Bolum 11 Roundup Ready? Soya`nin Es Zamanli - EU

 Gıda Örneklerinde
Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri
Bölüm 11
Roundup Ready Soya’nın Eş Zamanlı (Real-Time)
PCR ile Nicel Saptanması
N. Foti
WORLD HEALTH ORGANIZATION
REGIONAL OFFICE FOR EUROPE
ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE
BUREAU REGIONAL DE L'EUROPE
WELTGESUNDHEITSORGANISATION
REGIONALBÜRO FÜR EUROPA
ВСЕМИРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ
ЕВРОПЕЙСКОЕ РЕГИОНАЛЬНОЕ БЮРО
2 Roundup Ready Soya’nın Eş Zamanlı (Real‐Time) PCR ile Nicel Saptanması İçindekiler
Bölüm 11
Roundup Ready Soya’nın Eş Zamanlı (Real-Time) PCR ile Nicel
Saptanması
Deneysel
3
Giriş
3
ABI PRISM® 7700 kullanarak Eş Zamanlı (Real-Time) PCR
3
LightCycler (Roche) kullanılarak RT-PCR
8
Kaynaklar
14
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 11 Roundup Ready Soya’nın Eş Zamanlı (Real‐Time) PCR ile Nicel Saptanması 3 Deneysel
Giriş
Aşağıdaki protokoller, özel bir GD soya (Roundup Ready® soya) vakası için ham ve
işlenmiş materyallerde miktar tayini için kullanılan eş zamanlı PCR yöntemleridir. Bu
eş zamanlı PCR ölçümleri amplikon üretimini florasan kullanarak eş zamanda tespit
eden iki farklı PCR termal döngü cihazı ile gerçekleştirilmiştir: ABI PRISM® 7700
SDS (Applied Biosystems) ve LightCycler® (Roche).
Eş zamanlı PCR, genetik değişikliğe uğramış soya varlığını gösteren bir DNA hedef
sekansına ek olarak bir de endojen referans DNA (soyaya özgü) sekansının amplifiye
edilmesinde kullanılır. Her iki ölçüm de her biri özel DNA primerleri ve boya-işaretli
problar içeren iki farklı PCR sisteminden oluşur. Bir PCR sistemi GDO’ya spesifik
DNA sekansını tespit ederken, diğeri GD ve GD olmayan soya tespit edilmesinde
miktarsal referans olarak görev yapmak üzere tasarlanmış bir endojen referans
sistemidir.
Not: Bu kitapçığın içerdiği protokoller eğitici amaçlarla seçilmişlerdir ve eş zamanlı
(real-time) PCR yöntemi kullanarak yapılan GDO miktar tayini çalışmalarının temel
örnekleri olarak düşünülmelidirler. En son geliştirilen ve onaylanan protokoller
hakkında bilgi edinmek için uygun kaynakların ve literatürün periyodik olarak gözden
geçirilmesini tavsiye ederiz. Bu protokollerin bizim laboratuvarımızda bulunan aletlere
göre seçilmiş olduğuna lütfen dikkat ediniz. JRC ve WHO, hiç bir şirketin ya da
markanın kullanılmasını özel olarak desteklememektedir.
ABI PRISM® 7700 kullanarak Eş Zamanlı (Real-Time) PCR
RR soyaya spesifik RT- PCR için protokol: çok hedefli (multiplex) PCR metodu
Bu metod, lektin referans geni ve RR soyaya eklenmiş olan gen kasetinin bir
bölümünün Multipleks PCR analizi ile amplifikasyonu ve nicel saptanmasından oluşur
(Foti ve ark., 2006). TaqMan lektin ve RR probları sırasıyla VIC ve FAM boyalarıyla
işaretlenmiştir, bu da aynı tüpte birden fazla hedefin amplifikasyonunu tespit etmeyi
mümkün kılar. Reporter boya FAM emisyonu, farklı maksimal yayılım dalga boyu
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 11 Roundup Ready Soya’nın Eş Zamanlı (Real‐Time) PCR ile Nicel Saptanması 4 özelliği ile VIC’den ayrılabilir. ABI PRISM 7700 SDS emisyonu farklı dalga
boylarında olan birden fazla boyayı tespit etme özelliğine sahiptir.
RR soyaya karşılık gelen boya miktarı (FAM), her örnekte tespit edilen bitki
materyaline karşılık gelen boya (VIC) miktarı ile normalize edilir. Böylelikle tekrar
örnekleri için ortalaması alınan CT değerleri ortaya çıkar. Bu değerler bilinen RR
soya konsantrasyon standartlarından elde edilen kalibrasyon eğrisi ile hesaplanmış
olan CT değerleri ile karşılaştırılır ( karşılaştırmalı CT metodu veya CT ).
Bu prosedür çeşitli ham madde, katkı maddesi ve soya içeren gıdalarda (yoğurt, un,
lesitin, soya içeceği) başarıyla uygulanmıştır. Bu metodun analitik performansı birçok
yeterlilik testi sırasında başarıyla gözlemlenmiştir (FAPAS, GIPSA).
Alet ve malzemeler

ABI PRISM 7700 Sekans Tespit Sistemi (Applied Biosystems)

MicroAmp Optik 96-Kuyucuk Reaksiyon Plateleri (Cat No. N801-0560)

MicroAmp Optik kapaklar (Cat No. N801-0935)

TaqMan Universal PCR Master karışım (Cat No. 4304437) 2X içeriği: TaqMan
Tamponu 2X AmpliTaq Gold DNA Polimeraz (5U/µl), AmpErase UNG (1U/ml),
dNTP’ler 200 µM dUTP ile, Pasif Referans 1

Mikrosantrifüj

15 ml konik tüpler için soğutmalı santrifüj

Mikropipetler

Vorteks karıştırıcı

Reaksiyon tüpleri için taşıyıcı raf

1,5ml mikrosantrifüj tüpleri

15 ml polypropylene konik santrifüj tüpleri

Nükleaz ari su

Referans genine(lektin) özel primerler (Le-F ve Le-R) ve prob (Le-Probe)

Transgene özel primerler (RR-F ve RR-R) ve prob (RR-Probe)
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 11 Roundup Ready Soya’nın Eş Zamanlı (Real‐Time) PCR ile Nicel Saptanması 5 Referans geni primerleri ve probunun özellikleri
Le-F
TCC ACC CCC ATC CAC ATT T
19
5586.0
Sekans
Uzunluk (bp)
Mol. Ağırlık
Le-R
GGC ATA GAA GGT GAA GTT GAA GGA
24
7532
Sekans
Uzunluk (bp)
Mol. Ağırlık
Le-Probe
5’-(VIC)-AAC CGG TAG CGT TGC CAG CTT
CG-(TAMRA)-3'
23
7019.0
Sekans
Uzunluk (bp)
Mol. Ağırlık
Transgen primerleri ve probunun özellikleri
Sekans
Uzunluk (bp)
Mol. Ağırlık
RR-F
GCC ATG TTG TTA ATT TGT GCC AT
23
7014
Sekans
Uzunluk (bp)
Mol. Ağırlık
RR-R
GAA GTT CAT TTC ATT TGG AGA GGA C
25
7712
Sekans
Uzunluk (bp)
Mol. Ağırlık
RR-Probe
5’-(FAM)-CTT GAA AGA TCT GCT AGA GTC
AGC TTG TCA GCG-(TAMRA)-3'
33
10137
Master karışım hazırlanması

İşlem için gerekli ayraçları ihtiyaç duyulan miktarlarda çözüp, yavaşça karıştırın ve
santrifuj edin. Çözülmüş bileşenleri buz içinde tutun.
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 11 6 Roundup Ready Soya’nın Eş Zamanlı (Real‐Time) PCR ile Nicel Saptanması 
Buz içindeki tüpün içine, master karışım hazırlamak için gerekli bileşenleri aşağıda
belirtilen sırayla (DNA dışında) ekleyin. Ekstrakte edilen her DNA üç kere analiz
edilir. Solüsyonun akıcılığına bağlı pipetleme hatalarına karşı dört fazla reaksiyon
karışımı hazırlandığına dikkat edin.
Tablo 1. Çok hedefli (multiplex) PCR ölçümünün bir plate için master karışım hazırlanması
Son
Konsantrasyon
Steril, deiyonize su
TaqMan Universal
Master karışım 2X
Primer Le-F(20µM)
Primer Le-R(20µM)
Primer RR-F(20µM)
Primer RR-R(20µM)
Le-Prob(10µM)
RR-Prob (10µM)
DNA
Bir örnek
için µl
Bir örnek için
master karışım
(3 tekrar)
54,9
75
1X
18,3
25
40 nM
40 nM
100 nM
100 nM
100 nM
100 nM
50-250 ng
0,1
0,1
0,25
0,25
0,5
0,5
5
0,3
0,3
0,75
0,75
1,5
1,5
15
50
150
Toplam
Bir plate için
master karışım
(32+4 örnek)
1976,4
2700
10,8
10,8
27
27
54
54

Yavaşça karıştırın ve kısaca santrifüjleyin.

Test edilecek her DNA örneği için bir tane 1,5 ml mikrosantrifüj tüpü hazırlayın:
standart eğri örnekleri (CRM-RR soya % 0,1; 0,5; 1; 2; 5), bilinmeyen örnekler ve
kontrol örnekleri (%0 RR soya , RR soya DNA’sı ve hedef içermeyen kontrol).

Her mikrosantrifüj tüpüne 3 tekrar için gerekli master karışım miktarını ekleyin (135 µl
master karışım). Her tüpe 3 tekrar için uygun miktarda DNA ekleyin (15 µl DNA). Her
tüpü en az üç kere yaklaşık 10 sn vorteksleyin. Bu adım her örneğin 3 tekrarı
(replikalar) arasındaki farkı en aza indirmek için önemlidir.

Çok kısa santrifüjleyin. 96-well reaksiyon tepsisini yerleştirin ve yatay olarak soldan
sağa her kuyucuğa 50 µl ekleyin. Master karışımı dikey kuyu sütunlarından her birine
eklendikten sonra optik kapaklarla kapatın.

Not: optik kapağın üzerine yazmayınız ve kapağa dokunmayınız.

Yüklenen master karışım sıvısının kuyuların tabanında olduğuna, kapakta ve kuyu
kenarında damla ve baloncuk olmadığına emin olun.

Reaksiyon tepsisini ABI PRISM 7700 cihazına yerleştirin; her kuyu için örnek türünü
düzenlemek için erkandan yeni bir tepsi ayar penceresi açın: VIC boya için IPC, FAM
boya için UNKN örnek türü seçilir.

Tablo 2’de belirtildiği gibi cihazı başlatın.
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 11 7 Roundup Ready Soya’nın Eş Zamanlı (Real‐Time) PCR ile Nicel Saptanması Tablo 2. RR soya için ABI PRISM 7700 SDS’de çok hedefli (multiplex) program
Set: Eş zamanlı (real time) PCR modu
50µl reaksiyon hacmi
Aşama
1
2
3
4
Kademe
UNG
İlk denatürasyon
Amplifikasyon
Denatürasyon
Bağlanma ve
Uzama
TC
50C
95C
95C
60C
Zaman(sn)
120”
600”
15”
60”
Okuma
Yok
Yok
Yok
Ölçüm
Döngüler
1X
1X
45X
Veri analizleri ve sonuçların değerlendirilmesi
Çalışılan her örneğin reporter boyasının CT değerini hesaplamak için çalışmadan
sonra veriler ABI PRISM 7700 SDS bilgisayar programı ile analiz edilir.
Örneklerin SDS bilgisayar programının “Plate Setup” (tepsi ayarları) penceresinde
doğru bir şekilde numaralandırılması önemlidir. Her kuyu “Replicatea” (tekrarlar)
alanında özgün bir sayı ile numaralandırılmalıdır. Tekrarlarda örneklere aynı numara
verilmelidir. Amplifikasyon çizim penceresine otomatik olarak ulaşabilmek için analiz
menüsünden “Analyse” (analiz et) seçeneği işaretlenerek çalışılır. Eşik değer FAM
ve VIC seviyeleri için ayarlanır.
Çalışmayı analiz ettikten sonra elde edilen sonuçları excel dosyasına aktarılır.
Aktarılan dosyalar Microsoft  Excel programına açılı. Her kuyucuk için CT değeriyle
birlikte FAM ve VIC boya seviyelerine ilişkin veri iki bloklu bir tabloda toplanır.
CT (CT FAM - CT VIC)
değerini hesaplamak için her tekrar grubunun CT (FAM) ve
CT (VIC) ortalamaları hesaplanır.
Her örnek için, derişim standart ayarlarından elde edilen CT ve log (%GDO)
değerleri karşılaştırılıp, numunenin CT analizi sonucunda % GDO hesaplanır.
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 11 8 Roundup Ready Soya’nın Eş Zamanlı (Real‐Time) PCR ile Nicel Saptanması LightCycler (Roche) kullanılarak RT-PCR
RR-soya spesifik RT-PCR için protokol
Bu yöntem, iki bağımsız PCR reaksiyonunda, lektin referans geni ve RR soyaya
aktarılmış transgenik gen kasetinin bir bölümü için miktar ölçümünden oluşur (BgVV,
EU Tender Report, 2000). Bu iki PCR sistemi FAM’la işaretlenmiş problar kullanır.
Her örnek için GD soya ve referans gen (lektin geni) miktarı, transgen ve referans
gen için gereğine uygun olarak hazırlanmış standart eğrilerden saptanır. GD soya
içeriği, normalize edilmiş GD soya değerini belirlemek için referans gen miktarına
bölünür.
Cihaz ve Ayraçlar

Roche LightCycler sistemi

LightCycler örnek kapillerleri. Roche, Kat No 1909339

LightCycler kapiller adaptörü. Roche, Kat No 1909312

LightCycler FastStart DNA Master Hibridizasyon Probları. Roche, Kat No 3003248

İçeriği: FastStart Taq DNA Polimeraz, dNTP karışımı (dTTP yerine dUTP ile) ve
reaksiyon tampon solusyonu buffer, 10X kons.; PCR için uygun steril su

Bovine serum albumin (BSA), nükleaz içermeyen (DNAaz & RNAaz içermeyen) örn.
Promega Kat No. R9461 (1µg/µl)

Platinum Taq DNA Polimeraz 5U/µl (10X buffer ve 50 mM MgCl2 ile beraber).
Invitrogen- life technologies Kat No. 10966026

Mikrosantrifuj

Miropipetler

Vorteks karıştırıcı

Reaksiyon tüpleri için taşıyıcı raf

1,5 ml mirosantrifuj tüpleri

Nükleaz ari su

Referans gene sözel primerler (GM1-F ve GM1-R) ve prob (GM1-Probe)

Transgene özel primerler (GM2-F,GM2-R) ve prob (GM2-Probe)
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 11 Roundup Ready Soya’nın Eş Zamanlı (Real‐Time) PCR ile Nicel Saptanması 9 Referans geni için primer ve prob özellikleri
GM1-F
5'-CCA GCT TCG CCG CTT CCT TC-3'
Sekans
Sekans
GM1-R
5'-GAA GGC AAG CCC ATC TGC AAG CC-3'
Sekans
GM1-Probe
5'-(FAM)-CTT CAC CTT CTA TGC CCC TGA CAC -(TAMRA)-3'
Transgen için primer ve prob özellikleri
Sekans
GM2-F
5'-CAT TTG GAG AGG ACA CGC TGA-3'
Sekans
GM2-R
5'-GAG CCA TGT TGT TAA TTT GTG CC-3'
Sekans
GM2-Probe
5'-(FAM)-CAA GCT GAC TCT AGC AGA TCT TTC (TAMRA)-3'
Standart eğriler
Her işlemde 5 farklı standart DNA seyreltmesi kullanıalrak iki standart eğri
oluşturulur. Her standart kalibrasyon DNA’sı için ın, her iki master karışımla birer
reaksiyon gerçekleştirilir.
Toplam soya ve GD materyali ölçümü için standart eğriler, %2 RR soya ile başlayıp,
0,1M, pH 8,0 TE tampon ile seyreltmek suretiyle azalan standart DNA solüsyonları ile
oluşturulur. Standart eğrilerin ilk noktası için yaklaşık 100 ng DNA kullanılır. Tüm
seyreltmeler ve derişimler Tablo 3’te özetlenmiştir.
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 11 10 Roundup Ready Soya’nın Eş Zamanlı (Real‐Time) PCR ile Nicel Saptanması Tablo 3. DNA miktarları ve standart eğri seyreltmeleri
STD1
STD2
STD3
STD4
STD5
DNA miktarı
Soya DNA % GD DNA % Seyreltme Faktörü
(ng)/reaksiyon
100
100
2
50
50
1
1:2
25
25
0,5
1:4
12,5
12,5
0,25
1:8
6,25
6,25
0,125
1:16
Master karışım hazırlanması

İşlem için gerekli ayraçları ihtiyaç duyulan miktarlarda çözüp, yavaşça karıştırın
ve santrifuj edin. Çözünmüş bileşenleri buz içinde tutun.

Her sistem için master karışım hazırlamak üzere buz içindeki 1,5 ml mikrosantrifuj
tüpünün içine, master karışım hazırlamak için bileşenleri aşağıda belirtilen sırayla
(DNA dışında) ekleyin. Solüsyonun akıcılığına bağlı pipetleme hatalarına karşı iki
fazla reaksiyon karışımı eklendiğine dikkat edin.
Tablo 4. GM1 sistemi için master karışım hazırlanması
Bileşenler
Platinum Taq pol.buffer 10X
MgCl2 (50mM)
dATP,dGTP,dCTP,dTTP(4mM)
GM1-F primer (20µM)
GM1-R primer (20µM)
GM1-prob (10µM)
BSA nükleaz free(1µg/µl)
Platinum Taq pol.(5U/µl)
Nükleaz ari su
DNA
Toplam hacim:
Son
konsantrasyon
1X
4mM
0,8mM
500mM
500mM
200mM
0,1 mg/ml
0,8 U
#
µl/reaksiyon
2
1,6
4
0,5
0,5
0,4
2
0,16
6,85
2
18µl+2µl
DNA
Toplam µl
(18 reaksiyon için)
36
28,8
72
9
9
7,2
36
2,9
123,5
324,2µl (DNA
hariç)
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 11 11 Roundup Ready Soya’nın Eş Zamanlı (Real‐Time) PCR ile Nicel Saptanması Tablo 5. GM2 sistemi için master karışım hazırlanması
Bileşenler
Platinum Taq pol.buffer 10X
MgCl2 (50mM)
dATP,dGTP,dCTP,dTTP(4mM)
GM2-F primer (20µM)
GM2-R primer (20µM)
GM2-probe (10µM)
BSA nükleaz ari (1µg/µl)
Platinum Taq pol.(5U/µl)
Nükleaz ari su
DNA
Toplam hacim:
Son
konsantrasyon
1X
4mM
0,8mM
500mM
500mM
200mM
0,1 mg/ml
0,8 U
#
µl/reaksiyon
2
1,6
4
0,5
0,5
0,4
2
0,16
6,85
2
18µl+2µl
DNA
Toplam µl
(18 reaksiyon için)
36
28,8
72
9
9
7,2
36
2,9
123,5
324,2µl (DNA hariç)

Yavaşça karıştırın ve çok kısa santrifüjleyin.

Test edilecek her DNA (standart eğri örnekleri ve bilinmeyen örnekler) örneği için iki
(bir tane GM1 sistemi için ve bir tane GM2 sistemi için) 0,5 ml reaksiyon tüpü
hazırlayın.

Her reaksiyon tüpüne 2 tekrar için gerekli master karışım miktarını ekleyin (36 µl
masterkarışım). Her tüpe 2 tekrar için uygun miktarda DNA ekleyin (4 µl DNA). Her
tüpü en az üç kere yaklaşık 10 sn vorteksleyin. Bu adım bir örnek için tekrarlar
arasındaki farkı en aza indirmek için önemlidir.

Kapillerleri önceden soğutulmuş santrifuj adaptörüne yerleştirin.

Şemada belirtilene göre her kapillere 20µl master karışım pipetleyin (Tablo 6 Tepsi
kurulumu- yükleme sırası).

Düşük hızda mikrosantrifujde çevirin (700 rpm). Bu adım reaksiyon karışım hacminin
tamamının kapillerlerin ucunda konsantre olmasını sağlar.

Kapillerleri LightCycler® (Roche) carousel içine transfer edin.

Tablo 7’de belirtildiği gibi cihazı başlatın.
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 11 12 Roundup Ready Soya’nın Eş Zamanlı (Real‐Time) PCR ile Nicel Saptanması Tablo 6. LightCycler® carousel yükleme sırası: 1’den 16’ya GM1 sistemi, 17’den 32’ye GM2
sistemi. Rferans gen ve transgen (GDO) sistemi için her örnek çift çalışılmış.
Pozisyon
Örnek(%)
Pozisyon
Örnek(%)
Pozisyon
Örnek(%)
1
STD (100)
13
U2
25
STD (0.125)
2
STD (100)
14
U2
26
STD (0.125)
3
STD (50)
15
NTC
27
U1
4
STD (50)
16
NTC
28
U1
5
STD (25)
17
STD (2)
29
U2
6
STD (25)
18
STD (2)
30
U2
7
STD (12.5)
19
STD (1)
31
NTC
8
STD (12.5)
20
STD (1)
32
NTC
9
STD (6.25)
21
STD (0.5)
10
STD (6.25)
22
STD (0.5)
11
U1
23
STD (0.25)
12
U1
24
STD (0.25)
Tablo 7. LightCycler® programı
Her adım için eğimi 20C/s oalarak ayarlayın
Fluoresen gösterim modu F1/1
Denatürasyon:
Cycles:
1
Type:
None
Segment
Number
Temp.
1
96 °C
Fluorescence Display Mode:
Time
Slope
120 sec 20 °C/sec
F1/1
2° Target
Temp.
Step
Size
Step Delay
(Cycles)
Acquisition
Mode
0 °C
0 °C
0
None
Döngü:
Cycles:
45
Type:
Quantification
Segment Temp.
Number
Fluorescence Display Mode:
F1/1
Time
Slope
2° Target
Temp.
Step
Size
Step Delay
(Cycles)
Acquisition
Mode
5 sec
20 °C/sec
0 °C
0 °C
0
None
1
95 °C
2
60 °C
15 sec
20 °C/sec
0 °C
0 °C
0
Single
3
72 °C
15 sec
20 °C/sec
0 °C
0 °C
0
None
Soğutma:
Cycles:
1
Type:
None
Segment Temp.
Number
1
40 °C
Fluorescence Display Mode:
F1/1
Time
Slope
2° Target
Temp.
Step
Size
Step Delay
(Cycles)
Acquisition
Mode
30 sec
20 °C/sec
0 °C
0 °C
0
None
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 11 13 Roundup Ready Soya’nın Eş Zamanlı (Real‐Time) PCR ile Nicel Saptanması Çalışma sırasında EDIT SAMPLE düğmesini tıklayarak, yükleme ekranında örnek adlarını
girin. Tüm pozisyonları (kalibrator DNA da dahil) “ Unknown” (Bilinmeyen)olarak belirtin.
Data analizleri ve sonuçların değerlendirilmesi

Data analizi için data analizi ön penceresinde Fluorescence F1/F2’yi seçin.

Ölçüm için “quantification” düğmesine tıklayın.

LightCycler® bilgisayar programı ölçüm için iki farklı metod önerir: “Second derivative
Maximum” metodu ve “Fit Points” metodu. RR soya DNA tespit kiti ile miktar tayini
için tercihen “Fit Points” metodu kullanılır. Belirtilen ayarları kullanınız: baseline
adjustment = “Proportional”; number of points = 2.

Standart eğriyi diğer tüm ilgili bilinmeyen reaksiyonlarla beraber gösterin.

“Step 2: Noise Band” dosyasını açın.

Noise band pozisyonunu 0,1’e getirin (aşağıdaki nota bakınız). Noise band elle veya
“Chance Graph Settings” düğmesinin altındaki tuşa basarak hareket ettirilebilir. Bu
tuş ile “Manual Cursor Adjustment” penceresi açılır ve cursor değeri 0,1 olarak
ayarlanır.

“Step 3: Analysis” dosyasını açın.

Step 3: Analysis’de çakışma noktaları, kalibrasyon standartlarının ve bilinmeyen DNA
hedeflerinin ilgili konsantrasyonları hesaplanır.

Standart eğrinin r-değerini kontrol edin. r–0,98 değeleri kabul edilebilir; r= –1 değeri
optimaldir.
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 11 Roundup Ready Soya’nın Eş Zamanlı (Real‐Time) PCR ile Nicel Saptanması 14 Kaynaklar
EU Tender Report. (2000). Development of qualitative as well as quantitative
detection methods to identify a genetic modification in soybean and maize
products. Report of the EU Tender n. XXIV/98/A3/001.
LightCycler Operator’s Manual, version 3.0 (Roche Molecular Biochemicals).
User Bulletin #2. Relative quantitation of gene expression. ABI PRISM 7700
Sequence Detection System. PE Applied Biosystems, 1997.
User Bulletin
#5. Multiplex PCR with TaqM VIC probes. ABI PRISM 7700
Sequence Detection System. PE Applied Biosystems, 1998.
Foti, N., Onori, R., Donnarumma, E., De Sanctis, B., and Miraglia, M. (2006). RealTime PCR multiplex method for the quantification of Roundup Ready soybean in
raw material and processed food. European Food Research and Technology
Journal 222, 209-216.
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 11