). The role of zinc in the growth and development of children. Nutrition.
18(6):510-9. Review.
SANO T, UMEDA F, HASH MOTO T, NAWATA H, UTSUM H. (1998). Oxidative stress
measurement by in vivo electron spin resonance spectroscopy in rats with
streptozotocin-induced diabetes. Diabetologia. 41(11): 1355-60.
65
SATOH N, SATO T, SH MADA M, YAMADA K, K TADA Y. (2001). Lusitropic effect of
MCC-135 is associated with improvement of sarcoplasmic reticulum function in
ventricular muscles of rats with diabetic cardiomyopathy. J Pharmacol Exp Ther.
298(3): 1161-6.
SAYAR K, UGUR M, GURDAL H, ONARAN O, HOTOMAROGLU O, TURAN B.
(2000). Dietary selenium and vitamin E intakes alter beta-adrenergic response of L-type
Ca-current and beta-adrenoceptor-adenylate cyclase coupling in rat heart. J Nutr. 130(4):
733-40.
SCHEUHAMMER AM, CHER AN MG. (1991). Quantification of metallothionein by silver
saturation. Methods Enzymol. 205: 78-83.
SENS SL, CANZON ERO LM, YU SP, Y NG HS, KOH JY, KERCHNER GA, CHO
DW. (1997) Measurement of intracellular free zinc in living cortical neurons: routes of
entry. J Neurosci. 17(24): 9554-64.
SH MON Y, EWART HS, SEVERSON D. (1998). Type I and II models of diabetes
produce different modifications of K+ currents in rat heart: role of insulin. J Physiol. 507
( Pt 2): 485-96.
SH MON Y, EWART HS, SEVERSON D. (1999). Insulin stimulation of rat ventricular K+
currents depends on the integrity of the cytoskeleton. J Physiol. 514 ( Pt 3) :735-45.
SH MON Y, F REK L, SEVERSON D, G LES W. (1994). Short-term diabetes alters K+
currents in rat ventricular myocytes. Circ Res. 74(4): 620-8.
SH MON Y, L GHT PE, FRENCH RJ. (1998). Related Articles, Altered ATP sensitivity of
ATP-dependent K+ channels in diabetic rat hearts. Am J Physiol. 275(4 Pt 1): E568-76.
SOR ANO-GARC A M. (2004). Organoselenium compounds as potential therapeutic and
chemopreventive agents: a review. Curr Med Chem. 11(12): 1657-69. Review.
SZKUDELSKI, T. (2001). The mechanism of alloxan and streptozotocin action in
the rat pancreas. Physiol. Res. 50: 536-546.
cells of
TAHILIANI A.G, MCNEIL J.H. (1986). Diabetes-induced abnormalities in the
myocardium. Life Sci. 38(11): 959-74.
TOML NSON KC, GARD NER SM, HEBDEN RA, BENNETT T. (1992). Functional
consequences of streptozotocin-induced diabetes mellitus, with particular reference to
the cardiovascular system. Pharmacol Rev. 44(1): 103-50. Review.
TROST SU, BELKE DD, BLUHM WF, MEYER M, SWANSON E, D LLMANN WH.
(2002) Overexpression of the sarcoplasmic reticulum Ca(2+)-ATPase improves
myocardial contractility in diabetic cardiomyopathy. Diabetes. 51(4): 1166-71.
66
TSUCH DA K, WATAJ MA H, OTOMO S. (1994). Calcium current in rat diabetic
ventricular myocytes. Am J Physiol. 267(6 Pt 2): H2280-9.
TURAN B, FL SS H, DES LETS M. (1997) Oxidants increase intracellular free Zn2+
concentration in rabbit ventricular myocytes. Am J Physiol. 272(5 Pt 2): H2095-106.
TUVEMO T, GEBRE-MEDH N M. (1983). The role of trace elements in juvenile diabetes
mellitus. Pediatrician. 12(4): 213-9. Review.
UDOM AO, BRADY FO. (1980) Reactivation in vitro of zinc-requiring apo-enzymes by rat
liver zinc-thionein. Biochem J. 187(2): 329-35.
VALLEE BL, FALCHUK KH. (1993). The biochemical basis of zinc physiology. Physiol
Rev. 73(1): 79-118. Review.
VAN VLEET JF, RUNNELS LJ, COOK JR JR, SCHE DT AB. (1987). Monensin toxicosis
in swine: potentiation by tiamulin administration and ameliorative effect of treatment
with selenium and/or vitamin E. Am J Vet Res. 48(10): 1520-4.
VERN E LN. (1984) Selenium in carcinogenesis. Biochim Biophys Acta.738(4):203-17.
Review.
WAHLER, GM. (1997). Muscle and other contractile system section VI. Academic Press.
WANG H, CHEN J, CHA J. (1995). A study of mRNA expression of glucose transporter
gene in rats with diabetes mellitus. Chin Med J (Engl). 108(12): 892-4.
WANG H, WE QQ, CHENG XY, CHEN KY, ZHU PH. (2001). Inhibition of ryanodine
binding to sarcoplasmic reticulum vesicles of cardiac muscle by Zn(2+) ions. Cell Physiol
Biochem. 11(2): 83-92.
W NKLER R, MOSER M. (1992). Alterations of antioxidant tissue defense enzymes and
related metabolic parameters in streptozotocin-diabetic rats--effects of iodine treatment.
Wien Klin Wochenschr. 104(14): 409-13.
XU Z, PATEL KP, LOU MF, ROZANSK GJ. (2002). Up-regulation of K(+) channels in
diabetic rat ventricular myocytes by insulin and glutathione. Cardiovasc Res. 53(1): 808.
YANG GQ, CHEN JS, WEN ZM, GE KY, ZHU LZ, CHEN XC, CHEN XS. (1984). The
role of selenium in Keshan disease. Adv Nutr Res. 6: 203-31.
YE G, METREVEL NS, REN J, EPSTE N PN. (2003). Metallothionein prevents diabetesinduced deficits in cardiomyocytes by inhibiting reactive oxygen species production.
Diabetes. 52(3): 777-83.
Z MMET PZ, COLL NS VR, DOWSE GK, KN GHT LT. (1992). Hyperinsulinaemia in
youth is a predictor of type 2 (non-insulin-dependent) diabetes mellitus. Diabetologia.
35(6):534-41.
67
ÖZGEÇM
Adı ve Soyadı: Murat AYAZ
Do um yeri ve tarihi: Ankara, 17,04,1972
Medeni durumu: Bekar
leti im adresi: [email protected]
I-E
T M:
lk ö renim: Bahçelievler lkokulu, 1983
Orta-Lise: Yükseli Koleji, 1990
Hazırlık Okulu: Orta Do u Teknik Üniversitesi, 1990
Üniversite: Orta Do u Teknik Üniversitesi, Biyoloji Bölümü, 1995
Yüksek Lisans: Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Biyofizik Anabilim Dalı, 2000
Doktora: Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Biyofizik Anabilim Dalı, 2004
II-
DENEY M :
1997- 2004 Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Biyofizik Anabilim Dalı, Ara tırma
Görevlisi.
III- YABANCI D L:
ngilizce
IV- ÜYEL KLER:
Türk Biyofizik Derne i
V-PROJELER:
Tübitak:
SBAG- 1732 (Yardımcı ara tırmacı, tamamlandı)
Ankara Üniversitesi Ara tırma Fonu:
98-09-00-05 (Yardımcı ara tırmacı, tamamlandı)
99-09-00-10 (Yardımcı ara tırmacı, tamamlandı)
68
2003-08-09-098 (Yardımcı ara tırmacı, devam ediyor)
2003-08-09-110 (Yardımcı ara tırmacı, devam ediyor)
DPT Projesi:
99K-120190 (Yardimci arastirmaci, tamamlandı)
VI- BURSLAR:
1999 (6 ay) Fransız Hükümeti Yabancı Ara tırmacı Destekleme Fonu, INSERMMontpellier, FRANSA
VII-SUNUMLAR:
) Seminerler:
1. Kalpte potasyum kanalları ve özellikleri
2. Kübik üçlü reseptör i gal modeli: Model tariflemesi.
) Kongre Bildirileri:
1. Ayaz M., Tuncer T., Ugur M., Turan B, Deneysel diyabette gözlenen kalp
fonksiyon de i iklikleri. X. Ulusal Biyofizik Kongresi. 10-12 Eylül, 1998, stanbul,
Özet: Bildiri Kitapçı ı, sayfa: 26.
2. Ayaz M., Tuncer T., Ugur M., Turan B, Sıçan kalp kası elektrofizyolojik ve
mekaniksel özellikleri üzerine selenyumun in vitro etkileri. X. Ulusal Biyofizik
Kongresi. 10-12 Eylül, 1998, stanbul. Özet: Bildiri Kitapçı ı (Poster), sayfa: 30.
3. Turan B., Ayaz M., Tuncer T., Sakinci N., U ur M, Changes in
electrophysiological and mechanical responses of the rat heart to selenite in
streptozotocin-induced diabetes. 2nd Federation of European Physiological Society
(FEPS) Congress, 29 June-4 July, 1999, Prague, Czech Republic, Abstract in:
Physiological Research. 48 (suppl.1), pp, S131, 1999.
4. Toyran N., Ayaz M., Turan B., Severcan F, Comparison of streptozotocininduced diabetic and control rat liver tissues by Fourier Transform Infrared
Spectroscopy, 2nd Federation of European Physiological Society (FEPS) Congress,
29 June-4 July. 1999. Prague, Czech Republic, Abstract in: Physiological Research,
48 (suppl.1). pp, S131, 1999.
5. Ayaz M., Ba tu M., Karaorman G., U ur M., Turan B, Electrophysiological
parameters of rat papillary muscle exposed to hyperbaric oxygen, International
69
EUBS Congress, 28 August- 2 September 1999. Haifa and Eilat, Israel, Proceedings,
Tam metin pp, 4-7.
6. Kaptan N., Toyran N., Ayaz M., Turan B., Severcan F, Fourier Transform
Infrared study of the effect of diabetes on rat heart and liver tissues. Colloquium
Spectroscopicum Internationale XXXI., September 5-10 1999, Ankara, Turkey,
Book of Abstracts, pp, 296.
7. Ayaz M., Tuncer T., Sakinci N., U ur M., Turan B, In vivo selenyum
uygulamasının diyabetik sıçanların papiller kası aksiyon potansiyeli üzerindeki
pozitif etkisi. Türk Biyofizik Derne i XI. Ulusal Kongresi, 31 Ekim-2 Kasım 1999,
Antalya. Bildiri Özetleri s: 18.
8. Tuncer T., Ayaz M., Sakinci N., U ur M., Turan B, Sıçanların atriyal
aktiviteleri üzerine E vitaminin etkisinin elektrofizyolojik yöntemlerle incelenmesi.
Türk Biyofizik Derne i XI. Ulusal Kongresi, 31 Ekim-2 Kasım 1999. Antalya,
Bildiri Özetleri s: 23.
9. Turan B., Ayaz M., U ur M., Selenium treatment effects action potential
parameters of streptozotocin-induced diabetic cardiomyopathy in rat. Experimental
Biology 2000. San Diego, California, USA, April 15-18, 2000. Abstract in: The
FASEB Journal, 2000, 14(4), A537.
10.Ayaz M., U ur M., Turan B., Sodium selenite treatment prevents prolongation
of the cardiomyocyte action potential in streptozotocin induced diabetes rat.
Fouthyfive Annual Meeting, February 12-16, 2001. Boston USA, Biophysical
Journal, 80(1), A538, 2001.
11. Turan B., Ayaz M., Özdemir S., U ur M., Selenium shortens the prolonged
action potentials in experimental diabetic rat hearts. ISHR Montreal, Diseases of the
Cardiovascular System and Immunity, 12-15 July, 2001, Montreal, Canada.
12. Özdemir S., Ayaz M., U ur M., Turan B., In vivo selenit uygulamasının
diyabetik kardiyomiyopatiye pozitif etkilerinin patch-clamp tekni i ile incelenmesi,
XIII. Ulusal Biyofizik Kongresi, 5-7 Eylül 2001, Eski ehir, Bildiri Özetleri
Kitapçı ı, sayfa: S1.
13. Ayaz M., Özdemir S., U ur M., Turan B. In vivo selenit uygulamasının normal
sıçan kalbi elektriksel aktivitesine etkilerinin elektrofizyolojik tekniklerle
incelenmesi. XIII. Ulusal Biyofizik Kongresi, 5-7 Eylül 2001, Eski ehir, Bildiri
Özetleri Kitapçı ı, sayfa: S4.
14. Ayaz M., Can B, Özdemir S., U ur M., Turan B. In vivo selenit
uygulamasının diyabetik kardiyomiyopatiye pozitif etkisin elektron mikroskobu ile
70
incelenmesi. XIII. Ulusal Biyofizik Kongresi, 5-7 Eylül 2001, Eski ehir, Bildiri
Özetleri Kitapçı ı, sayfa: P1.
15. Turan B., Ayaz M., Özdemir S., U ur M., Vassort G., Selenite restores
diminished K currents in diabetic rat heart. 22nd European Section meeting of the
International Society for Heart Research, 3-6 July, 2002 – Szeged, Hungary, Abstract
in: J, Mol, Cell, Cardiol, 2002, 34(6); A65.
16. Ayaz M., Buluç M., Turan B., Demirel-Yılmaz E. The effects of resveratrol
om mechanical and elecrtrical activities of the isolated rat heart. 22nd European
Section meeting of the International Society for Heart Research, 3-6 July, 2002 –
Szeged, Hungary, Abstract in: J. Mol. Cell. Cardiol. 2002, 34(6); A6.
17. Özdemir S., Ayaz M., U ur Ö., U ur M., Turan B. Effect of diabetes and
selenite on contractile responses and -adrenergic signalling in rat heart. 22nd
European Section meeting of the International Society for Heart Research, 3-6 July,
2002 – Szeged, Hungary, Abstract in: J. Mol. Cell. Cardiol. 2002, 34(6); A47.
18. Ayaz M., Özdemir S., U ur M., U ur Ö., Turan B., Diyabetik sıçan kalbi adrenoseptör yanıtlarının moleküler mekanizması, 14, Ulusal Biyofizik Kongresi, 4-6
Eylül 2002, Ankara, Özet Kitapçı ı (Poster) S: 34.
19. Özdemir S., Ayaz M., U ur M., Turan B., Anjiyotensin reseptör (AT1)
antagonistinin diyabetik kardiyomiyopatiye etkisi, 14, Ulusal Biyofizik Kongresi, 4-6
Eylül 2002, Ankara, Özet Kitapçı ı (Poster) S:36.
20. Ayaz M, Özdemir S., U ur M., Turan B. Diyabetik kardiyomiyopatide hücre
içi serbest Ca deri imi. Ulusal Biyofizik Kongresi, 8-12 Ekim 2003, Pamukkale,
Özet kitabı, s:35.
21. Yara N., Ayaz M., Özdemir S., U ur M., Turan B. Interpretation of relevance
of sodium calcium exchange in action potensial of diabetic rat heart by mathematical
model, ISHR meeting, 2-6 June, 2004, Dresden-Germany, Abstract in: J. Mol. Cell.
Cardiol. 36(5): 765, 2004.
VIII-YAYINLAR:
1. U ur M., Ayaz M., Ozdemir S., Turan B. Toxic concentration of selenite
shortens repolarization phase of action potential in rat papillary muscle. Biol. Trace
Elem. Res. 89(3): 227-38, 2002.
2. Ayaz M., Can B., Ozdemir S., Turan B. Protective effect of selenium treatment
on diabetes-induced myocardial structural alterations, Biol. Trace Elem. Res., 89(3):
215-26. 2002.
71
3. Koç E., Ayaz M., Saran Y., Turan B. Relationship between structural alterations
of ileal smooth muscle and altered responses to acetylcholine in streptozotocininduced diabetic rats. Journal of Medical Research. 20(2): 65-71, 2002.
4. Özdemir S., Ayaz M., Tuncer T., Ugur M., Turan B. Vegetable Oils used as
Vitamin E vehicle effects the Electrical Activity of Rat Heart. Physiological
Research. 52(6): 767- 771. 2003.
5. Ayaz M., Ozdemir S., Ugur M., Vassort G., Turan B. Seleniterestores
prolonged action potential duration and diminished K+ currents in diabetic rat heart.
Archives of Biochemistry and Biophysics. 426: 83-90. 2004.

deneysel diyabetik kardiyomiyopatide hücre içi serbest iyon

Transkript

Benzer belgeler

Ulusal bilgi ve ileti im güvenli i (BG), Türk BG Ekipmanı