Kriyoprezervasyon - Klinik Embriyoloji Derneği

Kriyoprezervasyon - Klinik Embriyoloji Derneği

Laboratuvar Başarısında
Kriyoprezervasyonun Rolü
Ayşen Durmaz, PhD
Ege Üniversitesi Aile Planlaması
İnfertilite Araştırma ve Uygulama
Merkezi
Tanım
Kriyoprezervasyon; hücrelerin ve dokuların
sıfır
derecenin
altındaki
ısılara
kadar
soğutularak, bütün biyolojik aktivitelerinin
durdurulması
ve
gelecekte
kullanılması
amacıyla saklanmasını ifade eder.
(ASRM 2012)
Tarihçe





M.Ö. 2500 soğuğun medikal alanda kullanımı.
1776 Spallanzani L. kar içerisinde dondurduğu spermleri
çözdükten sonra hareketlilik gözlemiştir.
İlk kriyoprezervasyon denemeleri başarısız!
1940 yılında gliserolün sperm hücresini kriyo hasarına
karşı koruduğu keşfedilmiştir.
1953 yılında Bunge ve ark. dondurulmuş-çözülmüş insan
sperminden elde edilen ilk canlı doğumu bildirmişlerdir.
Tarihçe




1970 yılında propanediol, EG, DMSO keşfi
1972 programlanabilen dondurucuların kullanıldığı yavaş
dondurma tekniğinin geliştirilmesi
1984 dondurulmuş-çözülmüş insan embriyosundan elde
edilen ilk canlı doğum
1986 dondurulmuş-çözülmüş insan oositinden elde
edilen ilk canlı doğum
IVF Laboratuvarında Kriyoprezervasyon

Gamet (oosit ve sperm)

Testis ve over dokusu

Embriyo (2PN, Klivaj, Blastosist)
Laboratuvar Başarısında
Kriyoprezervasyonun Rolü
Laboratuvar Başarısı
Kriyoprezervasyon Başarısı
Laboratuvar Başarısı





Kullanılan indüksiyon ajanlarına
Mikromanipulasyon tekniğine
Kültür medyumunun içeriğine
Kültür ortamının pH, ısı ve osmolaritesine
Sterilite
Kriyoprezervasyon Başarısı





Gamet, zigot, ve embriyo kalitesine
Kullanılan malzemelere
Kullanılan yönteme
Yöntemi uygulayan kişinin tekniğine ve becerisine
bağlıdır.
Sterilite
Kriyoprezervasyon Hasarı





Hücre içi/dışı buz kristali oluşumu
Kimyasal toksisite
Osmotik şişme/büzüşme
Zona hasarı
Mayotik spindle hasarına ve dolayısıyla da anöploidilere
neden olmaktadır.
Kriyoprezervasyon Yöntemleri

Yavaş dondurma

Şok dondurma (ultra-rapid)

Vitrifikasyon
Yavaş Dondurma




CPA kons. düşük (1M Sukroz; 1,5M 1,2 propanediol)
-7oC’de seeding işlemi ile buz oluşumu başlatılır.
Dondurma hızı yavaş (0,3-0,5oC / dk.)
İşlem ~ 3 saat sürmektedir.
Dezavantajları
 Uzun sürmesi
 Pahalı olması
 Buz kristali oluşturması
Şok Dondurma

Yavaş dondurma ile vitrifikasyon arasında bir yöntem

Yavaş dondurmaya göre daha hızlı ve pahalı ekipmana
gereksinim yok

Yavaş dondurmaya göre CPA kons. yüksek

Vitrifikasyona göre CPA kons. düşük
Vitrifikasyon

Herhangi bir sıvının yoğunluğunun arttırılarak buz kristali
oluşmaksızın camsı hale getirilmesi
Sıvı haldeki madde
Buz kristali oluşmadan camlaşma
Vitrifikasyon






CPA konsantrasyonu yüksek (%15 EG, %15 DMSO)
Soğutma hızı yüksek (15,000 - 30,000oC/dk.)
Soğutma hızı ne kadar arttırılabilirse CPA kons.
İşlem süresi kısa (10 -15 dk.)
Buz kristali oluşmaz
Dondurma cihazına gereksinim yok.
Dezavantajı
Yüksek CPA kons. hücreler için toksiktir!!!
Hangi Yöntem?
1) Vitrifikasyon
2) Yavaş dondurma
3) Şok dondurma
Hangi Yöntem?
Vitrifikasyon-Yavaş
Şok-Yavaş dondurma
Klinik gebelik oranı
OR= 1,55
%95 CI=1,03-2,32
OR= 0,35
%95 CI= 0,16-0,76
Devam eden gebelik
oranı
OR= 1,82
%95 CI=1,04-3,20
OR= 0,37
%95 CI= 0,17 – 0,81
İmplantasyon oranı
OR= 1,49
%95 CI=1,03-2,15
-
Yavaş dondurma - Vitrifikasyon

Düşük oranda CPA
☻Yüksek oranda CPA

Dondurma hızı düşük
(0,3-0,5oC / dk.)
Yavaş dehidrasyona bağlı
olarak buz kristali oluşumu
☻Dondurma hızı yüksek

İşlem süresi uzun (3 saat)
☻ İşlem süresi çok kısa (10-15 dk)

Pahalı ekipman
☻ Dondurma cihazına ihtiyaç yok

(15,000-30,000oC / dk.)
☻ Buz kristali oluşmaz
Ege Üniversitesi IVF Lab. Sonuçları
Siklus
sayısı
Transfer
sayısı
Gebe
sayısı
Gebelik oranı
(%)
2010 yavaş
2010 vit.
55
27
42
24
9
5
21,42
20,83
2011 yavaş
2011 vit.
38
107
29
98
4
37
13,79
37,75
2012 yavaş
2012 vit.
13
121
7
111
1
48
14,28
43,24
2013 yavaş
2013 vit.
13
91
5
82
2
35
40,00
42,68
Vitirifikasyon Başarısı





1985 Rall ve Fahy fare embriyoları ile gerçekleştirilmiştir.
CPA kombinasyonu denenmiş,
Çeşitli taşıyıcı sistemler tasarlanmıştır.
Dondurma – çözme hızı
CPA konsantrasyonu
Kriyoprotektanlar
Hücre içine geçebilen
☻ DMSO, EG, PROH, Gliserol

Hücre içine geçemeyen (Sakkaritler)
☻Sukroz, Trehaloz

Makromoleküller
☻Fikol, PVP, PEG

Hücre içi su
Kriyoprotektan
CPA Seçimi





Hücre üzerine olan toksik etkisi
Diffüzyon hızı yüksek olan CPA seçilmelidir.
En çok kullanılan ve kabul edilen EG dür.
Kriyoprotektan toksisitesini azaltmak için iki farklı CPA
kombinasyonu kullanılabilir!!!
Major CPA kombinasyonu EG/DMSO kombinasyonudur.
Hücre içine geçemeyenler




Başarılı bir vitrifikasyon için gerekli olan CPA kons.
Toksik etkiyi azaltırlar
Osmotik etki
Çözme işlemleri sırasında osmotik tampon gibi
davranarak osmotik şoku engeller.
H2O
Ice
Kontrolsüz rehidrasyon
sonucu şişme
Çözme Solüsyonları
1.0 M Sükroz
Çözme
Solüsyonu
0.5 M Sükroz
Dilüsyon
Solüsyonu
Sükrozsuz
Yıkama
Solüsyonu
Makromoleküller



Fikol, PVP, PEG
Vitrifikasyonu kolaylaştırmakta
Etki mekanizmaları konusunda farklı yorumlar
bulunmaktadır.
Soğutma Hızı




Örnek hacmi ne kadar az olursa soğutma hızı
Vit. solusyonu ne kadar az olursa toksik ve ozmotik etkisi
de o kadar azalır.
VitMaster sıvı azotun ısısını -205/ -210 kadar düşürür
Taşıyıcı sistemlerin ısı iletim hızları farklıdır.
Taşıyıcı Sistemler

Açık Sistemler
☺Soğutma ve ısıtma oranlarını hızlandırarak hücrelerin vitrifikasyon
solüsyonlarında tutulma zamanlarını azaltırlar.
 Kapalı Sistemler
☺İzolasyon katının bulunması soğutma ve ısıtma oranlarını yavaşlatır.
Taşıyıcı Sistemler
Açık sistemler
Kapalı sistemler
→ Cryotop
→ OPS
→ Flexipet-denuding pipet
→ Hemistraw sistemi
→ Cryoloop
→ Cryoleaf
→ Elektron mikroskop grid
→ Fibre-plug
→ Cryotip
→ High security straw
→ Rapid-I
→ Straw-straw sistemi
→ Cryopet
Açık Sistemlerin Dezavantajı




Açık sistemlerde oosit/embriyo kaybolma ihtimali
Bakteriyel, viral ve fungal kontaminasyon riski
Kontaminasyon embriyonun in vitro yaşamını olumsuz
yönde etkiler.
Lab. da high security straw kullanmaktayız
Azot Kontaminasyonu
Azot sterilizasyonu
Azot Buharında Saklama
Oosit Kriyoprezervasyonu






Isı değişimlerine ve ekstrasellüler ozmotik basınca karşı
oldukça duyarlıdır.
Hücre içi sıvı miktarı yüksek
CPA kons. ve soğutma hızı yüksek olan vitrifikasyon!!
En uygun CPA ise EG’dur.
Literatürde 900’ün üzerinde doğum
Anomali insidansı normal
İmmatür oosit kriyoprezervasyonu


Mayotik iğcik hasarını engellemek için bir alternatif
Mayoz bölünme profaz I evresindedir
İmmatür oosit vitrifikasyonu
immatür oosit cryo + IVM
prematüre ovaryan yetmezliği ☺
İmmatür oosit vitrifikasyonu
İmmatür oosit vitrifikasyonu
→
PCO’li hastalardan alınan immatür oositlerin vitrifikasyon
yöntemi ile dondurulması sonrasında %90’ında klivaj
gördüklerini
ancak
implantasyon
elde
edemediklerini
açıklamışlardır.
Zigot Kriyoprezervasyonu






Almanya
Danimarka
İsveç
Avusturya
İsviçre
İtalya
En iyi yöntem vitrifikasyon
IVF – ICSI

IVF/ ICSI sonrası dondurulan
2PN aşamasındaki zigotlarda
benzer canlılık ve gebelik oranı
bildirilmiştir.
Zigot Kriyoprezervasyonu

Griesinger ve ark. yaptığı çalışmada dondurulan zigotların doğal
sikluslarda çözülerek transfer edildiği çalışmada embriyonun
canlılığını sürdürme oranının %77, devam eden gebelik oranının
da %36 olduğu bildirilmiştir.
Embriyo kriyoprezervasyonu
 En iyi yöntem vitrifikasyon
 8 hücreli embriyolarda canlılık oranı %79,2
 Hücre sayısı < 6 olanlarda canlılık oranı %21,1
 Canlılık oranı blastomer sayısının artmasıyla artar
Embriyo kriyoprezervasyonu


Dondurma işlemleri sırasında ZP sertlerşir
Transfer öncesi AH uygulanması gebelik ve
implantasyon oranlarını arttırır.
Blastosist Kriyoprezervasyonu




Blastosistlerdeki hücre sayısı fazla
Birkaç hücre hasar görse bile embriyonun bütünlüğü
bozulmaz
En iyi yöntem vitrifikasyon
Blastosöl sıvısının boşaltılması başarıyı arttırmaktadır.
Artificial Shrinkage
Needle used shrinkage
Laser pulse shrinkage
Mukaida et al., 2006
Blastosist Kriyoprezervasyonu
Konjenital anomali insidansı normal
Saklama Süresi
Saklama Süresi
Oosit
☺Canlılık, fertilizasyon, klivaj, embriyo kalitesi,
implantasyon ve canlı doğum
 Embriyo
☺ Yaşam kapasitesi
☺ Gebelik oranları
☺ İmplantasyon oranlarına etkisi yoktur.

Tekrar dondurma

Bir kez çözünmüş embriyoların tekrar dondurulması ile ilgili çok
fazla veri olmamasına rağmen Kumasako ve ark. yaptıkları
araştırmada tekrar vitrifiye edilmelerinin belirgin bir olumsuzluk
yaratmadığını bildirmişlerdir.
KOH – Kriyoprezervasyon İlişkisi
YÜT de başarıyı gösteren en önemli parametrelerden bir
tanesi implantasyondur.
→ embriyo kalitesine
→ endometriyal reseptiviteye
→ embriyo-endometriyum arasındaki ilişkiye bağlıdır.

YÜT’de implantasyon başarısızlıklarının;
→ 3/2’den endometriyum hasarı
→ 3/1’den ise embriyo sorumludur.

KOH – Kriyoprezervasyon İlişkisi


↑E2 ve P düzeyleri
endometriyum morfolojisi ve
biyokimyasını bozar.
Embriyo ile endometriyum
arasındaki senkronizasyon
bozulur.
İmplantasyon Başarısızlığı !
KOH – Kriyoprezervasyon İlişkisi

FET’de endometriyum doğal ya da doğala yakın
dozlarda ilaç kullanılarak hazırlanmaktadır.

Bu nedenle FET’de endometriyum reseptivitesi fresh
siklusa kıyasla daha iyidir.
Fresh embriyo vs. FET

KOH’nun embriyo-endometriyum senkroznizasyonu
üzerine olan olumsuz etkisinden kaçınmak için elektif
embriyo kriyoprezervasyonun yapılması

Bir sonraki siklusta endometriyum reseptivitesinin yüksek
olduğu FET’nin yapılması YÜT’de kümülatif başarıyı
arttıracaktır.
Çoğul gebeliklerin önlenmesi





KOH protokolleri → çok oosit → çok embriyo
Siklusların %60’ında transfer için uygun çok
sayıda emb.
Embriyo kriyoprezervasyonundaki başarının
artması
Transfer edilen embriyo sayısının azaltılmakta
Çoğul gebelikler önlenebilmektedir.
Fertilitenin Korunması
Bayanlar





Ciddi ovaryan hastalıklar
Kistler
Over kanserleri
Kemoterapi
Radyoterapi
Baylar
 Testiküler yetmezlik
 Ejakülatuvar disfonksiyon
 Cerrahi girişimler
 Kemoterapi
 Radyoterapi
SONUÇ






Oosit kriyoprezervasyonu yerine Embriyo
kriyoprezervasyonu
Klivaj aşamasında 8 hücreli embriyo
Transfer öncesi AH yapılması
Hücre sayısı fazla olduğundan blastosist dondurma daha
avantajlı
Blastosöl sıvısının boşaltılması
Fresh embriyo transferi yerine FET yapılması
TEŞEKKÜRLER
Sperm kriyoprezervasyonu





Sıvı içeriği az olduğu için daha dayanıklıdırlar.
İnsan semeninde en çok kullanılan CPA Gliserol egg
yolk sitrattır.
Daha çok manuel yöntem tercih edilmektedir.
Motilite, Morfoloji, Fertilizasyon kapasitesi azalır.
Sperm DNA integritesi tartışmalı
Blastosist Vitrifikasyonu

Current data on the
vitrification tablo 2
Canlılık oranı (%)
Gebelik oranı (%)
Oosit
54
14,2
Embriyo
67
28,2
Human Oocyte Vitrification
(Kuwayama et al. Highly Efficient Vitrification of Human Oocytes. RBM
Online 11:300-308, 2005)
Parameter
Result (% of # vitrified)
# oocytes vitrified
107
# Surviving (normal morphology)
86 (80%)
Fertilized (by ICSI)
77 (72%)
Blastocyst development
40 (37%)
# embryo Transfers
29 (18 D2, 11 D5)
Total # embryos transferred
64 (53 D2, 11 D5)
Avg # embryos/ transfer
2.2 (3 D2, 1 D5)
% Pregnancy (# sacs by ultrasound)
12 (41.3%)
# deliveries
7 babies (3 ongoing pregnancies)
Irvine Scientific’s Vitrification System:
Vit Kit™ - Freeze Solutions
Basal medium is M199-H + 20% DSS
7.5% ethylene
glycol
7.5% DMSO
Equilibration
Solution (ES)
15% ethylene glycol
15% DMSO
0.5 M sucrose
Vitrification
Solution (VS)