Diyare tanısında MALDI

Diyare tanısında MALDI - TOF MS
Yakut Akyön Yılmaz
MALDI-TOF MS
Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization timeof-flight, Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS)
(Matriks ile desteklenmiş lazer
dezorpsiyon/iyonizasyon uçuş zamanı kütle
spektrometresi)
Mikrobiyoloji Uygulamaları Tarihi
Gelişim
Klinik uygulamada sık kullanılan
yöntemler:
33
Mevcut Tanımlama Metodları
4
Modern mikrobiyal taksonomi:
proteomiks ve genomiks
bacterial cell
protein
DNA
proteome
species
definition & determination
mass
fingerprint
100
9476.2
4424.2
Voyager Spec #1=>AdvBC(32,0.5,1.0)=>NF0.7[BP = 4423.9, 2117]
2117.3
genome
DNA
fingerprint
4861.0
90
80
8823.5
70
5897.8
0
3000
5000
9000
10975.2
10493.9
10110.8
9075.2
9611.5
12271.4
8054.3
8903.3
8383.8
7000
8610.6
7424.9
6786.7
7209.8
6533.3
6137.3
4026.9
4535.6
10
3491.4
20
3132.3
30
4765.4 4738.6
40
6984.6
6271.2
6629.0
50
3311.8
% Intensity
60
11000
13000
Mass (m/z)
5
Günümüzde Klinik Kullanım
24 saatlik kültür
Manuel
Ön-seçim
Otomatize sistem
Manuel
Ön-seçim yok
Direnç Testleri
Serolojik Testler
Görsel
Metodlar
PCR
MALDI-TOF
MS
Sadece 2 dakika
4 – 72 saat
Mikroorganizma tanımlaması
MALDI-TOF MS
• MALDI-TOF bakterilerin protein yüklerine bağlı
ayrıma giderek tanımlamayı
gerçekleştirmektedir.
MALDI-TOF
MS: Temel Prensipler
İyon dedektörü
tespit
ayırım
+
+
+
Hareket alanı
+
elektrot
hızlanma
Hızlanma alanı
iyonizasyon
+
+
desorpsiyon
matriks / analit
kristalleri
kuyucuk
Tam bakteri hücresindeki kütle spektrometresine göre farklı tepe paternlerinin
oluşması
Pantoea agglomerans
Acinetobacter lwofii
Burkholderia cepacia
Raoultella ornithinolytica
Staph.aureus
E.coli
4000
m/z
8000
İş akışı
1- Örnek Hazırlığı
1µL CHCA matrix
Tek kuyucuk
Bakteri
Kurumaya bırakılır
1µL-Öze ile
Tek koloni alınır
2- Ölçüm
Escherichia
coli
Digestive tract
E.coli
3775
<<C:\Dokumente und Einstellungen\m.erhard\Eigene Dateien\AnagnosTec-dc\Zwischenablage\Dokument Banner.txt>> Spec [BP = 3
0
3000
5000
3- Analiz - Tanımlama
7000
10939
8744
9000
Mass (m/z)
11000
11572
11906
9654
10226
9330
10
10608
10347
7980
7863
7092
8450
5931
6837
20
7367
40
30
Veri
Analizi
5015
60
50
3581
% Intensity
70
9994
8074
90
80
9453
1648.1
7075
100
13000
Barkod, örnek numarası ile slayt pozisyonu arasındaki bağlantıyı sağlar
İş akışı:
Adım 1 – Örnek hazırlama
VITEK MS-DS slayd
48 pozisyonlu
1µL Matrix solusyon ilave edin
Tek bir koloni den seçim ve
transferi
Kalibrant suşu
tek kolonisinden seçimi ve
transferi
Örnek hazırlama
Sarf Malzemeler
Hazırlanmış Slayt
Cihaza Yükleme
Bir defada yüklenebilecek toplam örnek
sayısı 4X48= 192 adettir.
İş akışı:
Adım 2 – Ölçüm
Otomatik spektrum okuması ~1 dakika numune
kalitesine bağlı
proteinlerin ionizasyonu ve moleküler
ağırlık ölçümü
3775
<<C:\Dokumente und Einstellungen\m.erhard\Eigene Dateien\AnagnosTec-dc\Zwischenablage\Dokument Banner.txt>> Spec [BP = 3
5000
7000
10939
11000
11906
11572
10608
10347
9000
10226
8450
9330
7863
10
0
3000
9994
7980
20
7367
30
7092
40
6837
50
5931
5015
60
3581
% Intensity
70
9654
80
8744
8074
90
9453
1648.1
7075
100
13000
Mass (m/z)
18
İş akışı :
Adım 3 – Analiz - Tanımlama
Mikroorganizma
tanımlaması
Algoritma
hesaplaması
Veritabanı ile
karşılaştırma
Miktar
MALDI-TOF MS: Temel Prensipler
Değer
MALDI kaşifleri
Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-Of-Flight
Mass Spectrometry
1980‘de geliştirildi :
Karas & Hillenkamp _Almanya ve Tanaka et al _Japonya.
İlk ticari cihaz 1991
Kimya Nobel ödülü : K. Tanaka 2002
21
Koichi Tanaka: biyolojik makromoleküller
Koichi Tanaka § John Fenn, 2002
Kullanım alanları
MALDI-MS mikroorganizma analizi için önemli bir tanı
aracı
MALDI-MS
hastalık monitorizasyonu
tanısı
serum protein profillenmesi
Bakteri, maya ve filamentöz mantarların, virus, viral
vektörlerin doğru ve hızlı tanımlanması
Bakteri, maya ve filamentöz mantarların, virus, viral
vektörler ve paraziter yapıların araştırılması
Taksonomi ve epidemiyoloji
Abiotrophia
Bordetella
Corynebacterium Fusarium
Achromobacter
Brettanomyces
Cronobacter
Acinetobacter
Brevibacillus
Actinobacillus
Lactobacillus
Nocardia
Propionibacterium
Staphylococcus
Fusobacterium Lactococcus
Obesumbacterium
Proteus
Stephanoascus
Cryptococcus
Gardnerella
Leclercia
Ochrobactrum
Prototheca
Streptococcus
Brevibacterium
Cupriavidus
Gemella
Lecythophora
Oerskovia
Providencia
Suttonella
Actinomyces
Brevundimonas
Debaryomyces
Geobacillus
Legionella
Oligella
Pseudoflavonifractor
Tatumella
Aerococcus
Brochothrix
Delftia
Geotrichum
Leifsonia
Paecilomyces
Pseudomonas
Tetragenococcus
Aeromonas
Budvicia
Dermabacter
Globicatella
Leptotrichia
Paenibacillus
Psychrobacter
Thermoanaerobacterium
Aggregatibacter
Burkholderia
Dermacoccus
Gluconobacter Leuconostoc
Pantoea
Rahnella
Trichosporon
Alcaligenes
Buttiauxella
Dietzia
Gordonia
Parabacteroides
Ralstonia
Trueperella
Alicyclobacillus
Campylobacter
Edwardsiella
Alloiococcus
Candida
Eggerthella
Alternaria
Capnocytophaga
Eikenella
Anaerobiospirillum
Cardiobacterium
Aneurinibacillus
Listeria
753 Tür
Granulicatella
Lysinibacillus
Paracoccus
Raoultella
Vagococcus
Grimontia
Macrococcus
Parvimonas
Rhizobium
Veillonella
Haemophilus
Malassezia
Pasteurella
Rhodococcus
Vibrio
Elizabethkingia
Hafnia
Mannheimia
Pectinatus
Rhodotorula
Virgibacillus
Carnobacterium
Empedobacter
Helcococcus
Methylobacterium
Pectobacterium
Riemerella
Weeksella
Arcanobacterium
Cedecea
Enterobacter
Helicobacter
Microbacterium
Pediococcus
Rothia
Weissella
Arcobacter
Cellulosimicrobium
Enterococcus
Histophilus
Micrococcus
Penicillium
Saccharomyces
Williopsis
Arthrobacter
Chryseobacterium
Erwinia
Kingella
Mobiluncus
Peptoniphilus
Salmonella
Xanthomonas
Asaia
Citrobacter
Erysipelothrix
Klebsiella
Moellerella
Peptostreptococcus Serratia
Xenorhabdus
Aspergillus
Cladosporium
Escherichia
Kloeckera
Moraxella
Photobacterium
Shewanella
Yersinia
Bacillus
Clavibacter
Eubacterium
Kluyvera
Morganella
Pichia
Sphingobacterium
Yokenella
Bacteroides
Clostridium
Ewingella
Kocuria
Mycobacterium
Plesiomonas
Sphingobium
Zygosaccharomyces
Bergeyella
Collinsella
Facklamia
Kodamaea
Myroides
Porphyromonas
Sphingomonas
Bifidobacterium
Comamonas
Finegoldia
Kytococcus
Neisseria
Prevotella
Sporobolomyces
“MALDI-TOF”
“MALDI-TOF” “bacteria”
“MALDI-TOF” “fungi”
“MALDI-TOF” “virus”
“MALDI-TOF” “parasite”
11605
2484
1669
366
121
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez
13.Mayıs.2014
MALDI-MS
BAKTERİ
Anhalt JP, Fenselau C. Identification of bacteria
using mass spectrometry. Anal Chem 1975;
47:219–25.
1660 bakteri izolatının %95.4 doğru tanımlanmış
1 izolat için 6 dakika
Maliyet konvansiyonel fenotipik tanımlamanın %22-32
Mayıs 2010
MALDI-TOF %99
Fenotipik yöntem %98
Br J Biomed Sci. 2012;69(2):47-55.
Comparison of bacterial identification by MALDI-TOF mass
spectrometry and conventional diagnostic microbiology
methods: agreement, speed and cost implications.
El-Bouri K, Johnston S, Rees E, Thomas I, Bome-Mannathoko
N, Jones C, Reid M, Ben-Ismaeil B, Davies AR, Harris LG,
Mack D.
928 bakteride cins düzeyinde %99.4
tür düzeyinde %89
5-10 dak ilk sonuçlar
90 dak 96 bakteri
1.79-2.56 pound
PLoS One. 2012; 7(3): e32589.
Published online 2012 March 16. doi: 10.1371/journal.pone.0032589
PMCID: PMC3306318
Direct Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight Mass
Spectrometry Improves Appropriateness of Antibiotic Treatment of
Bacteremia
Anne L. M. Vlek,* Marc J. M. Bonten, and C. H. Edwin Boel
Tür düzeyinde saptama 28.8 saat
Uygun antibiyotik başlama oranında %11.3 artış
Hızlı ve Doğru Campylobacter Tanımlanması
VITEK MS ile Campylobacter türlerinin
hızlı ve doğru tanımlanması
Sonuçlar:
49 adet Campylobacter jejuni
49 adet Campylobacter coli
ve referans suşların tamamı
%100 doğrulukla ve
90 dakikadan az bir zamanda
tanımlanmıştır.
ECCMID 2012 - Rapid and accurate identification of Campylobacters with VITEK MS - Reading et al Poster 2323
Hızlı ve Doğru Salmonella Tanımlanması
Salmonella Türlerinin Hızlı Tanısında Kromojenik Besiyeri İle Birlikte “MatrixAssisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry” Yönteminin
Phoenix Otomatize Sistemi ile Kıyaslanması
Işın AKYAR Simge CAN
Acıbadem Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Üsküdar, İstanbul - TÜRKİYE
Acıbadem Labmed Klinik Laboratuvarları, Fahrettin Kerim Gökay Cad. No: 49 Altunizade/Üsküdar, İstanbul - TÜRKİYE
347 Salmonella türü hem Phoenix
otomatize sisteminde hem de MALDI-TOF
cihazında çalışılmıştır. 2 yöntemin
sonuçları birbiri ile %100 uyumludur. Her iki
cihazda da tür düzeyinde tanımlama
yapılabilmekte, alttür tanımlamaları için
konvansiyonel olarak Salmonella
antiserumları ile serolojik tiplendirmeye
gereksinim duyulmaktadır.
Kafkas Univ Vet Fak Derg
19 (2): 325-330, 2013
Haziran 2013 – 13 Mayıs 2014
• 37 Salmonella türleri
• 2 Shigella türleri
• 9 Campylobacter türleri (5 kan kültürü)
– 6 C. jejuni
MALDI-TOF Maliyet Etkinlik ve Sonuç Zamanı
MALDI-TOF Sonuç Duyarlılığı
Gram-pozitif koklar
Stafilokok, streptokoklar
Enterobacteriaceae
Escherichia coli
Yersinia enterocolitica
Erwinia türleri
Salmonella enterica
Nonfermentatif bakteriler
Campylobacter
Helicobacter pylori
Aeromonas
Haemophilus influenzae
Streptococcus pneumoniae
Streptococcus agalactiae
Bartonella henselae
Neisseria, Listeria, mikobakteri
Antibiyotik direncinin dakikalar içinde belirlenmesi
Avantaj
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Hızlı
Fazla sayıda örnek (96)
Maliyet etkin
Sarf malzemeleri ucuz
Az örnekle çalışılır
Maya ve anaerop tanısı koyulabilmekte
Parazit ve virus çalışılabilmektedir
Güvenilir
Rutin ve araştırma için kullanılabilir
Dezavantaj
•
•
•
•
Kurulum pahallı
Koloni olmalı
Teknik donanım
Veriler biyoinformatik programla kısıtlı
Teşekkür ederim.