Immunoloji 2011:Layout 1 - Turkish Journal of Immunology

İnsan Mezenkimal Kök Hücre Fenotipik
Karakterizasyonu; Yağ ve Kemik Hücrelerine
Yönlendirilmesi
Phenotypic Characterization of Human Mesenchymal
Stem Cells; Their Differentiation into Fat and Bone Cells
ESİN AKTAŞ ÇETİN1, CEM MUHLİS AR2, GÜLDEREN YANIKKAYA DEMİREL3, SEMA BİLGİÇ1,
FATİH SALMAN1 GÜNNUR DENİZ1
1İstanbul Üniversitesi, Deneysel Tıp Araştırma Enstitüsü, İmmünoloji Anabilim Dalı, İstanbul, Türkiye
2İstanbul Üniversitesi, Cerrahpaşa Tıp Fakültesi, İç Hastalıkları Anabilim Dalı, Hematoloji Bilim Dalı, İstanbul, Türkiye
3Yeditepe Üniversitesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Tıbbi İmmünoloji Bilim Dalı, İstanbul, Türkiye
ÖZET
Erişkin mezenkimal kök hücreler (MKH) kemik iliğinde (Kİ) bulunan ve dokularda farklı hücre tiplerine farklılaşma potansiyeli olan
hücrelerdir. Bu hücreler osteojenik, adipojenik ve kondrojenik farklılaşma özelliği göstermekte ve günümüzde klinikte kullanım
potansiyelleri araştırılmaktadır. Çalışmamızda Kİ kökenli MKH eldesi ve bu hücrelerin adiposit ve osteosite yönlendirilmesi amaçlanmıştır.
Primer hematolojik malignite saptanmayan kişilerin Kİ aspirasyon örnekleri kullanılmış, izolasyon öncesi ve sonrası CD3, CD16, CD33,
CD34, CD38, CD44, CD45, CD59, CD73, CD90 ve CD105 ekspresyonu flow sitometrik olarak analiz edilmiştir. 16 haftalık kültürleri
süresince MKH’lerin immünfenotipik analizlerine devam edilmiş ve bu hücrelerin 3. pasajını takiben hücreler 5 hafta boyunca adiposit
ve osteosite yönlendirilmiştir. Hücrelerin histokimyasal olarak adiposit ve osteositlere dönüşüm oranları araştırılmıştır.
MKH izolasyonu sonrası CD3, CD16, CD33, CD38 ve CD45 ekspresyonlarında izolasyon öncesine göre düşüş saptanmıştır. Kültür
periyodu boyunca CD59+CD105+, CD73, CD90, CD90+CD73+ ekspresyonunda artış, CD16 ekspresyonunda ise düşüş
görülmüştür. MKH ile kıyaslandığında adiposit ve osteosit kültürlerindeki CD59+CD105+, CD73, CD90, CD90+CD73+, CD105
ekspresyonlarında düşüş saptanmış ve hücrelerin adiposit ve osteositlere dönüşüm oranları histokimyasal olarak gösterilmiştir.
Primer kültür süresince yüzey molekül ekspresyonlarında değişiklik göstermeyen MKH’lere karşılık, adiposit veya osteosite
yönlendirilen hücrelerde MKH belirteçlerinde azalma tespit edilmiştir.
Çalışmamız, plastik olma özelliği sayesinde MKH’lerin yağ ve kemik hücrelerine yönlendirilebileceğini düşündürmektedir.
Anahtar Kelimeler: Mezenkimal kök hücre, kemik iliği, adiposit
ABSTRACT
Adult mesencyhmal stem cells (MSC) are the cells existing in bone marrow (BM) and having the potential to differentiate to different
cell types. These cells present osteogenic, adipogenic and chondrogenic differentiation characteristics and may thus BM aspiration
samples from patients with no haematological malignancies were used. CD3, CD16, CD33, CD34, CD38, CD44, CD45, CD59, CD73,
CD90 and CD105 expressions were analysed by flow cytometry before and after isolation. Immunophenotypic analyses of the MSCs
were repeated during the culture period of 16 weeks. Following the third passage, MSCs were directed into adipocytes and osteocytes
for 5 weeks. The differentiation rate into adipocytes and osteocytes were investigated histochemically.
There was a decrease in CD3, CD16, CD33, CD38, CD45 expressions following MSC isolation. Increased levels of
CD59+CD105+, CD73, CD90, CD90+CD73+ and a decreased CD16 level were observed following MSC differentiation.
Compared with MSC, adipocyte and osteocytes show lower CD59+CD105+, CD73, CD90, CD90+CD73+, CD105 expressions
and differentiation into adipocytes and osteocytes were also investigated histochemically.
This study demonstrated that MSCs can be directed into fat and bone cells through their plasticity.
Key Words: Mesenchymal stem cell, bone marrow, adipocyte
Turk J Immunol, 2011; 16: 1
Received: 13.10.2010
Revised: 21.12.2010
1
Accepted: 21.12.2010
TURK J IMMUNOL
Vol.16, No.1, 2011
olanak vermiştir. Ayrıca MKH’lerin tek tabaka kültür
halinde çoğalma kapasiteleri bulunmakta, in vitro ve in
vivo şartlarda osteoblast, kondrosit ve adipositlere
dönüşebildiği belirtilmektedir14,15.
Fonksiyonel çeşitlilik içeren ve farklı dokulardan
izole edilen MKH’ler CD29, CD44, CD49a-f, CD51,
CD73, CD105, CD106, CD166 ve STRO-1 gibi çok
sayıda yüzey molekülü eksprese etmelerine rağmen
CD11b, CD14 ve CD45 gibi hematopoetik soya özgü
yüzey moleküllerini taşımamaktadır2. MKH’ler
hematopoetik, non-hematopoetik büyüme faktörleri,
sitokinler ve kemokinler salgılamaktadır. Bu sitokinlerin
bazıları devamlı, bazıları ise aktivasyon sonucu
salgılanmaktadır16. Buna ek olarak MKH’ler
birçok sitokin ve büyüme faktörü reseptörlerini de
eksprese etmektedir. Kemik iliği mikroçevresine bu
hücrelerin dinamik katılımları proteoglikanlar, kollajen,
laminin, fibronektin gibi matriks molekülleri ile de
gösterilmektedir6. MKH’ler hücreler arası etkileşimde
önemli rolleri bulunan yapışma moleküllerini de
eksprese etmektedir. Osteopontin ve hiyalüronan gibi
çeşitli ligandlar için reseptör olan CD44’ün MKH’lerde
yüksek orandaki ekspresyonu, bu hücrelerin ilik veya
kemikte hücre dışı matriks organizasyonundaki rolünü
işaret etmektedir17,18.
MKH’ler için belirli belirteçler bulunmasına
rağmen, MKH elde edilen donörler arasındaki yaş
farklılığı, laboratuvarlarda kullanılan kültür teknikleri
ve doku kültürü medyum içeriğindeki farklılıklar
nedeniyle MKH için optimal bir belirteç
kombinasyonu saptanamamıştır. Çalışmamızda
insan Kİ kökenli MKH eldesi ve bu hücrelerin
adiposit ve osteosite yönlendirilmesi sürecinde
yüzey molekül ekspresyonlarındaki değişimler
araştırılmıştır.
GİRİŞ
etişkin organizmaların kemik iliğinden izole
edilen mezenkimal kök hücreler (MKH) veya
multipotent stromal hücreler in vivo olarak
transplante edildiklerinde heterotropik kemik
dokusu oluşturma kapasitesine sahip hücreler
olarak tanımlanmışlardır. Son yıllarda bu hücrelerin
yağ, göbek kordon kanı, plasenta, diş pulpası,
tendonlar, sinoviyal sıvı, dolaşım sistemi ve esas
olarak da kemik iliği stromasında bulunduğu
gösterilmiştir1-3. Kemik iliğinde bu hücreler
nukleuslu ilik hücrelerinin 1/10.000-1/100.000’ni
İnsan
MKH’leri
sağlıklı
oluşturmaktadır4.
gönüllülerin iliak kemik iliği aspiratından izole
edilebilmekte ve plastik doku kültürü plaklarında
çoğaltılabilmektedir5. Ex vivo olarak çoğaltılabilen,
in vivo veya in vitro ortamda osteoblast, kondrosit,
adiposit, tenosit, miyosit ve nöral hücrelere
farklılaşabilen bu hücrelerin multipotent özellikleri,
kolay izolasyon ve kültür aşamaları klinikte
terapötik amaçlı kullanımlarına olanak vermekte ve
bu hücrelerin çok sayıda doku hasarları için etkili
bir terapötik ajan olduğu düşünülmektedir6-9.
MKH’ler kemik iliğinin stromal fraksiyonunda
bulunarak hematopoezi destekleyen bir hücresel
mikroçevre oluşturmaktadır. MKH’lerin allogeneik
lenfositlerle ko-kültürleri sonucunda lenfosit
proliferasyonunu uyarmaması, bu hücrelerin doğal
olarak immünojenik olmadığını kanıtlamaktadır.
Son yıllarda MKH’lerin orta düzeyde sınıf I doku
uyumluluk antijenlerini (MHC) eksprese etmelerine
rağmen sınıf II antijenlerini taşımaması ve immün
sistemi baskılayıcı özelliklerinin in vitro şartlarda
spesifik T hücre fonksiyonlarını modüle ederek
yapması bu hücrelerin immünomodülatör
özelliklerinin de bulunduğunu göstermektedir10,11.
MKH’lerin yetişkin sağlıklı bireylerin dokularından
kolaylıkla izole edilebilmesi ve çoğaltılabilmesi
nedeniyle, birçok biyolojik sistemlerin aksine insan
MKH’leri hayvan MKH’lerinden daha ayrıntılı şekilde
tanımlanmıştır. Bununla birlikte bu hücrelerin farklı
hayvan türlerinden de izolasyonları yapılmaktadır. En
iyi sonuçlar sıçan ve fare deneylerinden elde
edilmesine karşılık, MKH’lerin terapötik potansiyelleri
at, inek, domuz, köpek, koyun ve maymunlarda da
araştırılmıştır12,13. MKH’lerin izolasyonları ile ilgili farklı
metodlar geliştirilmiş ve flow sitometri yöntemi bu
hücrelerin spesifik yüzey antijenlerinin analizlerine
Y
GEREÇ VE YÖNTEMLER
Hasta Grubu
Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Erişkin Hematoloji
Polikliniği’nde malignite dışı hematolojik hastalığı
nedeniyle kemik iliği biyopsi ve aspirasyonu
yapılan hastaların (n=17, yaş ortalaması 46±14)
örneklerinden artan materyaller hastaların onamı
alındıktan sonra MKH kaynağı olarak kullanılmıştır.
Kemik iliği biyopsi ve aspirasyonu Jamshidi tipi biyopsi
iğnesi kullanılarak posteriyor iliak kanattan yapılmıştır.
Rutin olarak sitogenetik çalışma için alınan heparinli
kemik iliği aspirasyon örneklerinden artan materyal
çalışmada değerlendirilmiştir. Araştırmamızda
Helsinki Deklarasyonu Prensipleri’ne uygun şekilde
2
TURK J IMMUNOL
Vol.16, No.1, 2011
İstanbul Üniversitesi İstanbul Tıp Fakültesi’nden etik
kurul onayı ve çalışma kapsamındaki hastalardan
‘Bilgilendirilmiş olur’ alınmıştır.
Lose, CA) ve izotipik kontrol olarak immünoglobulin
(Ig)G1-FITC/IgG1-PE/IgG1-ECD (Becton Dickinson,
San Lose, CA) monoklonal antikorları kullanılmıştır.
İmmünofenotiplemede kullanılan antikorlardan CD3,
CD16, CD33, CD34, CD38 ve CD45 negatif CD59,
CD73, CD90 ve CD105 monoklonal antikorları ise
pozitif belirteç olarak düşünülmüştür. 16 hafta
(8 pasaj) boyunca kültüre alınan MKH’ler ile bu
hücrelerin 3. pasajından sonra adiposit ve osteosite
yönlendirilen hücrelerin immünofenotipik analizlerine
devam edilmiştir. Kültür aşamalarındaki hücreler
Tripsin-EDTA solusyonu (Gibco, İnvitrogen, Grand
Island, USA) ile hücre süspansiyonu haline getirilmiş
ve fluoresan işaretli antikorlarla 30 dk. karanlıkta ve
oda ısısında inkübe edilmiştir. Yıkama aşamasını
takiben %1’lik paraformaldehitli fosfat tampon
solusyonu (PBS) ile hücreler fiske edilmiş ve fiske
edilen örnekler BD FACSCalibur cihazında (BD
Bioscience, San Jose, CA) CellQuest Software
programında analiz edilmiştir.
Kemik İliği Kökenli Mezenkimal Kök Hücre İzolasyonu
Heparinli tüplere alınan kemik iliği aspirasyon
materyalinden (n=17) MKH progenitörleri,
RosetteSep®Human Mesencyhmal Stem Cell
Enrichment Kokteyli (Stem Cell Technologies,
Vancouver, BC) kullanılarak ayrıştırılmıştır. Bu
amaçla kemik iliği örnekleri anti-glikoforin A, antiCD3, anti-CD14, anti-CD19, anti-CD38 ve antiCD66b antikorları içeren kokteyl ile (lenfosit,
eritrosit, granülosit ve monositleri dışlamak amacı
ile) inkübe edildikten sonra Ficoll-Hypaque (Sigma
Chem. Co., St. Louis, MO) gradiyentiyle santrifüj
edilmiş ve mezenkimal hücre öncüllerinin yoğun
bulunduğu faz toplanmıştır. İnterfazın toplanıp
yıkama aşamalarından sonra MKH öncüllerinin
hücre sayımları yapılmış ve MKH’leri uyarıcı destek
maddeleri içeren MesenCult®Bazal Medyumda
(Stem Cell Technologies, Vancouver, BC) kültüre
alınmıştır.
Adiposit ve Osteosit Kültürlerinin Histokimyasal
Analizleri
Mezenkimal Kök Hücrelerin Kültür Aşamaları, Yağ ve
Kemik Hücre Yönlendirmesi
Kemik veya yağ hücrelerine yönlendiren MKH
kültürlerinin 4. haftası sonunda adiposit farklılaşması
için hücreler Oil Red O boyaması, osteoblast
farklılaşması için ise Alizarin kırmızısı S boyaması ile
boyanarak değerlendirilmiştir. Alizarin kırmızısı
S (Santa Cruz Biotechnology, Burlington, NC)
boyaması için hücreler doku kültürü medyumundan
uzaklaştırıldıktan sonra %4’lük paraformaldehitli PBS
ile 2 dk. fikse edilmiş ve fiksasyon sonrası kültür
kuyucukları 2 kez distile su ile yıkanmıştır. Kuyucuklar
yıkama aşamasından sonra Alizarin kırmızısı S
boyasında 15 dk. inkübe edilmiş ve distile su ile
yıkandıktan sonra PBS ilave edilerek invert
mikroskopta değerlendirilmiştir. Osteojenik farklılaşma
hücrelerde kalsiyum fosfat birikimi ile tanımlanmıştır.
Adiposite yönlenen hücrelerin ise histokimyasal
boyamaları Oil Red O Boyama Kiti (Diagnostic
BioSystems, CA) kullanılarak saptanmıştır. Bu amaçla
kültür plağında hücrelerin kültür sıvıları uzaklaştırılmış
ve propilen glikolde 2 dk. bekletilen hücreler Oil Red O
boyası ile 6 dk. boyanmayı takiben %85’lik propilen
glikolde 1 dk. bekletilmiştir. Kuyucukların 2 kez distile
su ile yıkama aşamalarını takiben hücreler 1 dk.
Mayer’s Hematoksilini ile boyanmış ve yıkama
aşamalarını takiben adipositler invert mikroskopta
değerlendirilmiştir. Adipojenik yönlenim lipid
damlalarının boyanması ile tanımlanmıştır.
MKH kültürlerinin 3. pasajlarını takiben hücreler,
yağ ve kemik hücrelerine yönlendirilmiştir. Adiposit
farklılaşması için deksametazon, isobutilmetilksantin,
insülin ve BRL 49653 gibi maddeler içeren Adipojenik
stimülatör suplement (Stem Cell Technologies,
Vancouver, BC), osteosit yönlendirilmesi için de
deksametazon, askorbik asit-2 fosfat ve beta-gliserol
fosfat ihtiva eden osteojenik stimülatör kit (Stem Cell
Technologies, Vancouver, BC) kullanılmıştır.
Adipojenik ve osteojenik yönlenmeyi sağlayan
maddeler içeren MesenCult®Bazal medyumunda
MKH’ler kültüre alınmış, haftada iki kez kültürlerin
medyumları değiştirilmiş ve 4. haftanın sonunda
hücrelerde oluşan farklılıklar histokimyasal ve flow
sitometrik olarak analiz edilmiştir.
Flow Sitometrik Metodla Mezenkimal Kök Hücre
İmmünofenotiplemesi
Laboratuvarımıza gelen kemik iliği örneklerinden
MKH
izolasyon
öncesi
ve
sonrasında
immünofenotipleme yapılmıştır. Bu amaçla CD14fluoresan izotiyosiyanat (FITC)/CD16-fikoeritrin
(PE)/CD4-ECD, CD33-FITC/CD34-PE/CD45-PE
Texas kırmızısı (ECD), CD3-PE (Beckman Coulter
Immunotech, Marseille, France), CD59-FITC, CD73PE, CD90-FITC, CD105-PE (Becton Dickinson, San
3
TURK J IMMUNOL
Vol.16, No.1, 2011
İSTATİSTİKSEL ANALİZ
120
Verilerimize normal dağılıma uygunluk testi
yapılmış ve sonuçların istatistiksel anlamlılığı
Student’s t testi ile analiz edilmiştir. Her parametre
için veriler aritmetik ortalama ± standart sapma (SS)
olarak belirtilmiştir. İstatistiksel analiz SPSS 11,5
sürümü kullanılarak yapılmış ve p değeri 0,05’ten
küçük değerler anlamlı olarak kabul edilmiştir
MKH izolasyonu öncesi
MKH izolasyonu sonrası
% ekspresyon
80
40
0
CD59
CD105
CD59+ CD105+
CD90
CD90+ CD73+
CD73
120
BULGULAR
% ekspresyon
MKH Kültür Periyodu Boyunca Saptanan
İmmünofenotipik Değişimler
Taze kemik iliğinden MKH izolasyonu öncesi ve
sonrasında CD59, CD105, CD59+CD105+, CD73,
CD90, CD90+CD73+ ekspresyonları açısından
istatistiksel olarak anlamlı bir fark saptanmamasına
karşılık CD3, CD16, CD33, CD38, CD44, CD45
ekspresyonlarında istatistiksel olarak anlamlı düşüş
(p<0,001) saptanmıştır (Şekil 1, Tablo 1). MKH
kültürlerinin yüzey molekül ekspresyonu kültür
öncesi ve sonrası incelendiğinde MKH dönüşümüyle
bu hücrelerin CD59+CD105+, CD73, CD90,
CD90+CD73+ ekspresyonunda artış (p<0,001),
CD16 ekspresyonunda ise düşüş (p<0,001) tespit
edilmiştir (Şekil 2A, Tablo 2). MKH kültürlerinde
hücre yüzey CD59+CD105+ ve CD90+CD73+
ekspresyon artışları WinMDI analizlerinde
gösterilmiştir (Şekil 2B).
80
40
0
CD3
CD16
CD33
CD34
CD38
CD45
Şekil 1. Kemik iliği MKH izolasyon öncesi ve
sonrası hücre yüzey molekül ekspresyonu. Kemik
iliği örneklerinden MKH izolasyon öncesi ve
sonrası hücre yüzey molekül ekspresyonu flow
sitometrik olarak analiz edilmiştir. Sonuçlar her bir
grupta ortalama ± standart sapma (SS) olarak
saptanmış (n=17) ve istatistiksel olarak anlamlı
farklar bar grafiğinde gösterilmiştir (*p<0,001).
Tablo 1. MKH izolasyon öncesi ve sonrası yüzey molekül ekspresyonlarının istatistiksel analizleri
MKH İzolasyon Öncesi (n=17)
MKH İzolasyon Sonrası (n=17)
Aritmetik ortalama ± SS
(% ekspresyon)
Aritmetik ortalama ± SS
(% ekspresyon)
p değeri
CD59
95,02±4,30
90,00±8,03
AD
CD105
2,01±1,40
3,00±2,01
AD
CD59+CD105+
2,03±1,30
2,00±2,00
AD
CD90
2,01±1,80
3,00±0,50
AD
CD73
2,10±1,10
1,50±1,30
AD
CD90+CD73+
1,02±0,20
1,00±0,20
AD
CD3
39,10±12,00
1,30±0,60
p<0,001a
CD16
37,10±23,02
4,00±3,31
p<0,001a
CD33
50,15±19,22
2,20±1,08
p<0,001a
CD34
3,05±2,43
2,30±1,18
AD
CD38
20,10±11,03
2,60±2,00
p<0,001a
CD45
55,30±22,00
2,00±1,02
p<0,001a
aStudent’s
t testi MKH: Mezenkimal kök hücre; SS: Standart sapma, AD:Anlamlı değil
4
TURK J IMMUNOL
Vol.16, No.1, 2011
A
B
120
Kemik iliği MKH
izolasyon sonrası
90
0 10
CD105
40
CD59
0
CD59
CD105
CD59+ CD105+
CD90
CD73
CD90+ CD73+
MKH izolasyonu sonrası
MKH kültürleri (8 hafta)
8
% ekspresyon
0
6
1
12 82
0,
0
0
98
99
0,3
0
2
CD73
% ekspresyon
80
MKH kültür
aşamaları
4
CD90
0
CD3
CD16
CD33
CD34
CD38
CD45
Şekil 2. MKH izolasyon sonrası ve 8 pasajlık kültür periyodu boyunca yapılan immünfenotipik analizler. A. MKH
izolasyon kiti ile izolasyon sonrası kültüre alınan hücrelerin 16 haftalık 8 pasajlık MKH kültürü boyunca yüzey
molekül ekspresyonlarının değişimi ortalama ± SS olarak bar grafikte gösterilmiş (n=36) ve istatistiksel
anlamlılıklar belirtilmiştir (*p<0,001). B. Kİ MKH’lerin izolasyon sonrası ve 4. pasajdaki MKH hücrelerinin
CD59+CD105+ ve CD90+CD73+ ekspresyonlarının WinMDI görüntüleri gösterilmiştir.
Tablo 2. MKH kültür aşamaları boyunca yüzey molekül ekspresyon analizleri
MKH İzolasyon Sonrası (n=17)
MKH Kültür Aşamaları (n=36)
Aritmetik ortalama±SS
(% ekspresyon)
Aritmetik ortalama±SS
(% ekspresyon)
p değeri
CD59
85,00±4,03
97,00±5,13
p<0,001a
CD105
3,00±2,01
79,00±18,00
p<0,001a
CD59+CD105+
2,00±2,00
80,00±17,20
p<0,001a
CD90
3,00±0,50
96,10±5,10
p<0,001a
CD73
1,50±1,30
95,00±7,00
p<0,001a
CD90+CD73+
1,00±0,20
92,00±17,41
p<0,001a
CD3
1,30±0,60
1,20±0,50
AD
CD16
4,00±3,31
1,30±0,30
p<0,001a
CD33
2,20±1,08
1,30±1,00
AD
CD34
2,30±1,18
1,40±1,28
AD
CD38
2,60±2,00
1,80±1,60
AD
CD45
2,00±1,02
1,60±1,00
AD
aStudent’s
t tesi MKH: Mezenkimal kök hücre; SS: Standart sapma; AD:Anlamlı değil
5
TURK J IMMUNOL
Vol.16, No.1, 2011
yönlendirilmiş hücre öncülleri ile (20 günlük)
karşılaştırıldığında adiposit ve osteosit kültürlerindeki
CD59+CD105+, CD73, CD90, CD90+CD73+ ve
CD105 ekspresyonlarında istatistiksel olarak anlamlı
derecede düşüş (p<0,001, p<0,05, p<0,01, p<0,05,
p<0,01, sırasıyla), CD3, CD33, CD34, CD38 ve
CD45 ekspresyonları açısından ise anlamlı bir
MKH’lerin Yağ ve Kemik Hücresine Yönlendirilmesi
ve Kültür Aşamalarının Flow Sitometrik Analizleri
MKH kültürlerinin 3. pasajını takiben hücreler
adiposit ve osteosite yönlendirilmiş ve 5 haftalık
kültür periyodu boyunca hücrelerdeki yüzey
ekspresyon değişimleri flow sitometrik olarak
incelenmiştir. MKH’ler adiposit ve osteosite
Tablo 3. MKH kültürlerinin osteosit (I) ve adiposite (II) yönlenmeleri aşamalarında yüzey molekül
ekspresyonlarındaki değişimler
I
MKH Kültür Aşamaları (n=36)
Aritmetik ortalama±SS
(% ekspresyon)
Osteosit Kültürleri (n=17)
Aritmetik ortalama±SS
(% ekspresyon)
p değeri
CD59
87,00±5,13
75,00±12,23
AD
CD105
79,00±18,00
42,00±26,00
p<0,01a
CD59+CD105+
80,00±17,20
38,10±28,10
p<0,001a
CD90
96,10±5,10
72,40±26,30
p<0,01a
CD73
95,00±7,00
95,00±7,00
p<0,05a
92,00±17,41
60,00±33,20
p<0,05a
CD3
1,20±0,50
1,10±0,30
AD
CD16
1,30±0,30
1,00±0,20
AD
CD33
1,30±1,00
1,50±0,01
AD
CD34
1,40±1,28
1,00±0,58
AD
CD38
1,80±1,60
1,40±1,00
AD
CD45
1,60±1,00
1,20±0,50
AD
+
+
CD90 CD73
aStudent’s
t testi MKH: Mezenkimal kök hücre; SS: Standart sapma; AD:Anlamlı değil
II
MKH Kültür Aşamaları (n=36)
Adiposit Kültürleri (n=17)
Aritmetik ortalama±SS
(% ekspresyon)
Aritmetik ortalama±SS
(% ekspresyon)
p değeri
CD59
87,00±5,13
82,00±8,03
AD
CD105
79,00±18,00
32,00±25,00
p<0,01a
CD59+CD105+
80,00±17,20
29,00±26,20
p<0,001a
CD90
96,10±5,10
68,00±27,00
p<0,01a
95,00±7,00
95,00±7,00
p<0,05a
92,00±17,41
67,10±28,00
p<0,05a
CD3
1,20±0,50
1,20±0,40
AD
CD16
1,30±0,30
1,20±0,10
AD
CD33
1,30±1,00
1,30±0,60
AD
CD34
1,40±1,28
1,20±0,78
AD
CD38
1,80±1,60
1,20±0,60
AD
CD45
1,60±1,00
1,30±0,80
AD
CD73
+
+
CD90 CD73
aStudent’s
t testi MKH: Mezenkimal kök hücre; SS: Standart sapma; AD:Anlamlı değil
6
TURK J IMMUNOL
Vol.16, No.1, 2011
A
B
120
MKH kültürleri
CD105
% ekspresyon
80
Adiposit kültürleri
0
96
1
0
4
41 49
10
Osteosit kültürleri
0
21
7 72
40
0
CD59
CD105
CD59+CD105+
CD90
% ekspresyon
8
CD73
CD59
CD73 CD90+ CD73+
MKH kültürleri
Osteosit kültürleri
Adiposit kültürleri
26
1
97
1
0
2
55 18
4
35
41 20
CD90
4
0
CD3
CD16
CD33
CD34
CD38
CD45
Şekil 3. MKH ve 20 günlük adipojenik ve osteojenik kültürlerin hücre yüzey molekül ekspresyonlarının analizi.
A. MKH izolasyon kiti ile izolasyon sonrası hücreler kültür aşamalarına alınmıştır. 16 haftalık 8 pasajlık MKH
kültürü boyunca hücrelerdeki yüzey molekül ekspresyonlarının değişimi ortalama ± SS olarak bar grafikte
gösterilmiş (n=17) ve istatistiksel anlamlılıklar belirtilmiştir (*p<0,001, **p<0,05, ***p<0,01). B. MKH kültürleri ile
adiposit ve osteosite yönlendirilen 3 haftalık MKH kültürlerinde CD59+CD105+ ve CD90+CD73+ yüzey molekül
ekspresyonundaki değişimlerin WinMDI görüntüleri gösterilmiştir.
Şekil 4. MKH, adiposit ve osteosit
hücre görüntüleri. MKH kültürleri
ile 5 haftalık adiposit ve osteosit
kültürlerinin invert mikroskop
görüntüleri gösterilmiştir.
A. Tek tabaka olmuş primer
MKH kültürü (x20).
B. 4 haftalık kültürün
3. pasajındaki MKH
görüntüsü (x40)
C-D. Oil Red O ile boyanan
adiposite
yönlendirilmiş hücreler (x40)
E. Adipojenik medyumda
5 haftalık kültür sonrası
adipojenik hücreler (x40)
F-G. Alizarin kırmızısı S ile
boyanan osteoblastlar (x40)
H. Osteojenik medyumda 5
haftalık kültür sonrası
osteoblastların görünümü (x40)
7
TURK J IMMUNOL
Vol.16, No.1, 2011
değişiklik saptanmamıştır (Şekil 3A, Tablo 3).
Adiposit ve osteosit kültürlerinde flow sitometri
yöntemiyle CD59+CD105+ ve CD90+CD73+
ekspresyonlarındaki azalma WinMDI program
görüntüleri olarak da gösterilmiştir (Şekil 3B).
MKH’lerin çok çeşitli soylara farklılaşma
kapasiteleri bulunmakta ve yapılan araştırmalarda bu
hücrelerin kemik, kartilaj, tendon, kas ve adipöz
dokulara farklılaşabildikleri gösterilmiştir22-25. MKH’lerin
osteogenik farklılaşması, in vitro şartlarda tek tabaka
kültürün pro-osteogenik kokteyl ile kültür aşamaları
sonucunda oluşmaktadır. Standart olarak kullanılan bu
farklılaşma medyumu deksametazon, askorbik asit-2
fosfat ve beta-gliserol fosfat ihtiva etmektedir.
Mineralize depolar birinci hafta sonunda belirmekte;
kültür zamanı, mineralize olmuş nodüllerin sayı ve
büyüklük olarak artışını sağlamak amacıyla
kültür süresi 3 haftaya kadar çıkarılabilmektedir.
26Osteogenik farklılaşma alkalen fosfataz enzim
aktivitesi, Alizarin-Kırmızısı S solüsyonu ya da von
Kossa için gümüş nitrat boyaması ile mineral
birikiminin kantitatif ölçümü kolorimetrik yöntemle de
saptanabilmektedir26-28.
Ayrıca osteogenik farklılaşmayı takiben
osterix, Cbfa-1, osteopontin, osteocalcin ve kemik
siyaloprotein gen RNA ve protein düzeyleri
ölçülebilmektedir29. Çalışmamızda da osteojenik kültür
medyumunda 5 haftalık kültür sonrası MKH’lerin
osteojenik hücrelere yönlenip yönlenmedikleri Alizarin
kırmızısı S boyama tekniğiyle incelenmiş ve kalsiyum
fosfat birikimi histolojik olarak gösterilmiştir.
Olgun adipositlerin oluşumu için MKH’lerin 3 hafta
boyunca deksametazon, isobutilmetilksantin, insülin
ve BRL 49653 veya insülin gibi PPAR gamma
agonisti içeren medyumunda kültürleri yapılmakta ve
lipid damlaları içeren adipositler, oil red O boyama
yöntemi ve ayrıca adipsin, leptin, aP2 ve PPARγ2’nin
RT-PCR metodu ile gösterilebilmektedir28,30,31.
Olgun adiposit belirteci olan Gliserol-3-fosfat
dehidrogenazın enzimatik ölçümü ve ayrıca flow
sitometrik yöntemle lipofilik bir boya olan Nil
kırmızısı kullanılarak adipositlerin kantitasyonu da
mümkündür32. Araştırmamızda da MKH’lerde
adipojenik dönüşüm kültür periyodunun 5. haftasında
yaptığımız Oil Red O boyama yöntemi ile
kanıtlanmıştır. MKH’lerin adipojenik ve osteojenik
farklılaşmaları histokimyasal olarak belirlendikten
sonra bu hücrelerin yüzey molekül ekspresyon
analizleri incelenmiştir. Primer kültürleri boyunca
yüzey moleküllerinde değişiklik gözlemlenmeyen
MKH’lere karşılık, osteosit veya adiposite
yönlendirilen bu hücrelerde MKH belirteçleri olan
CD59, CD73, CD90 ve CD105 ekspresyonlarında
düşüş gözlenmiştir. Bulgularımız histokimyasal ve
flow sitometrik analiz sonuçlarının birbirleriyle uyumlu
olduğunu göstermektedir.
Yağ ve Kemik Hücresine Yönlendirilen MKH’lerin
Histokimyasal Analizleri
MKH’ler 3. pasaj aşamasından sonra yağ ve
kemik hücrelerine yönlendirilmiş ve hücrelerin
immünfenotipik analizlerinin yanı sıra Oil Red O
boyama kiti ve Alizarin kırmızısı S boyası yardımıyla
histokimyasal boyama yapılmıştır. Kültür plağında
MKH kültür görünümleri görülmektedir (Şekil 4A-B).
MKH’lerin 5 haftalık kültürleri süresince Oil Red O
boyama yöntemi ile lipid damlaları içeren adipositler
ve kalsiyum fosfat deposunu gösteren Alizarin
kırmızısı S solüsyonu boyamalarıyla da MKH’lerin
osteosite dönüşümleri histokimyasal olarak
izlenmiştir (Şekil 4C-D boyanmış; 4E boyanmamış,
Şekil 4F-G boyanmış; 4H boyanmamış).
TARTIŞMA
Çalışmamızın ilk aşamasında Kİ kökenli saf MKH
populasyonunun elde edilmesi, ikinci aşamada elde
edilen MKH’lerin kültür ortamında en uygun
koşullarda çoğaltılması, üçüncü aşamada çoğalan
hücrelerin kök hücrelerin plastik olma özelliği
sayesinde yağ dokusu ve kemik hücreleri haline
dönüştürülmesi amaçlanmıştır. İnsan MKH
kiti kullanılarak izole edilen 16 haftalık kültür
periyodları boyunca MKH’lerin yüzey molekül
ekspresyonları incelendiğinde CD59+CD105+,
CD73, CD90, CD90+CD73+ ekspresyonunda artış,
CD16 ekspresyonunda ise düşüş saptanmıştır. Daha
önceki çalışmalarda MKH’lerin in vitro şartlarda
CD59, CD90, CD106, CD29, CD166, CD44, CD73
ve CD105 gibi çok çeşitli yüzey antijenleri
eksprese ettiği gösterilmiştir1,2,11,19,20. Son yıllarda
Uluslararası Hücresel Terapi Derneği (ISCT)
tarafından tanımlanan kriterlere göre insan kökenli
MKH’lerin CD73, CD90 ve CD105 ekspresyonu
açısından pozitif; CD45, CD34, CD14, CD19 ve
HLA-DR molekül ekspresyonu açısından negatif
olmalarının yanında bu hücrelerin plastisite ve çeşitli
farklılaşma potansiyelleri gibi özelliklere sahip olduğu
gösterilmiştir21. Çalışmamızda da araştırmalarla
uyumlu biçimde MKH’lerin kültür aşamaları süresince
CD59, CD73, CD90, CD105 eksprese etmelerine
karşılık, CD3, CD16, CD33, CD34, CD38 ve CD45
eksprese etmedikleri saptanmıştır.
8
TURK J IMMUNOL
Vol.16, No.1, 2011
Klinik açıdan çok çeşitli kullanım alanları bulunan
MKH’lerin plastisite ve immünomodülatör özellikler
taşıması, doku mühendisliği çalışmalarında kullanım
potansiyelleri ile birlikte hasar bölgelerine göç etme
yetenekleri bu hücrelerin doku onarımında doğal in
vivo sistemler olarak da rol oynayabileceğini
düşündürmektedir. İmmünomodülatör ve antiinflamatuvar özelliklerinden dolayı bu hücrelerin greft
versus host hastalığı (GVHD) tedavisinde kullanımı,
MKH’lerin hücre tedavileri için önemli adaylar oldukları
yönündedir. Bulgularımız MKH’lerin adiposit ve
osteosite yönlendirilebileceğini göstermekte ve plastik
olma özelliği sayesinde yağ ve kemik hücrelerine
yönlendirilebilen MKH’lerin gerek estetik gerekse
ortopedi alanında tedavi amaçlı kullanılabileceğini
düşündürmektedir.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
TEŞEKKÜR
12.
Bu proje İstanbul Üniversitesi Bilimsel Araştırma
Projeleri Komisyonunca desteklenmiştir. (Proje No.
388/03062005).
13.
YAZIŞMA ADRESİ:
Prof.Dr.Günnur Deniz
İstanbul Üniversitesi, Deneysel Tıp Araştırma
Enstitüsü (DETAE), İmmünoloji Anabilim Dalı,
Vakıf Gureba Caddesi, Şehremini 34393,
İstanbul, Türkiye
Telefon : +90 212 414 20 00 (pbx) 33306
+90 212 414 20 97
Faks
: +90 212 532 41 71
E-posta : [email protected]
14.
15.
16.
KAYNAKLAR
1.
2.
3.
4.
5.
17.
Jackson L, Jones DR, Scotting P, Sottile V. Adult
mesenchymal stem cells: differentiation potential and
therapeutic applications. Postgrad Med, 2007;53:121-127.
Phinney DG, Prockop DJ. Concise review:
mesenchymal stem/multipotent stromal cells: the
state of transdifferentiation and modes of tissue
repair--current views. Stem Cells 2007;25:2896-2902.
Kuznetsov SA, Mankani MH, Gronthos S, Satomura
K, Bianco P, Robey PG. Circulating skeletal stem
cells. J Cell Biol, 2001;153:1133-1140.
Dazzi F, Ramasamy R, Glennie S, Jones SP, Roberts
I. The role of mesenchymal stem cells in
haemopoiesis. Blood Rev, 2006;20:161-171.
Risbud MV, Shapiro IM, Guttapalli A, Di Martino A,
Danielson KG, Beiner JM, et al. Osteogenic potential
of adult human stem cells of the lumbar vertebral
body and the iliac crest. Spine (Phila Pa 1976),
2006;31:83-89.
18.
19.
20.
21.
9
Minguell JJ, Erices A, Conget P. Mesenchymal stem
cells. Exp Biol Med (Maywood) 2001;226:507-20.
Abdallah BM, Kassem M. Human mesenchymal
stem cells: from basic biology to clinical applications.
Gene Ther, 2008;15:109-116.
Caplan A. Adult mesenchymal stem cells for tissue
engineering versus regenerative medicine. J Cell
Physiol, 2007;213:341-347
Kekilli E, Yağmur C, Ertem K, Turk Bilen B. [Bone
grafts and nuclear medicine:rewiev]. Turkiye Klinikleri
J Med Sci, 2005;25:261-279.
Le Blanc K, Tammik L, Sundberg B, Haynesworth
SE, Ringdén O. Mesenchymal stem cells inhibit and
stimulate mixed lymphocyte cultures and mitogenic
responses
independently
of
the
major
histocompatibility complex. Scand J Immunol,
2003;57:11-20.
Chamberlain G, Fox J, Ashton B, Middleton J.
Concise review: mesenchymal stem cells: their
phenotype, differentiation capacity, immunological
features, and potential for homing. Stem Cells,
2007;25:2739-2749.
Ringe J, Häupl T, Sittinger M. Mesenchymal stem
cells for tissue engineering of bone and cartilage]
Med Klin (Munich), 2003;98:35-40.
Bosnakovski D, Mizuno M, Kim G, Takagi S,
Okumura M, Fujinaga T. Isolation and multilineage
differentiation of bovine bone marrow mesenchymal
stem cells. Cell Tissue Res, 2005;319:243-253.
Muraglia A, Cancedda R, Quarto R. Clonal
mesenchymal progenitors from human bone marrow
differentiate in vitro according to a hierarchical
model. J Cell Sci, 2000;113:1161-1166.
Aslan H, Zilberman Y, Kandel L, Liebergall M,
Oskouian RJ, Gazit D, et al. Osteogenic
differentiation of noncultured immunoisolated bone
marrow-derived CD105+ cells. Stem Cells,
2006;24:1728-1737.
Le Blanc K, Tammik C, Rosendahl K, Zetterberg E,
Ringdén O. HLA expression and immunologic
properties of differentiated and undifferentiated
mesenchymal
stem
cells.
Exp
Hematol,
2003;31:890-896.
Minguell JJ. Is hyaluronic acid the "organizer" of the
extracellular matrix in marrow stroma? Exp Hematol,
1993;21:7-8.
Yamazaki M, Nakajima F, Ogasawara A, Moriya H,
Majeska RJ, Einhorn TA. Spatial and temporal
distribution of CD44 and osteopontin in fracture
callus. J Bone Joint Surg Br, 1999;81:508-515.
Pittenger MF. Mesenchymal stem cells from adult
bone marrow. Methods Mol Biol, 2008;449:27-44.
Lin JR, Guo KY, Li JQ, Yan DA. In vitro culture of
human bone marrow mesenchymal stem cell clonies
and induced differentiation into neuron-like cells. Di
Yi Jun Yi Da Xue Xue Bao , 2003;23:251-253.
Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, SlaperCortenbach I, Marini F, Krause D, et al. Minimal
criteria for defining multipotent mesenchymal stromal
cells. The International Society for Cellular Therapy
position statement. Cytotherapy, 2006;8:315-317.
TURK J IMMUNOL
Vol.16, No.1, 2011
22. Bruder SP, Kurth AA, Shea M, Hayes WC, Jaiswal N,
Kadiyala S. Bone regeneration by implantation of
purified, culture-expanded human mesenchymal
stem cells. J Orthop Res, 1998;16:155-162.
23. Kadiyala S, Young RG, Thiede MA, Bruder SP.
Culture expanded canine mesenchymal stem cells
possess osteochondrogenic potential in vivo and in
vitro. Cell Transplant, 1997;6:125-134.
24. Ferrari G, Cusella-De Angelis G, Coletta M, Paolucci
E, Stornaiuolo A, Cossu G, Mavilio F. Muscle
regeneration by bone marrow-derived myogenic
progenitors. Science, 1998;279:1528-1530.
25. Prockop DJ. Marrow stromal cells as stem cells for
nonhematopoietic tissues. Science, 1997;276:71-74.
26. Okamoto T, Aoyama T, Nakayama T, Nakamata T,
Hosaka T, Nishijo K, et al. Clonal heterogeneity in
differentiation potential of immortalized human
mesenchymal stem cells. Biochem Biophys Res
Commun, 2002;295:354-361.
27. Yoshimura H, Muneta T, Nimura A, Yokoyama A,
Koga H, Sekiya I. Comparison of rat mesenchymal
28.
29.
30.
31.
32.
10
stem cells derived from bone marrow, synovium,
periosteum, adipose tissue, and muscle. Cell Tissue
Res, 2007;327:449-462.
Sottile V, Halleux C, Bassilana F, Keller H, Seuwen K.
Stem cell characteristics of human trabecular bonederived cells. Bone, 2002;30:699-704.
Lin Y, Liu L, Li Z, Qiao J, Wu L, Tang W, et al.
Pluripotency potential of human adipose-derived
stem cells marked with exogenous green fluorescent
protein. Mol Cell Biochem, 2006 ;291:1-10.
Ohishi M, Schipani E. Bone marrow mesenchymal
stem cells. J Cell Biochem 2009;109:277-282.
Fink T, Abildtrup L, Fogd K, Abdallah BM, Kassem M,
Ebbesen P, et al. Induction of adipocyte-like
phenotype in human mesenchymal stem cells by
hypoxia. Stem Cells, 2004;22:1346-1355.
Neubauer M, Hacker M, Bauer-Kreisel P, Weiser B,
Fischbach C, Schulz MB, et al. Adipose tissue
engineering based on mesenchymal stem cells and
basic fibroblast growth factor in vitro. Tissue Eng,
2005;11:1840-1851.