genel biyoloji laboratuvarı deneyleri 1

GENEL BİYOLOJİ
LABORATUVARI
DENEYLERİ 1
ERZURUM TEKNİK ÜNİVERSİTESİ
MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE GENETİK BÖLÜMÜ
Hazırlayan
Arş. Gör. Mehmet Enes ARSLAN
Erzurum, 2014
1. HAFTA: LABORATUVAR GÜVENLİĞİ











Laboratuvar dersinden önce: Hocalarınız
Sizi sorumluluklarınız hakkında bilgilendireceklerdir.
Size kimyasalları ve diğer maddeleri nereye atmanız gerektiğini göstereceklerdir.
M.S.D.S (malzeme güvenlik bilgi formu) belgelerinin nerede olduğunu göstereceklerdir.
Ve herhangi bir kaza yada olay hakkında hocalarınızı bilgilendirmeniz gerekmektedir.
Güvenlik ekipmanlarının yerini ve nasıl kullanmanız gerektiğini göstereceklerdir.
Bunlar:
Güvenlik banyosu ve göz yıkama
İlk yardım çantası
Acil durum gaz kapama mandalı
Yangın söndürme tüpü
Lab telefonu
Bunun Yanında
 İlk yardım maddelerinin kullanılması.
 Planlanmış çıkışlar ve rotalar.
 Laboratuvar terketme prosedürü.
Laboratuvar da Çalışırken: Aşşağıdaki kurallar, kimyasal hijyen planında yer alır:
Cam / Cam tüpler/ Termometreler. Cam malzemeleri dizayn edildiği amaç doğrultusunda
kullanınız. Cam malzemeleri sabitleyicilere yerleştirirken “güvenli tutacaklar” kullanınız ki
kırılmalar gerçekleşmesin. Cam tüpleri kesmeniz gerekiyorsa gözlük giyiniz ve uygun araçlarla
kesimi yapınız.
Sigara içmek yasaktır. Bu kanun bütün üniverstelerde ve laboratuvarlarda geçerlidir.
Yerleşim.
Cihazlar, kimyasallar veya mobilyalar, geçişleri ,kapıları ya da çıkışları
kapamamalıdırlar.
Yemekler, içecekler ve kozmetik ürünler.
Yemek, içmek ve ya kozmetik ürünlerini
kullanmak laboratuvarda kesinlikle yasaktır (Zararlı kimyasaların buludunduğu ortamlar).
Kimyasal maddelerin bulunduğu dolaplara yiyecek maddelerini saklamayınız.
Eşek şakası. Laboratuvar içerisinde şakalaşmak veya profesyonel olamayan davranışlarda
bulunmak yasaktır. Deneylerine devam eden öğrencilerin dikkatini dağıtmaktan veya işlerinden
alıkoymaktan kaçınınız.
Ekipman. Sadece iyi durumda olan ekipmanları kullanmaya özen gösteriniz. Kırılmış yada
çatlamış cam malzemeleri kullanmak tehlikeli olabilir bu yüzden görevli araştırma görevlilerine
bildiriniz. Basınç veya vakum araçlarını dikkatli kullanınız ve kaynama malzemelerini
gereğinden fazla ısıtmaktan kaçınınız. Güvenlik malzemelerini elinizden geldiğince kullanınız.
Kimyasalların kullanımı. Kimyasal maddeleri tatmayınız veya koklamayınız. Kimyasalları
uygun yerlerde (çeker ocağı vb.) kullanınız, gerekiyorsa malzeme güvenlik bilgi formunu
okuyunuz
Zararlı materyaller. Zararlı maddeler açık bir şekilde bençlerde kullanılmamalıdır ve yanlız
başınıza bu maddeleri kullanmayınız. Kullandığınız zararlı maddenin kimyasal hijyen
prosedürünü öğreniniz.
Ağızla pipetleme. Kesinlikle yasaktır.
Uygun giyinme: Göz koruyucu gözlüklerinizi ve yüz korumalarınız yanınızda bulundurunuz.
Laboratuvarda bulunduğunuz süre boyunca lab önlüğünüzü ve eldivenlerinizi giyiniz. Yarı açık
ayakabılar veya sandaletler kesinlikle yasaktır. Açık bırakılan uzun saçlar veya uzun tırnaklar
laboratuvar güvenliği açısından tehlike oluşrurur.
Bireysel hijyen: Lab da çalışırken elinizi gözünüze veya ağzınıza götürmeyiniz Ve laboratuvarı
terkederken kesinlikle ellerinizi yıkayınız.
Atıkların çöpe atılamsı.
Atıkların ayrılması sağlık açısından önemlidir. Atıkların
sınıflandırılması ve depolanması uygun prosedürlere göre uygulanmalıdır.
Biyolojik tehlike içeren maddelerin atıldıkları bölgeler ve keskin uçlu materyallerin atıldığı
yerler bilinmelidir
Göz Koruma
-Gözler fırlayabilcek objelere, toz parcalarına ve kimyasal maddelerin sıçrama tehlikesine veya
UV ışınlarına karşı korunmalıdır.
-Ultra viyole ışınlarından koruyan gözlükler temin edilmelidir
Güvenlik Gözlükleri
-Kırılmaz plastik veya cam malzemeden üretilmiş olmalıdır.
-Kullanımı kolay olmalıdır
-Tıbbi lensler içermelidir
-Kontak lens kullananların görüşünü etkilememelidir
-Sıçrama tehlikesi olan maddelerle çalışırken giyilmelidir
-Reçeteli gözlükler üzerine giyilebilirler
Yüz Korumaları
-Patlama veya sıçrama tehlikesi olan maddelerle çalışırken yüzü koruma amacı ile kullanılırlar.
-Yüz korumaları gözleri çok etkili biçimde korumaz sadece yüzü koruma amacı ile
üretilmişlerdir.
Ellerin Korunması
-Ellerinizi kesilmelere, yanmalara ve kimyasal maddelerle temasa karşı korumanız
gerekmektedir.
-Çalıştığınız kimyasallara uygun olan spesifik dayanıklı eldiven türlerini seçiniz
Laboratuvarda çalışırken:
-Şüphelenilen biyolojik tehlikelere karşı uluslararası güvenlik noktalarını takip ediniz.
-Bilinmeyen kimyasal maddeleri tehlikeli madde sınıfındaymış gibi ele alınız
-Uçucu kimyasalları çeker ocaklarında kulllanınız
-Biyolojik canlılık içeren maddeleri özel kabinlerde muhafaza ediniz
-Etrafınızda yetkili kişiler olmadan cihazları ve kimyasalları kullanmayınız.
-HER ŞEYİ tanımlayın! TÜM kaplar açıkça içeriği ile etiketlenmelidir.
Hocalarınızı bilgilendirin:
-Kazalar
-Yaralanmalar
-Yanmalar
-Dökülmeler
-Kararsız kaldığınız durumlarda
Laboratuvardan Ayrılmadan Önce:
-Kapatınız!
-Gaz
-Su
-Güç kaynakları
-Vakum cihazlarını
-Sıkıştırma cihazlarını
-Isıtma aletlerini
-Çöpleri ve atılacak materyalleri belirleyip uygun bir şekilde paketleyiniz
-Arızalı cihazları belirleyip işaretleyiniz
-Kontamine olmuş bölgeleri ve cihazları temizleyiniz
-Kullandığınız cihazları ve kimyasal maddeleri yerlerine koyunuz
-Ellerinizi yıkayınız
-Laboratuvarı kapatıp kitleyiniz











o
o
o
o


o
LAB DEFTERLERİ YAZIM KLAVUZU
Spiral defter kullanmayınız çünkü sayfaları kolaylıkla kopabilmektedir. Beyaz düz veya kareli
defter kullanabilirsiniz. En az 200 sayfa yeterli olacaktır.
Defterlerinize not alırken silinmez kalemler kullanınız (tükenmez kalem olabilir)
Bütün sayfaları numaralandırınız, böylelikle işlerinizi takip edebiliriz.
Defterin ilk iki sayfasını boş bırakınız. Boş sayfalar içerikleri yazarken kullanılacaktır.
Lab dersi başladığında bulunduğu sayfayı içerik kısmına ve hangi sayfada yer aldığını yazınız.
Farklı dersleri aynı sayfaya yazmayınız.
Bilgiler lab defterine olduğu gibi yazılmalıdır.
Laboratuvarda yapılan işleri tarihlerle de etiketleyiniz. Gün-Ay-Yıl formatında ve sağ üst
köşeye yazınız.
Yazılan yanlışlar sadece bir çizgiyle üzerinden geçilmelidir. Yapılan bütün hatalar görünebilir
olmalıdır ve silinmemelidir.
Belgeler deftere yapıştırılabilir. Örneğin bilgisayar çıktıları, resimler, grafikler vb.
Laboratuvar çalışması başlığı mutlaka yazılmalıdır, bir sonraki sayfaya geçildiyse devamı
şeklinde tekrar yazılmalıdır.
Aşşağıdaki bilgiler lab defterinde yer almalıdır.
Lab partnerlerinizin isimleri
Konu ve amaç
Hipotez ve nasıl test edildiği
Prosedür
Her adım defterinize kaydedilmelidir, böylelikle aynı prosedür tekrar defterdeki metoda gore
yapılabilmelidir.
Deneyi etkileyebilecek çevresel faktörler (sıcaklık, nem, kirlilik vs.)yazılmalıdı.
Sonuçlar. Birimleri ile birlikte kaydedilmelidir (kg, cm, litre vs.). cihazlarla ölçülen ve elde
edilen bilgiler deftere yapıştırılabilir, beklenmeyen veya hatalı bilgiler de defterlerinize
yazılmalıdır.
o Eğer bilgiler bilgisayarda kayıtlıysa ve deftere yazılmadıysa, hangi dosyada ve bilgisayarda
olduğu yazılmalıdır.
o Grafikler, tablolar, çizimler veya fotoğraflar defterinizde yer alabilir.
o Hesaplamalar defter üzerinde yapılmalıdır. Kullanılan formüller belirtilmelidir. Birden fazla
aynı hesaplama varsa, bir tanesi örnek olarak bulundurulması yeterli olacaktır.
o Çıkarımlar defterde belirtilmelidir. Laboratuvarda yapılan deneyde neler beklendi ve başarıldı.
 Her deney bittiğinde yazınızın sonuna “SON” yazılmalıdır ve imza atılmalıdır.
 Laboratuvarda yapılan bütün deneysel bilgiler deftere o ders içerisinde yazılmalıdır.
RAPOR YAZIM NOKTALARI:
Adınız Soyadınız
Numaranız
Bölümünüz ve Sınıfınız
BAŞLIK
1- ÖZET-AMAÇ
2-GİRİŞ
3-MATERYAL-METHOD
4-SONUÇLAR
5-TARTIŞMA
6-REFERANSLAR
RAPOR ÖRNEĞİ:
İsim Soyisim
Numara
MBG-1 Ö.Ö.
COMPETITIVE ELISA ASSAY AND SPECTROPHOTOMETRIC
MEASUREMENTS
1-ABSTRACT
In this experiment our main purpose was learning background information about
ELISA, types of ELISA assay and calculating the concentration of unknown solutions by
performing competitive ELISA assay and spectrophotometric measurements.
2-INTRODUCTION
Before getting into the ELISA, we should first look to definitions of antibody, antigen
and immunoassay. Antibodies or immunoglobulins are gamma globulin proteins. They are
present in our blood and it is used for foreign molecules or organisms identification and
neutralization. Here are the structure of antibody that shows binding sites on antibody. Antigen
is a molecule that can cause production of antibodies when they are introduced into bodies. And
the last definition, immunoassay, it is a kind of assay for detecting and quantifing specific
antigen or antibody in samples by using interaction between antigen and antibody. Epitope is
a part of the antihen that is bound by antibody. And the epitope region of antigen is composed
of sugars, lipids or aminoacids(1).
Figure 1: Interaction between antigen and antibody
(www.scizmic.net/downloads/vaccinations/3_vaccinedef.pdf)
Enzyme-linked immunosorbent assay is a type of assay that depends on the reaction
between antigen and antibody in vitro. It is possible to detect and quantify antigens or antibodies
with the aid of this method. This test was firstly used for HIV screening test. Today, this test is
used to[2]
for measuring antibody level for allergy and vaccines cases
for detecting viruses such as hepatitis and HIV
for detecting hormonal changes such as in pregnancy,
for detecting circulatory inflammatory markers such as cytokines.
Generally ELISA is consisted of five main steps. In the first step, plate is coated with
antibody. In the second step, blocking solution is used for blocking all unbound sites. With the
aid of using blocking solution, we decrease the possibility of seeing false positive results. After
blocking all unbound sites with blocking solution, antigen is added to wells. Then anti-mouse
antibody(IgG) which is conjugated with an enzyme is added to wells. At the end of ELISA,
with the activity of enzyme, it is possible to see a colored product[3].
There are three types of ELISA which are Competitive ELISA, Sandwich ELISA and
Indirect ELISA. In this laboratory section, competitive ELISA was performed. In competitive
assay, specific antibody is used to coat the plate. Then test antigen and labelled antigen are
added to wells and these compete for binding to antibodies. If the amount of the test antigen is
greater than labelled antigen, less amount of labelled antigen can bind to antibodies. If our
sample is consisted of more antigens then, less labeled antigen is remained in the well.
Therefore weak signal can be detected. The following figure shows us the competitive ELISA.
The main steps are the same for all competitive ELISA assays, only the names of sample,
primary and secondary antibodies are different[4].
Figure 2: Example of Competitive ELISA
(www.scizmic.net/downloads/vaccinations/4_vaccinedef.pdf)
Competitive ELISA has several advantages. It does not require sample processing. It
also less sensitive to sample dilutions and sample matrix effects. Therefore with the use of this
technique, it is possible to get lower deviation or variability between repeated samples and
repeated assays. Briefly, it can be said that it has high precision, accuracy and reproducibility.
The disadvantages of this method according to sandwich assay are
lower sensitivity
lower specificity[5].
The main steps of our competitive ELISA: In this experiment, BIOXYTECH 8-OHdGEIA Kit was used. This is used for quantitative measurment of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine
(8-OHdG) in tissue. In addition 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine is one of the important
biomarker for oxidative stress and carcinogenesis. In this kind of ELISA, 8-0HdG is used to
coat plate wells. And these ones and the other 8-0HdG in our sample compete for primary
antibody binding sites. As the concentration of 8-0HdG in sample increases, there will be
reduction in the binding of antibodies. After binding antibodies that bound to 8-OhdG in the
sample are washed out of the well and only the ones that are bound to the plate will remain in
the plate after this washing step. After that enzyme-labelled secondary antibody is added to well
and in these well, it will bind to the primary antibody. To remove unbounded ones, washing
step is performed and unbounded secondary antibodies are eliminated from the
sample.Chromogen is added in to wells and with the aid of enzyme that is conjugated to
secondary antibodies give reaction and turns the color of the solution into yellow. After that to
stop the reaction stop solution is added and the absorbance values are read with the aid of the
spectrophotometer. Here is the flow chart of this procedure[6]:
Figure 3: The main steps of our competitive ELISA
(www.scizmic.net/downloads/vaccinations/5_vaccinedef.pdf)
There are also differences in antibodies: Polyclonal and monoclonal. Polyclonal antibodies
are the ones that:

Their production is not so expensive.

Not so much technology or technique requiring assay,

Its time scale is short.

During production of polyclonal antibodies, large amounts of nonspecific antibodies are
produced.

These polyclonal antibodies are able to recognizes multiple epitopes that provides robust
detection.

And with the aid of this property, it can give better results in IP/ChIP.

There can be seen variability due to batches.

They belongs to IgG subclass.
Monoclonal antibodies are the ones that

Expensive to produce

It requires more technology and technique.

Its time scale is longer if we consider hybridomas.

It can produce large amounts of specific antibodies but when we compare them polyclonal ones,
these are so specific. And this kind of specificity decreases the possibility of cross-reaction with
other proteins.

It can recognize only one epitope of antigen[7].
3-MATERIALS AND METHODS
MATERIALS
1-Spectrophotometer
2-Plate Shaker
3-Spectrophotometer
4-Water bath
5-pNPL
6-Reagent A
7-Lipase
8-OHdG Microtiter Plate-Precoated With 8-OHdG (8×12 wells, Split Type)
9-Primary Antibody Monoclonal Antibody Specific For 8-OHdG
10-Primary Antibody Dilution Buffer Phosphate Buffered Saline
11-Secondary Antibody HRP-Conjugated Antibody
12-Secondary Antibody Dilution Buffer Phosphate Buffered Saline
13-Chromogen 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine
14-Chromogen Dilution Buffer Hydrogen Peroxide/Citrate-Phosphate Buffered Saline
15-Washing Buffer (5x) Concentrated Phosphate Buffered Saline
16-Stop Solution 1M Phosphoric Acid
17-Standards 1-6 0.5, 2.0, 8.0, 20.0, 80.0, 200.0 ng/mL 8-OHdG (1 vial Each) 1 mL each
18-Plate Seal Adhesive sheet for covering plate
METHODS
Each sample had three replicates.
1. Firstly primary antibody with the primary antibody dilution buffer was reconstituted.
2. Then 50 ul of sample was added to each well. After that 50 ul of reconstituted primary antibody
was added to all wells expect blank.
3. Plate was covered with a kind of cover and plate was shaked to mix fully and it was incubated
for 1 h at 37 C.
4. At the end of incubation time, contents in plate was poured off. Then 250 ul diluted washing
buffer was added to each well. It was washed thoroughly by agitation. After that plate was
inverted and blot against clean paper towel to remove any remaining washing buffer. This step
was repeated twice.
5. Secondary antibody with secondary antibody dilution buffer was reconstituted. 100 ul of
reconstituted secondary antibody was added to each well.
6. Plate was covered with cover and after that plate was shaked from side to side to mix fully.
After shaking, it was incubated at 37C for 1 hour.
7. Chromogen was diluted and 100 ul diluted chromagen added to each well. After chromogen
addition, plate was mixed and incubated at room temperature for 15 minutes.
8. At last 100 ul stop solution was added and after 3 minutes, its absorbance was read at 450 nm.
4-RESULTS
Absorbance
Concentration
(ng/ml)
Blank
1,271
Sample 1
1,217
0,5
Sample 2
1,066
2
Sample 3
0,882
8
Sample 4
0,869
20
Sample 5
0,404
80
Sample 6
0,348
200
Equation
y=-0,151ln(x) + 1,1701
R2
0,938
Figure 4: Absorbance vs Log Scale of Concentration
1,4
1,217
1,2
y = -0,151ln(x) + 1,1701
R² = 0,938
1,066
1
0,882 0,869
0,8
0,6
0,4
0,404
0,348
0,2
0
0,1
1
10
100
Figure 5: Absorbance vs Log Scale of Concentration
1000
Absorbance Absorbance-
b=a/(-0,151)
Conc.(ng/ml)
1,1701=a
Unknown1 0,85
-0,3201
2,11986755
8,330034
Unknown2 0,7
-0,4701
3,113245033
22,49392
Unknown3 1,207
0,0369
-0,244370861
0,783197
Figure 6: Absorbance and Standart Deviation Calculations
1-For unknown 1 y=-0,151ln(x) + 1,1701
(0,85-1,1701)/(-0,151)=2,12
ln(x)=2,12
Concentration of Unknown 1: x= 8.33 ng/ml
2-For unknown 2 y=-0,151ln(x) + 1,1701
(0,7-1,1701)/(-0,151)=3,11
ln(x)=3,11
Concentration of Unknown 2: x= 22,49 ng/ml
3-For unknown 3 y=-0,151ln(x) + 1,1701
(1,207-1,1701)/(-0,151)=-0,24
ln(x)=-0,24
Concentration of Unknown 3: x= 0,78 ng/ml
5-DISCUSSION:
When we look the graph and after seeing the R2 value, it can be said that our data fits
the curve and the R2 is 0,938. This value should be more closer to 1 but even 0,938 can be
accepted as good one. In this experiment because of fluctuations between reading, the median
values were taken while drawind the graph. Also while drawing the graph, x axis was taken in
log scale and the logaritmic trendline was added to our graph. Thus we got an formula which
contains logarithm function. Our experiment proved that higher concentrations of 8-OhdG in
the sample solution lead to a reduced binding of the antibody to the 8-OhdG on the plate. When
the concentration of standard increased, the absorbance values decreased. When I calculated
the concentration of the unknowns, then I saw that there is a huge difference between our
results. For example the concentrations of unknowns are 8.33, 22.49 and 0.78 ng/ml. And the
expected/real concentration is the 8 ng/ml. So it can be concluded that there are some reasons
that cause such a kind of difference. The source or sources of such a kind of difference can be
because of various things:

Incomplete washing of wells

Contamination

Inadequate aspiration of wells: After pouring washing buffer from the plate, it was
placed/blotted to paper towel to get rid of all the remaining liquid. If these liquid were not
completely eliminated, or if the wells overdried, waiting without doing anything after removing
washing buffer, that could cause problems.

Errors due to experimenter or calibration of pipettes: During experiment, we faced a problem
that caused by the calibration of pipettes. These could cause problems.

The other reason could be reading beyond suggested reading window. Not reading the
absorbance values within time recommended in kit could cause problems but this step was done
by our assistants. Probably there could not be such a kind of error.

Also, in these kind of experiments, regression analysis of the results are recommended by
companies such as R&D Systems. Not using such a kind of data reduction method may cause
less precise fit of the standard curve. Doing such a kind of assay could be better but I do not
think not performing such an analysis could not explain this kind of difference. But if we did
this assay, maybe there will be some small differences between our data.

Not followind incubation times and temperatures: During the experiment, we tried to follows
things written in the kits but there can be some little differences in

And the last possibility can be inadequate sealing of plate cover which can cause leading to
evaporation.
8-OHdG Microtiter Plate-Precoated With 8-OHdG was used to see the effect of
concentrationand absorbance values. To do this samples containing 8-OHdG was used. Primary
antibody monoclonal antibody is specific to 8-OHdG because plate is precoated with 8-OHdG.
Secondary antibody which is HPR-conjugated were used and with the aid of this enzyme,
chromogen was cleaved and this reaction gave yellow color.
6-REFERENCES
1. www.scizmic.net/downloads/vaccinations/3_vaccinedef.pdf
2. http://www-saps.plantsci.cam.ac.uk/summer/2007/elisa.ppt
3. http://www.scribd.com/doc/3305370/ELISA-1
4. http://www.testkappa.com/Inglese/Immagini/How%20to%20use%20it_ING_GRN.jpg
5. http://www.apcbiomaterials.com/FAQ.html
6. http://www.oxisresearch.com/pub/PDF/inserts/76680404.pdf
7. http://www.abcam.com/index.html?pageconfig=resource&rid=11269&pid=11287
2. HAFTA: METRİK SİSTEM VE ÖLÇÜMLER
Dünya standardında ölçüler, metrik sistem kulanılarak yapılır. Dünya çapında bilim
insanlarının kullanmasının yanında, neredeyse bütün ülkeler metrik sistemi standart ölçü
birimleri olarak kullanırlar. Bu dersimizdeki tüm ölçümler metrik sistem kullanılarak
yapılacaktır.
Aşağıda ki tabloda standart metrik sisteminde olan; uzunluk, ağırlık, hacim ve sıcaklık
birimleri gösterilmektedir.
Metrik
Uzunluk metre
Ağırlık
gram
Hacim
litre
Sıcaklık derece (santigrat)
Tablo 1: Metrik sistem birimleri
Metre, gram ve litre büyüyüp küçüldükçe başlarına aşşağıdaki gibi kısaltmalar eklenir.
Kilo = 1000
Desi = 1/10
Santi = 1/100
Mili = 1/1,000
Mikro = 1/1,000,000
Nano = 1/1,000,000,000
Aşağıdaki tabloda ise metrenin diğer beş farklı uzunlukla olan ilişkisi gösterilmektedir.
Birim
kilometre (km)
Uzunluk
1,000 m (1 X 103 m)
metre (m)
1m
santimetre (cm)
0.01 m (1 X 10-2 m)
milimetre (mm) 0.001 m (1 X 10-3 m)
Mikrometre (um) 0.000001 m (1 X 10-6 m)
Nanometre (nm) 0.000000001 m (1 X 10-9 m)
Tablo 2: Metrenin uzunlukla olan ilişkisi
Dikkat ederseniz tabloda ki her birim metreye 10 un katları şeklinde ilişkilendirilir.
Aşağıdaki resimde bir cetvelin son kısmı gösterilmektedir. 90 cm işareti resmin orta kısmında
görünmektedir. Bir metre=100 cm ve her santimetre 10 mmlik birimlere bölünmüştür.
Figür 1: Bir cetvelin bölümleri
(http://faculty.clintoncc.suny.edu/faculty/michael.gregory/files/bio%20101/Bio%20101%20L
aboratory/metric%20system/meter_stick.gif)
Aşağıdaki tablolar aynı birimlerin gram(ağırlık) ve litre(hacim) cinsinden değerlerini
göstermektedir.
Birim
Ağırlık
Metrik ton (t)
1,000 kg or 1,000,000 g (1 X 106 g)
Kilogram (kg)
1,000 g (1 X 103 g)
gram (g)
1 gram
miligram (mg) 0.001 g (1 X 10-3 g)
mikrogram (ug) 0.000001 g (1 X 10-6 g)
nanogram (ng) 0.000000001 g (1 X 10-9 g)
Tablo 3: Gramın ağırlıkla olan ilişkisi
Birim
Hacim
kilolitre (kl) 1,000 litre (1 X 103 l)
litre (l)
1 litre
mililitre (ml) 0.001 litre (1 X 10-3 l), 1cm3
mikrolitre (ul) 0.000001 litre (1 X 10-6 l)
Tablo 4: Litrenin hacimle olan ilişkisi
Yukardaki tabloda dikkat ederseniz 1 ml(mililitre), 1 cm3 (santimetre küp)’e eşittir.
METRİK ÇEVİRMELER
Kuvvetleri: Aşşağıda ki örneklerde sayıların kuvvetleri şeklinde nasıl yazılacağı
gösterilmektedir.
100 = 1
100 = 1 X 102
1000 = 1 X 103
10,000 = 1 X 104
0.01 = 1 X 10-2
0.001 = 1 X 10-3
Örnekler:
256 = 2.56 X 102
3287 = 3.287 X 103
0.055 = 5.5 X 10-2
Kuvvetleri şeklinde yazmak çok büyük veya çok küçük rakamların gösterilmesinde
kolaylık sağlar. Örneğin; 1,930,000,000,000,000,000 rakamının kuvvetler şeklinde yazımı 1.93
X 1018 dır ve bize işlemlerin not edilmesinde kolaylık sağlar.
Ondalık Ayrıcı: Metrik dönüşümler, ondalık ayrıcın hareket ettirilmesiyle yapılır. Büyük
birimler daha küçük birimlere dönüştürülürken ( örneğin metreden milimetreye) ondalık ayrıç
sağa doğru hareket ettirilir ve tam tersi dönüşümler için ise sağa doğru hareket ettirilir.
Büyür (Ayrıç sola doğru hareket ederse)
103m kilometre (km), kilogram (kg), kilolitre (kl)
100m metre (m),gram (g), litre (l)
10-2 santimetre (cm)
10-3 milimetre (mm), miligram (mg), mililitre (ml)
10-6 mikrometre (um), mikrogram (ug), mikrolitre (ul)
10-9 nanometre (nm)
Küçülür (Ayrıç sağa doğru hareket ederse)
Örnek: 2.6 cm’yi um’ye çevirelim;
Santimetre için üs -2’dir ve mikrometre için -6. İki rakamı birbirinden çıkarırsak;
= (-2 - (-6) = 4).
Santimetreyi mikrometreye dönüştürmek için ondalk ayrıcı 4 birim sağa kaydırmak gerekir.
2.6 cm =2600 um
LABORATUVAR HESAPLAMALARI:
Uzunluk Hesaplamaları:
Cetvel kullanarak defterinizin genişliğini hesaplayınız ve hesaplamaları;
1-Milimetre
2-Santimetre
3-Metre cinsinden yazınız.
Aynı şekilde sıranızın genişliğini hesaplayınız ve
4- Milimetre
5- Santimetre
6- Metre cinsinen yazınız.
Figür 2: Laboratuvar masasının genişliği
(http://faculty.clintoncc.suny.edu/faculty/michael.gregory/files/bio%20101/Bio%20101%20L
aboratory/Metric%20System/lab_bench.jpg)
7- Laboratuvarın genişliğini ölçmek için hangi ölçüm birimi (kilometre, metre, santimetre,
milimetre, mikrometre veya nanometre) daha uygun olur? Neden?
Aşağıda ki uzunluk çevirimlerini hesaplayınız ve defterinize kaydediniz.
8) 1 m = _____ cm.
9) 1 cm = _____ m.
10) 3.57 mm = _____ um.
11) 452 cm = _____ mm.
12) 0.04 um = _____ mm
13) 37.6 nm = _____ mm
14) 52 nm = _____ um
15) 0.05 um = _____ nm.
16) 4.3 m = _____ um
17) 4206 mm = _____ cm
18) 0.046 mm = _____ nm
19) 4.8 cm = _____ um
Ağırlık Hesaplamaları:
Laboratuvarda kulandığımız ‘Hassas Terazi’’nin hassasiyeti 0.001’dir, bu yüzden hava
sirkülasyonu bile hesaplamaları değiştirebilir bu yüzeden Terazinin etrafı cam kabinle
kapalıdır. Tartım yaparken kullandığınız tartma kabının darasını almanız gerekmektedir,
böylelikle darası alınmış tartım kabı tartacağınız kimyasalın yada maddenin ağırlığından ayırt
edilmiş olur.
Figür 3: Hassas terazi
(http://faculty.clintoncc.suny.edu/faculty/michael.gregory/files/bio%20101/Bio%20101%20L
aboratory/Metric%20System/scale.jpg)
Hassas terazinin içerisine beher koyarak darasını alınız ve sonra bir adet bozuk parayı
behere yerleştirerek tartımını yapınız. Beher kullanmadan bozuk paranın tartımını yapınız ve
defterinize kaydediniz. Tarımlar arasıda fark oluştu mu?
Aşağıda ki hesaplamaları yaparak defterinize kaydediniz.
20) 37 g = _____ mg
21) 0.047 mg = _____ g
22) 45.36 g = _____ kg
Hacim Hesaplamaları:
23- 10 ml lik dereceli silindir alınız ve yarısına kadar su doldurunuz. Silindiri dik bir şekilde
tutarak ölçü alınız ve defterinize kaydediniz. Ölçüyü alırken su kavisinin alt kısmına dikkat
ediniz.
Figür 4: Dereceli silindir.
(http://faculty.clintoncc.suny.edu/faculty/michael.gregory/files/bio%20101/Bio%20101%20L
aboratory/Metric%20System/meniscus.jpg)
Aşağıda ki hesaplamaları yapınız.
24) 42 ml = _____ liters
25) 27 ul = _____ liters
26) 3.6 l = _____ ml
27) 1 ml = _____ ul
Bazen 1 ml hesaplamalarda 1 cm3 olarak kullanılır.
28- 27 liters = _____ cm3
3. HAFTA: MİKROSKOP VE MİKROSKOBİK ÖLÇÜMLER
1.1 Giriş
Biyolojik sistemlerin çoğu çıplak göz ile görülemeyecek kadar küçüktür. Bu nedenle biyolojik
sistemlerin olduğundan daha büyük görünmesini ve incelenmesini sağlayan sistemlere ihtiyaç
duyulmuştur. Mikroskop gözle görülemeyecek kadar küçük biyolojik sistemlerin
incelenmesinde kullanılan optik bir araçtır. Zaman içerisinde gelişen teknoloji ile paralel olarak
mikroskop ve mikroskobik yöntemlerde büyük ilerleme kaydedilmiştir [1].
1.1.1 Basit Mikroskop
Yaklaşık 500 yıl önce keşfedilen cam mercekler mikroskopların temelini oluşturur. bu
mercekler konveks şeklindeydi.Gözle ile nesnenin arasına konulan konveks şeklindeki bu
mercekler incelenen örneğin büyütülmesini sağlar[2].
Şekil 1. Basit Mikroskop
Örneği tek kademede büyütmek için
tek bir lens kullanılır.
Şekil 1.
Şekil 2. Anton Van Leeuwenhoek
mikroskobu
Şekil 2.
1.1.2.Bileşik (Karmaşık ) Mikroskop
1600'lerin başında Hollandalı Hans-Zacharios Janssen tarafından ilk karmaşık yapılı mikroskop
geliştirilmiştir. Bugünkü mikroskobun ana prensiplerini ise 17. asırda Hollandalı Auton van
Leeuwenhoek ve İngiliz Robert Hook bulmuşlardır. Bileşik mikroskop iki adet konveks lensten
oluşur. Örneğe yakın olan lense objektif, gözlem yapan kişinin gözüne yakın olan lense ise
oküler denir. Bileşik mikroskop iki kademeli büyütme sağlar. Objektif büyütülmüş resmi
mikroskop tüpüne yansıtır, oküler ise resmi bir kez daha büyüterek yansıtır. 10X objektif ve
15X oküler kullanılarak toplamda 150X büyütme sağlanır.
Şekil 3. Bileşik Mikroskop
Objektif ve tüp lens tarafından
büyütülen görüntü oküler tarafından
tekrar büyütülür.
Şekil 4. İlk Bileşik mikroskop
Şekil 4.
Şekil 3.
(http://www.microscopyu.com/galleries/)
Mikroskoplar temelde iki kategoride incelenirler;
1.Işık Mikroskopları : Aydınlatma ışık dalgaları ile sağlanır. (ışık mikroskobu, karanlık alan
mikroskobu, faz-kontrast mikroskobu, Ultraviyole mikroskobu).
2. Elektron Mikroskobu: Aydınlatmanın elektronlarca gerçekleştirilir. (Transmission elektron
mikroskobu "TEM" ve Scanning elektron mikroskobu "SEM") [4].
IŞIK MİKROSKOPLARININ BAŞLICA KISIMLARI
Mikroskop iki ana kısımdan oluşur:
1. Mekanik Kısımlar
2. Optik Kısımlar
Şekil 5. Mikroskobun başlıca kısımları
(http://www.microscopyu.com/galleries/)
1.Mekanik kısımlar
a. Mikroskop tüpü:
Mikroskop tüpü mikroskobun göz ile baktığımızda görüntünün oluşması için gerekli olan
mercek sistemini taşıyan uzatıcı bir tüptür. Tüpün her iki ucunda iki grup büyütücü mercek
sistemi bulunur. Bunlar; incelenen örneğe yakın konumda olan objektif mercekleri
ile mikroskobun üst kısmında bulunan göze yakın olan oküler mercekleridir. Bu mercekler
hareketlidir. Objektiflerde farklı büyütmelerde olabilir.
b. Mikroskop kolu:
Kol kısmı mikroskop tüpüne desteklik eder. Mikroskop taşınmasında kol kısmı kullanılır. Kol
kısmıyla mikroskop dik olarak tutulur ve taban kısmı diğer el ile desteklenir.
c.Revolver:
Üzerinde objektiflerin bulunduğu döner sistemdir. Bu sistem sayesinde objeye uygun objektif,
el ile hareket ettirilerek seçilir.
d. Maşa:
Objenin mikroskop tablasına tutturulmasını sağlamaya metal yapıdır.
e. Mikroskop tablası:
Örneklerin yerleştirildiği tabladır.
f. Kondansör:
Tablanın hemen altında bulunur. Bu kısım aynadan ya da lambadan gelen ışığın örnek üzerine
yoğunlaşmasına yarar.
g. Diyafram:
Örnekten geçen ışık ışınları göze ulaşarak retina üzerinde görüntünün oluşmasını sağlarlar.
Burada ışığın yeterli olması da çok önemlidir. Işığın şiddeti diyafram ile ayarlanır. Fotoğraf
makinelerindeki diyafram gibi burada da ışığın geçebileceği alanın küçültülüp, büyültülmesi
söz konusudur.
h. Makro ve Mikrovida:
Büyütme sırasında cismin görülebilmesi için mercek ile aralarında belli bir uzaklık
bulunmalıdır, buna çalışma uzaklığı denir. Çalışma uzaklığının ayarlanmasıyla da çalıştığınız
objenin net görünmesini sağlarsınız. Çalışma uzaklığının ayarlanması gövde üzerinde bulunan
makro ve mikrovida ile yapılır. Çalışma uzaklığı ayarlamada makrovida kaba, mikrovida ise
ince ayar sağlar. Bu ayarlama sırasında objektif ile preperatın arasındaki çalışma uzaklığına çok
dikkat edilmeli, preperatın ve objektifin zarar görmemesine özen gösterilmelidir.
i. Mikroskop ayağı:
Mikroskobun zemine oturmasını sağlayan kaide kısmıdır. Sağlıklı bir çalışma için lütfen
mikroskobunuzu sabit bir alana yerleştiriniz ve kaymasını engelleyiniz.
2. Optik Kısımlar
a. Oküler:
Oküler mikroskobun göz ile bakılan kısımlarında yer alan mercekler dizisidir. Oküler sayısına
göre iki mikroskop çeşidi vardır.
·
Monoküler mikroskop: Bir adet okülere sahip mikroskop
·
Binoküler mikroskop: İki adet okülere sahip mikroskop
Birçok binoküler mikroskopta gözler arasındaki mesafeyi ayarlamak mümkündür. Okülerlerin
içeri ya da dışarı doğru hareket etmelerini sağlayacak mekanizmaları vardır. Farklı
mikroskopların, okülerleri farklı büyütmeye sahip olabilir. Oküler mikroskop yuvasındaki
yerinden çıkarılarak büyütme gücü okunabilir. İncelenen nesneyi ölçmeye uygun mikrometrik
oküler veya nesneyi belirtmeye yarayan oklu okülerler de vardır.
b. Objektif:
Dönebilir bir başlık (revolver) üzerine monte edilmiş mikroskop tüpü üzerinde üç ya da dört
adet objektif bulunur. Her bir objektif çalışma sırasına göre “klik” sesi duyulana kadar çevrilir.
Objektiflerin üzerinde büyütme güçleri yazılmıştır. Objektifler üzerlerinde yazılı olan büyütme
gücüne göre isim alırlar ve her mikroskopta farklı büyütme gücüne sahip olabilirler.
Taramalı güç ....... 4X
Düşük güç ............10X
Yüksek güç ........... 40X
İmmersiyon .............. 100X
c. Işık Kaynağı:
İki değişik ışık kullanılabilir.
·
Ayna ile ışık doğal olarak ya da bir lambadan objeye yansıtılır. Işık yoğunluğundaki
değişmeler nedeniyle doğal ışık fazla tercih edilmez.
·
Doğrudan mikroskoba monte edilmiş bir ışık kaynağı kullanılır.
Rezolüsyon
Bir merceğin rezolüsyon gücü, en yakın mesafede bulunan iki cismin hayallerini ayırt etme
yeteneğidir. Bu güç merceğin açıklık sayısı ve ışığın dalga boyuna bağlıdır. Görünen ışığın
dalga boyu 4000-7000 Aº’dür. Adi ışık mikroskobunun rezolüsyon gücü beyaz ışığın dalga
boyunun 1/3'ü kadar olup yaklaşık 2000 Aº = 0,2 mikron'dur. Bundan daha küçük cisimler adi
ışık mikroskobunda görülemezler. Dalga boyu daha küçük olan UV ışınlan ile 2-3 kez, dalga
boyu çok daha kısa olan elektronların kullanıldığı elektron mikroskoplarında ise 100 kez daha
fazla rezolüsyon elde edilir [3].
Mikroskop Çeşitleri
Faz-Kontrast Mikroskobu
stereoskop
Elektron Mikroskobu
Scanning Elektron Mikroskobu
Transmission Elektron Mikroskobu
floresan Mikroskobu
-Mikroskobun Kullanılması:
Mikroskop, mikroskop kolu kendimize doğru olmak üzere konarak yerinden oynatılmamasına
özen gösterilir. Döner tabla (revolver) çevrilerek en küçük objektif mikroskop tablası deliğinin
üzerine getirilir.Mikroskoba monte edilmiş ışık kaynağı açılır. Preparat, mikroskop tablası
açıklığının ortasına gelecek şekilde tablanın üzerine konur. Mikroskop tüpü, makrovidayı
çevirerek objektif ile preparat arasında çok küçük bir uzaklık kalıncaya kadar aşağıya indirilir.
Göz tekrar okülere getirilerek ve makrovida çevrilerek görüntüyü görene dek tüp yukarı doğru
kaldırılır. Eğer görüntü elde edilemez ise o zaman objenin görüntü alanının dışına çıktığı
düşünülmelidir. Bu durumda preparat hareket ettirilerek cismin objektif alanının içine girmesi
sağlanır. Büyük objektife geçildikten sonra sadece mikrovida kullanılır, makrovida kesinlikle
kullanılmaz[3].
-Mikroskobun bakımı:
Okülerde, objektiflerde veya ışık kaynağında görüntünün netliği çevreden gelen tozlarla ve
temas ile bozulabilir. Bu nedenle çalışmaya başlamadan önce mutlaka mikroskobun mercekleri
yumuşak bir bez ile temizlenir. En ideal temizleyici lens paper veya ksilola batırılmış gazlı
bezdir.
- Mikroskop Kullanırken Kesinlikle Uyulması Gereken Kurallar:
1. Mikroskop her zaman iki elle tutulmalıdır.
2. Kullanılacağı zaman dikkatlice kutusundan çıkarılarak dengeli durup durmadığı kontrol
edilmelidir.
3. Mercekler hiçbir zaman ellenmemelidir.
4. Mercekler, kullanılmadan önce ve sonra temiz ve yumuşak bir bezle temizlenmelidir.
5. Mesafe doğru algılanamayacağı için preparat ve objektif arasındaki mesafeyi ayarlarken
hiçbir zaman mikroskobun üzerinden bakılmamalıdır. Yandan bakarak ayar yapılması,
mercekler ve preparatın zarar görmesini önler.
6. İmmersiyon objektifi kullanıldıysa inceleme sonunda mercekler silinerek immersiyon yağı
temizlenmelidir. Özellikle kuruduğunda temizlenmesi oldukça güç olan immersiyon yağı ile
kirlenmiş mercekler 1 damla ksilol veya kloroform damlatılmış yumuşak bir bezle
temizlenmelidir.
7. Preperatlar her zaman mikroskop küçük objektifteyken konulup çıkarılmalıdır.
8. Mikroskobun hiçbir parçası gereksiz kurcalanmamalıdır.
9. Mikroskop; inceleme ve temizleme bittiğinde, kutusuna kaldırılırken en küçük büyütmeli
objektifin revolver üzerinde ayarlanmış ve mikroskop tablasında obje bırakılmamış olmasına
dikkat edilmelidir[3].
-Mikroskop kullanımından sonra dikkat edilmesi gereken hususlar:
1. Mikroskop sadece gövde kolu üzerinden tutulmalı ve taşınmalıdır.
2. Objektifi tüpteki oküler ile birlikte en düşük büyütme seviyesine getirip bırakınız.
3. Aydınlatma sistemini kapatmayı unutmayınız.
4. Toz, mikroskop ve optik aksamın en kötü düşmanıdır. Bu nedenle mikroskobun hassas iç
bölümlerine tozun girmesini engellemek için herhangi bir objektifi veya oküleri kesinlikle
mikroskop üzerinden çıkartmayınız.
5. Eğer mikroskobun gövdesi ve tablası tozlu ise, tozun silinmesi için yumuşak pamuklu bez
parçası kulanınız.
6. Tüm bu işlemlerden sonra artık mikroskobu koruma örtüsüyle örtebilirsiniz (veya çantasına
yerleştirebilirsiniz) [4].
4. HAFTA: SOĞAN ZARININ İNCELENMESİ
Deneyin Amacı:
Soğan zarını inceleyerek bitki hücresinin kısımlarının gözlenmesi.
Teorik Bilgi:
Hücre zarından maddeye, hücreye giriş:
• Hücre zarı seçici geçirgen özelliğinden dolayı bütün maddelerin girmesini engeller.
• Küçük moleküller büyüklerden daha kolay geçer.
• Nötr moleküller iyonlardan daha kolay geçer.
• Yağı çözen maddeler kolay geçer.
• Yağda çözünen maddeler de kolay geçer.
Difüzyon: Maddelerin yoğun oldukları ortamdan az yoğun oldukları ortama doğru
yayılmalarıdır. (Şekerin çay içinde çözülmesi,kolonyanın havada dağılması)
Bitki ve Hayvan Hücresinin Karşılaştırılması:
Bitki Hücresi
Hayvan Hücresi
-Hücre duvarı bulunur
-Hücre duvarı bulunmaz
-Sentriol bulunmaz
-Sentriol bulunur
-Kloroplast, lökoplast, kromoplast bulunur
-Kloroplast, lökoplast, kromoplast bulunmaz
-Kofullar büyüktür
-Kofullar küçüktür
-Nişasta ve selüloz bulunur
-Glikojen bulunur
-Hücreler sürekli birbirlerine
-Hücreler bağımsızdır
hücre duvarıyla bağlıdır
Kullanılan Araç ve Gereçler:
• Mikroskop
• Damlalık
• Pens
• Lam ve Lamel
• Jilet
• Kuru soğan
• Bıçak
Deneyin Yapılışı:
Bıçak yardımıyla soğanı birkaç parçaya bölünüz. Soğan parçalarından birinden kare bir kesit
alın. İç kısmındaki ince zarı pens yardımıyla ayırınız. Soğan zarından jiletle küçük bir kesit
alarak lamın üzerine koyunuz. Damlalık ile bir damla su damlatın. Lamel ile hava almayacak
şekilde üzerini kapatınız.
Hazırladığımız preparatı önce küçük sonra büyük objektifle mikroskopta inceleyiniz.
Deneyin Sonucu:
Deneyde su yerine iyot çözeltisi damlatılırsa hücre çekirdekleri yukarıdaki gibi net olarak
gözlemlenir.
Biz yaptığımız deneyde sadece su kullandığımızda bu kadar ayrıntılı bir şekil elde edemeyiz.
5. HAFTA: KARBONHİDRATLAR VE PROTEİNLER
KARBOHİDRATLAR: Karbonhidratların genel formülleri (CH2O)n’dir.
Monosakkaritler basit şekerlerdir ve 3’den 7’ye kadar karbon atomu bulundurabilirler. Bir
araya gelerek polisakkaritleri oluştururlar. Genellikle şekelerin sonuna oz eki getirilerek
isimlendirilirler. Örneğin: Glukoz, fruktoz ve galaktoz. Monosakkaritlerin yapısal formulleri
C6H12O6 ‘dir.
Glikoz ve diğer şekerler düz yapıda moleküllerdir ama sıvı solusyonlar içerisinde çember
formlar oluştururlar.
.
Figür 1: Glikozun yapıları
Glikozun iki farklı isomeri vardır ve bu isomerler OH gurubunun yerleşimine göre
isimlendirilirler.
Figür 2: Glikozun isomer yapıları
Basit şekerler hücrelerde enerji saklama amacıyla toplanırlar ve hücre respirasyonunda
enerjiye çevrilirler. Bunların yanında, hücrelere basit şekerleri başka organik moleküllere
dönüştürmede kullanabilirler
Disakkaritler iki monosakkaritin bir araya gelmesiyle oluşturulurlar.
Örneğin:
Sukroz (çay şekeri şekeri) oluşturak için bir adet glikoz ve bir adet fruktoz gerekldir.
Figür 3: Sukroz oluşturma reaksiyonu
Glikoz gibi sukroz da enerji depolar ve bitkiler sukrozu fotosente yapmayan organlarına
enerji göndermek için kullanır. Laktoz sütün içeriğinde bulunur ve glikoz ve galaktozun
birleşmesi sonucu oluşur. Polisakkaritler gibi kompeks moleküllerin sindirimi hidroliz
mekanizmasıyla gerçekleşir ve moleküller maltoz disakkaritlerine parçalanır. Maltoz
disakkaritleri daha sonra iki glikoz molekülüne dönüşütürülür.
Polisakkaritler monosakkaritlerin bir araya gelerek oluşturdukları zincir yapılarıdır.
Nişasta ve Glikojen enerji depolamak için kullanlan polisakkaritlerdir. Glikoz moleküllerinin
bir araya gelerek oluşturdukları uzun zincir yapılarıdır.
Hayvanlar ekstra karbonhidrat olarak glikojeni karaciğer ve kaslarda depolarlar. Öğün
aralarında karaciğer glikojeni glikoza parçalayarak kandaki glikoz konsantrasyonunu sabit
tutmaya çalışır. Yemeklerden sonra glikoz yine glikojene dönüştürülerek kandaki glikoz
seviyesinin yükselmesi engellenir.
Bitkiler karbonhidratları nişastaya dönüştürerek depolama işlemini gerçekleştirirler.
Amylopectin bir tür nişasta türevidir ve glikojene çok benzer. Dallanma yapıları gözükür fakat
glikojene göre daha az dallanmalar vardır. Amylose da bir nişasta türüdür fakat dallanmalar bu
türevde bulunmaz.
Figür 4: Bir nişasta türevi olan Amylose
Selüloz ve kitin molekülleri de birer polisakkarit türüdür ve organizmaların yapılarını
korumasında ve desteklemesinde kullanılır. Bitkilerdeki hücre duvarı selülozdan oluşur.
Fungilerin hücred duvarlarının yapısında ise kitin yapıları yer alır.
Selülozun yapısında beta glikoz monomerleri bulunur fakat nişasta ve glikojen alfa
glikozlardan oluşurlar. Nişasta ve glikojenin yapısında bulunan glikoz altbirimleri daha
kompakt spiral yapıları oluşturmaya neden olur. Selüloz ve kitinin yapısında bulunan glikoz
altbirimleri ise düz bir yapı oluştururlar.
Figür 5: Selülozun yapısal formülü
Pamuk ve odunun yapısı genel olarak selülozdan meydana gelmektedir. Bu yapılar bitki
hücre duvarının kalıntılarıdır. İnsanlar ve hayvanlar selüloz ve kitin yapısını sindirebilecek
enzim türlerine sahip değillerdir. Fakat bazı ayvanlar (otçul hayvanlar) mikro organizmalar
yardımıyla selüloz ve kitini sindirebilmektedirler.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
PROTEİNLER
Proteinlerin önemi:
Proteinlerin öneli fonksiyonalrı aşşağıda listelenmiştir.
Enzim (kimyasal reaksiyonlar)
Hormonlar
depolama (kuşlar ve kertenkeleler için yumurta akı, bitkiler için tohumlar)
Taşıma (hemoglobin)
Hareket (kaslar)
Koruma (antikorlar)
Hücre zarı proteinleri ( reseptörler, taşıma proteinleri ve antijenler)
Yapısal görevler
Enzimler protein yapılarıdırve reaksiyonların gerçekleşme hızını arttırırlar. Proteinler sahip
oldukları şekillerden dolayı enzim görevi görebilmektedirler. Örneğin reaktant şeklindeki bir
protein molekülü enzim yapısının reaktantlarla yakın bir şekilde bağlanmasında rol alırlar.
Aşşağıdaki şemada enzimin substurat molekülüyle şekilsel uyumu sonucunda bağlanmaları
gösterilmektedir. Enzimin substuratı doğru oryantasyonda tutması reaksiyonun gerçekleşmesi
için büyük öneme sahiptir. Enzimler reaksiyon sonucu harcanmazlar ve olduğu gibi reaksiyon
sonucunda tekrar kullanılabilirler.
Figür 6: Enzim ve substurat molekülünün doğru oryantasyonda bağlanması
TEMİZLİK
Laboratuvara geldiğinizde oturduğunuz yerlerin ve bençlerin temiz olması çok önemlidir.
Bu yüzden deneyleri bitirdiğimizde oturduğunuz yerleri temizleyiniz ve kullandığınız cam
malzemeleri sudan geçirerek bulaşıklığa yerleştiriniz.
MONOSAKKARİTLER


1.
2.
3.
4.




Bir solusyon içerisinde ki monosakkaritleri yada belirli disakkaritleri bulmak için Benedik
Testi kullanılır. Eğer kullanılan solusyon şeker içeriyorsa, Benedikt maddesi konulur ve
ısıtılarak Benedikt maddesinde renk değişikliği gözlenir. Bu renk sarıdan yeşile ve koyu
kırmızıya kadar değişiklik gösterir. Bu değişiklik seker miktarına göre renk verir.
6 tane test tüpü işaretlenir. İlk işaret 1 cm ve ikinci işaret 3 cm ye konulur.
İlk 4 tüp 1 cm ye kadar aşağıdaki solusyonlar konulur.
Tüp 1: Su
Tüp 2: glikoz solusyonu
Tüp 3: sukroz solusyonu
Tüp 4: nişasta solusyonu
Bir parça soğan ezilerek parçalanır. Parçalama sırasında bir kaç damla su damlatılır. Tüp 5’e 23 damla soğan suyu eklenir ve 1 cm çizgisine kadar su ile tamamlanır.
Bir parça patates parçalanır ve aynı şekiğlde parçalanırken birkaç damla su eklenir. Tüp 6’ya
2-3 damla patates suyu eklenerek 1 cm çizgisine kadar su ile tamamlanır.
Her tüp 3 cm çizgisine kadar Benedikt çözeltisi eklenerek tamamlanır ve 5 dakika boyunca su
banyosunda kaynatılır.
Sonuçkar laboratuvar defterine not alınır. Renk değişimi şeker varlığına işaret eder.
Figür 7: 1 den 6 ya kadar numaralandırılmış tüpler kaynarken
Figür 8: Kaynadıktan sonra renk değişimi
PROTEİNLER
Biuret Test
Biuret solusyonunda ki (CuSO4 ve KOH) bakır atomları peptid bağlarıyla reaksiyona
girerler ve renk değişimine neden olurlar. Koyu mor renk protein varlığına ve açık pembe renk
ise peptid varlığına işaret eder. Açık mavirenk ise protein olmamasını gösterir.
Bruiet testini yumurta albumin proteinine uygulayacağız.



3 tane tüp 2 cm ye kadar işaretlenecektir
Bir tüpü 2 cm çizgisine kadar su ile doldurun, ikinci tüpü 2 cm çizgisine kadar albumin
solusyonu ile doldurun ve son olarak da 3. tüpü nişasta solusyonu ile 2 cm çizgisine kadar
doldurun.
5 damla %3 lük bakır sülfat (CuSO4) solusyonunu her tüpe ekleyin
10 damla %10 lük potasyum hidroksit (KOH) solusyonunu da hertüpe ekleyin
Renk değişimini laboratuvar defterinize kaydediniz.
Figür 9: Su, Abumin ve nişasta bulunan test tüpleri
6. HAFTA: PREPARAT HAZIRLAMA
Preparat hazırlama aşamaları aşağıdaki gibidir:
-Temiz bir lam alınır.
-İncelenecek örnek sıvı ise lama damlatılmadan önce iyice çalkalanır. Steril bir
pipet yardımıyla bir damla damlatılır.
-Katı ise lama bir damla saf su konur.
-Öze yakılıp soğutulur.
-Örnek alınıp damlanın bir kenarında ezilir.
-Sonra su damlası ile azar azar karıştırılarak lamın üzerine ince bir tabaka
hâlinde yayılır (smear yapma).
-Öze tekrar yakılıp soğutulur.
-Lamın havada kuruması beklenir.
-Mikroorganizmaların lam üzerine tesbiti (fiksasyon) yapılır.
-Hazırlanan preparatlar ışık mikroskobunda incelenir.
-Preparatların Tesbit Edilmesi (Fiksasyon)
Tesbit, numunelerdeki mikroorganizmaların lama tutunmasını sağlamaktır. Böylece
daha sonraki işlem aşamalarında lamdan akıp gitmeleri önlenir. Fiksasyon iki şekilde yapılır:
Alevle fiksasyon: Mikrobiyolojide en çok kullanılan yöntemdir. Preparat havada kurutulduktan
sonra lam kenarından tutularak materyalin olmadığı alt kısmı bek alevinin mavi kısmından 2-3
kez hızlıca geçirilir.
Preparat uzun süre alevde tutulursa numune yanabilir. Tesbitten sonra lamın soğuması
beklenmelidir.
Kimyasal maddelerle fiksasyon: Kimyasal maddelerle tesbit etil alkol, metil alkol veya
asetonla yapılabilir.
-Etil alkolle tesbitte preparat düz bir yere konur. Üzerine saf alkol dökülür. 8-10 dakika sonra
saf su ile yıkanır.
-Saf metil alkolle tesbitte preparat düz bir yere konur. Üzerine metil alkol dökülür ve 3 dakika
tutulur.
-Aseton ile tesbitte preparat asetonda 5 dakika tutulur. Aseton ile tesbit, özellikle floresans
mikroskopisi için hazırlanan preperatlara uygulanır.
Preparat hazırlamada dikkat edilecek bazı önemli noktalar şunlardır:
-Lamlar çok temiz, yağsız ve çiziksiz olmalıdır.
-Lamlardan yağın uzaklaştırılması için % 50’lik alkol kullanılmalıdır. Alkolü
uzaklaştırmak için lamlar saf sudan geçirilmeli ya da yakıldıktan sonra
kurutulmalıdır.
-Lamların temizlenmesi için potasyum bikromatlı çözeltide bir gece tutulmaları
sonra sırası ile çeşme suyu ve damıtık sudan geçirilmeleri gerekir. En iyisi her
defasında yeni lam kullanılmasıdır.
-Preparatların hazırlanmasında kullanılan öze, iğne ve pastör pipetleri de temiz
ve steril olmalıdır.
-Preparatlar, lamın ortası ile bir ucu arasındaki bölgede hazırlanırsa diğer
uçlarından tehlikesizce tutulabilir.
Tüm preparatlar; işleri bitince % 4’lük formol, % 5’lik fenol veya % 3’lük
hipokloritli suya bırakılarak dezenfekte edilmelidir.
Şekil: Katı kültürden preparat hazırlama
(http://hbogm.meb.gov.tr/modulerprogramlar/kursprogramlari/gida/moduller/mikroskopik_inceleme.pdf)
7. HAFTA: PREPARAT İNCELEME
Bu hafta her grubun üyeler 5’er adet hazır preparat inceleyecektir. Önce küçük
objektifte bulup sonra büyük objektiflerde netleştirecektir. 40x objektifinde görüntüyü
netleştirdikten sonra bulunan 5 adet görüntü defterlere çizilecektir.
Şekil: Daha önceden hazırlanmış bir preparatın incelenmesi
(http://hbogm.meb.gov.tr/modulerprogramlar/kursprogramlari/gida/moduller/mikroskopik_inceleme.pdf)
Referanslar
1-Mortimer Abramowitz Volume 1, Revised 2003 Basics and Beyond Series
2-http://www.microscopyu.com/galleries/
3-The Principles of Microscopy Purdue University Department of Basic Medical Sciences Scghool of Veterinary
Medicine J.Paul Robinson 2005
4-http://www.nobelprize.org/educational/physics/microscopes/phase/index.html
5-http://www.bilimtey.com/deneyler.php?dy=dnm&deney=SOGANZARININ&dm=.html
6-http://hbogm.meb.gov.tr/modulerprogramlar/kursprogramlari/gida/moduller/mikroskopik_inceleme.pdf