İki Fazlı Brushite-Apatit Ortopedik Çimento

İki Fazlı Brushite-Apatit Ortopedik Çimento Tozlarının
Kimyasal Çöktürme ile Hazırlanması
Preparation of Biphasic Brushite-Apatite Orthopedic Cement
Powders by Chemical Precipitation
Murat Bıcakçı ve A. Cüneyt Taş
Biyomedikal Mühendisliği Bölümü,
Yeditepe Üniversitesi, Istanbul
[email protected]
Özetçe
Brushite (CaHPO4⋅2H2O, dikalsiyum fosfat dihidrat) fazının,
sert dokuların mineral kısmını oluşturan kalsiyum
hidroksiapatiti (HA: Ca10(PO4)6(OH)2) biyolojik kristalizasyon
süreçlerinde öncelediği bilinir. Bir başka deyişle, brushite ile
hidroksiapatit fazlarının arasında fizyolojik çözeltilerde bir
denge noktası (pH, sıcaklık ve konsantrasyon uzayında)
varolduğu
rahatlıkla
söylenebilir.
Brushite
asidik,
hidroksiapatit ise bazik fazlardır. Bu iki fazı aynı anda içeren
ve uygun faz oranlarındaki karışımların insan vücut sıcaklığı
olan 36.5°C’deki su-bazlı çözeltiler içinde birbirleri ile
nötürleştirme tepkimesine girebildikleri de bilinmektedir. Bu
bilinenlere dayanılarak, apatit ve brushite içeren iki-fazlı toz
karışımlarından ortopedik uygulamalarda kullanılabilecek
kemik çimentoları üretilebilecektir. Bu çalışmada, ilk kez
olarak, bu iki-fazlı toz karışımlarının tek bir kimyasal
çöktürme süreci sonunda elde edilebilirliği sınanmıştır. İkifazlı brushite-apatit tozları, geliştirilen özgün bir kimyasal
çöktürme yöntemi kullanılarak, üstelik değiştirilebilen faz
miktarlarında elde edilebilmiştir. Bu makale bu yöntemi
açıklamakta ve elde edilen tozların X-ışını kırınımı ve infrared
spektroskopisi analizlerini irdelemektedir.
Abstract
Brushite (CaHPO4⋅2H2O, dicalcium phosphate dihydrate) is
known to be the precursor to the mineralized portion (HA:
calcium hydroxyapatite, Ca10(PO4)6(OH)2) of hard tissues in
the biological crystallization processes. In other words, it can
be readily asserted that there must be a point of equilibrium
(within the three-dimensional pH, temperature and
concentration space) between brushite and hydroxyapatite
phases in physiological solutions. While brushite is acidic,
hydroxyapatite is a basic phase. It is also known that mixtures
which contain these phases, in appropriate mixing ratios,
could undergo a neutralization reaction in aqueous solutions
at the human body temperature of 36.5°C. Based on these
facts, it would be possible to produce bone cements, for
orthopedic applications, from the biphasic powder mixtures
of brushite and apatite. The feasability of synthesizing these
biphasic powder mixtures in variable phase ratios have been
tested, for the first time in this study, by using a single-step
chemical precipitation process. This paper explains this novel
process and analyzes the X-ray diffraction and infrared
spectroscopy data obtained from these powders.
1. Giriş
Brushite (CaHPO4⋅2H2O) tek-fazlı ve saf bir toz olarak
kimyasal çöktürme süreçleri kullanılarak eldesi oldukça kolay
olan bir kalsiyum fosfat fazıdır. Suda çözünebilen kalsiyum
klorür dihidrat, kalsiyum nitrat tetrahidrat veya kalsiyum
asetat tuzlarından herhangi birisinin kullanılması ile
oluşturulabilecek su-bazlı çözeltilerin (veya anılan kalsiyum
tuzları kullanılarak elde edilecek uygun karışımların), yine
suda çözünebilen diamonyum hidrojen fosfat ve disodyum
hidrojen fosfat tuzlarının suda çözülmesi ile üretilecek fosfat
çözeltilerinin birbiri ile, pH 2 ile 6 arasında tutulmak koşulu
ile, karıştırılması sonucunda bu çözeltilerden elde edilecek
olan faz brushite olmaktadır [1]. Çözeltiler hazırlanırken Ca/P
molar oranının 1 civarında tutulması brushite sentezindeki
verimliliği arttıracaktır. Ancak çözeltilerin pH değeri yukarıda
anılan asidik aralığın dışına (özellikle bazik alana doğru)
çekilirse, o durumda brushite ile birlikte kalsiyum-eksikli
hidroksiapatit
(KEHA;
Ca10-x(HPO4)x(PO4)6-x(OH)2-x)
oluşumu da gözlenebilecektir. KEHA formülündeki x
faktörünün değerinin 1’e kadar yakınsayabileceği, böylece de
KEHA fazı için Ca/P molar oranının 1.50 civarında
olabileceği bilinmektedir. KEHA fazının yukarıda verilen
formülünde görülen x faktörünün değeri sıfır olduğunda da
karşımıza çıkacak olan faz kalsiyum hidroksiapatit (HA:
Ca10(PO4)6(OH)2) olarak adlandırılacaktır. KEHA fazı, çözelti
pH değerinin ancak 6.5 ile 9.5 olması durumunda kararlı iken,
çözelti pH değeri 9.5 ile 12 arasına çıkarıldığında ise
KEHA’nın HA’e dönüşmesi söz konusu olacaktır [1].
Literatürde, maalesef, KEHA ile HA fazı henüz pek çok
araştırmacı tarafından birbiri ile karıştırılmakta olup, pek çok
yayında apatit familyasına ait olan bu iki faz yalnızca
“hidroksiapatit” olarak yanlış biçimde anılmaktadır. Brushite
ile KEHA ve HA fazlarını birbirinden ayırt eden en önemli
özellik, bu üç fazın oda sıcaklığında, su içindeki
çözünürlükleridir. Bu üç fazın logKSP değerlerini art arda
yazmanın bu noktada yararlı olacağı düşünülmelidir.
25°C’deki logKSP değerleri brushite, KEHA ve HA için,
sırasıyla, -6.6, -85.1 ve -116.8 şeklindedir [1]. Buradan da
açıkça görüleceği üzere, brushite ile KEHA veya HA’in
logKSP değerleri arasında çok ciddi bir fark vardır ve bu üç
faz arasında en yüksek çözünürlüğe sahip olanı da
brushite’tır. Brushite’ın oda sıcaklığında ve pH değeri 5.5’ta
sabitlenmiş olan su-bazlı bir çözeltideki çözünme hızı
4.26x10-4 mol⋅m-2⋅min-1 iken, aynı koşullarda HA’in çözünme
hızı ise 1.42x10-6 mol⋅m-2⋅min-1 olarak ölçülmüştür [2]. Bir
başka deyişle, brushite’ın çözünme hızı, anılan koşullarda,
HA’inkinden 300 kez fazladır. İşte salt bu nedenledir ki, son
on yılda, sertleştikten, yani set ettikten sonraki yegane fazı
brushite olan yeni kemik çimentoları geliştirilmeye
başlanmıştır [3].
Set ettikten, sertleştikten sonraki yegane fazı hidroksiapatit
olan pek çok kemik çimentosu şu anda ortopedik cerrahların
klinik kullanımı için mevcuttur [4]. Fakat hidroksiapatit
çimentolarının osteoentegrasyon ve in vivo özümsenebilme
düzeyleri oldukça düşük olup, pek çok ortopedik cerrah da
bunları
hastalarında
kullanmaktan
bu
yüzden
kaçınmaktadırlar.
Bu noktada sorulması gereken belki de en önemli sorulardan
birisi de şu olacaktır: brushite ve apatiti yüzde elli oranlarında
biraraya getiren çimentolar var mıdır, hiç geliştirilmiş midir?
Bu sorunun yanıtı pozitif olup, bunun dünyada yalnızca bir
örneği vardır: α-BSM®/Biobon® isimleriyle (sırasıyla
Amerika ve Avrupa’da) bilinen ve Etex Corporation, USA
tarafından geliştirilmiş olan çimentodur. Bu çimento, yüzde
elli oranında brushite ve yüzde elli oranında da KEHA
içermektedir [4-6]. Bu çimentonun yüksek in vivo
çözünürlüğe sahip oluşu ve yeni kemik oluşumu süreçlerine
mükemmele yakın bir uyum sağladığı kanıtlanmıştır. Fakat bu
çimento üretilirken, KEHA ve brushite tozları ayrı ayrı
üretilmekte, sonra da fiziksel olarak yüzde elli oranında
birbiri
ile
havan
veya
değirmenler
kullanılarak
karıştırılmaktadır [6]. Bu çimentonun tetikleyici ve
kristalizasyona yol açan çözeltisi de (setting solution) basit bir
tuzlu su (0.9 wt% NaCl) solüsyonudur.
Burada özetlenen çalışmanın motivasyonu ve başlangıç
noktası, literatür taramalarımıza dayanarak, dünyada henüz
hiç denenmemiş veya yayınlanmamış olan bir şeyi deneyerek
brushite ve kristalinitesi oldukça düşük olan KEHA fazlarının
her ikisini de aynı ve tek evreli, tek adımlı bir kimyasal
çöktürme süreci ile elde etmeye, sentezlemeye çalışmaktır.
Ortaya çıkacak tozlardan bir kemik çimentosu geliştirmek ve
bunun sertleşme kinetiği ile mekanik ve biyolojik
özelliklerinin ayrıntılı olarak incelenmesi ise bunu takip eden
bir diğer çalışmamızın konusu olacaktır.
2. Deneysel Yöntem
Bu çalışmada aşağıdaki başlangıç kimyasalları kullanılmıştır;
diamonyum hidrojen fosfat, (NH4)2HPO4 (>99%, Katalog No:
1.01207, Merck KGaA, Darmstadt, Almanya), kalsiyum klorür
dihidrat, CaCl2⋅2H2O (>99%, Katalog No. 1.02382, Merck
KGaA), amonyum hidrojen karbonat, NH4HCO3 (>99%,
Katalog No: 1.01131, Merck KGaA), sodyum klorür, NaCl
(>99%, Katalog No: 1.06404, Merck KGaA) ve potasyum
klorür, KCl (>99%, Katalog No: 1210517, Labkim, İstanbul).
Kimyasal çöktürmede kullanılan çözeltilerin hazırlanması için
iki kez damıtılmış su kullanılmıştır.
Tipik bir sentez deneyi ise şöyle yapılmıştır. Öncelikle, iki ayrı
cam beherde, iki ayrı çözelti hazırlanmıştır. Bunlar A ve B
çözeltileri olarak isimlendirilmişlerdir. A çözeltisi içinde fosfat
ve/veya karbonat iyonlarını barındırmakta ve 1 L kapasiteli bir
cam beherde hazırlanmakta iken, B çözeltisi ise içinde
yalnızca kalsiyum iyonlarını bulundurmakta ve 250 mL
kapasiteli ayrı bir cam beherde hazırlanmıştır.
Saf brushite tozlarının eldesi için A çözeltisi hazırlanırken 400
mL saf su içinde 3.9617 g (NH4)2HPO4 (=0.03 mol P) oda
sıcaklığında (21±1°C) çözülmüş, B çözeltisini hazırlamak için
de 7.3508 g CaCl2⋅2H2O tuzu (=0.05 mol Ca) 150 mL saf su
içinde çözünmüştür. Bunu takiben de, B çözeltisi hızlıca A
çözeltisine eklenmiş ve oluşan karışım (pH=5.65) 20 dakika
karıştırılmıştır. Oluşan çökelekler filtre kağıdı kullanılarak
süzülmüş, 1500 mL saf su ile yıkanmış ve son olarak da
36.5°C’de kurutulmuşlardır.
Saf KEHA tozlarının üretimi için ise A çözeltisi 400 mL saf su
içinde 3.9617 g (NH4)2HPO4 (=0.03 mol P) ile birlikte 3.9528
g NH4HCO3 (=0.05 mol HCO3) çözülmesi ile hazırlanmıştır. B
çözeltisini hazırlamak için de yine 7.3508 g CaCl2⋅2H2O tuzu
(=0.05 mol Ca) 150 mL saf su içinde çözünmüştür. Bunu
takiben de, B çözeltisi hızlıca A çözeltisine eklenmiş ve oluşan
karışım (pH=8.3) 20 dakika karıştırılmıştır. Oluşan ince
çökelekler filtre kağıdı kullanılarak süzülmüş, 1500 mL saf su
ile yıkanmış ve son olarak da 36.5°C’de kurutulmuşlardır.
İki fazlı brushite-KEHA eldesi için ise A çözeltisine eklenecek
olan NH4HCO3 tuzunun miktarı çok önemli bir rol
oynamaktadır. Bu çalışma kapsamında, iki fazlı brushiteKEHA üretiminde, saf KEHA tozlarının üretimine benzer
sentez reçetelerindeki amonyum hidrojen karbonat miktarı
0.01 ile 0.04 mol aralığında, 0.01 mol artışlarla çalışılmıştır.
Bir örnek oluşturması amacı ile iki fazlı ve yaklaşık olarak
yarı yarıya brushite ve KEHA fazlarını içeren tozların sentezi
için aşağıdaki reçete kullanılmıştır
A çözeltisi 400 mL saf su içinde 3.9617 g (NH4)2HPO4 (=0.03
mol P) ile birlikte 2.3717 g NH4HCO3 (=0.03 mol HCO3)
çözülmesi ile hazırlanmıştır. B çözeltisini hazırlamak için de
yine 7.3508 g CaCl2⋅2H2O tuzu (=0.05 mol Ca) 150 mL saf su
içinde çözünmüştür. Bunu takiben de, B çözeltisi hızlıca A
çözeltisine eklenmiş ve oluşan karışım (pH=7.0-7.1) 20 dakika
karıştırılmıştır. Oluşan çökelekler filtre kağıdı kullanılarak
süzülmüş, 1500 mL saf su ile yıkanmış ve son olarak da
36.5°C’de kurutulmuşlardır.
İki fazlı brushite-KEHA tozlarının insan vücut sıcaklığı olan
36.5°C’de 72 saat içinde gözlenebilecek hidrotermal
dönüşümlerinin incelenmesi için de kalsiyum iyonu içeren
özel bir fizyolojik çözelti kullanılmıştır [7]. Bu çözelti NaCl,
KCl ve CaCl2⋅2H2O kullanılarak hazırlanmış ve 142 mM Na+,
5 mM K+ ve 50 mM Ca2+ içermekte olup, özellikle Na ve K
iyonu miktarları insan kan plazması konsantrasyonları ile
eşitlenmiştir. Ürettiğimiz iki fazlı brushite-KEHA tozlarının 1
gramlık bölümleri, bu çözeltinin 100 mL’lik bir kısmı içine,
ağzı sıkıca kapatılmış bir cam şişe içinde, konularak 36.5°C’de
72 saat karıştırılmadan bekletilmişlerdir.
Üretilen tüm toz örneklerinin karakterizasyonu için X-ışını
kırınımı (Advance D8, Bruker AXS, Karslruhe, Almanya) ve
Fourier-dönüşümlü kızılötesi spektroskopi (SpectrumOne,
Perkin-Elmer, USA) kullanılmıştır. X-ışını kırınım
analizlerinde, tozlar once bir agat havanda hafifçe
öğütülmüşler, sonra da 40 kV, 40 mA X-ışını jeneratörü
işletim koşullarında 0.02° 2θ adım aralıkları (her adımda 3
saniye beklemeli) ile X-ışını verisi toplanmıştır. FTIR
analizleri yapılırken, 1 mg örnek tozu ile 300 mg saf KBr tozu
bir agat havanda karıştırılmış, bunu takiben elde edilen tozlara
1 cm iç çapa sahip çelik bir kalıp içinde 10 ton basınç
uygulanarak yaklaşık 1 mm kalınlığındaki FTIR pastilleri elde
edilmiştir. Bu pastiller FTIR cihazında 128 kez taranarak,
4000 ile 400 cm-1 aralığında veri toplanmıştır.
3. Bulgular ve Tartışma
brushite-KEHA tozlarının FTIR verileri ise Şekil-4’de, bu
çalışmada üretilen saf brushite ve saf KEHA tozlarının FTIR
verileri ile birlikte, verilmiştir.
Şekil-1, yukarıda verilen kimyasal çöktürme yöntemi ile
üretilen saf brushite tozlarının X-ışını kırınım verisini
göstermektedir. Brushite tozlarının oldukça yüksek bir
kristaliniteye (5200 cps: counts-per-second) sahip oldukları
görülmüştür. Bu veride gözlenen tüm peak’ler monoklinik
brushite fazına ait olup, buradaki peak’ler ve onlara karşılık
gelen 2θ açıları ve d-spacingsö brushite fazı için verilen
ICDD-PDF 9-0077 standart kartı ile uyumludur. Şekil-2’de
ise saf KEHA tozlarının X-ışını kırınım verisi sunulmuştur.
KEHA tozlarının brushite’a kıyasla ne denli düşük bir
kristaliniteye sahip olduğunun (55 cps) gözlenmesi ilginçtir
ve bu zaten istediğimiz bir durumdur. Böylesi düşük
kristaliniteye sahip KEHA tozları “poorly-crystallized
apatitic” kalsiyum fosfat olarak da isimlendirilirler [5, 6] ve
bu tozların X-ışını kırınım verisi ile birlikte diğer fizikokimyasal özellikleri yeni doğmuş bebeklerin henüz yarı sert
kemik dokuları ile de büyük benzerlik göstermektedir [8, 9].
Şekil-3: İki fazlı brushite-KEHA X-ışını kırınım verisi
Şekil-1: Saf brushite tozlarının X-ışını kırınım verisi
Şekil-4: Saf brushite, saf KEHA ve iki fazlı brushite-KEHA
tozlarının FTIR verileri
Kristalinitesi düşük KEHA [10] ile birlikte brushite tozlarının,
iki fazlı ve oldukça homojen bir toz karışımı biçiminde, tek
adımlı bir kimyasal çöktürme süreci kullanılarak, oda
sıcaklığında ve içinde hiç bir yabancı ve/veya organik madde
barındırmayan sistemlerde üretilmesi, bir sonraki evre olan bu
tozlar
kullanılarak
yeni
çimento
formülasyonları
geliştirilebilmesi konusunda ümit vericidir.
Şekil-2: Saf KEHA tozlarının X-ışını kırınım verisi
Benzer biçimde, Şekil-3’de ise iki fazlı brushite-KEHA
tozlarının X-ışını kırınım verisi verilmiştir. Bu iki fazlı
karışımda, brushite miktarı ancak yüzde 50 civarında olduğu
için, brushite fazına ait ana peak (11.68°’de gözlenen)
yoğunluğu 440 cps civarında kaydedilmiştir. Şekil-3’de
varolan KEHA fazına ait peak’ler de işaretlenmiştir. İki fazlı
Deneysel yöntem bölümünde anlatılan biçimde üretilen ve
Şekil-3 ile Şekil-4’te X-ışını ve kızılötesi karakterizasyonu
yapılmış iki fazlı brushite-KEHA tozları, kalsiyum içeren
NaCl-KCl çözeltileri (50 mM Ca2+, 142 mM Na+ ve 5 mM
K+) içinde 36.5°C’de, 72 saat boyunca hiç karıştırılmadan
bekletildiklerinde ise hidrotermal bir tepkimeye girmişler ve
Şekil-5’te görüldüğü gibi tümüyle insan kemik mineraline
benzer, kristalinitesi oldukça düşük bir kristalografik yapıya
dönüşmüşlerdir. Başlangıç tozunda varolan ve kısmen asidik
karaktere sahip brushite fazının sadece 72 saat içinde
yokolarak KEHA formuna dönüşmüş olması oldukça ilgi
çekicidir. Öte yandan, saf, tek fazlı brushite tozlarının yapay
vücut sıvıları (synthetic body fluid, SBF) içinde 36.5°C’de
insan kemik mineraline benzer bir yapıya dönüştükleri de
daha önce gösterilmiştir [11].
Şekil-5: İki fazlı brushite-KEHA tozlarının kalsiyum, sodyum
ve potasyum içeren çözeltilerde 72 saat süresince 36.5°C’de
tutulmalarından sonra gözlenen X-ışını kırınım verisi
Tümoral veya kist-kaynaklı kemik defektleri ile travma, spor
ve savaş-terör yaralanmaları gibi durumlarda ortaya
çıkabilecek sert doku boşluklarının cerrahi girişim ile
doldurulması sürecinde, defekte yerleştirilecek yapay
biyomalzemelerin bu çalışmada örneklendiği üzere kendi
başlangıç yapısını doğal kemik mineraline, bu çalışmada
gösterildiği gibi, 72 saat gibi oldukça hızlı bir sürede
dönüştürebilir olması bundan sonraki araştırmalarımız
açısından heyecan vericidir [12].
4. Sonuçlar
Bu çalışmada, iki fazlı brushite-kalsiyum eksikli
hidroksiapatit (KEHA) tozları literatürde daha önce
varolmayan bir kimyasal çöktürme yöntemi geliştirilerek
üretilmiştir. Bu tek adımlı, tek evreli yöntem, iki fazlı toz
karışımları içindeki brushite veya KEHA miktarının rahatlıkla
değiştirilebilmesine olanak tanımaktadır. Ayrıca, iki fazlı
brushite-KEHA toz karışımlarının insan kan plazmasını
andıran yapay bir çözelti içinde, insan vücut sıcaklığı olan
36.5°C’de sadece 72 saat tutulması sonucunda insan kemik
mineraline çok benzer bir yapıya dönüştükleri de deneysel
olarak kanıtlanmıştır.
5. Kaynakça
[1] S. V. Dorozhkin, “Calcium orthophosphate cements and
concretes,” Materials, vol. 2, pp. 221-291, 2009.
[2] R. Tang, M. Hass, W. Wu, S. Gulde, and G. H. Nancollas,
“Constant composition dissolution of mixed phases II.
Selective dissolution of calcium phosphates,” J. Colloid
Interface Sci., vol. 260, pp. 379-384, 2003.
[3] D. Apelt, F. Theiss, M. Bohner, and B. von Rechenberg,
“In vivo behavior of three different injectable hydraulic
calcium phosphate cements,” Biomaterials, vol. 25, pp.
1439–1451, 2004.
[4] M. Bohner, U. Gbureck, and J. E. Barralet, “Technological
issues for the development of more efficient calcium
phosphate bone cements: A critical assessment,”
Biomaterials, vol. 26, pp. 6423–6429, 2005.
[5] D. Knaack, M. E. P. Goad, M. Aiolova, C. Rey, A.
Tofighi, and D. D. Lee, “Resorbable calcium phosphate
bone substitute,” J. Biomed. Mater. Res. Appl. Biomater.,
vol. 43, pp. 399–409, 1998.
[6] D. D. Lee, C. Rey, M. Aiolova, A. Tofighi, “Neutral selfsetting calcium phosphate paste,” US Patent, No.
7,150,879; December 19, 2006.
[7] A. C. Taş, “Monetite (CaHPO4) synthesis in ethanol at
room temperature,” J. Am. Ceram. Soc., vol. 92, pp.
2907-2912, 2009.
[8] M. C. Dalconi, C. Meneghini, S. Nuzzo, R. Wenk, and S.
Mobilio, “Structure of bioapatite in human foetal bones:
An x-ray diffraction study,” Nucl. Instrum. Meth. B, vol.
200, pp. 406-410, 2003.
[9] C. Meneghini, M. C. Dalconi, S. Nuzzo, S. Mobilio, and R.
Wenk, “Rietveld refinement on X-ray diffraction patterns
of bioapatite in human fetal bones,” Biophysical J., vol.
84, pp. 2021-2029, 2003.
[10] A. S. Posner and F. Betts, “Synthetic amorphous calcium
phosphate and its relation to bone mineral structure,” Acc.
Chem. Res., vol. 8, pp. 273-281, 1975.
[11] A. C. Taş and S. B. Bhaduri, “Chemical processing of
CaHPO4⋅2H2O: Its conversion to hydroxyapatite,” J. Am.
Ceram. Soc., vol. 87, pp. 2195-2200, 2004.
[12] M. Bıcakçı, “Single-pot synthesis of biphasic brushiteapatite powders,” BME 492, Graduation Project Thesis,
(Supervisor: A. C. Taş), Dept. of Biomedical
Engineering, Yeditepe University, İstanbul, 2009.