POLİAKRİLAMİD JEL ELEKTROFOREZİ

POLİAKRİLAMİD JEL ELEKTROFOREZİ
ELEKTROFORETİK YÖNTEMLER
Prensipte kromatografik yöntem sistemine benzerlik gösterir. Elektroforezde durgun fazı, örneğin üzerine uygulandığı
kağıt yada sentetik jeller oluşturur. Hareketli faz ise elektrik akımıdır. Elektrik akımı, elektrolit bir tampon çözelti yardımıyla
uygulanır. Seçilen pH değerine göre aynı özellikteki biyomoleküllerin iyonizasyonu benzer olacağından yürüme yalnızca bir
kutuba doğru oluşur. Böylece ayrışma jel elemesinde olduğu gibi molekül büyüklüğü ve üç boyutlu yapıya göredir. Yürümeyi
yük/kütle oranı doğrudan etkiler. Küçük moleküller önde, büyükler ise geride olacak şekilde sıralama oluşur. Elektroforez
yöntemleri ,matriksin tipine ve uygulama pH'ına göre çeşitlilik gösterir.
POLİAKRİLAMİD JEL ELEKTROFOREZİ
En yaygın kullanım alanı olan elektroforez tipidir. Jel sentetik bir madde olan akrilamid ile akrilamid türevi olan N-N'metilen bisakrilamidin polimerleşmesiyle oluşturulur ve örnekler bu jel üzerinde yürütülür. Proteinler için çok uygun olduğu gibi
DNA ve RNA elektroforezleri için de kullanılabilir. Akrilamid miktarı ve akrilamid/bisakrilamid oranı jelin ayrıştırma kapasitesini
belirler. Akrilamid / bisakrilamid oranı yükseldikçe jellerde ısınma fazlalaşır, kırılganlık artar, daha kolay yıkanır.
PAGE sisteminde uygulama sınırları (proteinler için)
Jel yüzdesi
Ayrıştırma Kapasitesi (Dalton)
% 5
60.000 - 212.000
% 10
18.000 - 75.000
% 15
15.000 - 45.000
Polimerleşme reaksiyonunda akrilamid molekülleri yanyana bağlanarak düz zincirler oluştururlar. Bisakrilamid
molekülleri ise iki akrilamid zinciri arasında çapraz bağlanmalar oluşturur. Böylece ağımsı bir yapı meydana gelir. Polimerleşme
derecesi; sıcaklık, pH, amonyum per sulfat (APS) ve N,N,N',N'- tetrametil-etilendiamin ( TEMED) miktarına göre farklılık gösterir.
Polimerleşme için serbest radikal oluşumuna sebep olan APS reaksiyon başlatıcı, TEMED ise katalizör olarak rol oynar.
Poliakrilamid jel elektroforezi:
1. SDS PAGE ( denatüre edici page)
2. ND-PAGE( non denatüre edici page ) olarak ikiye ayrılır.
ND PAGE ( non denature edici page)
Proteinlerin doğal (intakt) yapılarını bozucu ajanlar kullanmadan yapılan PAGE yöntemidir. Saflık derecesinin tayini için
kullanıldığı gibi direk olarak saflaştırma işlemi olarakda kullanılabilir.
SDS PAGE ( denatüre edici page)
SDS ( Sodyum dodesil sülfat) anyonik bir deterjan olup iki amino asitte bir peptit zincirine bağlanarak protein
moleküllerini oluşturan alt birimleri biribirinden ayırır. Ayrıca (-) yük taşıdığından peptitlerede yüksek oranda '(-) yük kazandırır.
Böylece elektrik yükü açısından karışım içerisindeki bütün protein molekülleri eşit duruma getirilir. Jel konsantrasyonu arttırılarak
protein moleküllerinin molekül ağırlıklarına göre ayrışmaları sağlanır.
SDS PAGE yöntemi proteinlerin saflığının kontrolü, molekül ağırlıklarının saptanması ve konsantrasyon çeşitliliğinin
belirlenmesi amacıyla kullanılmaktadır.
İZLENECEK YOL
Gereçler
Mini gel elektroforez aleti
Güç kaynağı( 200 V,500 mA)
Mikrofüj
Eppendorf tüpler
Tüplük
Otomatik pipet ve pipet uçları
Saç ayağı ve kaynatma kabı
Eldiven
1.Örneklerin Hazırlanışı
10-50 mg / 10 ml protein çözeltisi, 2.5 ml yükleme çözeltisi ile karıştırılarak, kaynar su banyosunda 2 dakika inkübe
edilir ve jele uygulanır. Örnek hazırlanırken, ortama disülfid köprülerini redükleyen bir ajan olan ditiyotiretiyol (DTT)
eklendiğinde, polipeptid zincirleri üzerinde bulunan disülfid köprüleri açılarak, moleküller düz zincir haline geçerler. Böylelikle üç
boyutlu yapı tamamen ortadan kalkar ve tüm protein molekülleri benzer primer yapı halinde hareket ederler. DTT eklenmesi
sonucunda polipeptidlerin elektroforetik mobilitelerinde bir miktar azalma gerçekleşir. Bu azalma molekül ağırlığındaki artıştan
değil, açılan zincirlerin daha geniş yer tutmasından ileri gelir.
www.hasanunal.net
2. Jelin Hazırlanışı
Poliakrilamid jeli ya iki cam tabakası arasında (slab) ya da ince uzun tüpler içerisinde hazırlanır. Günümüzde en yaygın
kullanımı slab jeldir. Slab jelin avantajları, az madde harcanması, pratik oluşu ve örneklerin yan yana karşılaştırılmaları açısından
daha kullanışlı olmasıdır.
Cam tabakaların iki yanına jelin arzu edilen kalınlığı ölçüsünde, genellikle teflondan yapılmış birer "spacer" yerleştirilir.
Jel ne kadar ince ise resolüsyon o kadar iyi olur (0.5 - 1 mm). Camlar kıskaç yardımıyla sıkıca tutturulur. Jelin alt kısmının
geleceği yere yine aynı kalınlıkta teflondan yapılmış dip "spacer"ı yerleştirilir ve kıskaç yardımıyla sıkıştırılır. "Spacer" ve cam
tabakalar arasındaki jelin sızıntı yapmasına sebep olabilecek olası boşlukları izole etmek için, tabakanın kenarlarına bir pastör
pipeti yardımıyla agaroz çözeltisi dökülür ve kuruması beklenir. Herhangi bir sızıntının olup olmadığı su ile kontrol edilir. Sızıntı
olmadığından tamamen emin olunduktan sonra jel karışımı ileride belirtildiği gibi hazırlanarak, genellikle bir enjektör yardımıyla
hava kabarcığı oluşturmadan boşaltılır.
Jel polimerleşirken su çıkışı olur. Çıkan su yüzeyde birikir ve kurumaya maruz bırakılırsa jel yüzeyinin bozulmasına neden
olur. Bu nedenle jel polimerleşmek üzere doldurulduktan sonra üzerine pastör pipeti yardımıyla ve yavaşca bir miktar distile su
konmalıdır. Böylece hem yüzeyin kuruması önlenir hem de jel yüzeyinin daha düzgün olması sağlanır. Polimerleşme başladıktan
sonra ilk 15 dakika içinde %75'e erişir. Polimerleşme gerçekleştikten sonra jelin üst kısmındaki su alınarak yerine jeldeki
derişimine eş değerde tampon konur ve polimerleşmenin tamamlanması için bir gece bekletilir. Eğer jel karışımı içinde (özellikle
% 10 ve üzerindeki yoğunluklardaki jellerde) fazla miktarda çözünmüş hava varsa, polimerleşme sırasında bu hava, kabarcıklar
halinde jel içinde kalır ve jel yapısını bozar. Bu nedenle jele TEMED eklenmeden önce vakumlanarak
havası alınmalıdır.
Sıkıştırma jeli kullanılıyorsa, sıkıştırma jelinin polimerleşmesi tamamlandıktan sonra örnekler hemen uygulanır. Uzun süre
beklenirse iki jel arasındaki derişim ve pH farkı ortadan kalkacağından sıkıştırma jelinin fonksiyonu tam olarak gerçekleşmez.
3. Yürütme
50 mA sabit akım verilerek (250 V) yapılır. Elektroforez, jelin boyuna göre yaklaşık olarak 2-4 saatte, işaret boya jel
bitimine 1/2 cm kalana dek sürer.
4. Coomasie Blue ile Boyama
Coomasie mavisi, aktif grubu —SO3H olan bir boyadır. Asidik ortamda proteinlerin serbest amino gruplarına bağlanır
(lizin, histidin, arjininin amino grubu azotuna ). Boya maddesinin sülfonik asit grubu, (+) yüklü amino grubuyla birleşir. Boyama
çözeltisi 10 kez kullanılabilir.
Ayrıca Coomasie blue ile boyamaya oranla 100 kat daha hassas olan bir başka boyama yöntemi de gümüş boyamadır.
Proteinler ile birlikte DNA'yı da boyar.
450 ml Metanol
90 ml Asetik asit
450 ml Distile su
2.5 g Coomasie brilliant blue G250
ile 20 - 25 °C ' da 30 dakika.
Jel boyandıktan sonra çeşme suyu ile yıkanır. ardından;
450 ml Metanol
90 ml Asetik asit
450 ml H2O
karışımının 200 ml'si içinde 30 dakika bekletilir. Yıkama çözeltisi değiştirilerek gece boyu yıkamaya devam edilir.
Jel, % 10 gliserol çözeltisine aktarılır. Bu çözelti içinde jel hem normal boyutuna ulaşır, hem daha iyi temizlenir, hem
de kırılganlığı azalır.
5.Stok Çözeltilerin Hazırlanışı
% 30'luk akrilamid stoğu
28.8 g Akrilamid
1.2 g Bisakrilamid (N-N'-metilen bisakrilamid)
H2O ile son hacim 100 ml'ye tamamlanır. Çözündükten sonra Whatman 1 MM ya da eşdeğeri bir filtre kağıdından
süzülür. Koyu renkli bir şişede ve +4°C'da 1-2 ay saklanabilir.
10 x TBE pH 8.3
121.1 g Tris-baz
55.67 g Borik asit
7.45 g EDTA
H2O ile son hacim 1 L'ye tamamlanır.
pH 6.7 TBE
37.5 ml 10 x TBE tamponunun pH değeri, konsantre HCl ile 6.7'e getirilir ve son hacim H2O ile 50 ml'ye tamamlanır.
www.hasanunal.net
% 10 (H/A) APS
100 mg amonyum per sülfat
H2O ile son hacmi 1 ml olacak şekilde çözülür. APS solüsyonu karanlıkta 1 hafta saklanabilir.
% 1 (H/A) SDS
1 g Sodyum dodesil sülfat (ya da sodyum lauryl sülfat)
H2O ile son hacmi 100 ml olacak şekilde çözülür.
Yürütme Tamponu (0.5 x TBE + % 0.1 SDS)
25 ml 10 x TBE pH 8.3
50 ml % 1 SDS
425 ml H2O
Yükleme Tamponu (10 ml)
5 g Sukroz
0.025 g Brom fenol mavisi (ya da Pyronin Y)
0.5 ml % 10 SDS
2.5 ml 10 x TBE pH 8.3
Son hacim H2O ile 10 ml'ye tamamlanır. Çözündükten sonra 50 ya da 100 µl'lik kısımlara ayrılarak derin dondurucuda
saklanarak her elektroforez için bir tüp kullanılır.
% 12'lik Jelin hazırlanışı (20 ml)
8 ml Akrilamid stoğu
7.5 ml 10 x TBE pH 8.3
2 ml % 1 SDS
2.39 ml Distile su
0.1 ml % 10 APS
Karıştırılır ve Whatman 3 MM ya da eşdeğeri bir filtre kağıdından vakum altında süzülerek havası alınır.
0.010 ml TEMED eklenir.
Karıştırılır ve dökülür. Üzerine pastör pipeti ile birkaç ml distile su konur. Polimerleşme olduktan sonra su yerine 1 : 2.67
oranında seyreltilmiş 10 x TBE pH 8.3 konur ve gece boyunca bekletilir.
KAYNAKLAR
1.Daniel M. Bollag , Stuart J. Edelstein; Protein Methods, 1991
2. B.D.Hames,D. Rıckwood; Gel Electrophoresis of proteins,1990
www.hasanunal.net