S19-Yaşlanmanın Sıçan Dokularında Paraoksonaz Arilesteraz
Transkript
S19-Yaşlanmanın Sıçan Dokularında Paraoksonaz Arilesteraz
YAŞLANMANIN PARAOKSANAZ ARİLESTERAZ AKTİVİTESİNE ETKİSİNİN İNCELENMESİ Gözde AKYOL, Oya COġKUN, Duygu KARACAN, Deniz KAYA, Utku YALINBAġ Danışmanlar: Doç. Dr. Derya AKAYDIN ALDEMĠR, Prof. Dr. E. Suna TÜRKOĞLU ÖZET YaĢlanmanın doğumla baĢlaması nedeni ile sadece geciktirilebileceği ve yaĢam sürecinde oksidatif stresin artmasına karĢın antioksidan statüsün azaldığı bildirilmektedir. Bu çalıĢmada, sıçan dokularında paraoksonaz arilesteraz aktivitesinin varlığı ve yaĢlanma sürecinde enzim aktivitesindeki olası değiĢikliklerin incelenmesi amaçlanmıĢtır. Erkek Wistar albino sıçanlar üç farklı yaĢ grubunda: Grup 1 (2 aylık, n=8), Grup 2 (9 aylık, n=7) ve Grup 3 (15 aylık, n=8) olmak üzere çalıĢmaya alınmıĢtır. Anestezi altında intrakardiyak kan alımı sonrası deney hayvanları sakrifiye edilmiĢ; karaciğer ve böbrek izolasyonu gerçekleĢtirilmiĢtir. Elde edilen serum örneklerinde paraoksonaz arilesteraz aktivitesi ile ürik asit, kolesterol ve trigliserit deriĢimleri incelenmiĢtir. Karaciğer ve böbrek doku örneklerinde de paraoksonaz arilesteraz aktivitesi saptanmıĢtır. Analizler, yaĢlanma sürecinde kolesterol ve trigliserit deriĢimlerinin arttığını (sırası ile p<0,001 ve p<0,05), total antioksidan statüsün ise düĢtüğünü (p<0,05) göstermektedir. YaĢlanma ile artan serum paraoksonaz arilesteraz aktivitesi (p<0,01) ile serum total kolesterol deriĢimi pozitif korelasyon göstermektedir (r:0,593 p<0,01). Deneysel modelde, karaciğer paraoksonaz arilesteraz aktivitesi (g/doku) yaĢa bağımlı olarak değiĢmemektedir. Böbrek dokusunda ise paraoksonaz arilesteraz aktivitesi (g/doku) yaĢa bağımlı olarak artmaktadır (p<0,05). Bulgularımız yaĢlanma ile antioksidan statüste azalmanın gerçekleĢtiğini doğrulamaktadır. YaĢlanmaya bağlı olarak artması beklenen lipit oksidasyonlarına karĢı (lipoproteinlerin yapısında yer alan veya almayan özellikle fosfolipitler) antioksidan etkisi olduğu bilinen paraoksonaz aril esteraz aktivitesi doku-bağımlı olarak değiĢiklik göstermektedir. YaĢlanma ile geliĢen oksidatif stres ve oksidatif strese organizmanın verdiği cevap dokuya özgüdür. YaĢlanma, karaciğerin oksidatif strese olan duyarlılığını anlamlı olarak değiĢtirmemekte, böbrekleri ise oksidatif strese duyarlı kılmaktadır. Anahtar kelimeler: YaĢlanma, oksidatif stres, paraoksonaz arilesteraz, sıçan. 1 GİRİŞ Paraoksonazlar (PON1-3), Ca2+-bağımlı dimerik hidrolazlardır. Enzimlerin isimlendirilmesinde PON1’in paraoksonu hidroliz etme yetisi esas alınmıĢtır. PON1, paraoksonun yanı sıra pek çok organofosfat insektisit aktif metabolitinin de hidrolizinden sorumludur. Ayrıca sarin ve soman gibi nörotoksik sinir gazlarının detoksifikasyonunda da iĢlevi tanımlanmıĢtır. Buna karĢın PON2 ve PON3 paraoksonaz aktivitesine sahip değildir (2, 8, 9-11). Temel olarak laktonaz aktivitesine sahip olan enzimlerin substrat özgüllükleri çok geniĢtir. PON’lar pek çok ilacın ve ilaç öncüsünün metabolizmasına laktonaz aktivitesi ile katılmaktadırlar. Arakidonik asit metabolitlerini de substrat olarak tanıyabilmektedirler. Bunun yanı sıra PON1’in fosfolipaz A2 benzeri açil-, arilesteraz aktiviteleri tanımlanmıĢtır. PON 3’ün de düĢük olmak üzere arilesteraz aktivitesine sahip olduğu bildirilmektedir (4,8,9). Karaciğer, PON ekspresyonlarının ve aktivitelerinin en yüksek olduğu organdır. PON1 ve PON 3’ün temel sentezi karaciğerde gerçekleĢmektedir. Sentez sonrası karaciğerden plazmaya enzimlerin bir bölümü özgün taĢınım sistemi ile aktarılmaktadır. Plazmada lipoproteinlerle birlikteliği sağlanmaktadır. HDL, plazmada PON’larla iliĢkili olan ana lipoproteindir. PON2 ise intrasellüler bir protein olup, HDL ile iliĢkili değildir. Ġnsan dokularının hepsinde ekspresyonu bildirilmektedir. Karaciğer dıĢında yüksek ekspresyonu sırası ile akciğer, plezanta, testis ve kalpte gerçekleĢmektedir (8,9,11). PON’ların antioksidan ve antiaterojenik etkiye sahip oldukları bildirilmektedir. PON2’nin intrasellüler oksidatif streste süper oksit anyonunun birikimini engellemesi nedeni ile koruyucu olduğu ileri sürülmektedir (1, 2, 9, 11, 14). PON1 ve PON3’ün antioksidan etkisinin ise, özellikle HDL ve LDL’yi oksidasyonlardan korumak olduğu bildirilmektedir. Antioksidan etkinin olasılıkla aktive olmuĢ fosfolipitleri ve/veya lipit peroksit ürünlerini enzimlerin hidroliz etmesinden kaynaklanmaktadır. Enzimler, lipoproteinlerde yer alan fosfolipitlerin oksidasyonunu engeller ve oluĢanları ise hidroliz ederek yapıdan uzaklaĢtırır. HDL’nin antioksidan aktivitesinin, ağırlıklı olarak iliĢkili olduğu PON aktivitesinden kaynaklandığı ileri sürülmektedir. PON1’in özellikleri, kardiovasküler hastalıklar için bağımsız risk faktörü olduğu ileri sürülmesi nedeni ile daha fazla araĢtırmaya konu olmaktadır (6, 11, 14). YaĢlanma doğumla baĢlayan, ölüme neden olacak hastalıkların riskini arttırmaktan veya ölümle sonuçlanacak yıpranmayı yaratmaktan sorumlu, yıkıcı, ilerleyici ve evrensel değiĢimler birikimidir. YaĢlanma genetik, epigenetik ve çevresel faktörlere bağlı olan karmaĢık bir süreçtir (12). 2 YaĢlanmanın tam olarak mekanizması bilinmese de nedenini açıklayan teoriler üretilmiĢtir. Bu teoriler birbirleriyle endojen reaktif oksijen moleküllerinin/ radikallerinin (ROS) neden olduğu hasarlar konusunda örtüĢmektedir. ROS’lar (O2-•, H2O2, LOOH, OH•) O2’den daha kuvvetli oksitleme yetisine sahip ajanlardır. Hedefleri tüm biyolojik moleküller olup, zincir tepkimeler sonrası ilerleyici tarzda hasara neden olabilmektedirler. Oksidanların neden olduğu hasar, organizmada savunmadan sorumlu moleküller ve hasarlı biyolojik moleküllerin tamiri veya yok edilmesinden sorumlu enzimlerce kontrol altına alınmaktadır. Oksidanların deriĢiminin artması durumunda ise (oksidatif stres), ROS mekanizmasındaki kontrol yitirilmekte ve biyolojik moleküllerin hasarı önem kazanmaktadır. Oksidatif stresin, pek çok patolojik durumun yanı sıra yaĢlanmada da rolü olduğu ileri sürülmektedir (12, 13, 16, 20, 21). Oksidatif strese karĢı olan genler, SOD1, SOD2 ve paraoksonaz uzun ömür genlerindendir. Hücre içi veya hücre dıĢında HDL ile iliĢkili olmak üzere yer alan paraoksanaz enzimleri, temelde lipit peroksidasyonunu engellemekte ve bu nedenle oksidatif strese karĢı antioksidan etki gösterebilmektedir (18). YaĢlanmada PON1 aktivitesinin azaldığını ileri süren gerek deneysel gerek insan üzerinde yapılmıĢ sınırlı sayıda çalıĢmalar literatürde yer almaktadır. Ancak PON arilesteraz aktivitesinin yaĢlanma sürecinde doku bağımlı olası değiĢiminin yer aldığı az sayıda çalıĢma bulunmaktadır (10,15). Bu çalıĢmanın amacı; yaĢlanma sürecinde oluĢması beklenen oksidatif strese karĢı antioksidan bir enzim olduğu ileri sürülen paraoksonaz arilesteraz enzim aktivitesinin sıçan karaciğer, böbrek dokuları ile serumda yaĢa bağlı değiĢiminin incelenmesi ve bu değiĢimin plazmadaki total kolesterol, trigliserit ve total antioksidan durumun bir göstergesi olan ürik asit ile iliĢkilendirilmesidir. GEREÇ VE YÖNTEM Kimyasallar AraĢtırmada kullanılan bütün kimyasallar analitik saflıkta olup, Sigma, USA firmasından sağlanmıĢtır Deney Hayvanları ve Grupların Tanımlanması Bu araĢtırma 2010-2011 Dönem II Eğitim-Öğretim programında yer alan ÇalıĢma Grubu Dersi kapsamında gerçekleĢtirilmiĢtir. BaĢkent Üniversitesi Hayvan Deneyleri Etik Kurulu tarafından onaylanmıĢ (DA11/12) ve BaĢkent Üniversitesi AraĢtırma Fonunca desteklenmiĢtir. Beslenmeleri standart diyet ve su (ad libitum) ile sağlanan 8 adeti 2 aylık (Grup I), 7 adeti 9 aylık (Grup II) ve 8 adeti de 15 aylık (Grup III) olmak üzere toplam 23 adet Wistar albino erkek sıçan çalıĢmaya alınmıĢtır. Deney hayvanları, bir gecelik açlık sonrası anestezi altında intrakardiak kan alımı yolu ile sakrifiye edilip, karaciğer ve böbrek izolasyonu gerçekleĢtirilmiĢtir. Kan örnekleri 1500g’de 10 dk santrifüj edilmiĢ ve elde 3 edilen serumlardan ayrılan örnekler ile kadar –86oC da saklanmıĢtır. dokular enzim aktivite analizine Serum total kolesterol, trigliserit ve ürik asit analizleri Serum örneklerinde total kolesterol, trigliserit ve ürik asit analizleri Merkez Biyokimya Laboratuarında enzimatik kolorimetrik yöntem ile modüler sistemde gerçekleĢtirildi. Sonuçlar mg/dl olarak ifade edildi. Doku enziminin izolasyonu Doku örnekleri 2mM CaCl2 içeren 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) tamponunda cam-cam homojenizatör kullanılarak (1/10, w/v) homojenize edilmiĢtir. Homojenat örnekleri 15,000 g’de 10 dk. +4 C’de santrifüjlenerek enzim kaynağı olarak kullanılmıĢtır. Serum ve doku örneklerinde PON arilesteraz aktivitesinin analizi Serum ve izole edilen doku örneklerinde PON arilesteraz aktivitesi, Jerzy Beltwoski’nin yöntemine göre Biyokimya AraĢtırma Laboratuarında gerçekleĢtirilmiĢtir (4). Yöntemde PON arilesteraz aktivitesi fenilasetat’ın hidroliz edilme hızının spektrofotometrik (Shimadzu 1601) olarak 270 nm’de ölçülmesi esasına dayanmaktadır. Substrat olarak fenilasetat kullanılmıĢ ve PON arilesteraz aktivitesi molar ekstinksiyon katsayısı (E 270= 1310 M/ cm-1) kullanılarak hesaplanmıĢtır. Bir ünite , 1 µmol fenilasetatı bir dakikada hidroliz edebilen protein miktarı olarak kabul edilerek aktivite U/g doku olarak ifade edilmiĢtir. Serum PON arilesteraz aktivitesi ise U/ml olarak ifade edilmiĢtir. İstatistiksel değerlendirme DeğiĢkenlerin normal dağılıma uyumları Shapiro-Wilks testi ve grup varyanslarının homojenlikleri Levene testi ile kontrol edilmiĢtir. Veri seti parametrik testlerin ön Ģartlarını sağladığından, grup ortalamaları tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ile karĢılaĢtırılmıĢtır. ANOVA sonrası farklılığı yaratan grupların belirlenmesi amacıyla çoklu karĢılaĢtırma testlerinden Duncan testi uygulanmıĢtır. Parametreler arası korelasyonları değerlendirmek için Pearson korelasyon analizi yapılmıĢtır. Tüm veriler ortalama standart hata (ort SEM) olarak ifade edilmiĢtir. p<0,05 düzeyi istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiĢtir. Veri setinin değerlendirilmesinde SPSS 13.0 istatistik paket programı kullanılmıĢtır. BULGULAR: Serum ürik asit, kolesterol ve trigliserit derişimleri Serum ürik asit, kolesterol ve trigliserit deriĢimlerinin yaĢ bağımlı olarak değiĢimi Tablo 1’ de gösterilmektedir. YaĢlanma ile Grup 3 trigliserit deriĢimleri Grup 1’e göre anlamlı bir artıĢ gösterirken (p<0,05); kolesterol deriĢimleri ise hem Grup 1 hem de Grup 2’ye göre artıĢ göstermiĢtir 4 (p<0,001). Grup 3 ürik asit deriĢimleri ise Grup 1’e göre anlamlı bir azalma göstermiĢtir (p<0,05). Tablo 1. Serum ürik asit,kolesterol, trigliserit deriĢimleri. Grup 1(n=8) Grup 2(n=7) Grup 3(n=8) Ürik asit (mg/dl) 1,8 ± 0,27 1,14 ± 0,24 0,9 ±0,08* Kolesterol (mg/dl) 59,9 ± 3,61 58,6 ± 4,13 81,1 ± 3,63*** Trigliserit (mg/dl) 36,5 ± 2,17 47,6 ± 4,26 58,8 ± 8,63* Grup 1 (2 aylık), ; Grup 2 (9 aylık), ; Grup 3 (15 aylık). Veriler, ortalama standart hata olarak verilmiĢtir. *p<0,05 Grup III, Grup I’e göre; ***p<0,001 Grup III, GrupI ve Grup II’ye göre. PON Arilesteraz aktivitesi Serum PON arilesteraz aktivitesi ġekil 1’de verilmiĢtir. Enzim aktivitesi yaĢlanma ile istatiksel olarak anlamlı bir artıĢ göstermektedir (p<0,01). Serum PON arilesteraz aktivitesi ile kolesterol deriĢimi arasında pozitif korelasyon saptanmıĢtır ((r=0,593 p 0,01). Karaciğer PON arilesteraz aktivitesi ise çalıĢılan yaĢ diliminde gruplar arasında anlamlı bir fark göstermemektedir (ġekil 2). Böbrek PON arilesteraz aktivitesinde yaĢ-bağımlı anlamlı artıĢ saptanmıĢtır (p<0,05; ġekil 3). Aktivite (U/ml) 140 120 100 80 60 40 20 0 Grup1 Grup2 Grup3 Şekil 1. Serum PON Arilesteraz aktiviteleri. Grup 1 (2 aylık), n=8; Grup 2 (9 aylık), n=7; Grup 3 (15 aylık), n=8. Veriler her grupta ortalama standart hata olarak verilmiĢtir.**p<0,01 Grup III, Grup I ve Grup II’ye göre. 5 Aktivite (U/g) 120 100 80 60 40 20 0 Grup1 Grup2 Grup3 Şekil 2. Karaciğer PON Arilesteraz aktivitesi. Grup 1 (2 aylık), n=8; Grup 2 (9 aylık),n=7; Grup 3 (15 aylık), n=8. Veriler her grupta ortalama standart hata olarak verilmiĢtir. * Aktivite (U/g) 40 30 20 10 0 Grup1 Grup2 Grup3 Şekil 3. Böbrek PON Arilesteraz Aktivitesi. Grup 1 (2 aylık), n=8; Grup 2 (9 aylık), n=7; Grup 3 (15 aylık), n=8. Veriler her grupta ortalama standart hata olarak verilmiĢtir. *p<0,05 Grup III, Grup I’e göre. TARTIŞMA YaĢlanmaya bağlı olarak organizmamızda biyolojik moleküller tersinemeyen modifikasyonlara uğramaktadırlar. Bu modifikasyonlar temelde yaĢlanma ile artan oksidatif stres ile iliĢkilendirilmektedir. Reaktif oksijen türlerinin metabolizmasında kontrolün yitirilmesi oksidatif hasarın artmasına neden olmaktadır. Lipit oksidasyon ürünlerinin, biyolojik moleküllerde çapraz bağlanmaların, protein glikozilasyonlarının artması, proteinlerin oksidatif modifikasyonları nedeni ile aktivitelerindeki kayıplar ve DNA’nın oksidatif yıkımı söz konusu hasarlar arasında yer almaktadır (12, 13, 16, 20). YaĢlanma ile metabolizmada çeĢitli değiĢiklikler meydana gelmektedir. Bu metabolik değiĢikliklerden biride lipit metabolizmasında yaĢa-bağımlı olarak geliĢen değiĢimlerdir. AraĢtırmalar, yaĢlanma ile plazma trigliserit deriĢiminin arttığını göstermektedir. AraĢtırmamızda, trigliserit deriĢimde istatistiksel olarak anlamlı olmak üzere yaĢ-bağımlı artıĢ saptanmıĢtır (p<0,05). Trigliserit deriĢimindeki artıĢ, olasılıkla deney hayvanlarının 6 yaĢlanmaya bağlı olarak kafesler içindeki spontan aktivitelerindeki azalma nedeni ile lipoprotein lipaz aktivitelerindeki düĢüĢten kaynaklanmaktadır. Bey ve arkadaĢları söz konusu durumu, farklı sıçan ırklarında deneysel olarak göstermiĢlerdir (5). YaĢlanma ile birlikte plazma total kolesterol deriĢimi genel olarak artmaktadır. Kolesterol kleransındaki yetersizlik ve /veya yetmezlik artıĢın temel nedenidir. ÇalıĢmamızda söz konusu durumla uyumludur. YaĢlanma ile plazma total kolesterol deriĢimi artmıĢtır (p 0,001). Ürik asit, singlet oksijen, peroksi radikalleri ve hidroksi radikallerini süpürme yetisine sahiptir. Serumdaki deriĢimi total antioksidan kapasitenin göstergesi olarak kabul edilmiĢtir. Serum ürik asit deriĢimindeki azalma, reaktif oksijen türlerinin deriĢimin arttığını ve oksidatif hasara duyarlılık kazanıldığının bir göstergesidir. ÇalıĢmamızda incelen yaĢ aralığında, ilerleyen yaĢla beraber ürik asit deriĢiminde azalma saptanmıĢtır (p 0,05). Bu veri oksidatif stres varlığının bir göstergesidir (7, 17, 19). Paraoksonazlar, antioksidan etkiye sahip enzimlerdir. PON 1, akut organofosfat insektisit ve soman, sarin gibi nörotoksik ajanların detoksifikasyonlarına karĢı ve özellikle aterosikleroz ve diabet patogenezinde çok önemli olan lipit peroksidasyonlarına karĢı koruyucu etki göstermektedir. Bu neden ile serum PON 1 aktivite ve/veya deriĢiminin arttırılmasının yararlı olacağı ileri sürülmektedir (8, 9). AraĢtırmamızda, serum paraoksonaz arilesteraz aktivitesi incelenen yaĢ diliminde yaĢlanma ile artmaktadır (p 0,01). Antioksidan statüsteki bu artıĢ, yaĢlanma ile geliĢen oksidatif strese organizmanın cevabıdır. Söz konusu artıĢ ile serum kolesterol deriĢimi arasında anlamlı pozitif korelasyon saptanmıĢtır (r=0,593 p 0,01). Bu iliĢki, artan enzim aktivitesinin kolesterol taĢınımından sorumlu lipoproteinlerin oksidasyondan korunması amaçlı olduğunu düĢündürmektedir. ÇalıĢmamızda, arilesteraz aktivitesinin karaciğer ve böbrek dokusunda varlığı belirlenmiĢtir. Böbrek dokusunda aktivite karaciğerdeki aktivitenin yaklaĢık üçte biri kadardır. Karaciğer arilesteraz aktivitesi yaĢlanma ile değiĢmemektedir. Bu sonuç karaciğerde antioksidan statüsün yüksek olduğunun bir göstergesidir. Buna karĢın incelen yaĢ diliminde böbrek arilesteraz aktivitesi yaĢlanma ile anlamlı olmak üzere artmıĢtır (p 0,05). Bu sonuç, böbrek dokusunda yaĢlanma ile oluĢan oksidatif strese dokunun cevabı olarak değerlendirilmiĢtir. SONUÇ GeliĢmesi beklenen oksidatif stres, dokuya özgüdür. Dokunun oksidatif strese verdiği cevap, antioksidan yeterliliğine bağlı olarak farklılık göstermektedir. YaĢlanma, karaciğerin oksidatif strese olan duyarlılığını anlamlı olarak değiĢtirmemekte, böbrekleri ise oksidatif strese duyarlı kılmaktadır. 7 KAYNAKÇA 1. AteĢ O, Azizi S, Alp H.H. et al. Decreased serum Paraoxonase 1 activity and increases serum homocysteine and malondialdehyde levels in age related macular degeneration. The Tohoku J Exp Med. 2009;217:17-22. 2. Aviram M, Rosenblat M. Paraoxonases 1, 2, and 3,oxidative stress, and macrophage foam cell formation during atherosclerosis development. Free Rad Bio Med. 2004; 37(9): 1304-1316. 3. Aharoni A et al. Directed evolution of mammalian paraoxonases PON1 and PON3 for bacterial expression and catalytic specialization. PNAS. 2004; 101: 482-487. 4. Beltowski J,Wojcika G,Jamroz A. Effect of 3-hydroxy3methylglutarylcoenzyme a reductase inhibitors(statins) on tissue paraoxonase 1 and plasma platelet activating acetylhydrolase activities.J.Cardiovasc Pharmacol 2004; 43(1):121-127. 5. Bey L et al. Reduced lipoprotein lipase activity in postural skeletal muscle during aging. J Appl Physiol. 2001; 91: 687-692. 6. Cakatay U, Kayali R, Uzun H. Relation of plasma protein oxidation parameters and paraoxonase activity in the ageing population. Clin Exp Med. 2008;8(1):51-57. 7. Chelchowska M et al. The effect of tobacco smoking during pregnancy on plasma oxidant and antioxidant status in mother and new born. Eur J Obstet Gynecol Rep Biol 2011; 155: 132-136. 8. Costa LG et al. Modulation of paraoxonase 1 (PON 1) activitiy. Biochem Pharmacol. 2005; 69: 541-550. 9. Costa LG, Giordano G, Furlong CE. Pharmacological and dietary modulators of paraoxonase 1 (PON 1) activitiy and expression: The hunt goes on. Biochem Pharmacol . 2011; 81:337-344. 10. Gabrowny H.K., Farag M.E., Sallam A.A.A. Involvement of paraoxonase in oxidative stres induced by chlorpyrifos in albino rats. J Egypt Soc Toxicol. 2007;37:71-86. 11. Gupta N, Gill K, Singh S. Paraoxonases: Structure,gene polymorphism and role in coronary artery disease. Indian J Med Res. 2009; 130: 361-368. 8 12. Halliwell B, Gutteridge M.C. Role of free radicals and catalytic metal ions in human disease: An overview. Methods in Enzymology. 1990; 186: 1-85. 13. Harman D. Extending functional life span. Exp Gerontol. 1998; 33: 95-112. 14. Jaouad L et al. Age-related decrease in high-density lipoproteins antioxidant activity is due to an alteration in the PON1’s free sulfhydryl groups. Atherosclerosis. 2006; 185: 191-200. 15. Karanth S, Pope C. Carboxylesterase and A-Esterase activities during maturation and aging: Relationship to the toxicity of chlorpyrifos and parathion in rats. Toxicol Sci. 2000; 58:282-289. 16. Martin R. Fitzl G. Mozet C. et al. Effect of age and hypoxia/reoxygenation on mRNA expression of antioxidative enzymes in rat liver and kidneys. Exp Gerontol. 2002; 37: 14791485. 17. Maxwell SR et al. Antioxidant status in patient with uncomplicated insulin-dependent and non-insulin-dependent diabets mellitus. Eur J Clin Invest. 1997; 27:484-490. 18. Negre-Salvayre A, Coatrieux C, Ingueneau C, Salvayre R. Advanced lipid peroxidation end products in oxidative damage to proteins, potential role in diseases and therapeutic prospects for the inhibitors. BJP. 2008; 153:6–20. 19. O’Reilly EJ et al. Plasma urate and Parkinson’s disease in women. Am J Epidemiol. 2010; 172: 666-670. 20. Stadtman E.R. Importance of individuality in oxidative stress and aging. Free Rad Bio Med. 2002; 33(5): 597-604. 21. Zanetti M, Capellari, GG., Burekovic Ġ et al. Caloric restriction improves endothelial dysfunction during vascular aging: Effects on nitric oxide synthase isoforms and oxidative stress in rat aorta. Exp Gerontol. 2010; 45(11):848-55. 9