Antimikobakteriyel Direnç Mekanizmaları ve Duyarlılık Testleri, Nuri

Antimikobakteriyel Direnç Mekanizmaları ve Duyarlılık Testleri, Nuri

Antimikobakteriyel
Direnç Mekanizmaları ve
Duyarlılık Testleri
Doç. Dr. Nuri ÖZKÜTÜK
Celal Bayar Üniversitesi Tıp Fakültesi
Tıbbi Mikrobiyoloji AD
MANİSA
Sunum İçeriği
• Mikobakterilerde direnç mekanizmaları
• MTB’de duyarlılık testleri
– Ne zaman?
– Hangi yöntemle?
– Hangi ilaçlarla?
• TDM’lerin duyarlılık testlerini;
–
–
–
–
Hangi TDM için?
Ne zaman?
Hangi yöntemle?
Hangi ilaçlarla?
Mikobakterilerde doğal direnç
•
•
•
•
Özel hücre duvarı yapısı  azalmış geçirgenlik
Dışa atım mekanizmaları
Beta-laktamaz enzimleri
Konaktaki fizyolojik adaptasyon mekanizmaları
Çoğu antibiyotiğe doğal direnç
Kısıtlı seçenek
• 1943’de Streptomisin keşfedildi
The drug would lead the path in the elimination of
“The Great White Plague”
Monoterapi
• 1948’de Streptomisin direnci
British Medical Research Council
(BMRC) trial 1948
-------------------------------------------------------------------------------------------
• Monoterapi alan çoğu hastada
direnç gelişti
Kombine tedavi
ÇİD-TB
YİD-TB
Dirençle ilişkili tanımlar
• Tek ilaca direnç: (Mono-resistant)
• Birden fazla ilaca direnç: (Poly-resistant)
• Çok ilaca direnç (ÇİD): (Multidrug-resistant, MDR)
– en az izoniazid ve rifampisine direnç
• Yaygın ilaca direnç (YİD): (Extensively drug-resistant, XDR)
• ÇİD’e ek olarak florokinolon ve parenteral ikinci seçenek ilaçlardan
(kanamisin, amikasin, kapreomisin) birine direnç
• Primer (yeni olguda) ilaç direnci:
– Daha önce tedavi almamış veya bir aydan kısa süre tedavi almış olguda
görülen direnç
• Sekonder (tedavi almış olguda) ilaç direnci:
– En az bir ay kemoterapi almış olguda ortaya çıkan direnç
Mikobakterilerde kazanılmış direnç
Vahşi M.tuberculosis suşu
Spontan mutasyon (10-6 -10-9)
Dirençli suş
Seleksiyon
•Uygunsuz tedavi rejimi
•İlaç temininde zorluk
•Tedaviye uyumsuzluk
Sekonder ilaç direnci
Bulaşma
Primer ilaç direnci
•Tanının gecikmesi
•Yetersiz enfeksiyon kontrolü
•Aşırı nüfus yoğunluğu
Mikobakteriyel İlaç direnç mekanizmaları
rolü
Dirençte
mutasyon
sıklığı %
RNA polimeraz β subunit
İlaç hedefi
95
katG
Katalaz-peroksidaz
Ön ilaç
dönüşümü
50-95
inhA
Enoil-ACP redüktaz
İlaç hedefi
8-43
pncA
Pyrazinamidaz /
nikotinamidaz
Ön ilaç
dönüşümü
72-97
embB
Arabinozil transferaz
İlaç hedefi
47-65
rpsL
Ribozomal protein S12
İlaç hedefi
52-59
16S rRNA
İlaç hedefi
8-21
rRNA metiltransferaz
İlaç hedefi
İlacın etki
mekanizması
Dirençle
ilişkili gen
Rifampisin
RNA sentez inhibisyonu
rpoB
İzoniazid
Mikolik asit sentezi
inhibisyonu ve diğer
etkiler
İlaç
Pirazinamid
Etambutol
Streptomisin
Membran enerjisinin
azalması
Arabinogalaktan sentezi
inhibisyonu
Protein sentez
inhibisyonu
rrs
gidB
Amikasin /
Kanamisin
Gen ürününün
fonksiyonu
Protein sentez
inhibisyonu
rrs
16S rRNA
İlaç hedefi
76
Kapreomisin Protein sentez
/ viomisin
inhibisyonu
rrs
tlyA
16S rRNA
2'-0-metiltransferaz
İlaç hedefi
90
İlaç hedefi
75-94
Kinolonlar
DNA giraz inhibisyonu
gyrA, gyrB DNA giraz subunit A ve B
Int J Tuberc Lung Dis. 2009;13(11):1320
TB’da İlaç Direncinin Saptanmasının Önemi
İlaç direncinin doğru ve hızlı tanısı
Erken etkin tedavi
• İlaç direncinin yayılımı 
• Hastalık süresi 
• Kür oranı 
Direnç sürveyansı
• Enfeksiyon kontrol
önlemleri
TB KONTROLÜ
CLSI M24-A2
Curr Opin Pulm Med 2011, 17:134
EUCAST doc. E.DEF 8.1, 2007
Her hasta için
kültürde izole edilen ilk M.tuberculosis izolatına
duyarlılık testi uygulanmalıdır.
Birinci seçenek ilaçlara karşı İDT sonuçları
örnek kabul edildikten sonra
30 gün içinde bildirilmelidir.
(çoğu izolat için)
-CLSI M24-A2 (2011)
-CDC, Fact Sheets, Diag. of Tuberculosis Dis., 2011
-WHO/HTM/TB/2009
Mikobakteriyel Duyarlılık Test Yöntemleri
 Katı kültüre dayalı Konvansiyonel
yöntemler
 Direnç oranı yöntemi
 Mutlak konsantrasyon yöntemi
 Proporsiyon (orantı) yöntemi
 Genotipik (Moleküler) yöntemler




Line probe Assay (LPA)
Real-time PCR
DNA microarray
DNA dizi analizi
 Elektroforez temelli testler




SSCP
PCR Heterodubleks analiz
DGGE
RFLP
 Denaturing HPLC
 MAS-PCR
 PCR-ELISA
 Sıvı kültüre dayalı hızlı ticari
yöntemler





MGIT 960
Versa TREK (ESP II)
BACTEC 460 TB
BacT/Alert 3D
Mycolor-TK ?
 Nonmoleküler alternatif yöntemler
 MODS
 TLA
 NRA
 Klasik
 Rapid Colorimetric DST (MDRXDRTB Colour Test)
 CRI
 REMA
 Alamar blue
 MTT
 Mikobakteriyofaj temelli testler
 Lusiferaz taşıyıcı faj yöntemi
 Faj çoğaltma yöntemi
 E test
 Sensititre MYCOTB (Trek Diagnostic)
Uygulama
Direkt test
İndirekt test
• Dekontamine ve konsantre edilmiş,
ARB pozitif örnek kullanılır.
• Kültürde üremiş, saf bakteri
kolonileri kullanılır.
• Kültüre dayalı yöntemlerde
• Kültüre dayalı yöntemlerde
• Dirençli TB kuşkusu yüksek olduğu
durumlarda uygulanabilir.
• İndirekt testle doğrulanmalıdır
• Moleküler yöntemlerde
• Önerilen uygulama
• Direnç saptandığında
kontaminasyon olmadığı
doğrulanmalıdır
• Moleküler yöntemlerde
Katı Besiyerinde Kültüre Dayalı
Konvansiyonel Yöntemler
–Direnç oranı yöntemi
–Mutlak konsantrasyon yöntemi
–Proporsiyon (orantı) yöntemi
• Sık kullanılan güvenilir bir yöntemdir.
• Belli bir ilaç konsantrasyonunda dirençli
olan organizmaların oranının
belirlenmesini sağlar.
• Bu oran ≥ %1  R
Proporsiyon Yöntemi
• Lowenstein-Jensen (LJ)
 Ekonomik
 Geç sonuç verir (4-6 hf)
• Middlebrook 7H10-7H11
 Pahalı
 Daha hızlı (21 gün)
 Daha güvenilir
CLSI,
MD7H10 / MD7H11 besiyerinde yapılan
indirekt proporsiyon test yöntemini
referans yöntem olarak kabul etmektedir.
(Agar Proporsiyon Yöntemi)
CLSI, M24-A2
Hız?
Konvansiyonel katı kültür ve İDT kullanarak ÇİD-TB tanısı
Mikroskopi
24 saat
Katı kültür
6-8 hf
1. Seçenek İDT
3-4 hf
9-12 hf sonra
ÇİD-TB tanısı
Sıvı kültür ve İDT kullanarak ÇİD-TB tanısı
Mikroskopi
24 saat
Sıvı kültür
2-3 hf
1. Seçenek İDT
1-3 hf
3 -5 hf sonra
ÇİD-TB tanısı
WHO, A Roadmap for Ensuring Quality Tuberculosis Diagnostics
Services within National Laboratory Strategic Plans, 2011.
Öneri
30 gün içinde duyarlılık sonuçlarını bildirebilmek için;
Hızlı, kısa enkübasyon süreli, sıvı besiyerinde kültüre
dayalı ticari sistemler kullanılmalıdır.
CLSI, M24-A2
Aynı amaçla,
DSÖ de hızlı, ticari sıvı kültür sistemlerinin kullanımını
onaylamıştır.
WHO/HTM/TB/2009.422
Sıvı Besiyerinde Kültüre Dayalı
Hızlı Ticari Yöntemler
(Becton Dickinson)

MGIT 960
Versa TREK (ESP II)

Mycolor-TK ?
(Salubris)

(Trek Diagnostic )
FDA onaylı
Hız?
Konvansiyonel katı kültür ve İDT kullanarak ÇİD-TB tanısı
Mikroskopi
24 saat
Katı kültür
6-8 hf
1. Seçenek İDT
3-4 hf
9-12 hf sonra
ÇİD-TB tanısı
Sıvı kültür ve İDT kullanarak ÇİD-TB tanısı
Mikroskopi
24 saat
Sıvı kültür
2-3 hf
1. Seçenek İDT
1-3 hf
3 -5 hf sonra
ÇİD-TB tanısı
Çözüm?
Moleküler Yöntem, sıvı kültür ve İDT kullanarak ÇİD-TB tanısı
Mikroskopi
24 saat
1-2 gün sonra
ÇİD-TB tanısı
Moleküler yöntem (+)
24 saat
Moleküler yöntem (-)
24 saat
Sıvı kültür
2-3 hf
1. Seçenek İDT
1-3 hf
WHO, A Roadmap for Ensuring Quality Tuberculosis Diagnostics
Services within National Laboratory Strategic Plans, 2011.
Moleküler (Genotipik) yöntemler
– Line probe Assay (Ters hibridizasyon testi, LPA)
• Inno-LiPA Rif TB
(Innogenetics)
• GenoType MTBDRplus (Hain LifeScience)
• GenoType MTBDRsl
(Hain LifeScience)
– Real-time PCR
• GeneXpert MTB/RIF
(Cepheid)
– DNA microarray
• Infiniti MDR-TB
(AutoGenomics)
– DNA dizi analizi
• Konvansiyonel sanger yöntemi
• Pirosekanslama
– Elektroforez temelli testler
•
•
•
•
SSCP (Single strand conformation polymorphism)
PCR Heterodubleks analiz
DGGE (double gradient denaturing gradient gel electrophoresis )
RFLP (restriction fragment length polymorphism)
– dHPLC (denaturing high performance liquid chromatography)
– MAS-PCR (multiplex-allele-specific PCR)
– Mismatch analiz
Journal of Microbiological Methods 84 (2011) 155–160
Ticari Moleküler yöntemlerin hedef genleri
• MTBDRplus
(Hain LifeScience)
– RİF direnci

rpoB
– INH direnci

katG ve inhA
• MTBDRsl
(Hain LifeScience)
– Etambutol direnci
embB

– Amikasin, kanamisin, viomisin ve kapreomisin direnci  rrs
– Kinolon direnci
gyrA

• INNOLIPA RIF TB
–
(Innogenetics)
RİF direnci  rpoB
• GeneXpert MTB/RIF (Cepheid)
–RİF direnci 
rpoB
• Infiniti MDR-TB
(AutoGenomics)
– RİF direnci

rpoB
– INH direnci

katG ve inhA
– PZA direnci

pncA
MTBDRplus (Hain LifeScience)
Xpert MTB/RIF (Cepheid)
Avantajları;
• Dirençle ilişkili, bilinen mutasyonları saptamada duyarlı ve
özgül
– Kültürden çalışıldığında çok az bir üreme yeterlidir
– Klinik örneklerden direkt çalışılabilmektedir.
• Laboratuvar tehlikelerini en aza indirmektedir.
• Çok hızlı
Dezavantajları;
• İlaç direncine yol açan
tanımlanmamış mutasyonlar
 yanlış duyarlı
• Sessiz mutasyonlar
 yanlış dirençli
• Maliyet ?!
İlaç
Direnç
geni
Fenotipik dirençte
mutasyon sıklığı (%)
RIF
rpoB
>95
İNH
katG
inhA
~ %70-90
Journal of Microbiological Methods 84 (2011) 155.
Int J Tuberc Lung Dis. 2009;13(11):1320
• Belli durumlarda İlaç direncinin hızlı tanısı için
moleküler yöntemlerin
(LPA’lar ve Xpert MTB/RIF)
kullanılabileceği
onaylanmıştır.
- CLSI, M24-A2
- WHO/HTM/TB/2009.422.
- WHO/HTM/TB/2011.4
Direnç saptamak amacı ile
Hangi durumlarda moleküler yöntem kullanalım?
Yayma pozitif örnekten (Direkt)
• İlaç direnci olduğundan kuşkulanılan hastalarda
–
–
–
–
Daha önceye ait tedavi öyküsü olan
Yüksek direnç oranı olan ülke veya etnik gruptan olan
Tedaviye iyi yanıt vermeyen
ÇİD-TB teması olan hastalar
• Diğer kişilere hastalığı yayabilecek geniş bir temaslı
grubu olan hastalar
Kültürden (İndirekt)
• TDM ile karışık veya diğer bakterilerle kontamine
olan MTBC kültürlerinden
M24-A2
Öneriler;
• Moleküler yöntem fenotipik duyarlılık testlerinin
yerine kullanılamamalıdır.
• Saf kültür mevcut ise fenotipik testler uygulanmalıdır
• Sonuçları fenotipik testlerle doğrulanmalıdır.
• Moleküler yöntem ile ÇİD-TB ilişkili mutasyon
saptandığında, hemen kültür temelli yöntem ile
birinci ve ikinci seçenek ilaçlara duyarlılık test
edilmelidir.
M24-A2
Sorun
• ÇİD-TB’nin hızlı tanısında ticari sıvı kültür sistemleri
ve bazı moleküler testleri onaylanmasına rağmen,
Bu testlerin maliyeti ve ileri laboratuvar alt yapısı
gerektirmesi kısıtlı kaynağa sahip çoğu yerde bu
teknolojilerin uygulanmasını kısıtlamaktadır.
Çözüm?
Daha ileri altyapı ve tekniklere erişim sıkıntısı olan
laboratuvar için
ticari olmayan, hızlı, ucuz ve kolay yöntemler
Nonmoleküler Alternatif Yöntemler
 MODS (microscopic observation of drug susceptibility)
 NRA (nitrate reductase assay)
 CRI yöntemleri (colorimetric redox indicator)
 REMA (resazurin microtitre assay )
 Alamar blue
 MTT
 TLA (thin layer agar)
 Klasik
 Rapid Colorimetric DST (MDRXDRTB Colour Test)
 Mikobakteriyofaj bazlı testler
 Lusiferaz taşıyıcı faj yöntemi
 Faj çoğaltma yöntemi
DSÖ 2009 uzman grubu kararları;
Kısıtlı kaynağı ve uygun koşulları olan yerlerde;
1. MODS ve NRA, ÇİD-TB kuşkulu hastaların taranmasında geçici
bir çözüm olarak önerilmektedir
2. İndirekt CRI yöntemleri, ÇİD-TB kuşkulu hastalardan elde
edilen MTBC izolatlarının taranmasın da geçici bir çözüm olarak
önerilmektedir.
(saptama zamanı daha kısa olmayacak, fakat daha ucuz olacak)
3. TLA ve Faj temelli testlerin, ÇİD-TB kuşkulu hastaların
taranmasın da hızlı test olarak kullanımını önermek için yeterli
kanıt olmadığına karar verilmiştir.
WHO, A Roadmap for Ensuring Quality Tuberculosis Diagnostics
Services within National Laboratory Strategic Plans, 2010.
Sonuç
Farklı ekonomik koşullara ve farklı TB yüküne göre en uygun,
en hızlı,
en doğru,
en erişilebilir
testi kullanmamız gerekmektedir.
İyi donanımlı,
deneyimli,
kalite değerlendirme programlarına katılan
laboratuvarlarda uygulanmalıdır
Curr Opin Pulm Med 2011,17:134–141
Int J Tuberc Lung Dis 2012,16:860–70
EUCAST document E.DEF 8.1
Hangi ilaçları test edelim?

CLSI
 INH
 RIF
 EMB
 PZA

DSÖ ve TR
 INH
 RIF
 EMB
 SM
+
 PZA

DSÖ
(ekonomik alternatif)





INH
RIF
+
EMB
SM
PZA
İkinci seçenek ilaçlar
(Kanamisin, Amikasin , Kapreomisin, Ofloksasin)
• M24-A2
•WHO/HTM/TB/2008.392
• WHO/HTM/TB/2009.422
•SB, Ulusal TB Tanı Lab.ları Ağı Çalışma Usul Ve Esaslarına Dair Tebliğ, 2012
TÜBERKÜLOZ DIŞI MİKOBAKTERİLERİN
Duyarlılık Testleri
Duyarlılık testleri standardize edilmiş TDM’ler
• Yavaş üreyenler;
– M. avium kompleks
– M. kansasii
– M. marinum
• Hızlı üreyenler;
Diğer TDM’ler:
– Duyarlılık test sonuçları ile klinik yanıt uyumu ?
M24-A2
Ne zaman yapmalıyız?
• Sadece klinik olarak anlamlı olduğuna inanılan izolatlar
için yapılır.
• Kan, doku, steril vücut bölgeleri izolatları
• ≥2 pozitif balgam izolatı
• BAL izolatı
– Yavaş üreyen TDM’ler;
– Rutin duyarlılık testine gerek yok
– Tedavi başarısızlığı olanlarda önerilir
– Hızlı üreyenler;
– Klinik önemi olan tüm izolatlar için endikedir
M24-A2
Hangi ilaçları test etmeliyiz?
• M. avium kompleks
 R  Moksifloksasin, Linezolid
• Klaritromisin
• M. kansasii
 R  ikinci seçenek ilaçlar
• RİF
• M. marinum
– RIF,
– Doksisiklin/Minosiklin,
– SXT,
– Klaritromisin,
– EMB,
– Amikasin,
– Siprofloksasin,
– Moksifloksasin,
– Rifabutin
• Hızlı üreyenler
–
–
–
–
Amikasin,
Sefoksitin ,
Siprofloksasin,
Klaritromisin,
–
–
–
–
Doksisiklin/Minosiklin, – Moksifloksasin,
İmipenem,
– SXT,
Linezolid,
– Tobramisin (sadece M.chelonae için)
Meropenem,
M24-A2
Hangi yöntemi kullanmalıyız?
• Genel olarak önerilen sıvı mikrodilüsyon
•
•
Yavaş üreyenler : OADC eklenmiş Cation-adjusted Mueller Hinton broth
Hızlı üreyenler : Cation adjusted Mueller Hinton broth
Kim yapmalı?
• Klinik olarak önemli mikobakterileri tanımlayabilen
• Yeterli bilgi ve deneyimi olan laboratuvarlar
– yoksa referans lab.a göndermeli veya danışılmalı
M24-A2
Ticari mikrodilüsyon testi
(Sensititre; Trek Diagnostic)
• Sensititre MYCOTBI
• Sensititre SLOMYCOI
• Sensititre RAPMYCOI
 M. tuberculosis
 Yavaş üreyen TDM
 Hızlı üreyen TDM
Teşekkürler