İrem Akar Soycan

AKIM SİTOMETRİ
PRENSİPLERİ
İrem Akar Soycan (Becton Dickinson)
Flow sitometri;
Belli bir hızda akan hücreleri eş
zamanlı olarak farklı özelliklerine göre
tanımlayan sistemdir.
2
Ortak özellikleri nedir?
alg
Kan
hücreleri
3
kromozomlar
protozoa
Hücre Hakkında Bize Ne Söyler?
— Yaklaşık büyüklüğünü (Forward Scatter-FSC)
— Yaklaşık granüllüğünü (Side Scatter-SSC)
— Yaklaşık floresans miktarını (FL1, FL2, FL3 ve
FL4)
4
FSC ve SSC Özellikleri
Side Scatter Detektörü
Hücrenin içsel yapısı
Laserden
gelen ışık
kaynağı
Forward Side Scatter
Detektörü
Hücre büyüklüğü
Forward Scatter— yüzeyden yansıyan ışınlar
— Hücrenin büyüklüğü ile ilişkilidir.
Side Scatter— içerden kırılıp yansıyan ışınlar
— Hücrenin granüllüğü ve içsel yapısı ile ilgilidir.
5
600
Nötrofiller
400
Side Scatter
800
1000
Eritrositleri uzaklaştırılmış tam kan örneği
200
Monositler
0
Lenfositler
0
200
400
600
800
Forward Light Scatter
6
1000
Hücre Hakkında Bize Ne Söyler?
— Yaklaşık büyüklüğünü (Forward Scatter-FSC)
— Yaklaşık granüllüğünü (Side Scatter-SSC)
— Yaklaşık floresans miktarını (FL1, FL2, FL3 ve
FL4)
7
Fluoresan ışık nedir?
λ = 488 nm
HO
O
λ ≅ 530 nm
C
CO2H
Işık enerjisi
Fluoresan
Molekülü
Açığa çıkan ışık
enerjisi
Antikor
— Florokrom laserden gelen enerjiyi emer.
— Florokrom tarafından emilen enerji;
– Vibrasyon ve ısı salınımı
– Uzun dalga boylu fotonların emisyonu ile açığa
çıkar.
8
Floresans yoğunluğu
Salınan enerjinin miktarı, hücrede bulunan bağlanma
bölgelerinin miktarı ile doğru orantılıdır.
FITC
FITC
FITC
FITC
FITC
Hücrelerin Sayısı
FITC
FITC
FITC
FITC
Floresan Yoğunluğu
9
FITC
Görüntüleme..
10
Sitometri hangi sistemlerin varlığına
ihtiyaç duyar?
— Sıvı Sistem
Hücrelerin lasere taşınması ve tek tek lazerden geçişini
sağlar.
— Optik Sistem
Işık enerjisinin oluşmasını ve sonrasında da
toplanmasını sağlar.
— Elektronik Sistem
Optik sinyallerin veri aktarımını sağlamak üzere dijital
sinyallere çevrimini sağlar.
11
Sıvı Sistem-FACS Calibur
Hava Flitresi
Hava
Pompası
Flow Cell
Sheath
Düzenleyici
Sheath
Sheath Filitresi
Atık
Örnek
geçiş düzenleyici
Örnek
12
Sıvı Sistem–FACSCanto II
Hava
Filitresi
FACSFlow
tankıı
tank
Atık Tankı
Compressor in wet cart
Sheath
Filitresi
™
FACSCanto Wet
cart
Sheath
Regulator
Flow Cell
FACSCanto
cihazı
Plenum
reservoir
Sample
Regulator
Örnek tüpü
13
Sıvı Sistem:BD FACSAriaII
Fluidic cart
– Cihaza sıvı akışını
sağlar ve vakum
oluşturur.
14
Optik Sistem:FACSCalibur 4C
FL1
530/30
SSC
FL2
FL4
488/10
585/42
90/10 Beam Splitter
661/16
DM 560SP
DM 640LP
670LP
Yarım Ayna
Floresans toplama lensi
FL3
Beam Combiner
488 nm
Blue Laser
15
Flow
Cell
Red Diode Laser
~635 nm
488/10
Odaklayıcı Lens
FSC Diode
Optik Sistem: FACS CantoII-Aria II
To PMT
Fiber optics
Waste line
633 nm Kırmızı Lazer
Collection
lens
Focusing
Lens
Beam
reshape
Pin hole block
FSC
488 nm Mavi Lazer
405 nm Mor Lazer
488 / 10
FACSFlow
Positive
Differential
Pressure
16
Diode
Optik Sistem:FACSCanto II-Aria II
Trigons
17
Octagon
Elektronik Sistem
— Optik sinyalleri voltaj değerlere dönüştürür.
— Voltaj değerinin yüksekliğini, genişliğini ve alanını
hesaplar.
— Bilgi aktarımı görevi görür.
18
Laz
Lazer
Voltaj
Voltaj değerinin oluşması
Laz
Lazer
Voltaj
Zaman
Laz
Lazer
19
Voltaj
Zaman
Zaman
Alan
Yükseklik
Volt
Hesaplanması..
0
Genişlik
Zaman
(µ Saniye)
20
Verilerin Dijital Çevrimi
Oluşan voltajların yükseklik
değerlendirmeleri
FSC
Analogdan dijitale
çevrim
SSC
Zaman
Zaman
FL1
Analogdan dijitale
dönüştürücü
GPIO
Interface
FL2
Zaman
0
1000
Kanallar
FL3
Zaman
FL4
Zaman
21
Zaman
Dot Plot
List-Mode Data
1000
SSC
FL1
FL2
Event 1
30
60
638
840
Event 2
100
160
245
85
Event 3
300
650
160
720
1000
840
800
600
FL2
FL2
FSC
400
800
600
400
200
200
85
0
0
0
200 400 600 800 1000
0
200
FL1
FL1
245
22
400 600 800
638
1000
SSC
FL2
Özet
Zaman
FL1
FSC
Zaman
Veri
işlemcisi
FSC
SSC
Zaman
FL1
Zaman
Zaman
Zaman
23
FL2
FL3
FL4
Örnek Hazırlama
100 ul tam kan veya kemik iliği eklenir
20 ul floresan eklenir
Vorteks 15 dk inkübasyon
2 ml BD Lysis Buffer eklenir
Vorteks
10 dk inkübasyon
Santrifüj edilerek süpernatant
uzaklaştırılır.
Hücreler yıkanır ve analize
geçilir.
24
Florokromların floresan
yoğunlukları
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
25
BD Anti-CD4’ün CompBeadler üzerindeki yoğunlukları
FITC=1
PE-Cy7=4.9
APC=5.8
PE=4.3
PerCP-Cy5.5=1.5
Alexa700=0.91
APC-Cy7=1.2
PerCP=0.68
Pacific Blue=0.15
AmCyan=0.1
Florokromlar
—Antijenin düşük seviyede ifade edildiği
durumlarda florokromun yüksek
seviyede ışıma vermesi gerekir.
26
27
Neden Hücre Ayırırız?
Bir ya da birkaç farklı hücre populasyonu izole etmek için;
28
Damla Oluşturulması
— Amplitude
– Akıma uygulanan şiddeti belirler
— Frequency
– Saniyede meydana gelen damla sayısınısıklığını belirler.
— Drop 1
– Görüntünün en üst noktası ile meydana
gelen ilk damlanın orta noktası arasındaki
pixel sayısıdır.
— Gap
– Oluşan ilk bağımsız damla ile akım
arasındaki pixel sayısıdır.
29
Hücre ayrıştırması(Sorting):Nasıl?
Analiz edildiği an = hücrenin lazere çarptığı
an
Drop Delay; hücrenin
A noktasından B
noktasına ulaşması
sırasında geçen
süredir. Damla sayısı
ile ifade edilir.
A
B
30
Elektrik yüklendiği an = ayrılma noktası
Sorting
Bir kablo yardımı ile akıma elektrik
yüklenir
Örneğin oluşturduğu ışık saçılımları ve floresan
sinyalleri analiz edilir.
Elektrik yüklü
damlacıklar
oluşur.
plakalar aracılığı ile yüklü
damlacık tüplere yönlendirilir.
Yüklü olmayan damlacıklar atık
tankına gider.
31
Sort edilmesi istenen
partikülleri içeren
yüklenmiş damlalar
toplanır.
Sorting öncesi ve sonrası saflık
değerlendirmesi
Sort öncesi
örnek
dağılımı
CD3+
TCR+
Quadrant Statistics
Acquisition Date: 22-Apr-99
X Parameter: FL1 (Log)
Y Parameter: FL2 (Log)
Quad
UL
UR
LL
LR
CD3+ ve TCR+
Hücrelerin
sort sonrası
dağılımı
3
% Gated
0.07
% Total
0.03
68
2071
1945
1.66
50.67
47.59
0.68
20.71
19.45
Quadrant Statistics
Acquisition Date: 22-Apr-99
X Parameter: FL1 (Log)
Y Parameter: FL2 (Log)
Quad
UL
UR
LL
LR
32
Events
Events
% Gated
0
0.00
177
0
1
99.44
0.00
0.56
% Total
0.00
78.67
0.00
0.44
Saflık %’si
Lösemide BCR-ABL
•t(9;22) Kromozomal translokasyonu
(Philadelphia kromozomu) BCR ve ABL
genlerinin füzyonuna neden olur.
• KML’de >%95 (tanı kriteri)
• erişkin precursor B-ALL’de %25-40
• pediatric precursor B-ALL ‘de %3-6
oranında görülmektedir.
33
BCR-ABL Kalitatif Araştırma Kiti
bead
Çekirdek
CBA BONCUĞU
BAĞLI
BCR ANTİKORU
füzyon gen
5' BCR geni
ABL geni
bead
transkripsyon
Hücre
translasyon
B
A
FÜZYON PROTEİNİNİN
YAKALANMASI
Lizatı
Patents:
Sitoplazma
US 6,610,498 B1 (26 August 2003)
US 6,686,165 B2 (3 February 2004)
34
bead
B
Füzyon proteini
PE
FLOROKROMU
İLE TESPİT
EDİLMESİ
Veri Alımı :
BCR-ABL
negatif
BCR-ABL
pozitif
35
BCR-ABL’nin tüm alt tiplerinin
tanımlanması :
697 (t(1;19)
TOM-1, BCR-ABL+
(neg. kontrol)
(p190)
LAMA-84, BCR-ABL+ (p210)
AR230, BCR-ABL+
36
(p230)
Translokasyonların tespitinde
kullanılan diğer metodlar
Sitogenetik
37
FISH
(RQ)-PCR
Metodlara ait Parametreler
38
Metod
Gereken
Zaman
Notlar
Sitogenetik
3-10 gün
Hücre kültürü ve birçok farklı
ürün gerektirir.
Manuel - Otomatize
FISH
1-2 gün,
(gönderilirse 2-7
gün)
Manuel
PCR
3 saat
(gönderilirse 2-7
gün)
Manuel - Otomatize
Foxp3 (259D klonu)(BD)
hakkında
— Foxp3 T-regülatör hücrelerini tanımlamak için kullanılır.
İnsan T-reg hücrelerini fonksiyonlarına göre belirlemek
amaçlı CD127 ile birlikte kullanımı önerilmektedir.
— BD bünyesinde insan T-reg hücrelerini bütünüyle incelemek
amaçlı Foxp3 (hücre içi) ve CD127 (yüzey) içeren kitler
mevcuttur.
— Foxp3 259D klonu özgüllüğünden ötürü konu ile ilgili
yayınlarda en çok görülen ürün olmuştur.
39
CD127; insan periferik kan tek çekiredekli
hücrelerinden canlı T-reg hücrelerini ayırır.
CD4+ kapılanmış hücrelerde CD127 ve CD25 işaretlenmesi gösterilmektedir.
40
T-reg hücrelerinin fenotipik analizleri
Hücrelerin CD127 ve CD25 ifade etme özelliklerine
göre incelenmiştir.
CD25 düşük/CD127 yüksek
CD4 - PerCP
CD127yüksek
hücreler,
Foxp3’ü
neredeyse
hiç ifade
etmezler.
CD25 yüksek/CD127 düşük
CD4 - PerCP
CD127 düşük
hücrelerde
Foxp3 ifadesi
yüksektir.
41
İsotipik kontrol-APC
Foxp3 APC
Foxp3 APC
BD Stem Cell Enumeration Kit
— CD45 FITC/CD34 PE
— Ammonium Chloride Liziz
solüsyonu 10x
— 7-aminoactinomycin-D
AAD)
— BD TrucountTM tüpleri
— Kit başına 50 test
— Okutma ve analiz için
oluşturulmuş kalıplar
42
(7-
BD Trucount Mutlak Sayım Tüpleri
— Mutlak sayı vermek amaçlı
BD Stem Cell Enumeration
kit ile kullanılır.
— Lyophilize edilmiş ve
bilinen sayıda floresan
işaretli boncuk içeren
pelletten meydana gelir.
43
Çalışılabilecek Örnek Tipleri
—Periferik Kan
—Kemik İliği
—Aferez Ürünü
—Kordon Kanı
44
Veri analizi..
Hesaplama
için gereken
veriler
Kapı
İstatistikleri
Sonuçlar
45
Teşekkür
Ederim..
İrem Akar Soycan
46