RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0

Transkript

altona
altona
DIAGNOSTICS
DIAGNOSTICS
RealStar®
Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0
08/2014
altona Diagnostics GmbH
Mörkenstr. 12
22767 Hamburg
Almanya
phone
fax
e-mail
+49 40 548 06 76 - 0
+49 40 548 06 76 - 10
[email protected]
www.altona-diagnostics.com
always a drop ahead.
RealStar®
Filovirus Screen
RT-PCR Kit 1.0
aşağıda sıralanan cihazlarla kullanılmak üzere hazırlanmıştır:
Mx 3005P™ QPCR System (Stratagene)
VERSANT® kPCR Molecular System AD (Siemens)
ABI Prism® 7500 SDS and 7500 Fast SDS (Applied Biosystems)
LightCycler® 480 Instrument II (Roche)
Rotor-Gene® 3000/6000 (Corbett Research)
Rotor-Gene® Q5/6 plex Platform (QIAGEN)
CFX96™ system/Dx real-time system (BIO-RAD)
in vitro diagnostik kullanım amaçlı
Ürün No.: 441013
96 rxns
MAN-441010-TR-01
Store at -25°C ... -15°C
Ağustos 2014
altona Diagnostics GmbH • Mörkenstraße 12 • D-22767 Hamburg
İçindekiler
1.
KullanımAmacı .....................................................................................6
2.
KitBileşenleri ........................................................................................6
3.
MuhafazaEtme ......................................................................................6
4.
GerekliOlanamaÜrünleTeslimEdilmeyenMalzemeler
Ve Cihazlar
SınırlamalarveÖnlemler ....................................................................32
13.
Kalite Kontrol
14.
TeknikYardım ......................................................................................33
15.
TicariMarkalarveRetBeyanları .......................................................33
16.
SembollerinAçıklaması ......................................................................34
......................................................................................33
.............................................................................................7
5.
TemelBilgiler .........................................................................................8
6.
ÜrünTanımı ......................................................................................... 11
7.
UyarılarveÖnlemler ...........................................................................13
8.
KullanmaTalimatı ...............................................................................14
8.1
Örnek Hazırlama
8.2
Master Mix Hazırlanışı
..........................................................................15
8.3
Reaksiyon Hazırlanışı
...........................................................................17
9.
GerçekZamanlıPCRAletleriniProgramlama ..................................18
9.1
Ayarlar
9.2
Floresan Detektörleri (Boyalar)
9.3
Sıcaklık Profili ve Boya Alma
...................................................................................14
...................................................................................................18
.............................................................18
................................................................19
10.
VeriAnalizi ...........................................................................................19
10.1
Diagnostik Test Çalışmalarının Geçerliliği
10.1.1 Geçerli Diagnostik Test Çalışması
10.1.2 Geçersiz Diagnostik Test Çalışması
............................................20
........................................................20
.....................................................20
10.2
Sonuçların Yorumlanması
11.
PerformansDeğerlendirmesi .............................................................22
11.1
Analitik Hassasiyet
11.2
Analitik Özgüllük
11.3
Kesinlik
4
12.
.....................................................................21
................................................................................22
...................................................................................25
..................................................................................................28
5
1.
KullanımAmacı
4.
erekliOlanamaÜrünleTeslimEdilmeyenMalzemeler
G
Ve Cihazlar
RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 Ebola ve Marburg virüsüne spesifik
RNA'nın kalitatif saptanması ve diferansiyasyonu için gerçek zamanlı PCR tekno-
•
Uygun real time (gerçek zamanlı) PCR aleti (Bölüm 6: Ürün Tanımı)
lojisi temelinde in vitro bir diagnostik testtir.
•
Uygun nükleik asit ekstraksiyon sistemi veya kiti
•
2 ml reaksiyon tüpleri için rotorlu masaüstü santrifüjü
•
96 kuyulu reaksiyon plakaları kullanılıyorsa mikrotitre plakaları için rotorlu
2.
KitBileşenleri
Kapak
Rengi
Mavi
Bileşen
Master A
Şişe Sayısı
Hacim
[µl/Şişe]
Mor
Master B
santrifüj
Yeşil
Kırmızı
Turuncu
Dahili
Pozitif Kontrol
Pozitif Kontrol
Kontrol
Hedefi Ebola
Hedefi Marburg
Beyaz
•
Vorteks karıştırıcı
•
Karşılık gelen (optik) kapatma materyalli 96 kuyulu uygun reaksiyon tüplüğü
PCR
derecesinde
Su
8
8
1
1
1
1
60
180
1000
250
250
500
veya reaksiyon tüpleri
•
Pipetler (ayarlanabilir)
•
Filtreli pipet uçları (tek kullanımlık)
•
Pudrasız eldivenler (tek kullanımlık)
NOT
3.
MuhafazaEtme
Lütfenaletlerinüreticinintalimatveönerilerinegörekurulduğundan,
kalibre ve kontrol edildiğinden ve bakımının yapıldığından emin
•
RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 kuru buzla sevk edilir. Kit bileşen-
olunuz.
lerinin donmuş bir şekilde teslim edilmesi gerekir. Kitler teslim alındığında, bir
veya birkaç bileşen donmuş durumda değilse veya tüpler sevkiyat sırasında
zarar görmüş ise, yardım için altona Diagnostics GmbH ile irtibat kurun.
•
Tüm bileşenler teslim alındıktan sonra (must-have) -25 °C ... -15 °C'de
saklanmalıdır.
•
Master reaktiflerin tekrarlı bir şekilde çözülüp dondurulmasından (iki kezden
fazla) kaçınılmalıdır. Bu durum analiz performansını etkileyebilir. Reaktifler
ara sıra kullanılacaklarsa bölüntüler halinde dondurulmalıdır.
6
•
+4°C'de saklama iki saatlik bir süreyi geçmemelidir.
•
Master A ve Master B ışıktan korunmalıdır.
7
5.
TemelBilgiler
reaksiyonunda Ebola ve Marburg virüsünü saptayıp sınıflandırabilmiştir. 2007
yılında Panning ve onun meslektaşları tarafından hazırlanan ve L genini hedef alan
Ebola ve Marburgvirüs, Filoviridae ailesi içinde yer alır. Marburgvirus türü Marburg
protokol L geni analizinin ne kadar duyarlı ve spesifik bir tahlil olduğunu göstermiştir.
marburgvirus (MARV) adlı tek bir tür içerir. Ebolavirus türü beş sınıfa ayrılır:
[10]. O zamandan beri bu tahlil filovirüse tanı koymak için dünya çapında birkaç
Bundibugyo ebolavirus (BEBOV), Reston ebolavirus (RESTV), Sudan ebolavirus
referans laboratuvarı tarafından kullanılmıştır. Yine de mevcut son sekans bilgiler
(SEBOV), Tai Forest ebolavirus (TAFV) ve Zaire ebolavirus (ZEBOV) [1].
ve yeni Ebola türlerinin (BEBOV) ortaya çıkması mevcut yöntemleri sürekli olarak
kontrol edip güncelleme gereğini ortaya koymuştur. 2007 L geni analizinin bazı zayıf
Güneydoğu Asya'da endemik RESTV hariç tüm bilinen Ebola ve Marburg virüs türleri
yönleri vardır ve bu nedenle altona Diagnostics GmbH tarafından filovirüslerin L
Afrika'da yaygındır. Filovirüslerin doğal kaynakları meyve yarasalarıdır [2] [3].
geni temelinde yeni bir analiz geliştirilmiştir.
İnsanlara geçtikten sonra filovirüsler %20-90 şeklinde yüksek mortalite oranına sahip
şiddetli bir hemorajik ateşe neden olabilir (tekli vakalarda türe ve bakterinin kaynağına
Viral polimerazı kodlayan filovirüs L geni yüksek ölçüde korunmuş sekans unsurları
bağlı olarak) [4]. Bulaşma şeklini belirlemek genellikle zordur. Enfekte vahşi hayvanları
içerir. Enzimatik olarak aktif yerleri kodlayan bölgelerdeki mutasyonlar genellikle
avlama, kesme ve tüketme virüsün insan popülasyonuna girmesinin olası
işlev kaybıyla sonuçlanır. Bu mutantlar, viral tür benzerleri arasından kaybolur ve
yollarındandır. Yarasalarla doğrudan temasın da olası bir enfeksiyon yolu olduğu
RT-PCR tabanlı analizin özgüllüğü üzerine negatif bir etki yapmazlar. Bu nedenle
gösterilmiştir [5]. Birçok memeli türü filovirüs enfeksiyonlarına duyarlıdır. Özellikle
RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 için hedef sekans olarak L genini
şempanzeler ve goriller Ebolavirus epidemilerinden önemli ölçüde etkilenen kategoriye
kullanmaya karar verdik. Diagnostik RT-PCR'larda RNA virüslerinin L genini seçme
aittirler. Sonuç olarak bu büyük maymun popülasyonlarında belirgin bir azalma
işlemi geçmişte Lassa virüsü, filovirüsler ve diğer RNA virüsleri için de başarıyla
olmuştur [6].
sonuçlanmışır [10–12].
Semptomlar hastalık başlangıcında pek belirgin değildir ve genellikle halsizlik, ateş
ve vücudun çeşitli kısımlarında ağrı şeklinde ortaya çıkar. [7]. Salgın başlangıcında
RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 bir birinci basamak diagnostik test olarak
hastalık genellikle Afrikanın güney Sahra bölgesinde sık görülen Malarya, Tifo veya
önerilir. Bu test ilgili filovirüs türlerini saptamak üzere tasarlanmıştır. altona Diagnostics
diğer ateşli hastalıklarla karıştırılır.
GmbH ikinci basamak bir analiz de sunmaktadır. RealStar® Filovirus Type RT-PCR
Kit 1.0 virüs genomundaki diğer sekansları hedefler ve böylece doğrulayıcı bir
Akut hastalık sırasında enfeksiyöz virüs titresi ve RNA titresi genellikle yüksektir ve viremi
diagnostik sonuç oluşturma olasılığını sunar. RealStar® Filovirus Type RT-PCR Kit 1.0
seviyesi hastalığın sonucuyla negatif korelasyon gösterir [8]. Kanama ve diğer kan
ayrıca tüm ilgili filovirüslerin türlerine kadar ayırt edilmesini mümkün kılar.
kaybetme türleri de Ebola ve Marburg ateşinde ölümcül sonuç göstergelerindendir [7].
Laboratuvar yoluyla tanı koyma tercihen plazma, serum ve hatta tüm kan örneklerinde
Filovirüs enfeksiyonlarından şüphelenilmesi ve bunların doğrulanmasının toplum
RT-PCR kullanımı yoluyla yapılır. Serolojik testler destekleyici diagnostik araçlar
sağlığı ve vaka yönetimi üzerine büyük etkisi vardır. Tüm vakaların kamu sağlığı ve
olarak faydalıdır ama hastalığın primer tanısı için faydalı değildir. Hatta birçok
biyogüvenlikten sorumlu ilgili makamlara hemen bildirilmesi gerekir (Almanya
hastada (özellikle ölümle sonuçlananlarda) hastalık sırasında saptanabilir antikor
içinde: Robert Koch Institut, Berlin; ve yerel “Landesgesundheitsämter -Ülke Sağlık
titresinin hiç oluşmadığı saptanmıştır. [9].
Merkezlerine-”). Diagnostik işlem (örn. önerilen ayırıcı tanı, olası A ve B örneği
kullanımı) uzman referans kurumlarıyla tartışılmalıdır.
Filovirüs tespiti için birçok gerçek zamanlı RT-PCR protokolü yayımlanmıştır, ama
bunların hiçbirisi ne bir dahili amplifikasyon kontrolü içermiş ne de bir RT-PCR
8
9
[1]
Carroll SA, Towner JS, Sealy TK, McMullan LK, Khristova ML, Burt FJ, et al.
[12]
Vieth S, Drosten C, Lenz O, Vincent M, Omilabu S, Hass M, et al. RT-PCR assay
Molecular Evolution of Viruses of the Family Filoviridae Based on 97 Whole-Genome
for detection of Lassa virus and related Old World arenaviruses targeting the L gene. Trans
Sequences. J Virol 2013;87:2608–16.
R Soc Trop Med Hyg 2007;101:1253–64.
[2]
NOT
Towner JS, Amman BR, Sealy TK, Carroll SAR, Comer JA, Kemp A, et al. Isolation
of Genetically Diverse Marburg Viruses from Egyptian Fruit Bats. PLoS Pathog
Filovirüslerinmolekülerevriminedeniylezamaniçindemutasyon-
2009;5:e1000536.
[3]
ların birikiminin herhangi bir PCR temelli test sisteminde yalancı
Leroy EM, Epelboin A, Mondonge V, Pourrut X, Gonzalez J-P, Muyembe-Tamfum
negatif sonuçlara neden olması şeklinde bir risk, sistemin doğası
J-J, et al. Human Ebola Outbreak Resulting from Direct Exposure to Fruit Bats in Luebo,
gereğimevcuttur.
Democratic Republic of Congo, 2007. Vector-Borne Zoonotic Dis 2009;9:723–8.
[4]
Kortepeter MG, Bausch DG, Bray M. Basic Clinical and Laboratory Features of
Filoviral Hemorrhagic Fever. J Infect Dis 2011;204:S810–S816.
[5]
Van Paassen J, Bauer MP, Arbous MS, Visser LG, Schmidt-Chanasit J, Schilling
6.
ÜrünTanımı
S, et al. Acute liver failure, multiorgan failure, cerebral oedema, and activation of proangiogenic and antiangiogenic factors in a case of Marburg haemorrhagic fever. Lancet Infect Dis
RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0, filovirüse spesifik RNA'nın kalitatif
2012;12:635–42.
olarak saptanması için gerçek zamanlı PCR teknolojisini temel alan bir in vitro
[6]
diagnostik test sistemidir.
Leroy EM, Rouquet P, Formenty P, Souquière S, Kilbourne A, Froment J-M, et al.
Multiple Ebola virus transmission events and rapid decline of central African wildlife. Science
Analiz, ilgili insan patojenleri olan tüm filovirüs türleri ve Restonvirüsü saptamak
2004;303:387–90.
üzere tasarlanmıştır. Reaktif sistemi, olası RT-PCR inhibisyonunu tanımlamak ve
[7]
reaktifler veya kitin bütünlüğünü doğrulamak üzere bir heterolog amplifikasyon
Roddy P, Howard N, Van Kerkhove MD, Lutwama J, Wamala J, Yoti Z, et al. Clinical
Manifestations and Case Management of Ebola Haemorrhagic Fever Caused by a Newly
sistemi (Dahili Kontrol) içerir.
Identified Virus Strain, Bundibugyo, Uganda, 2007–2008. PLoS ONE 2012;7:e52986.
Towner JS, Rollin PE, Bausch DG, Sanchez A, Crary SM, Vincent M, et al. Rapid
Test, gerçek zamanlı RT-PCR teknolojisini temel alır ve RNA'yı tamamlayıcı DNA'ya
Diagnosis of Ebola Hemorrhagic Fever by Reverse Transcription-PCR in an Outbreak Setting
(cDNA) dönüştürmek için revers transkriptaz (RT) reaksiyonu, spesifik hedef
and Assessment of Patient Viral Load as a Predictor of Outcome. J Virol 2004;78:4330–41.
sekansların amplifikasyonu için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve amplifiye
[9]
edilmiş DNA'nın saptanması için hedefe spesifik problar kullanır. Problar, floresan
[8]
Gupta M, MacNeil A, Reed ZD, Rollin PE, Spiropoulou CF. Serology and cytokine
profiles in patients infected with the newly discovered Bundibugyo ebolavirus. Virology
raportör ve söndürücü boyalarla etiketlenmiştir.
2012;423:119–24.
Ebolavirus RNA için spesifik problar FAM floroforu ile etiketlenmiştir. Marburgvirus
[10]
RNA için spesifik problar Cy5 ile aynı özelliklere sahip bir floroforla etiketlenmiştir.
Panning M, Laue T, Ölschlager S, Eickmann M, Becker S, Raith S, et al.
Diagnostic Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction Kit for Filoviruses Based on
Dahili Kontrol (IC) hedefi için spesifik prob, JOE floroforu ile etiketlenmiştir. Ayırt
the Strain Collections of all European Biosafety Level 4 Laboratories.
edilebilir boyalarla bağlantılı problar kullanılması gerçek zamanlı PCR aletinin
J Infect Dis 2007;196:S199–S204.
karşılık gelen detektör kanallarında Ebola ve Marburg virüsüne spesifik RNA'sının
[11]
ve ayrıca Dahili Kontrolün paralel olarak saptanması ve ayırt edilmesini mümkün
Blasdell KR, Adams MM, Davis SS, Walsh SJ, Aziz-Boaron O, Klement E, et al. A
reverse-transcription PCR method for detecting all known ephemeroviruses in clinical samp-
kılar.
les. J Virol Methods 2013;191:128–35.
10
11
RNA virüslerinin nispeten hızlı moleküler evrimi nedeniyle zaman içinde
Master A ve Master B reaktifleri tek bir reaksiyon kurulumunda revers transkripsi-
mutasyonların birikiminin herhangi bir RT-PCR temelli test sisteminde yalancı
yonu, PCR aracılıklı amplifikasyonu ve hedef saptamayı (Filovirüse spesifik RNA
negatif sonuçlara neden olması şeklinde bir risk, sistemin doğası gereği mevcuttur.
ve Dahili Kontrol) mümkün kılacak tüm bileşenleri (tampon, enzimler, primerler ve
Analiz tasarımı Aralık 2013'te Genebank'te yayımlanmış sekans bilgisini temel alır.
problar) içerir.
Henüz bilinmeyen yeni suşlar ve türlerin oluşması bir primer/prob seti güncellemesini
7.
UyarılarveÖnlemler
gerekli kılabilir.
•
•
Numunelere daima enfeksiyöz ve/veya biyolojik olarak tehlikeliymiş gibi ve
güvenli laboratuvar işlemleriyle uyumlu şekilde muamele edilmelidir.
•
Numunelerin muamelesi sırasında koruyucu tek kullanımlık pudrasız
eldivenler, laboratuvar önlüğü ve göz koruması kullanın.
•
Numune ve kit bileşenlerinin mikrobiyal ve nükleaz (DNase/RNase)
kontaminasyonundan kaçının.
•
Daima aerosol bariyerli, DNase/RNase içermeyen tek kullanımlık pipet uçları
kullanın.
•
Kit bileşenlerinin kullanımı sırasında daima koruyucu tek kullanımlık pudrasız
eldivenler kullanın.
•
Şu işlemler için ayrılmış ve bölünmüş çalışma alanları kullanın: (i) numune
hazırlama, (ii) reaksiyon kurulumu ve (iii) amplifikasyon/saptama aktiviteleri.
Laboratuvarda iş akışı tek yönlü olarak ilerlemelidir. Daima her bölgede tek
kullanımlık eldivenler kullanın ve farklı bölgelere girmeden bunları değiştirin.
•
Ayrı çalışma alanlarına ayrı malzeme ve ekipman tahsis edin ve bunları bir
alandan ötekine taşımayın.
•
Pozitif olan ve/veya olabilecek materyali kitin tüm diğer bileşenlerinden ayrı
olarak saklayın.
•
Amplikonlarla kontaminasyondan kaçınmak için amplifikasyondan sonra
reaksiyon tüplerini/plakaları açmayın.
•
Pozitif Kontrol Hedefi Ebola
Yerel, bölgesel ve/veya ulusal düzenlemeler veya akreditasyon
organizasyonlarının kılavuz ilkeleri veya gerekliliklerine göre ek kontroller test
edilebilir.
•
Kitin son kullanma tarihi geçmiş bileşenlerini kullanmayın.
Pozitif Kontrol Hedefi Marburg
•
Örnek ve test atığını yerel güvenlik düzenlemelerinize uygun olarak atın.
•
Hedef RNA'nın cDNA'ya revers transkripsiyonu
•
Hedef cDNA ve Dahili Kontrolün PCR amplifikasyonu
•
PCR amplikonlarının floresan boya etiketli problarla eş zamanlı saptanması
RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 şu gerçek zamanlı PCR aletleriyle
kullanılmak üzere geliştirilmiş ve doğrulanmıştır:
•
Mx 3005P™ QPCR System (Stratagene)
•
VERSANT® kPCR Molecular System AD (Siemens)
•
ABI Prism® 7500 SDS and 7500 Fast SDS (Applied Biosystems)
•
LightCycler® 480 Instrument II (Roche)
•
Rotor-Gene® 3000/6000 (Corbett Research)
•
Rotor-Gene® Q 5/6 plex Platform (QIAGEN)
•
CFX96™ system/Dx real-time system (BIO-RAD)
RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 şunlardan oluşur:
•
İki Ana reaktif (Master A ve Master B)
•
Şablon Dahili Kontrol (IC)
•
İki Pozitif Kontrol:
•
12
Bu ürünün kullanımı gerçek zamanlı PCR ve in vitro diagnostik işlemlerin
teknikleri konusunda özel talimat almış ve eğitilmiş personelle sınırlıdır.
Test, tek bir tüp analizinde üç süreçten oluşur:
PCR sınıfı su
13
8.
KullanmaTalimatı
Ön muamele ve örnek hazırlama açısından ek bilgi ve teknik destek için Teknik
Destek kısmımızla irtibat kurun:
8.1
ÖrnekHazırlama
RealStar Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 için başlangıç materyali ekstraksiyon
®
e-posta:
[email protected]
telefon:
+49-(0)40-5480676-0
yapılmış RNA'dır. Ekstraksiyon yapılmış RNA'nın kalitesinin tüm test sisteminin performansı üzerine çok önemli bir etkisi vardır. Nükleik asit ekstraksiyonu için kullanılan sistemin gerçek zamanlı PCR teknolojisiyle uyumlu olduğundan emin olmak
8.2
MasterMixHazırlanışı
gerekir.
Tüm reaktifler ve örnekler kullanımdan önce tamamen çözülmeli, karıştırılmalı
Şu nükleik asit ekstraksiyon kiti önerilir:
•
QIAamp® Viral RNA Mini Kit (QIAGEN)
Etanol içeren yıkama tamponları içeren bir spin kolon temelli örnek hazırlama işlemi
(pipetleme veya hafif vorteksleme ile) ve kısa süre santrifüje konmalıdır.
RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0, bir RT-PCR inhibisyonu kontrolü ya da
örnek hazırlama işlemi (nükleik asit ekstraksiyonu) kontrolü ve RT-PCR inhibisyonu
kontrolü olarak kullanılabilecek bir heterolog Dahili Kontrol (IC) içerir.
kullanıyorsanız nükleik asit elüsyonu öncesinde yeni bir toplama tüpü kullanılarak
yaklaşık 17000 x g (~ 13000 devir/dk) hızında 10 dakika boyunca ek bir santrifügasyon adımı kuvvetle önerilir.
•
Eğer IC bir RT-PCR inhibisyonu kontrolü olarak kullanılır ama örnek hazırlama
işlemi için bir kontrol olarak kullanılmazsa, Master Mix şu pipetleme şemasına
göre oluşturulur:
NOT
1
12
Master A
5 µl
60 µl
Master B
15 µl
180 µl
1 µl
12 µl
21 µl
252 µl
ReaksiyonSayısı(rxns)
Ekstraksiyonunverimliliğiveekstraksiyonuyapılannükleikasidin
stabilitesiaçısındantaşıyıcıRNAkullanılmasıelzemdir.
EtanolgerçekzamanlıPCR'dagüçlübirinhibitördür.Örnekhazırlamasisteminizetanoliçerenyıkamatamponlarıkullanıyorsa,nükleik
Dahili Kontrol
asit elüsyonundan önce tüm etanol izlerini giderdiğinizden emin
MasterMixHacmi
olmanızgerekir.
14
15
•
Eğer IC örnek hazırlama işlemi için bir kontrol ve bir RT-PCR inhibisyonu
8.3
ReaksiyonHazırlanışı
kontrolü olarak kullanılıyorsa IC'nin nükleik asit ekstraksiyonu işlemi sırasında
•
eklenmesi gerekir.
Uygun bir optik 96 kuyulu reaksiyon plakası veya uygun optik reaksiyon
tüpünün gerekli her kuyusuna 20 μl Master Mix pipetleyin.
•
Nükleik asit ekstraksiyonu için hangi yöntem/sistem kullanılırsa kullanılsın, IC
•
Örnekten 10 μl (nükleik asit ekstraksiyonundan elüt) veya kontrollerden 10 μl
(Pozitif veya Negatif Kontrol) ekleyin.
•
Her çalışma için Pozitif Kontrollerin her birinden birer adet ve en az bir Negatif
Kontrol kullanıldığından emin olun.
•
Örnekleri ve kontrolleri yukarı aşağı pipetleme yoluyla Master Mix ile iyice
karıştırın.
•
96 kuyuluk reaksiyon plakasını uygun bir optik yapışkan filmle kapatın ve
reaksiyon tüplerini uygun kapaklarla kapatın.
•
96 kuyuluk reaksiyon plakasını bir mikrotitre plakası rotorunda 30 saniye
boyunca yaklaşık 1000 x g (~ 3000 devir/dk) hızında santrifüje edin.
numuneye doğrudan eklenmemelidir. IC daima numune/izis tamponu
karışımına eklenmelidir. Eklenmesi gereken IC hacmi daima ve sadece
elüsyon hacmine bağlıdır. Elüsyon hacminin %10'unu temsil eder. Örneğin
nükleik asit elüsyonu 60 µl elüsyon tamponu veya suda yapılacaksa numune/
lizis tamponu karışımına örnek başına 6 µl IC eklenmelidir.
NOT
Dahilikontrolüasladoğrudannumuneyeeklemeyin!
•
Eğer IC örnek hazırlama işlemi sırasında eklenmişse Master Mix şu pipetleme
şemasına göre hazırlanır:
1
12
Master A
5 µl
60 µl
Master B
15 µl
180 µl
MasterMixHacmi
20 µl
240 µl
ReaksiyonSayısı(rxns)
16
ReaksiyonKurulumu
Master Mix
20 µl
Örnek veya Kontrol
10 µl
ToplamHacim
30 µl
17
9.
GerçekZamanlıPCRAletleriniProgramlama
9.3
Farklı gerçek zamanlı PCR aletlerinin kurulumu ve programlanması hakkında temel
•
SıcaklıkProfiliveBoyaAlma
Sıcaklık profili ve boya alınmasını tanımlayın:
bilgi için lütfen ilgili aletin kılavuzuna başvurun.
RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 ürününün belirli gerçek zamanlı PCR
Evre
DöngüTekrarı
Alma
Sıcaklık
Zaman
Revers
Transkripsiyon
Tutma
1
-
55 °C
20:00 dk
Denatürasyon
Tutma
1
-
95 °C
02:00 dk
-
95 °C
00:15 dk
√
58 °C
00:45 dk
-
72 °C
00:15 dk
aletlerinde kullanımıyla ilgili ayrıntılı programlama talimatı için lütfen Teknik Destek
kısmımızla irtibat kurun.
9.1
•
Ayarlar
Şu ayarları tanımlayın:
Amplifikasyon
Döngüleme
Ayarlar
Reaksiyon Hacmi
45
30 µl
Rampa Hızı
Varsayılan
Pasif Referans
10.
Yok
VeriAnalizi
Belirli gerçek zamanlı PCR aletlerinde veri analizi hakkında temel bilgi için lütfen
ilgili aletin kılavuzuna başvurun.
RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 ürününün farklı gerçek zamanlı PCR
9.2
FloresanDetektörleri(Boyalar)
aletlerinde kullanımıyla ilgili ayrıntılı programlama talimatı için lütfen Teknik Destek
kısmımızla irtibat kurun.
•
Floresan detektörleri (boyalar) tanımlayın:
Saptama
Ebolavirüse spesifik RNA
Marburg virüsüne spesifik RNA
Dahili Kontrol
18
DetektörAdı
Reporter
Quencher
Ebolavirüs
FAM
(Yok)
Marburg virüsü
Cy5
(Yok)
IC
JOE
(Yok)
19
10.1
DiagnostikTestÇalışmalarınınGeçerliliği
10.2
10.1.1 GeçerliDiagnostikTestÇalışması
Geçerlibir diagnostik test çalışması için şu kontrol koşulları karşılanmalıdır:
KontrolKimliği
FAM Saptama
Kanalı
Cy5 Saptama
Kanalı
JOE Saptama
Kanalı
Pozitif Kontrol
Ebolavirüs
POZİTİF
NEGATİF
POZİTİF
Pozitif Kontrol
Marburg virüsü
NEGATİF
POZİTİF
POZİTİF
Negatif Kontrol
NEGATİF
NEGATİF
POZİTİF
10.1.2 GeçersizDiagnostikTestÇalışması
Bir diagnostik test çalışması şu durumlarda geçersizdir: (i) çalışma tamamlanma-
SonuçlarınYorumlanması
Örnek
Kimliği
FAM
Saptama
Kanalı
Cy5
Saptama
Kanalı
JOE
Saptama
Kanalı
A
POZİTİF
NEGATİF
POZİTİF*
Ebolavirüse spesifik RNA
saptandı.
B
NEGATİF
POZİTİF
POZİTİF*
Marburg virüsüne spesifik RNA
saptandı.
POZİTİF
Ebola veya Marburg virüsüne
spesifik RNA saptanmadı.
Örnek, Ebola veya Marburg virüsüne spesifik RNA'yı saptanabilir
miktarlarda içermiyor.
NEGATİF
PCR inhibisyonu veya reaktif
hatası.
Testi orijinal örnekten tekrarlayın
veya yeni bir örnek toplayın ve
test edin.
C
D
NEGATİF
NEGATİF
NEGATİF
NEGATİF
Sonuçların
Yorumlanması
dıysa veya (ii) geçerlibir diagnostik test çalışması için kontrol koşullarından herhangi biri karşılanmadıysa.
* JOE saptama kanalında Dahili Kontrolün saptanması, FAM saptama kanalı veya Cy5 saptama kanalında pozitif sonuçlar için gerekli değildir. Örnekte yüksek filovirüs yükü azalmış
Geçersizbirdiagnostik test çalışması durumunda testi kalan saflaştırılmış nükleik
veya bulunmayan Dahili Kontrol sinyallerine neden olabilir.
asitleri kullanarak tekrarlayın veya orijinal örneklerle tekrar başlayın.
20
21
11.
PerformansDeğerlendirmesi
Tablo 2: ZEBOV spesifik RNA analitik hassasiyetini hesaplamak için kullanılan RT-PCR
sonuçları, RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0
11.1
ZEBOVGabon2003
AnalitikHassasiyet
GirişKons.
[kopya/µl]
Replikat
Sayısı
PozitifSayısı
Belirlenme
Oranı[%]
Dahili
Kontrol
31,6
12
12
100
Geçerli
10
12
12
100
Geçerli
3,16
12
12
100
Geçerli
1,0
12
11
91,7
Geçerli
MARV Popp, ZEBOV Gabon 2003 ve SEBOV Gulu için %95 LoD (saptama limiti)
0,316
12
7
58,3
Geçerli
hesaplanması için oluşturulan veriler sırasıyla aşağıda Tablo 1, 2 ve 3'te
0,1
12
4
33,3
Geçerli
0,03
12
1
8,3
Geçerli
0,01
12
0
0
Geçerli
NTC
12
0
0
Geçerli
RealStar Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 analitik hassasiyeti, ≥ %95 pozitiflik
®
oranıyla saptanabilen Ebola veya Marburg virüsüne spesifik RNA molekülleri konsantrasyonu (μl elüt başına kopya) olarak tanımlanır. Analitik hassasiyet, bilinen
konsantrasyonda MARV Popp, SEBOV Gulu ve ZEBOV Gabon 2003 için spesifik
in vitro transkriptlerin (İVT) dilüsyon serilerinin analiziyle belirlenmiştir.
özetlenmiştir.
Tablo 1: MARV spesifik RNA analitik hassasiyetini hesaplamak için kullanılan RT-PCR
MARVPopp
22
GirişKons.
[kopya/µl]
Replikat
Sayısı
PozitifSayısı
Belirlenme
Oranı[%]
Dahili
Kontrol
31,6
12
12
100
Geçerli
10
12
12
100
Geçerli
3,16
12
12
100
Geçerli
1,0
12
12
100
Geçerli
0,316
12
8
66,7
Geçerli
0,1
12
2
16,7
Geçerli
0,03
12
0
0
Geçerli
0,01
12
1
8,3
Geçerli
NTC
12
0
0
Geçerli
23
Tablo 3: SEBOV spesifik RNA analitik hassasiyeti hesaplamak için kullanılan RT-PCR
11.2
AnalitikÖzgüllük
RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kitinin analitik özgüllüğü oligonükleotidlerin
SEBOVGulu
(primerler ve problar) kapsamlı bir şekilde seçilmesiyle sağlanır. Oligonükleotidler
tüm bilinen Ebola ve Marburg virüsü varyantlarının saptanacağından emin olmak
GirişKons.
[kopya/µl]
Replikat
Sayısı
PozitifSayısı
Belirlenme
Oranı[%]
Dahili
Kontrol
31,6
12
12
100
Geçerli
10
12
12
100
Geçerli
RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 analitik özgüllüğü Marburg virüsü ve
3,16
12
7
58,3
Geçerli
Ebola virüsü ile ilişkili ve/veya benzer belirtilere yol açabilecek farklı patojenlerden
1,0
12
1
8,3
Geçerli
ekstraksiyonla
0,316
12
0
0
Geçerli
0,1
12
0
0
Geçerli
0,03
12
0
0
Geçerli
0,01
12
0
0
Geçerli
NTC
12
0
0
Geçerli
için sekans karşılaştırma analizi kullanılarak halka açık mevcut sekanslarla kontrol
edilmiştir.
alınmış
bir
genomik
RNA/DNA panelinin
test
edilmesiyle
değerlendirilmiştir.
RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 analitik hassasiyeti Probit analiziyle
belirlenmiştir.
MARV'a özgül RNA için:
1,16 kopya/μl
[%95 güven aralığı:
0,22-11,67 kopya/μl]
ZEBOV'a özgül RNA için: 1,39 kopya/μl
0,69-5,32 kopya/µl]
SEBOV'a özgül RNA için: 6,75 kopya/μl
4,25-24,58 kopya/µl]
.
24
25
Tablo 4: RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 analitik özgüllüğünü göstermek üzere test
Tablo 4 devam: RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 analitik özgüllüğünü göstermek
edilen organizmalar
üzere test edilen organizmalar
RealStar Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0
®
FAM
(Hedef Ebola)
Cy5
(Hedef Marburg)
JOE
(IC)
Organizmalar
FAM
(Hedef Ebola)
Cy5
(Hedef Marburg)
JOE
(IC)
Japon ensefalit virüsü
Negatif
Negatif
Geçerli
Junin virüsü XJ
Negatif
Negatif
Geçerli
Saint Louis ensefalit virüsü
Negatif
Negatif
Geçerli
Machupo virüsü Carvallo
Negatif
Negatif
Geçerli
Batı Nil virüsü, NY99
Negatif
Negatif
Geçerli
Sabia virüsü SPH114202
Negatif
Negatif
Geçerli
Batı Nil virüsü, Uganda
Negatif
Negatif
Geçerli
Guanarito Virüsü INH-95551
Negatif
Negatif
Geçerli
Sarı Humma virüsü
Negatif
Negatif
Geçerli
VSV Indiana
Negatif
Negatif
Geçerli
Murray Vadisi ensefaliti virüsü
Negatif
Negatif
Geçerli
Rift Vadisi ateşi virüsü MP 12
Negatif
Negatif
Geçerli
Negatif
Negatif
Geçerli
Organizmalar
26
Zika virüsü
Negatif
Negatif
Geçerli
Hantaan virüsü 76-118
Kene ile taşınan ensefalit virüsü
Negatif
Negatif
Geçerli
ZEBOV Gabon 2003
Pozitif
Negatif
Geçerli
Usutu virüsü
Negatif
Negatif
Geçerli
ZEBOV Mayinga
Pozitif
Negatif
Geçerli
Dang virüsü 1
Negatif
Negatif
Geçerli
ZEBOV 2014/Gueckedou-C05
Pozitif
Negatif
Geçerli
Dang virüsü 2
Negatif
Negatif
Geçerli
SEBOV Gulu
Pozitif
Negatif
Geçerli
Dang virüsü 3
Negatif
Negatif
Geçerli
TAFV
Pozitif
Negatif
Geçerli
Dang virüsü 4
Negatif
Negatif
Geçerli
RESTV
Pozitif
Negatif
Geçerli
Hepatit C virüsü
Negatif
Negatif
Geçerli
MARV Musoke
Negatif
Pozitif
Geçerli
Batı Nil virüsü NY99 D
Negatif
Negatif
Geçerli
MARV Popp
Negatif
Pozitif
Geçerli
Hepatit A virüsü
Negatif
Negatif
Geçerli
MARV Leiden
Negatif
Pozitif
Geçerli
Hepatit E virüsü
Negatif
Negatif
Geçerli
CCHFV Afg09-2990
Negatif
Negatif
Geçerli
Lassa virüsü Nig08-A37
Negatif
Negatif
Geçerli
Lassa virüsü CSF
Negatif
Negatif
Geçerli
Lassa virüsü Lib05-1580/121
Negatif
Negatif
Geçerli
Lassa virüsü AV
Negatif
Negatif
Geçerli
RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 belirtilen organizmalardan hiçbiriyle
reaksiyona girmemiştir.
27
11.3
Kesinlik
Tablo 6: RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 MARV RNA spesifik saptama sisteminin
kesinlik verileri
RealStar Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 kesinlik verileri, analiz içi değişkenlik (bir
®
deney içinde değişkenlik), analizler arası değişkenlik (farklı deneyler arasında
değişkenlik) ve lotlar arasında değişkenlik (farklı üretim lotları arasında değişkenlik)
Kesinlik
şeklinde belirlenmiştir.
Değişkenlik verileri ortalama değer, standart sapma, varyans ve varyasyon katsayısı
olarak eşik döngüsü (Ct) değerleri temelinde ifade edilmiştir. Örnek başına en az atı
replikat, analiz içi değişkenlik, analizler arası değişkenlik ve lotlar arası değişkenlik
Analiz İçi
Değişkenlik
için analiz edilmiştir. Toplam varyans üç analiz kombine edilerek hesaplanmıştır.
Tablo 5: RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 ZEBOV RNA spesifik saptama sisteminin
kesinlik verileri
Kesinlik
Analiz İçi
Değişkenlik
Analizler
Arası
Değişkenlik
Örnek
konsantrasyonu
[kopya/μl]
Ortalama
Ctdeğerleri
Standart
Sapma
Varyans
30
31,56
0,17
0,03
0,54
10
32,80
0,12
0,01
0,36
30
31,85
0,32
0,10
1,02
10
33,07
0,34
0,12
1,04
Varyasyon
Katsayısı
(%)
Analizler
Arası
Değişkenlik
Lotlar Arası
Değişkenlik
Toplam
Varyans
Örnek
konsantrasyonu
[kopya/μl]
Ortalama
Ctdeğerleri
Standart
Sapma
Varyans
30
30,71
0,27
0,07
0,88
10
31,82
0,25
0,06
0,80
30
30,86
0,24
0,06
0,79
10
32,06
0,32
0,10
0,99
30
30,83
0,21
0,05
0,69
10
32,03
0,30
0,09
0,93
30
30,79
0,23
0,05
0,75
10
31,96
0,29
0,09
0,92
Varyasyon
Katsayısı
(%)
Dahili kontrol saptama sistemi için oluşturulan kesinlik verileri sırasıyla 30 ve 10 viral
Lotlar Arası
Değişkenlik
Toplam
Varyans
28
30
31,76
0,40
0,16
1,26
10
33,03
0,44
0,20
1,35
30
31,70
0,35
0,12
1,10
10
32,95
0,38
0,15
1,16
hedef kopya içeren örnekler için tablo 7 ve 8'de özetlenmiştir.
29
Tablo 7: RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 IC saptama sistemi için oluşturulan
Tablo 8: RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 IC saptama sistemi için oluşturulan
kesinlik verileri 30 hedef kopya/μl içeren örnekler için sırasıyla ZEBOV ve MARV ile
kesinlik verileri 10 hedef kopya/μl içeren örnekler için sırasıyla ZEBOV ve MARV ile
belirlenmiştir
belirlenmiştir
Kesinlik
Analiz İçi
Değişkenlik
Analizler
Arası
Değişkenlik
Lotlar Arası
Değişkenlik
Toplam
Varyans
30
Varyasyon
Katsayısı
(%)
30kopya/μl
Ortalama
Ctdeğerleri
Standart
Sapma
Varyans
ZEBOV
28,98
0,05
0,00
0,19
MARV
28,90
0,09
0,01
0,32
ZEBOV
29,32
0,36
0,13
1,23
MARV
29,26
0,39
0,15
1,32
ZEBOV
29,26
0,43
0,19
1,48
MARV
29,22
0,43
0,18
1,47
ZEBOV
29,16
0,37
0,14
1,29
MARV
29,11
0,38
0,15
1,31
Kesinlik
Analiz İçi
Değişkenlik
Analizler
Arası
Değişkenlik
Lotlar Arası
Değişkenlik
Toplam
Varyans
Varyasyon
Katsayısı
(%)
10kopya/μl
Ortalama
Ctdeğerleri
Standart
Sapma
Varyans
ZEBOV
29,09
0,05
0,00
0,17
MARV
29,02
0,07
0,01
0,26
ZEBOV
29,41
0,34
0,12
1,16
MARV
29,34
0,34
0,12
1,17
ZEBOV
29,32
0,43
0,19
1,48
MARV
29,28
0,41
0,17
1,40
ZEBOV
29,24
0,37
0,14
1,26
MARV
29,19
0,35
0,13
1,21
31
12.
•
SınırlamalarveÖnlemler
13.
Kalite Kontrol
Bu ürünün kullanımı gerçek zamanlı PCR ve in vitro diagnostik işlemlerin
altona Diagnostics GmbH ISO EN 13485 sertifikalı Kalite Yönetimi Sistemi uyarınca
teknikleri konusunda özel talimat almış ve eğitilmiş personelle sınırlıdır.
her RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 lotu tutarlı ürün kalitesini garanti
•
Bu analizin uygun şekilde yapılması için iyi laboratuvar uygulamaları şarttır.
Kit ve reaksiyon adımlarının bileşenlerinin saflığını korumak için çok dikkatli
olunmalıdır. Tüm reaktifler safsızlık ve kontaminasyon açısından yakından
izlenmelidir. Herhangi bir şüpheli reaktif atılmalıdır.
etmek üzere önceden belirlenmiş spesifikasyonlara göre test edilir.
•
Testin optimum performansı için uygun numune toplama, taşıma, saklama ve
işleme işlemleri gereklidir.
•
Test doğrudan numune üzerinde kullanılmamalıdır. Bu analizin kullanılmasından
önce uygun nükleik asit ekstraksiyon yöntemlerinin kullanılması gerekir.
Müşteri Desteği için lütfen Teknik Destek kısmımızla irtibat kurun:
•
RT-PCR inhibitörlerinin varlığı yalancı negatif veya geçersiz sonuçlara neden
olabilir.
•
Testin primer ve/veya problarının kapsadığı virüs genomu hedef bölgelerinde
olası mutasyonlar patojenlerin varlığının saptanamamasıyla sonuçlanabilir.
•
Her diagnostik testle olduğu gibi RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0
sonuçları tüm klinik ve laboratuvar bulguları dikkate alınarak yorumlanmalıdır.
14.
15.
TeknikYardım
e-posta:
[email protected]
telefon:
+49-(0)40-5480676-0
TicariMarkalarveRetBeyanları
RealStar® (altona Diagnostics GmbH); Mx 3005P™ (Stratagene); ABI Prism®
(Applied Biosystems); LightCycler® (Roche); Rotor-Gene®, QIAamp® (QIAGEN);
VERSANT® (Siemens); CFX96™ (BIO-RAD).
Bu belgede kullanılan tescilli isimler, ticari markalar vs. bu şekilde işaretlenmemiş
olsalar bile kanunen koruma altında olmadıkları düşünülmez.
RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0, Avrupa in vitro diagnostik direktifi 98/79/EC
uyarınca bir CE işaretli diagnostik kittir.
Tüm ülkelerde sağlanmamaktadır.
© 2014 altona Diagnostics GmbH; tüm hakları saklıdır.
32
33
16.
SembollerinAçıklaması
Notlar
In vitro diagnostik tıbbi cihaz
Ürün numarası
Lot kodu
İçindekiler “n” test/reaksiyon için yeterlidir (rxns)
Sıcaklık sınırlaması
Versiyon
Son kullanma tarihi
Dikkat
Kullanma talimatına başvurun
Üretici
34
35
36
37

RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0

Transkript

Benzer belgeler

Alerji, nefes darlığı, dermatolojik hastalıklar, mikrobik enfeksiyonlar