Biyolüminesent Photobacterium leiognathi

Orlab On-Line Mikrobiyoloji Dergisi
Yıl: 2005 Cilt: 03 Sayı: 02 Sayfa: 1-6
www.mikrobiyoloji.org/pdf/702050201.pdf
Biyolüminesent Photobacterium leiognathi TEM04S2
Straini ile Bakterilerde Quorum Sensing 'in Kanıtlanması
Esra Ersoy1, İsmail Karaboz2, Atakan Sukatar3,
D. Seyfettin Aldağ4, Erencan Sinecan5, Güray Güner5
Özet
Bu çalışmada lüminoz bir bakteri olan Photobacterium leiognathi Boisvert et al.
1907’nin TEM04S2 straini kullanılarak bakterilerde toplu bir davranış biçimi olan
“Quorum Sensing”’in kanıtlanması amaçlanmıştır. Model organizma olarak kullanılan
bakteri İzmir Körfezi’nden izole edilmiş ve tanılanmıştır. Quorum Sensing denemesi
için Seawater Complete (SWC) ortamında geliştirilen 24 saatlik genç Photobacterium
kültüründen 2.1x 107 kob/ ml düzeyde alınarak sıvı SWC ortamındaki gelişmeleri her
saat başı uygun ardışık seyreltmeleri yapılarak ve yayma plaka yöntemi kullanılarak
izlenmiştir. Bakterilerin ışıma gösterdiği süre ve sayı sırasıyla 7 saat ve 7.6 x 107
kob/ ml olarak belirlendiğinden Quorum Sensing için Photobacterium leiognathi ’nin
belli bir süre sonra ve belli bir sayıya ulaştıktan sonra ışıma oluşturduğu
kanıtlanmıştır.
Anahtar Kelimeler: Quorum Sensing, biyolüminesens, Photobacterium, bakterilerde
iletişim
Giriş
Son zamanlara dek bakterilerin ayrı ayrı yaşayan ve sosyal davranışlar göstermeyen
asosyal canlılar oldukları biliniyordu. Ancak son yıllarda yapılan çalışmalar ile,
bakterilerde bazı iletişim sistemleri bulunduğunu ve bu sayede çevreleri ile iletişim
kurdukları gösterilmiştir. Quorum Sensing (QS) adı verilen bakterilerdeki iletişim
sistemlerinin, bakterilerin hücre yoğunluğuna bağlı toplu bir davranış biçimi olduğu
belirlenmiştir (1 - 4).
QS sistemleri bakteriler içinde farklılık göstermektedir. Türe özgü iletişim sistemleri
bakımından Gram negatif bakterilerde Açillenmiş Homoserin Laktonlar (AHL) veya
1
Uzman Mikrobiyolog, 2Prof. Dr., Ege Üniversitesi Fen Fakültesi, Biyoloji Bölümü, Temel ve
Endüstriyel Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, 35100 Bornova-İzmir. Yazışmalardan sorumlu
yazarın elektronik posta adresi: [email protected]
3
Doç. Dr., Ege Üniversitesi, Fen Fakültesi, Biyoloji Bölümü, Hidrobiyoloji Anabilim Dalı,35100
Bornova-İzmir
4
Uzman Biyoloji Öğretmeni, 5Öğrenci, İzmir Fen Lisesi, 35100 Bornova-İzmir
1
Homoserin Laktonlar (HSL) denilen otoindükleyicilerle (AI-1) indüklenen Lux I / Lux
R tipinde bir QS sistemi bulunmasına karşın, Gram pozitif bakterilerdeki QS sistemi
Oligopeptit/ İki komponentli tiptedir. Türler arası iletişim sistemleri ise Lux S / AI-2 tip
QS sistemleri ile çalışmaktadır (2, 4 - 6).
Gram negatif bakterilerde görülen QS sistemlerinin: biyolüminesens, biyofilm
oluşumu, virülens, antibiyotik üretimi, ekzo enzim salgılanması, hareketlilik, bazı
pigmentlerin üretimi, nodül oluşumu, swarming v.b. davranış biçimlerini belirlemede
rol oynadığı belirlenmiştir (4, 5, 7- 9).
Global bir genetik regülasyon mekanizması olan QS’in bakterilerde bilinen ilk örneği
biyolüminesens (biyolojik ışıma)’dır. Işık oluşturan bakterilerden denizel ortamlarda
yaşayan örnekleri Vibrio, Photobacterium ve Shewanella olarak üç genus altında
toplanmış olup, her üç genus üyeleri de Gram negatif bakterilerdendir. Tüm diğer
Gram negatif bakterilerce oluşturulan QS sistemlerinde olduğu gibi, ışık oluşturan
bakterilerde otoindükleyiciler olan AHL veya HSL’ler Lux I tipi proteinlerce
oluşturulmaktadır. Sistemin diğer unsuru ise Lux R proteini olup, otoindükleyicisi ile
birleşebilen sitoplazma içindeki eşleniğidir. Gram negatif bakteri kendine özgü bir
AHL veya AHL’ler kombinasyonu ürettiği için, sadece kendi bireylerini tanıması ve
yanıt vermesi sağlanmış olur. Dışarıya diffüzyon ile salınan AHL düzeyi belli bir eşik
değere geldiğinde, otoindükleyici yine diffüzyon ile hücre membranından içeriye
alınıp Lux R proteini ile bağlanır.Böylece oluşan Lux I / Lux R birleşiği özgül DNA
promotor elementine bağlanarak, hedef genlerin ifade edilmesine yol açar.
Biyolüminesensde hedef gen ışıma genleri olduğu için bakterilerin belirli bir sayıya
ulaştığında belirli bir dalga boyunda ve renkte ışıma yaptığı görülür. Vibrio ve
Photobacterium ’larda ışığın dalga boyu ve rengi genelde 490 nm ve mavi-yeşildir.
Bazı tür ve strainlerde sarı veya mavi renkte ışımaya neden olan yardımcı gen ve
proteinlerin olduğu da bilinmektedir. Örneğin, V. fischeri ‘de max. 540 nm de sarı ışık
oluşumu ve YFP geni; P. phosphoreum ve P. leiognathi ’de max. 475 nm de mavi
renk oluşumu ve BFP “Lumazin” geni v.b. (3, 10 - 19).
QS’in görüldüğü ilk olay lüminoz bakterilerdeki ışıma olup, günümüzde birçok
fizyolojik davranışın temelinde bu sistem yatmaktadır. Hatta son araştırmalar ile
neredeyse her bakteride QS ile ilgili en az 1-2 sistemin var olduğundan söz
edilmektedir. QS’in lüminoz bakterilerde gösterilmesi için, in vivo veya in vitro olarak
yaşayan bakterileri ışımaya başladığı andaki konsantrasyonlarının belirlenmesine
gereksinim vardır. Bu amaçla bu çalışmada in vitro olarak uygun besiyerlerine
yapılan inokülasyonlar sonrası, bakterilerin zaman içinde hangi saatte ve hangi
sayıda ışıdıklarının belirlenmesine çalışılmıştır.
Materyal ve Metot
Bu çalışmada deney organizması olarak lüminoz bir deniz bakterisi olan
Photobacterium leiognathi kullanılmıştır. Bu organizma Ege Üniversitesi Fen
Fakültesi Biyoloji Bölümü Temel ve Endüstriyel Mikrobiyoloji (TEM) kültür
koleksiyonundan temin edilen Photobacterium. leiognathi TEM 04S2 nolu strainidir.
Bu strainin karakteristik özellikleri Çizelge 1’de gösterilmiştir (20).
2
Çizelge 1. Photobacterium leiognathi Strainlerin Özellikleri (Ersoy, 2005)
Strainler
Özellikler
K u l l a n ı m ı
Sıcaklık
1-3 polar flagel
Düz çubuklar
PHB
akümülasyonu
Oksidaz
Gram
reaksiyonu
D-Glukoz, gaz
Nitrat
redüksiyonu
Lüminesens
Arginin
dihidrolaz
İndol üretimi
+4 oC
+20 oC
+30 oC
+35 oC
+40 oC
Lipaz üretimi
Amilaz üretimi
L-Serin
Maltoz
D(+) Ksiloz
DL-Alanin
D(+)
Galaktoz
D-Mannoz
Na-Asetat
L-Prolin
Glukoz
Gliserol
Na-Piruvat
Sellobioz
Mannitol
N-asetil
glukozamin
L-arabinoz
+: pozitif strainler ;
TEM0401
TEM0403 TEM0405 TEM0406 TEM04S1 TEM04S2
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
-: negatif strainler
-
-
-
-
Deney organizması olan P. leiognathi’nin saklanması, üretilmesi QS denemelerinde
besiyeri olarak katı ve sıvı Seawater Complete (SWC) ortamı kullanılmıştır (10,11).
Bakterinin üretilmesi için yatık SWC agarlı tüplerde bulunan P. leiognathi ’den bir öze
alınarak, Petri kutusunda hazırlanan SWC agarlı plaklara inoküle edilip, 20 oC’de 1
gece inkübe edilmiştir.SWC agarlı petrilerde üreyen bakterilerden 1-2 öze dolusu
alınıp, içinde 25 ml sıvı SWC besiyeri bulunan erlenlerde iyice karıştırılarak süspande
3
edilmiştir. Elde edilen bu bakteri süspansiyonundan (10-1-10-10) aralığında hazırlanan
ardışık seyreltmelerinden 0,1’er ml alınarak, önceden hazırlanmış SWC agarlı
plaklara L-bagetle yaymak sureti ile yayma ekim yöntemi kullanılmış ve ekim yapılan
petriler 20 oC’de 1 gece inkübe edilmiştir. İnkübasyon sonunda oluşan koloniler
sayılarak ve seyreltme katsayısı ile çarpılarak bakteri süspansiyonundaki sayı
hesaplanmıştır. Daha sonra, bilinen bu bakteri düzeyinden 2,1 x 107 kob / ml ‘si
başlangıç (0. saat) olarak kabul edilip, içinde 25’er ml sıvı SWC ortamı bulunan 10
adet erlene 1‘er ml aşılanmıştır. Erlenler 20 oC’de inkübasyona bırakılmış ve her saat
başı hem karanlıkta ışıma olup olmadığı kontrol edilmiş ve hem de yukarıda
belirtildiği şekilde ardışık seyreltmeleri hazırlanıp, yayma plaka yöntemi kullanılarak
SWC plaklarında büyüyen ve ışıma gösteren bakteri sayıları hesaplanmıştır. Böylece
her saat 1 ml de oluşan biyolüminesen bakteri sayıları elde edilmiştir. Deneme SWC
besiyerli erlenlerde ışıma gözleninceye dek sürdürülmüştür. Işıma, karanlıkta ve göz
karanlığa uyum sağladıktan sonra çalkalanarak iyice karıştırılan sıvı ortamlı erlenler
incelenerek gözlenmiştir (10 - 12, 21, 22).
Araştırma Sonuçları ve Tartışma
Deneme sonucunda lüminoz bakterilerin SWC ortamında zamana karşı
oluşturdukları bakteri sayıları hesaplanmış olup, Çizelge 2’de gösterilmiştir. Deneme
esnasında bakterilerin biyolüminesens gösterip ışımaya başladıkları süre 7. saat
olarak belirlenmiştir. Bu nedenle bakterilerin QS yapması için gerekli minimal düzey
7,6 x 107 kob / ml olarak belirlenmiştir.
Çizelge 2. P. leiognathi TEM04S2 Denemeler esnasında biyolüminesen bakteri
Straininden Farklı Sürelerde Elde sayısının başlangıçta 2,1 x 107 kob / ml gibi
Edilen Ortalama Bakteri Sayıları yüksek düzeyde alınmasının nedeni, hem aynı
gün içinde kısa sürede deneme sonucunun
7
alınması ve hem de daha önemlisi çeşitli
l0 x kob / ml
kaynaklarda ışıma için gerekli bakteri sayısının
0. saat
2,1
107 adet/ ml’den daha fazla olması gerektiğinin
1. saat
2,3
belirtilmesinden
kaynaklanmaktadır
(11,12).
2. saat
2,6
Gerçektende
bakterilerde
ışıma
aynı
gün
içinde
3. saat
2,9
görülmüş ve ışıma için gerekli olan sayıya kısa
4. saat
3,3
sürede ulaşılmıştır. Böylece bakterilerin QS
5. saat
4,6
yapmasında model olarak seçilen biyolüminesens
6. saat
6,0
için gerekli süre 7 saat ve ışıma için gerekli
7. saat
7,6
minimal düzey de 7,6 x 107 kob / ml olarak
8. saat
10,0
belirlenmiştir.
Sonuçta bakterilerin biyolüminesens örneğinde olduğu gibi, bazı davranış biçimlerini
göstermede QS sistemlerini kullandıkları, İzmir Körfezi’nden elde edilmiş lüminoz bir
bakteri ile Photobacterium leiognathi TEM04S2 straini ile kanıtlanmıştır.
Denizde serbest olarak yaşarken 0,01- 40 hücre / ml gibi düşük seviyelerde bulunan
lüminoz bakterilerin simbiyotik olarak çeşitli omurgasız ve omurgalı deniz canlıları
içinde 109- 1011 hücre / ml şeklinde yüksek düzeylerde rastlanması, biyolüminesens
göstermesi için QS sistemlerini çalıştırarak toplu bir davranış biçimi sergilediklerini
4
göstermektedir Denemelerde elde edilen sayı, bakterilerin logaritmik döneminin
henüz başlarında olduğu için, denemeye devam edilseydi çok daha yüksek sayılara
ulaşılabileceği görülecekti. Amaç ışımanın gözlenmesi olduğu için denemenin
sürdürülüp daha da yüksek olan sayılara ulaşmak gerekmemiştir (11,12,15).
Sonuç
Son yıllarda ortaya çıkarılan QS sistemleri ve bunlarda yer alan bakterileri sayıları
giderek artmaktadır. Ayrıca, bazı bakterilerde farklı sistemler ile çalışan birden fazla
QS sistemi olduğu da belirlenmiştir. QS sistemlerinde rol oynayan proteinlerin
bulunması ve tanımlanması ile, hücrelerin fizyolojik davranışlarının anlaşılmasına ve
böylece bunlarla ilgili yeni stratejilerin saptanmasına olanak sağlanacaktır. QS’in
mekanizmaları aydınlatıldıkça tıp, tarım, çevre, biyoteknoloji, moleküler genetik v.b.
ilgili alanlarda yeni fırsatlar yaratılabileceği görülmektedir. Yapılan yeni çalışmalar,
QS’e dayalı olarak oluşan çeşitli bitki, hayvan ve insan hastalıklarındaki bazı
patojenlerin virülanslarının engellenmesi, bakterilerin çeşitli yüzeylerde veya canlı
içinde tek olarak ya da farklı tür ve genusların birlikte oluşturdukları biyofilmlerin
engellenmesi,hastalıkların biyolojik kontrolü için yeni alternatiflerin yaratılması,
patojenler için yeni ilaç hedeflerinin belirlenmesi,sistemle ilgili yeni metabolitlerin
üretiminin arttırılması, moleküler düzeyde QS ve diğer genetik regülasyon
sistemlerinin (örneğin, stres ptoteinleri) bağlantılarının ortaya konarak sistemlerin ve
etkileşimlerinin anlaşılması mümkün olabilecektir (2, 5, 23 - 27).
Kaynaklar
1. Karaboz ve Sukatar, 2004.Bakterilerde Sosyal Davranışlar (Bakterilerde İletişim
Mekanizmaları), Orlab On-Line Mikrobiyoloji Dergisi,02:05, 23-32.
2. Greenberg,E.P. 2003.Bacterial communication and group behavior. The Journal of Clinical
Investigation, 112 (9), 1288-1290.
3. Madigan, M.T., Martinko, J.M. and Parker, J. 2000. Biology of Microorganisms. PrenticeHall Int. Ltd. London.
4. Federle, M..J. and Bassler, B. 2003. Interspecies communication in bacteria. The Journal
of Clinical Investigation, 112 (9), 1291-1299.
5. Daniels, R., Vanderleyden, J. and Michiels, J. 2003. Quorum sensing and swarming
migration in bacteria. FEMS Microbiology Reviews ( in press ).
6. Camara, M., Williams, P. and Hardman, A. 2002. Controlling infection by tuning in and
turning down the volume of bacterial small-talk. The Lancet Infectious Diseases, 2, 667-676.
7. Podbielski, A. and Kreikemeyer, B. 2004. Cell density-dependent regulation: basic
principles and effect on the virulence of Gram-positive cocci. International Journal of
Infectious Diseases, 8 (2), 81-95.
8. Xavier, K.B. and Bassler, B.L. 2003. LuxS quorum sensing: more just a numbers game.
Current Opinion in Microbiology, 6, 191-197.
9. Sukatar, A. ve Karaboz, İ. 2001. Sucul Canlılarda Biyolüminesens, E.Ü. Su Ürünleri
Dergisi, 18 ( 3-4), 547-554.
10. Sneath, P.H.A., Mair,N.S., Sharpe, M.E. and Holt, J.G. 1986. Systematic Bacteriology,
Vol.2, p. 539-544.Williams and Wilkins, Baltimore, USA.
5
11. Dunlap, P.V. and Kita-Tsukamoto, K. 2001. Luminous bacteria. Chapter 329, in Dworkin,
M. Et al. (eds.), The Prokaryotes, an Evolving Electronic Resource for Microbiological
Community. Academic Press, New York,NY.
12. Nealson, K. and Hastings, J.W. 1992. Luminous bacteria, pp. 625-639. In A Balows.,
H.G. Trüper., M. Drowkin., W. Harder., K.H.Schleifer (eds.) The Prokaryotes. SpringerVerlag.
13. Shimumuro, O. 1985. Bioluminescence in the sea: photoprotein systems. Symposia of
the Society for Experimental Biology, 39: 351-372
14. Rees, J.F., Wergifosse, F.B., Noiset, O., Dubuisson, B., Janssens, and Thomson, E.M.
1998. The origins of marine bioluminescence: turning oxygen defence mechanisms into
deep-sea communication tools. The Journal of Experimental Biology, 201: 1211-1221.
15. Herring, P. 2002. Marine microlights: the luminous marine bacteria. Microbiology Today,
(29), 174-176.
16. Prasher, D.C., O’Kane, D.O., Lee, J. and Woodward, B. 1990. The lumazine protein gene
in Photobacterium phosphoreum is linked to the lux operon. Nucleic Acids Research, 18:21,
6450.
17. O’Kane, D.J., Woodword, B., Lee, J. and Prasher, C. 1991. Borrowed proteins in
bacterial bioluminescence. Proc. Natl. Sci. USA, 88, 1100-1104.
18. Karatani, H. and Konaka, T. 2000. Activities of the Bimodal Fluorescent Protein
Produced by Photobacterium phosphoreum Strain bmFP in the Luciferase Reaction In Vitro.
Photochemistry and Photobiology, 71 (2), 237-242.
19. Lin, J.W., Chao, Y.F. and Weng, S.F. 2001. Riboflavin Synthesis Genes ribE, ribB, ribH,
ribA Reside in the lux Operon of Photobacterium leiognathi, Biochemical and Biophysical
Research Communications, 284, 587-595.
20. Ersoy, E. 2005.İzmir İli Deniz Suyu ve Deniz Canlılarındaki Lüminoz Bakterilerin
İzolasyonu ve Tanılanması. E.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü, Biyoloji Anabilim Dalı Yüksek Lisans
Tezi, Bornova-İZMİR.
21. Makemson, J.C., Fulayfil, N. and Basson, P. 1992. Association of Luminous Bacteria with
Artificial and Natural Surfaces in Arabian Gulf Seawater. Applied and Environmental
Microbiology,2341-2343.
22. Orndorff, S.A. and Colwell, R.R. 1980. Distribution and Identification of Luminous
Bacteria from the Sargasso Sea. Applied and Environmental Microbiology, 983-987.
23. Delisa, M.P. and Bentley, W.E. 2002. Bacterial autoinduction: looking outside the cell for
new metabolic engineering targets. Microbial Cell Factories, 1 (5), 1-9.
24. Suga, H. and Kristina, M.S. 2003. Molecular mechanisms of bacterial quorum sensing as
a new drug targed. Current Opinion in Chemical Biology, 7. 586-591.
25. Kievit, T.R. and Iglewski, B.H. 2000. Bacterial quorum sensing in pathogenic
relationships . Infection and Immunity, 68 (9), 4839-4849.
26. Perego, P., Fanara, L., Zilli, M. And Del Borghi, M. 2002. Applications of Luminous
Bacteria on Environmental Monitoring. Chem. Biochem. Eng. Q. 16 (2), 87-92.
27. Ersoy, E., Karaboz, İ., Sukatar, A. 2004. İzmir Körfezi’nden Elde Edilen Biyolüminesens
Özellik Gösteren Bir Bakteri. Deniz Bakteriyolojisi (25-27 Kasım 2004, İstanbul), Özet Kitabı,
24-26.
6