Referans dışı yöntemlerdeki gelişmeler neler sunuyor?

Referans dışı yöntemlerdeki gelişmeler neler sunuyor?

Referans Dışı Yöntemlerdeki
Gelişmeler Neler Sunuyor?
Dilek Yeşim METİN
Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi
Mikrobiyoloji AD, Bornova-İZMİR
Antifungal
Duyarlılık
testleri
Antifungal tedavinin doğru
yönlendirilebilmesi
Klinik yanıtın tahmin edilebilmesi
CLSI (Clinical and Laboratory Standarts
Institute) Kılavuzları
Mayalar-sıvı
dilüsyon
• 1992
• M27P
• 1995
• M27T
• 1997
• M27A
• 2002
• M27A2
• 2008
• M27A3
• M27S3
Mayalar- disk
difüzyon
• 2003
• M44P
• 2004
• M44A
• 2009
• M44A2
• M44S3
Küfler-sıvı
dilüsyon
• 1998
• M38P
• 2002
• M38A
• 2008
• M38A2
Küfler-disk
dfüzyon
• 2009
• M51P
• M51S1
• 2010
• M51A
The European Committee on Antimicrobial Susceptibility
Testing” Antifungal Susceptibility Testing
(EUCAST-AFST)
Dilüsyon temelli
Mayalar
Küfler
EUCAST E.Def 7.2
EUCAST E.Def.9.2
Referans Dışı Yöntemler
Dilüsyon Temelli Testler
Kolorimetrik dilüsyon testleri
•Sensititre YeastOne (TREK Diagnostic Systems Inc.,Westlake, Ohio)
•ASYT Kalorimetrik Antifungal Panel (Kyokuto Pharmaceutical Industrial, Japan)
•Liofilchem® SensiQuattro Candida EU ((Liofilchem Diagnostics, L’Aquila, Italy)
•Candifast Es Twin (ELITech Microbiology Reagents; France)
•Integral Yeast Systems Yeasts (Liofilchem Diagnostics, L’Aquila, Italy)
•Fungitest (Bio-Rad Laboratories, France)
•ATB Fungus 3 (API-bio-Mérieux, Marcy I’Etoile; France)
•Mycostandard (Institut Pasteur, Paris, France)
•Mycototal (Behring Diagnostic, Rueil-Malmaison, France)
Tam otomatize sistemler
• Vitek 2 (bio-Mérieux, Marcy I’Etoile; France)
Referans Dışı Yöntemler
Difüzyon Temelli Testler
Gradiyent Strip Test
• Etest (bioMérieux, France)
• The Liofilchem MIC Test Strips (Roseto degli Abruzzi Italy)
Disk Difüzyon /Tablet Difüzyon Test
• Neo-Sensitabs tablet (A/S Rosco Diagnostica, Denmark)
• Abtek Biological antifungal disks (Abtek Biologicals Ltd.,
Liverpool, UK)
• BBL Sensi-Disc (BD Diagnostics, New Jersey, US)
• Fungidisc (Mast Group Ltd., Merseyside, UK)
Referans Dışı Yöntemler
"Araştırma amaçlı"
•
•
•
•
•
•
•
Akan hücre ölçer "flow cytometry"
MALDİ-TOF
İzotermal mikrokalorimetre
X-Plate tekniği
XTT
Ergosterol miktarının tayini
Nükleik asit temelli yöntemler
Referans Dışı Yöntemler
FDA onaylı-Candida kökenleri için
Etest (bioMerieux, Marcy
l’Etoile, France
Sensititre YeastOne (TREK
Diagnostic Systems
Inc.,Westlake, Ohio);
VİTEK 2 (bioMerieux;
France)
flukonazol
itrakonazol
vorikonazol
flusitozin
flukonazol
itrakonazol
vorikonazol
flusitozin
kaspofungin
flukonazol
flusitozin
kaspofungin (!)
Mikafungin (!)
Kullanılan ticari yöntemler
13
6
6
4
Etest
Vitek
Sensititre
DD
1
1
Biorad
API ATB
Fungus 3
Gradiyent strip test
Yüzeyinde tek bir antifungal ilacı, giderek artan
oranlarda içeren plastik şeritlerin mantar inokule
edilmiş agar plakları üzerine yerleştirilmesini temel alan
duyarlılık testi yöntemidir.
Gradiyent strip test
Etest (bioMérieux, France)
The Liofilchem MIC Test Strips (MTS) (Via
Scozia, Roseto degli Abruzzi (Te) Italy)
Gradiyent strip test (Etest)
• 15 dilüsyonluk skala
– Amphotericin B (0.002-32 µg/ml)
– Anidulafungin (0.002-32 µg/ml)
– Caspofungin (0.002-32 µg/ml)
– Flukonazol (0.002-32 µg/ml)
– Flucytosine (0.002-32 µg/ml)
– İtrakonazol (0.002-32 µg/ml)
– Ketokonazol (0.002-32 µg/ml)
– Posakonazol (0.002-32 µg/ml)
– Vorikonazol (0.002-32 µg/ml)
Gradiyent strip test
Besiyeri
• MOPS’la tamponlanmış, %2 glikoz içeren
RPMI 1640 besiyeri
İnokulum
• Candida ve Aspergillus türleri: 0,5
McFarland
• C. neoformans ve bazı küfler: 1 McFarland
Enkübasyon
süresi
• Aspergillus ve Rhizopus türleri: 18-24 saat
• Candida türleri: 24-48 saat
• C. neoformans: 48-72 saat
Değerlendirme
• Mayalar; azoller için %80, amfoterisin B için
%100 olan inhibisyon zonu
• Küfler; %100 inhibisyon zonu
Gradiyent Strip Test-Sinerji
Pankey G et al. Antimicrob Agents Chemother 2014; 58: 5795-5800
• 35 C. glabrata, Polimiksin B ve Flukonazol
• BMD Time kill, E test arasındaki uyumsuz
sonuçlar kökenlere veya yöntem farklılıklarına
bağlı olabilir.
• Etest sinerji yöntemi araştırma amaçlı kullanılan
bir yöntem.
• Time kill yöntemi de standardize değil
• Etest yöntemi daha elverişli, kullanımı daha
kolay ve tekrar edilebilir.
Etest
sinerji
Etest
etkisiz
BMD time
kill Sinerji
BMD time
kill Etkisiz
13
6
8
8
Gradiyent Strip Test-Sinerji
Time-kill
Etest
En iyi sinerji kaspofungin+vorikonazol
Referans Yöntemlerle Uyum-Mayalar
Dannaoui E ve ark. Clin
Microbiol Infect. 2010
Referans
Yöntem
EUCAST
AMB
FLU
ITC
VOR
75
71.7
70.7
86.6
25-91
POS
CAS
ANF
75
-
Bourgeois N ve ark. J
Clin Microbiol, 2010
CLSI
32-100
Pfaller MA ve ark. L Clin
Microbiol. 2010
Espinel Ingrof A ve ark.
Antimicrob Agents
Chemother. 2010
CLSI
-
-
-
-
90.2
93.2
CLSI
-
-
-
-
-
54-82
88-100
Cuenca-Estrella M ve
ark. J Clin Microbiol.
2010
Ranque S ve ark. J Clin
Microbiol, 2012
CLSI
EUCAST
97.4-96.4
98.4
96.4-95.2
97.2
-
95.2-95.2
95.2
-
-
CLSI
≥90
Mahabeer Y ve ark.
Diagn Microbiol Infect
Dis. 2014
CLSI
C. neoformans
83.3
95.1
Koehling HL ve ark. J
Clin Microbiol, 2015
EUCAST-MTS
60-100
87-100
76.598.5
91.2
-
80-100
92-100
49-100
Referans Yöntemlerle Uyum-Küfler
Araujo J ve ark.
Antimicrobial Agents
Chemother. 2009
Martos AI ve ark. Med
Mycol. 2010
Fuller J ve ark J Clin
Microbiol. 2010
Pinto E ve ark.
Mycopathologia, 2014
Referans
Yöntem
CLSI
Cins/tür
Antifungal
Uyum
A. fumigatus
Posakonazol
92 (24 saat)
90 (48 saat)
CLSI
Aspergillus türleri
(A. niger ve A.
glaucus dışında)
Ekinokandinler
82.4-100
CLSI
Aspergillus
Kaspofungin
CLSI
*(MHA)
Aspergillus spp
(48), Fusarium spp
(7), Beauveria
bassiana (1)
Paecilomyces
lilacinus (3)
Kaspofungin,
anidulafungin,
vorikonazol,
posakonazol, AmB
18 (MHA)
26 (RPMI)
71.9 (±1)
99.7 (±2)
*MHA: Müller Hinton Agar besiyeri
Üç yöntemden en az
birinde yüksek MİK
değerleri gösteren
kökenlerde FKS1 ve
FKS2 mutasyonu
aranmış
Amaç
C. glabrata’nın (n: 193) KF duyarlılığını 3 yöntemle
değerlendirmek
Etesti referans yöntemlerle karşılaştırmak
MİK değerlerini farklı sınır değerleri ile değerlendirmek
Sınır değerler
• S ≤ 0.125 mg/l, I = 0.25 mg/l, R≥ 0.5 mg/l (Pfaller ve ark)
• S ≤ 0.5 mg/l, R> 0.5 mg/l (Arendrup ve ark.)
• Etest: S ≤ 2 mg/l, R > 2 mg/l (üretici önerisi)
Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2014; 33: 1247-1252
Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2014; 33: 1247-1252
• ≤0.25 mg/L olan köken
• Etest ile %98.4
• CLSI ile %90.7
• EUCAST ile %26.4
• ≤0.5 mg/L olan köken
(EUCAST): %93.2
• 16 köken; CLSI (R), Etest (S)= ÇBH
18 kökende FKS1 mutasyonu yok. FKS2 mutasyonu 3 kökende (!)
Etest; FKS mutasyonunu saptamada CLSI ve EUCAST kadar başarlılı
C. glabrata için önerilen sınır değer; S ≤ 0.5 mg/l, R> 0.5 mg/l (Arendrup ve ark.)
24 saatlik değerlendirmeler başarılı bulunsa da, C. glabrata yavaş ürediği için 48
saatlik değerlendirmeler önerilmektedir.
Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2014; 33: 1247-1252
"dip-effect"
• Düşük konsantrasyonlarda, stribe paralel görülen dar
inhibisyon zonu
Amaç:
• Candida türleri (n: 60), ekinokandinler, MTS (Liofilchem-Roseto
degli Abruzzi Italy) X SYO ve CLSI yöntemi değrelendirmek
• "dip-effect" görüldüğünde, MİK değerlendirmesi için yeni bir
formül geliştirmek
Yöntem:
• Ekinokandin duyarlılık testleri SYO ve MTS ile yapıldı
• "dip-effect" varlığında, Etest ve CLSI
J Clin Microbiol. 2015; doi: 10.1128/JCM.02073-15
Dip-effect varlığında MİK değerlendirme
• inhibisyon zonunun, stribi kestiği dipeffect’in tabanı (üretici firma önerisi)
• Eliptik inhibisyon zonunun tahmini
olarak stripi keseceği yer, dip-effect’in
üstü
• Yeni geliştirilen formülle bulunan değer
J Clin Microbiol. 2015; doi: 10.1128/JCM.02073-15
İlaca ve
MİK’e bağlı
gelişen bir
fenomen
• Yalnızca kaspofunginde gözleniyor
"Plastik striplerden difüzyon sorunu,
daha düşük moleküler ağırlığı nedeniyle
olabilir"
• CLSI MİK ≥ 0.5mg/L ise; "dip-effect" yok
Etest ile değerlendirildiğinde,
"dip-effect" net değil
• Eliptik zon daha uzun, fenomen
daha kısa ve stribi kesen açı dar
"dip-effect" anlaşılır değilse,
duyarlı kökenler yanlışlıkla,
dirençli olarak
yorumlanabilir.
Gradient konsantrasyonları 0.03-1 mg/L; ise
• değerlendirme hatalarını önlemek için bu yeni
formülasyonla MİK değerlerini hesaplama öneriliyor
Gradiyent Strip Test
Uygulaması kolay
Kontaminasyon kolay farkedilir
İnokulum değişikenliklerine tolerans
gösterir
AmB içim MİK aralığı daha geniş
MİK, mantarın üreme hızından etkilenmez
Antifungaller arası sinerji çalışılabilir
CLSI sınır değerleri kullanıyor. Yönteme uygun
KSD/ECV’leri yok
Pahalı
Okuma-değerlendirme ile ilgili teknik
sorunlarla karşılaşılabiliyor
Referans yöntemlerle uyumu tür-ilaç
kombinasyonuna göre farklılık gösteriyor
Küf mantarları için onay yok
Sensititre YeastONE Antifungal Duyarlılık
Paneli
Kolorimetrik mikrodilüsyon
yöntemi
CLSI sınır değerleri kullanılır
Amphotericin B
Dilüsyon Aralıkları
µg/ml
0.12 - 8
5-Flucytosine
0.06 - 64
Anidulafungin
0.015 - 8
Caspofungin
0.008 - 8
Micafungin
0.008 – 8
Fluconazole
0.12 - 256
Itraconazole
0.015 - 16
Variconazole
0.008 - 8
Pasaconazole
0.008 - 8
Antifungal İlaçlar
Dehidrate formda, çift kat
dilüsyonlu, 9 antifungal içerir
Kolorimetrik son nokta okuması
için alamar mavisi indikatörü içerir.
Sensititre YeastONE Antifungal Duyarlılık Paneli
Mayalar
Küfler
• İnokulum: 1.5 -8X 103 cfu/ml [0.5 Mc Farland
maya süspansiyonu + yeast One buyyon
(RPMI1640+%1.5 glikoz)]
• Enkübasyon süresi: Candida türleri: 24 saat, C.
neoformans: 48 saat
• Değerlendirme: Renk değişikliğinin olduğu en
düşük konsantrasyon: MİK
• İnokulum: 0.5-5 X 104 cfu/ml [0.5 Mc Farland
maya süspansiyonu+yeast One buyyon
(RPMI1640+%1.5 glikoz)]
• Enkübasyon süresi: 48 – 72 saat
• Değerlendirme: Renk değişikliğinin olduğu en
düşük konsantrasyon: MİK
Sensititre YeastONE Antifungal Duyarlılık Paneli
En yaygın kullanılan ticari yöntemlerden biri!
Kullanıma hazır, tek kullanımlık ambalajlarda,
uygulaması kolay, güvenilir
Hızlı ve zamanında sonuç verebilen,
tekrarlanabilirliği yüksek
Sensititre YeastONE Antifungal Duyarlılık Paneli
%99.3
Ekinokandinler, Candida türleri
için valide edilmiştir.
%100
%100
Yüksek düzeyde tekrarlanabilirlik:
%99
Sensititre YeastONE Antifungal Duyarlılık Paneli
Cins/tür
Referans
Yöntem
CLSI
AMB
FLC
FLU
ITC
VOR
CAS
≥92
≥92
82
≥92
85
≥92
CLSI 24
CLSI 48
EUCAST
97.4
96
97.9
95.2
95.2
96
96
95.6
97.2
-
95.6
95.2
95.5
Alexander BD ve
ark. . J Clin
Microbiol. 2007
Cuenca-Estrella
M ve ark. J Clin
Microbiol. 2010
Candida spp
(212)
Castro C ve ark.
J Clin Microbiol.
2004
Guinea J ve ark.
Diagnos
Microbiol Infect
Dis. 2006
Aspergillus spp
(63)
A.fumigatus
CLSI 24
CLSI 48
CLSI72
Patel R ve ark. J
Clin Microbiol.
2007
Aspergillus spp
(179)
Fusarium spp
(41)
Zygomycetes (29)
CLSI
Maya
-
POS
82.5
0
31.5
82.1
86.7
98.3
98.2
92.8
98.3
98.9
97
100
93
Sensititre YeastONE Antifungal Duyarlılık
Paneli
Dirençli kökenleri saptamada başarılı ve CLSI ile güçlü
korelasyon göstermekte
Klinik sınır değerler, CLSI’ya dayanır
CLSI klinik sınır değerleri, kazanılmış yada mutasyonel
direnç kazanan mantarı duyarlı olarak tanımlayabilir
J Clin Microbiol. 2013; 51: 2691-2695
J Clin Microbiol. 2012; 50: 3921-3926
857 köken (1 merkez)
• SYO için belirlenmiş KSD’ler yok, CLSI
önerileri ile
• Ekinokandin, AmB ve FC / azoller için
Candida türlerinde WT –MİK dağılımını
göstermek
• Her bir tür-ilaç kombinasyonu için ECV
değerleri önermek
• Beş farklı yöntemle ve CLSI yöntemi ile
elde edilen ECV’leri karşılaştırmak
1995-2010
• C. albicans (334)
• C. parapsilosis (315)
• C. glabrata (56)
• C. tropicalis (62)
• C. orthopsilosis (63)
• C. krusei (27)
1262 köken (43 merkez)
2009-2010
• C. albicans (610)
• C. parapsilosis (327)
• C. glabrata (156)
• C. tropicalis (113)
• C. orthopsilosis (30)
• C. krusei (26)
J Clin Microbiol. 2013; 51: 2691-2695
J Clin Microbiol. 2012; 50: 3921-3926
CLSI ile SYO MİK/ECV dağılımları uyumlu
Avantajı
•tedavi öncesi elde edilen
kökenlerle çalışılmış
Kısıtlılıkları.
• tek ülke verisi,
• C. krusei ve C. orthopsilosis’in
sayıca az olması
• direnç mekanizması bilinen
köken sayısı az
Kalıcı ECV’ler belirlenerek, duyarlılıkları azalmış ya da direnç
kazanmış kökenler daha kolay tanımlanır
Antimicrob Agents Chemother, 2015; 59: 6725-6732
Amaç:, 9 ülke, 38 bağımsız laboratuvardan, 8 farklı Candida
türleri için elde edilen verilerle tür-ekinokandin kombinasyonu
için SYO ECV değerleri önermek
81 non-WT, 14 WT (6 laboratuvardan)
SYO ECV’ler, modal MİK dağılımlarına göre hesaplandı.
SYO-ECV
5 Candida türüne ait, 81
fks mutant kökenleri
SYO ECV
üç ekinokandin
Anidulafungin:
72 (%88.9)
non-WT
kökenleri74belirlemede
Kaspofungin:
(%91.4)
katkı sağlayabilir.
Mikafungin:
76 (%93.8)
VITEK 2
• Dilüsyon temelli tam otomatik antifungal duyarlılık
sistemi
• Eş zamanlı tanımlama
• Spektrofotometrik değerlendirme
• Daha objektif ve daha kısa sürede
– Candida türleri için 9.1-27.1 saat (ortalama 12-14 saat)
– Cryptococcus türleri 12.1 saat
FDA , 2006 yılında flukonazol direncini saptamada klinik
kullanımını onayladı
VITEK 2 Antifungal Duyarlılık Kartları
Vitek 2 ASTYS01
•Amfoterisin B,
Flusitozin,
Flukonazol,
Vorikonazol
Vitek 2 ASTYS02
•Flukonazol
Vitek 2 ASTYS06
•Amfoterisin B,
Flusitozin,
Flukonazol,
Vorikonazol,
Kaspofungin
Vitek 2 ASTYS07
•Amfoterisin B
Flusitozin,
Flukonazol,
Vorikonazol,
Kaspofungin,
Mikafungin
Vitek 2 AF03
IUO yeast
Flukonazol
Cuenca-Estrella M ve
ark. J clin Microbiol,
2010
Bourgeois N ve ark. J
Clin Microbiol. 2010
Peterson JF ve ark. J
Clin Microbiol. 2011
Melhem MSC ve ark.
Brazil J Microbiol.
2013
Mahaber Y ve ark.
Diagnost Microbiol
Infect Dis. 2014
Figueiredo-Carvalho
MHG ve ark.
Mycopathologia,
2014
Referans
Yöntem
CLSI
Cins/tür
AmB
Flu
Vori
Candida, C.
neoformans
99.3
96.6
96.8
98.7
97.5
97.5
CLSI
Candida
86.4-100
94.6100
89.6100
CLSI
Candida
CLSI ve
EUCAST
Candida
100
100
CLSI
C. neoformans
95.1
97.1
CLSI
C. Parapsilosis
komplex
100
100
EUCAST
KF
MF
99.5
98.6
100
100
100
205 Candida türü, AmB, flukonazol, vorikonazol
Çok büyük hata C. glabrata kökenlerinde
C. krusei ve C. glabrata gibi azollere dirençli olabilen kökenler için Vitek
sınır değerleri yeniden düzenlenmeli
Türe özgü sınır değerler?
Ya da EUCAST sınır değerlerinin kullanımı
3 farklı lab, 425
Candida türü
Diag Microbiol Infect Dis 2013; 77: 37-40
Vorikonazol
ECV
wt≤0.5, ≥1 non wt
J Clin Microbiol 2014; 52: 2126-30.
• Flukonazol dilüsyonları düzenlenmiş, Vitek 2 AF03 IUO yeast
(0,5-64 µg/ml)
• 86’sı dirençli olan 746 köken
• Yeni belirlenmiş türe özgü klinik sınır değerleri
• Esas uyum:
• Candida türleri %94, C. neoformans %86.4
– C. glabrata %88.4, C. kefyr %66.7
• Kategori uyumu Candida türleri %92, C. neoformans %84.1
C. glabrata
Vitek: ≤ 0.25 - ≥ 4
CLSI:
≤ 0.125 (S)
0.25 (I)
≥ 4 (R)
CLSI & Vitek
Esas uyum:
%92.6
fks : %78.6
WT: %98.5
Candida spp (n: 98)
[fks mutant (n: 31)]
FKS geni "altın
standart"
Vitek 2
CLSI
EUCAST
(KF)
(KF)
(AF)
Kategori uyumu:
%93.9
Kategori uyumu:
%88.4
ÇBH: %3.5
Kategori uyumu:
%98.7
ÇBH: %19.4
ÇBH: %3.3
AAC. 2013; 57: 177-182
VITEK 2
Kolay uygulanabilir
Erken sonuç verebilen
Eş zamanlı tanımlama yapabilen
Referans yöntemlerle esas uyumu yüksek
Tam otomatize
CLSI /EUCAST sınır değerleri ile sonuç
Kategori uyumu özellikle yeni sınır değerlerin
kullanılması ile düşük
Dilüsyon aralıklarının alt sınırı, bazı türler için
tanımlanan ECV sınırının üzerinde
C. glabrata türleri için tanımlanan sınır
değerler dirençli kökenleri tanımlamada
yetersiz
Akım sitometrisi "flow cytometry"
Test edilecek antifungal ilacın çift kat seri
dilüsyonları ile işlem görmüş mantar hücrelerinin
florokrom boyalarla boyanması ve akım
sitometrisinde okutulması ve analiz edilmesi
Floresan boyalarla boyanıp boyanmama
durumuna göre hasara uğramış veya ölü mantar
hücrelerinin hızlı saptanmasına olanak verir.
Akım sitometrisi "flow cytometry"
Besiyeri
İnokulum
Enkübasyon
süresi ve ısı
Değerlendirme
• RPMI1640
• 1X106 cfu/ml (en hızlı ve kaliteli okuma için)
• Maya hücreleri ve Aspergillus türleri için
konidyumlar
• 30 dk-24 saat (genellikle 4 saatten
kısa), 350C
• FC’de özel Software ile
• MFEC (Minumum Fluorescence-Enhancing
Concentration)
• MFEC (Minumum Fluorescence-Enhancing
Concentration): Yüksek bir floresan düzeyi ile
karşılaştırıldığında, hücrelerin belirli bir yüzdesinde
floresan artışı gösteren en düşük ilaç konsantrasyonu
• C. glabrata ve C. krusei için %50, C. parapsilosis için
%40
Vale-Silva LA, Pinto P, Lopes V, Ramos H, Pinto E. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2012; 31: 941-946
Akan hücre ölçer "flow cytometry"
Akan hücre ölçer "flow cytometry"
• Sıvı dilüsyon temelli bir yöntem
• Araştırma amaçlı kullanılıyor
Avantaj:
• >10000 hücrenin ayrı analizi yapılır: Test sonuçlarının
doğruluğu ve duyarlılığını artırır
• Sonuç kısa sürede
Dezavantaj:
•
•
•
•
Maliyeti yüksek, özel ekipman gerektirir
Uygun sonuç elde etmek için, deneyimli personel gerekir
Standardize edilmeli
Tekrar edilebilirlik ve test sonuçlarının klinik ile uyumunun
araştırıldığı çalışmalara ihtiyaç var.
İzotermal Mikrokalorimetre
• Mikroorganizmaların üreme ve
metabolizmalarına bağlı olarak üretilen ısının
ölçülmesi temeline dayanır.
• Duyarlı, kesin ve gerçek zamanlı bir ölçüm
sağlar
İzotermal Mikrokalorimetre
Besiyeri
• Sıvı Sabouraud (farklı besiyerleri içinde
daha kısa sürede ve daha fazla ısı üretimi)
İnokulum
• 2.5 x 104conidya/ml (hemasitometre
ile)
Enkübasyon
süresi
Değerlendirme
• Saat-gün
• MHIC (Minimal Heat Inhibitory
Concentration)
• Analiz: Özel bir software
İzotermal Mikrokalorimetre
MHIC
• AmB ve azoller için: Üreme kontrolünün oluşturduğu toplam ısının %50’sini
48 saatte inhibe eden en düşük ilaç konsantrasyonu
• Ekinokandinler için: Üreme kontrolüne göre 48 saatte ısı akış tepesini %50
azaltan en düşük ilaç konsantrasyonu
İzotermal Mikrokalorimetre
Kalorimetre
modülü
İzotermal Mikrokalorimetre
• Aspergillus türlerinin gerçek zamanlı antifungal
duyarlılıklarının belirlenmesinde referans yöntemlerle
uyumlu
– CLSI MEK ve MHIC ±2 dilüsyonda uyum oranı AmB, vorikonazol ve
posakonaol için ≥%90
– Kaspofungin için %70
• Mucorales, Fusarium ve Scedosporium türleri ile yapılan
çalışmada CLSI MEK ve MHIC ±2 dilüsyonda uyum oranı
– AmB, posakonazol ve kaspofungin için <%90, posakonazol >%90
Tafin UF et al. Clin Microbiol Infect 2012; 18:
Tafin UF et al. Diagnost Microbiol Infect Dis. 2012; 73: 330-337
Diag Microbiol Infect Dis 2013; 77: 31-36
• A. fumigatus ATCC 204305
– AmB X Ekinokandin (anidulafungin ve kaspofungin)
• A. terreus ATCC 10690
– Vorikonazol X ekinokandin (anidulafungin ve kaspofungin)
• Eşit fraksiyonel konsantrasyonlar (0.125X, 0.25X, 0.50 ve 1)
• AmB ve vorikonazol, ekinokandinlerle kombine edildiğinde
etkinliklerinde artış gözlenmiş
• Aspergillus türlerinde gerçek zamanlı sinerjinin değerlendirilmesini
sağlıyor
• Yöntem Aspergillus türleri ve diğer küf cinslerinin antifungal
kombinasyonlarında sinerji için valide edilmesi , hayvan çalışmaları
ve klinik çalışmalarla desteklenmesi gerekmektedir.
MALDI-TOF-MS
Matriks ile desteklenmiş lazer dezorpsiyon/iyonizasyon
uçuş zaman kütle spektrometrisi
• Mikroorganizmaları, protein yüklerinin
ayrımına bağlı olarak tanımlayan bir yöntemdir
• Kullanılan iyonizasyon tekniğidir
Örnek matriks ile kristalize edilir (iyonizasyonu
kolaylaştırmak ve biyomolekülü direkt lazer atışının
tahribinden korumak için)
Lazer ışını, örnek+matriksin
buharlaşmasına neden olur
Oluşan iyonlar yüklerine göre
ayrılacakları tüp içerisinde hareket
ederler
Uçuş hızlarına göre ayrılan biyoanalitler
bir kütle spektromu oluşturur
Proteinler, peptid kütle parmak izi ile
tanımlanır
MALDI-TOF AFDT
15 saat, seri ilaç konsantrasyonlarına maruz kalan mantarın proteom değişikliklerine
dayanan bir yöntemdir.
Tüm konsantrasyonlar / üç nokta testi (en yüksek, sınır değer, sıfır değeri) kullanılabilir
Composite Correlation Index (CCI) değerleri kullanılıyor
Minimal Profile Change Concentration (MPCC): Sıfır konsantrasyona göre maksimum
konsantrasyonda izlenene daha yakın spektrumdaki en düşük ilaç konsantrasyonu (CCI
değeri)
Vella A ve ark. J Clin Microbiol 2013; 51: 2964-69
Saraçlı MA ve ark. Med Mycol 2015; 53: 736-42.
MALDI-TOF AFDT
Antifungal duyarlılıkların belirlenmesinde
güvenilir ve tekrar edilebilir bir yöntem
Daha hızlı sonuç (15 saat)
İdentifikasyon amacıyla bu teknolojiyi kullanan
ve rutin yükü fazla olan laboratuvarlarda
kullanılabilecek objektif bir yöntem
Aynı anda ve tüm Candida türlerinin farklı ilaç
duyarlılıklarını test etmek mümkün
CCI tabanlı eşleştirme gibi yazılım algoritmaları
üzerinde personel eğitimi gerektirir.
Gray- zone tanımı eksik: [CCI: 0.99 (R), CCI: 1.01
(S); arsındaki oran ???
Kalite kontrol prosedürü yok
Direnç, proteomik değişiklerle belirlenebiliyor.
Proteomik değişiklikler yeteri kadar yüksek
değilse saptayamayabilir
Vella A ve ark. J Clin Microbiol 2013; 51: 2964-69
Saraçlı MA ve ark. Med Mycol 2015; 53: 736-42.
SONUÇ
Ticari yöntemler
Etest
SYO
Gelişmekte olan yöntemler
FC
IMC
Vitek 2
Maldi-Tof MS
Mantar
maya ve küf
maya ve küf
mayalar
Aspergillus
türleri
sıvı MD
Candida ve
Aspergillus
türleri
sıvı dilüsyon
sıvı dilüsyon
Candida ve
Aspergillus
türleri
sıvı dilüsyon
Yöntem
agar difüzyon
sıvı MD
Enkübasyon
zamanı (saat)
Son nokta
okuması
24-48
24-48
12-24
1-7
48
3-15
görsel
görsel
otomatik
floresan
mikroskobi
IMC
kütle
spektrometre
Trailing üreme
var
var
pahalı
Rutin
pahalı
rutin
Uygulanabilirlik
Maliyet
Kullanım alanı
Direnci saptamada
hiçbir
yok
var
yok
yöntem birbirine üstün
değil
pahalı
rutin
ekonomik
antifungal
direnç
saptamada,
yalnızca
araştırma
amaçlı
ekonomik
antifungal
direnç
saptamada,
yalnızca
araştırma
amaçlı
yok
ekonomik
antifungal
direnç
saptamada,
yalnızca
araştırma
amaçlı
SONUÇ
Ticari yöntemlerle elde edilen sonuçlar CLSI/EUCAST sınır değerleri ile olmakta
Referans yöntemlerin sınır değerlerine dayanarak klinik köken, dirençli olarak tanımlanmamalı
Yönteme özgü standardizasyon ve klinik sınır değerler
belirlenmeli
SYO’da başladığı gibi…
Yeni yöntemler umut verici, standardize edilmeli, çeşitli tür ve ilaçlarla
çalışmalar yapılmalı
Teşekkür ederim