Seher Başaran - Türkiye Maternal Fetal Tıp ve Perinatoloji Derneği

MATERNAL PLAZMADAN SERBEST FETAL
DNA ANALİZLERİ İLE
ANÖPLOİDİLERİN PRENATAL TANISI
Prof. Dr. Seher Başaran
İstanbul Üniversitesi, İstanbul Tıp Fakültesi,
Tıbbi Genetik ABD
Trizomi 21
Live born infants in relation
to maternal age in
Switzerland
Trizomi 18
Trizomi 13
Turner s
Triploidi s
Trizomi 21
Turner s
Trizomi 18
Trizomi 13
Triploidi s
KH Nicolaides, NJ Sebire, RJM Snijders
BEVNAT, BFS
Fetal kromozom anomalilerinin
prenatal tanısı
TARAMA Testleri;
1. USG; NT ve
diğer markerler
2. MS-Tarama Testleri;
• Üçlü test, Dörtlü test
• 11-14 hafta testi
• Bunların kombinasyonları
3. MS- fetal DNA/RNA
analizleri ile anöploidi
-Kantitatif yöntemler-
TANI Testleri;
1. İnvaziv Girişim (AS,CVS, KS)
sonrası
• fetal kromozom analizi
• FISH/QF-PCR (anöploidi)
• mikroarray/a-CGH
(2. Non-invaziv Yöntem
MS- fetal DNA/RNA analizleri
ile fetal cinsiyet ve paternal
mutasyonun araştırılması
- Kalitatif yöntemler-)
Tarama testleri ve duyarlılıkları
İAY ile DS Yakalama Oranı
> 35 yaş
30%
ÜT ile DS Yakalama Oranı
ÜT riski
<1:250
40%
< 35 yaş
70%
NT ile DS Yakalama Oranı
ÜT riski
>1:250
60%
1. TTT ile DS Yakalama Oranı
1. TTT
<1:300
18%
NT normal
25%
NT ↑
75%
1. TTT
>1:300
82%
Tri 21 prevalansı 1:700 100 Tri 21 doğumu için  70 000 gebelik
Anne yaşı (>35)% 10
7 000 AS
30x Tri 21
70 DS’lu doğacak
Üçlü test
%5
3 500 AS
60x Tri 21
40 DS’lu doğacak
NT
%5
3 500 AS
75x Tri 21
25 DS’lu doğacak
1.Tri tarama % 5
+ USG
3 500 AS
>90x Tri 21
<10 DS’lu doğacak
…… diğer biokimyasal ve ultrasonografik (burun kökü hipoplazisi, vd)
parametrelerin kullanımı ile duyarlılık artmakta……
Amaç,
daha az girişim yaparak daha geniş bir populasyona
ulaşmak ve daha fazla anomali yakalamak.
80’ler ve 90’lar anne dolaşımından
fetal hücre avı ile geçti….
Anne kan dolaşımında fetal hücreler (T21)
1:1 000 000
yıl 2012 ve
Anne karaciğerinde fetal
erkek hücreler
Anne beyninde fetal erkek hücreler
PLAZMADA EKSTRASELLÜLER DNA
- 1940 larda insanda plazmada ekstraselluler DNA bildirildi,
-1990 larda kanser hastalarının plazmalarından elde edilen serbest
DNA da tümör kökenli genetik markerler saptandı,
-1997 de erkek çocuğa gebe olan kadınların plazmalarında fetusun Y
kromozomuna ait markerler gösterildi (Lo et al., 1997).
Maternal Plazmada Dolaşan Fetal DNA’nın
Biyolojik Özellikleri
-Serbest dolaşımdaki fDNA’nın % 80’i <200 bp
küçük parçalar halinde bulunur ve plazmadaki
tüm DNA’nın % 3-10 unu oluşturur,
-Implantasyonu takip eden 18 inci günden itibaren
maternal serumda saptanmaya başlanır ve
gebelik ilerledikçe miktarı artar,
-Gebelik bittikten sonra, yarı ömrü 16 dakikadır,
-Genel görüş, fDNA nın maternal plazmada kalıcı olmadığıdır; ancak bir yayın fetal
DNA nın uzun süre (27 yıl) maternal kanda saptanabildiğini öngörmekte ve bu
durum bazı fetal hücrelerin maternal yapıda uzun yaşadığı ve plazma ayrıştırması
esnasında tüm nükleuslu hücrelerin iyi uzaklaştırılamaması ile açıklanmaktadır,
-fDNA, ağırlıklı olarak plasenta kaynaklı olduğundan, plasentaya ait özellikleri
(plasenta ile sınırlı mozaisizm, plasental epigenetik özellikler, vs) de
yansıtacaktır.
KLİNİK UYGULAMALAR
Maternal kandan alınan plazma örneğinde tüm hücre yapılarının uzaklaştırılması
DNA nın ekstraksiyonu
(Minör oranda fetal DNA+Major oranda maternal DNA)
Kalitatif Yöntemler;
Maternal ve fetal DNA
polimorfizm/değişimlerini
tanır
TANI
Kantitatif Yöntemler;
Normal ile karşılaştırma esasına göre
tanır
TARAMA
Kalitatif yöntemle PATERNAL mutasyonun fetusta TANISI;
www.nature.com/reviews/genetics
Kantitatif Yöntem; ÖPLOİD FETUSTA BULGULAR
Başlangıçtaki DNA Havuzu
Amplifikasyon sonrası DNA Havuzu
Kromozom
18
13
21
18
Kromozom
13
21
Anne ye ait
DNA fragmanları
Yeni nesil
dizileme ile
amplifikasyon
1 : 1 : 1
Fetusa ait
DNA fragmanları
İncelenen tüm AMPLİKONLARIN oranı eşit
Kantitatif Yöntem; ANÖPLOİD FETUSTA BULGULAR
Başlangıçtaki DNA Havuzu
Amplifikasyon sonrası DNA Havuzu
Kromozom
18
13
21
18
Kromozom
13
21
Anne ye ait
DNA fragmanları
Yeni nesil
dizileme ile
amplifikasyon
Fetusa ait
DNA fragmanları
1 : 1 : 1,1
21. Kromozom AMPLİKONLARINDA artış
Commercial landscape of noninvasive prenatal testing in the United States
Ashwin Agarwal, Lauren C. Sayres, Mildred K. Cho, Robert Cook-Deegan, and Subhashini
Chandrasekharan
Prenatal Diagnosis 2013, 33, 521–531
Noninvasive prenatal testing for aneuploidy–ready for prime time?
Lyn S. Chitty, Melissa Hill, Helen White, David Wright, Stephen Morris,
American Journal of Obstetrics & Gynecology, APRIL 2012
Firma
Son yayın
Sequenom
Palomaki,
2011 ve 2012
Verinata
Bianchi, 2012
Ariosa
Natera
Zimmermann, 2012
Norton, 2012
Nicolaides, 2012 Nicolaides, 2013
BGI
Jiang, 2012
Test adı
Materni21
Materni21plus
Verifi
Harmony
Teknik
MP shotgun S
MPSS
DANSRtargeted
Hedef
Anomaliler
21, 18, 13, X, Y
Plus +DGS,5p-,
1p36 -, PW/AS
21, 18, 13, X, Y
21, 18, 13
X,Y
21, 18, 13, X, Y,
triploidi
21, 18, 13, X, Y
Olgu sayısı
1971
532
3080
185
903
Duyarlılığı
T21
T18
T13
X/Y
%99,1
>%99,9
%91,7
%96,2
T21
%100
T18
%97,2
T13
%78,6
X, Y %93,8-100
T21
T18
T13
%100
%97,4
%80
Yanlış
negatif
T21
T13
X/Y
3/212 T18
1/36
1/12 T13
3/14
25/26 XX 232/233
T21
T18
T13
0/81
1/38
2/10
Özgüllüğü
T21
T18
T13
X/Y
%99,9
>%99,6
%99,7
%99,7
T21
%100
T18
%100
T13
%100
X ,Y %99,6-100
T21
T18
T13
%99,97
%99,93
>%99
T21, T18, T13
%0
T21
T18
T13
1/2888
2/2888
1/1939
Yanlış
pozitif
T21, T18, T13
24/1688 ( %1,4)
Panorama
NIFTY
NGS -SNP basedtargeted
T21
T18
T13
45,X
>%99
>%99
>%99
%91,7
45,X
1/12
Tümü
%100
0
MPSS
T21
T18
T13
45,X
45,X
%100
%100
%100
%75
1/4
T21
T18
T13
%100
%99,7
%100
T18
1/891
Cell Free Fetal DNA Uygulama Endikasyonları;
• İleri anne yaşı (>35)
• Fetal USG de anöploidi riskini arttıran bulgu varsa
• Trizomili gebelik öyküsü
• MS- tarama testlerinde trizomi için artmış risk
•21 ve 13. kromozomlarının katıldığı Robertson tipi
translokasyon için taşıyıcı ebeveynlerin gebelikleri
1. Artmış anöploidi (21, 18, 13 için) riski taşıyan gebeliklerde cff-DNA test önerilebilir.
Bu teknolojinin <0,5% yanlış pozitiflik ile Down sendromlu fetusların ~ %98 ini
yakalaması beklenmektedir.
2. cff-DNA testi rutin prenatal laboratuvar uygulamalarının bir parçası
olmamalıdır, ancak test hasta seçimine bırakılmalıdır.
3. cff-DNA testi yeterli deneyim olmadığından düşük risk grubuna veya çoğul
gebeliklere önerilmemelidir.
4. Ön danışmada, cff-DNA testinin tanı testi olmamasına rağmen yüksek
duyarlılıkta olduğu, sadece sık görülen 5 kromozom anöploidisine yönelik uygulandığı
ve diğer genetik hastalıklar için bilgi vermeyeceği belirtilmelidir.
5. Test öncesi aile öyküsü alınmalı ve gebelikte prenatal tanısı mümkün diğer
genetik hastalıklar için risk olup olmadığı belirlenmelidir.
6. Eğer fetal USG de anomali saptanırsa invaziv prenatal tanı önerilmelidir.
7. Negativ cff-DNA testi sağlıklı fetusun garantisi değildir.
8. Pozitiv cff-DNA test sonucu alındığında genetik danışmaya yönlendirilmeli ve
konfirmasyon amacı ile invaziv prenatal tanı önerilmelidir.
9. cff-DNA testi, CVS veya amniosentezin tanısının güvenilirliğini ve doğruluğunu
karşılayamaz .
PRETAM+PREMED serilerinde ( 2 453 CVS ve 23 338 Amniosentez)
saptanan anomaliler içinde sık görülen 5 anöploidinin oranı ve cff-DNA testinin
hassasiyeti %100 kabul edildiğinde hipotetik yakalama/yakalayama oranı
İnvaziv yöntemlere göre
endikasyon grublarında
saptanan kromozom
anomalileri ve % leri
CVS-ileri anne yaşı
335’de 15 anomali
cff-DNA testi ile cff-DNA testi ile
yakalanabilir
yakalanamayan
anomaliler
anomaliler
n
%
n
%
Endikasyon
grublarındaki
rezidual risk
%
%4,5
12
66,8
3
33,2
%0,9
1:111
CVS- Tarama testi +
282’de 53 anomali
%18,8
39
73,6
14
26,4
%5
1:20
CVS- Patolojik USG
824’de 244 anomali
%29,6
199
81,6
45
18,4
%5,5
1:18
AS- ileri anne yaşı
10 430’da 233 anomali
%2,2
135
57,9
98
42,1
%0,9
AS- Tarama testi +
6749’da 185 anomali
%2,7
120
64,9
65
35,1
%1
AS- Patolojik USG
4442’de 378 anomali
%8,5
298
78,8
80
21,2
%1,8
1:111
1:100
1:56
cff-DNA Testi Öncesi Genetik Danışma
Tarama testleri, “hedefe yönelik” testlerdir
cff-DNA testlerinin PPV ve NPV değeri?
Prenatal tanı = Down s. tanısı değildir
Testin (–) olmasının bir garanti olmadığı,
FN ve FP olasılıkları
testin saptayamadığı anomali olasılıkları
(rezidual risk) anlatılmalı
 Gebeye NIPD ve IPD farkları anlatılmalı






Ayrıca Türkiye özelinde;
Bugüne kadarki uygulamalar nasıl yürütüldü?
Genetik “danışma” veriliyor mu?
Sonuçlar nasıl ve bunlar kayıt altında mı?
cff-DNA testinin izlemde yeri nerededir?
Ekstra bir ücret ile yapılan bu testte
sorumluluk kimde?
 Cinsiyet tanısının kötüye kullanımı nasıl
kontrol edilecek?
 Genetik materyalin topluca yurtdışına
gönderilmesi için Sağlık Bakanlığının izni gerek





bu konuların tartışılması gerekmiyor mu?
Sorular;
1. Down sendromu için “tanı” mı yoksa tarama mı?
2. Tarama testi + ise, NIPD invaziv prenatal tanının yerini alabilir mi?
3. Fetal kromozom analizinde (CVS ve AS) saptanan diğer anöploidileri saptayabilir mi?
4. FISH veya mikroarray teknikleri ile saptanan mikrodelesyon/duplikasyon sendromları?
5. Klasik tarama testlerinin yerini alır mı? Evet ise biokimyasal ve USG nin konjenital
malformasyonların erken gebeliklerdeki potansiyel faydalarını kaybeder miyiz?
Cevaplar;
1. Tanı testi , %100 duyarlılığı ve özgüllüğü olmalı, NIPD çok yüksek duyarlığı olan tarama
testidir, tanı testi değildir,
2. Eğer tarama testi + ise ve NIPD + ise Down sendromu riski 290 kez artmıştır,
NIPD – ise risk 110 kez azalmıştır ancak çok az da olsa rezidual risk önemli ve ciddidir,
3. T21 anomalilerin yarısını oluşturur, tarama testleri ile diğer anöploidi ve triploidi için risk
hesaplanabilir, ancak NIPD çalışmalarında klinik süreç tamamlanmadı,
4. NIPD ile mikrodelesyon/duplikasyon tanısının yakın gelecekte gerçekleşmesi beklenmiyor,
5. USG’nin yerini alamaz.
cff-DNA özellikle non-viable trofoblast kökenli olduğundan “CPM” riskini taşır.
NIPD testleri yüksek riskli gruplarda yapılmış ve yapılmaktadır. NIPD’nin düşük ve
orta risk grubunda performansı daha düşüktür, buna karşın maliyeti artıracaktır.
Tarama testi > 1:150 ise
->NIPD + ise ->CVS
1:380 Down s. Prevalansı
500 000 gebelikte 1 389 Down s.
Taramada >1:150 ise
13 646 NIPD %99 DR ve %1 FPR
1 305 CVS
13 düşük ve 1 169 Down s.
NIPD 200 £ ise
tarama+tanı 29,7 milyon £
Duyarlılık %100
Özgüllük %99 ( 100’ de 1 yanlış pozitif)
Prevelans Down sendromu %10 ise
1000 olguda;
Pozitif prediktif değer
%91
Prevelans Down sendromu %0,1 ise
1000 olguda;
Pozitif prediktif değer
%9
……coming soon …….
Bugün 10 Kasım
ATAMIZI sevgi ve saygıyla anıyoruz
KALİTATİF YÖNTEM
Yaklaşım
Analitik prensip
Marker
Klinik Uygulama
Fetal DNA da genetik
hastalığın dışlanması
Y kromozom arama
Fetal cinsiyet (%100 güvenilir)
X-e bağlı hastalıklar
RHD
Fetal RHD (rhesus blood group D-antigen)
(%100 güvenilir)
Rh- kadınlarda, RHD immunoglobin uygulama kararı için (kafkas
ırkında Rh- anne oranı % 15)
Paternale özgün hastalıkla
ilişkili allel tarama (real
time, fluorescence,
konvansiyonel PCR, kütle
spektrofotometresi/tek
alleli çoğaltma)
Fetal HLA (human lökosit antijenleri)
haplotiplemesi
Konjenital Adrenal Hiperplazi gibi HLA ya bağlı hastalıklar (erkek
fetuslar için)
Paternal mutasyonlar
B-talasemi, hemoglobin E-hastalığı, kistik fibroz, konjenital
adrenal hiperplazi, myotonik distrofi, Huntington hastalığı (fetal
DNA yı maternal DNA dan ayırmak için allel spesifik PCR yapmak
gerekiyor)
KANTİTATİF YÖNTEM
Yaklaşım
Analitik prensip
Marker
Klinik Uygulama
Gebelikle ilişkili hastalıkların
takibi için fetal DNA analizi
Real-time PCR ve benzeri
kantifikasyon yöntemleri ile aynı
gebelik yaşındaki normaller ile
karşılaştırma yapmak
Fetal durum,
Fetal aneuploidiler, intrauterin büyüme geriliği, fetomaternal
kanamalar
Diğer gebelik
komplikasyonları
Pre-eklamsi, pre-term labour, ektopik gebelik, invazif
plasentasyon, hiperemesis gravidatum, polihidramnios
Real-time RT- PCR ile plasentaya
ait transkriptlerin
kuantifikasyonu
CGB (chorionic gonadotropin,
beta polipeptidi)
Gestasyonal trofoblastik hastalıklar
CRH (Corticotropin releasing
hormone)
Pre-eklampsi
Transkriptlerin quantifikasyonu;
RNA-SNP allelik oranların
saptanması
21. kromzomun kodladığı
transkripitler
Fetal trisomi 21
Real-time metilasyon spesifik
PCR; epigenetik allelik oranlar
Hipometile SERPINB5
Pre-eklampsi, fetal trisomi 18
Plasental RNA analizi
Epigenetik analizler
Sequenom – LifeCodexx –
Materni21 plus
Trizomiler; 21, 18, 13,
X and Y ve 16 ve 22
Mikrodeletions;
del 22q11.2
(DiGeorge s.),
5p- (Cri-du-chat s.),
del 15q11.2 (PraderWilli/Angelman s.,
del 1p36
Verinata - Verifi
ARIOSA – Harmony test
HARMONY
400 kan örneği
300 öploid 3 örnekte risk skoru belirlenememiş.
297 örnekte risk değeri < 0,01% specificity %100
50 T21
50/50 risk değeri > 99%
sensitivity %100
50 T18
47/50 risk değeri > 99%
1/50 risk değeri > 98,8%
1/50 risk değeri > 88,5%
1/50 risk değeri
0,11%
Toplam 49/50
sensitivity %98
FNR %2
2002 örnekten 53 ünde sonuç alınamamış, 1949 örnekte risk skoru alınmış.
10 T13
risk skoru
1939 öploid risk skoru
> 99%
< 0.01%
0.79%
> 99%
8/10
1937/1939
1/1939
1/1939
sensitivity
FNR 20%
specificity
80.0%
99.9%
FPR 0.05% (95% CI,0.0–0.3%)
From prenatal genomic diagnosis to fetal personalized medicine: progress and
challenges
Diana W Bianchi, Nature Medicine, 2012
Table 4a: The number of chromosome anomalies detected in different
indication groups of CVS series (385 anomalies detected in 2 453 CVS)
Chromosome anomalies
(including mosaics) CVS
CBCR
NIR
LR
AMA
ST
P-USG
45,X and variants
n
42
0
1
0
1
4
36
Polysomy X/Y
6
0
2
0
2
0
2
Tri somy 21
125
1a
0
2
7
29
86
Trisomy 18
61
1a
0
0
1
4
55
Trisomy 13
23
0
0
0
1
2
20
Uncommon trisomies
20
0
2
1
1
8
8
Poliploidies
20
1
0
0
0
2
17
Balanced structural
51
35
5
1
2
1
7
Unbalanced structural
37
21
0
0
0
3
13
Total
385
59
10
4
15
53
244
Table 4b: The number of chromosome abnormalities detected in different
indication groups of AC series (890 anomalies detected in 23 338 AC)
Chromosome
anomalies (including
mosaics) AC
n
CBCR
NIR
LR
AMA
ST
P-USG
45,X and variants
58
0
1
0
6b
18bbb
33
Polysomy X/Y
68
0
0
0
32
18
18
Trisomy 21
324
0
1
1
80
75
167 aa
Trisomy 18
87
1a
0
0
13 a
7
66
Trisomy 13
21
0
0
1
4
2
14
Uncommon trisomies
20
0
0
0
5
4
11
Polyploidies
17
0
0
0
1
1
15
Balanced structural
Unbalanced
structural
218
64
5
6
74
47
22
77
11
0
3
18
13
32