GİRİŞ - Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi
Transkript
GİRİŞ - Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi
GİRİŞ Histoloji terimi, doku anlamına gelen histos ve bilim ya da çalışma anlamına gelen logia kelimelerinin birleşmesiyle türemiştir. Bu nedenle sözlük anlamıyla hem bitki ve hem de hayvan dokularının bileşimini ve yapısını özelleşmiş işlevleriyle bağlantılı olarak inceleyen bilim dalını ifade etmektedir. Bugün, bilim dalları içinde histoloji hangi anlamda kullanılıyor şeklinde düşünebiliriz. Anatomi iki alt gruba ayrılmaktadır. Bunlardan biri çıplak gözle görülebilen vücut kısımlarını inceleyen gross anatomi, diğeri yalnızca mikroskop yardımıyla incelenebilen vücut kısımlarını konu edinen mikroskopik anatomidir. Mikroskopik anatomiyi de kendi içinde alt grublara ayırabiliriz: Organoloji (organ bilimi), Histoloji (doku bilimi) ve Sitoloji (hücre bilimi). Histoloji doku bilimi olarak bütün bu mikroskopik anatomi alt gruplarını kapsamakta, hatta mikroskobik anatomi olarak da tanımlanabilmektedir. Her ne kadar vücut, hücrelerden yapılmışsa da, hücreler dışında iki önemli kompenenti daha vardır. Eğer vücut yalnızca hücrelerden yapılmış olsa idi vücudun destek fonksiyonu son derece kısıtlı olacaktı. Bu problemin çözümünde, esas dokulardan birisi olan bağ dokusu hücreleri, bir kaç çeşit lif sentezlerler. Bu lifler cansız yapılar olmakla birlikte inert hücreler arası maddeler değildirler. Bundan başka, hücrelerin yaşam ve fonksiyonel aktivitelerinin devam edebilmesi için, sürekli olarak oksijen ve besleyici maddelerin sağlanması ve toksik maddelerin de uzaklaştırılması gereklidir. Bu fonksiyonlar kan ve diğer sıvıları içeren vücut sıvıları tarafından temin edilir. Kan, kan damarları içerisinde dolaşmaktadır. Diğer vücut sıvılarından ise ileriki bölümlerde bahsedilecektir. Bu nedenle, vücut dokuları üç farklı kompenentten oluşmuştur. Bunlar; 1- Hücreler 2- Hücrelerarası (İntersellüler) maddeler 3- Vücut sıvılarıdırlar. Dolayısıyla histoloji yalnızca dokuları değil, hücreleri ve organ sistemlerini de incelemektedir. Histoloji, hücre, doku ve organlar bilimi olduğuna göre yapılarını inceleme yanında fonksiyonlarını da konu edinecektir. Bu nedenle histoloji yalnızca gross anatomiyi tamamlamakla kalmamakta, fizyoloji biliminin de yapısal temelini oluşturmaktadır. Yapı ve fonksiyon arasındaki ilişki, belki de histolojinin niçin ilgi uyandırıcı ve kolay öğrenilebilir bir konu olduğunu açıklayabilmektedir. Bir hücrenin, dokunun veya organın yapısı ne kadar iyi bilinirse fonksiyonları hakkında da o kadar iyi bilgi sahibi olunacaktır; ters yönden de bir hücre, organ veya dokunun fonksiyonu ne kadar iyi bilinirse mikroskopik yapılarının ne olabileceği hakkındaki varsayımlar da o kadar doğru olacaktır. Normal yapı hakkındaki bir bilgi, çeşitli hastalıklar sonucu hücre, doku ve organların yapılarında görülen değişiklikleri inceleyen patoloji biliminin de temelidir. Bu nedenle, histoloji bilimi gerek tıp ve gerekse diş hekimliği sahalarında hayati bir önemliliğe sahiptir. Biyoloji sahasında ise, histoloji hem biyolojideki profesyonel dereceler için esastır ve hem de oldukça değerli bir başvuru alanıdır. Biyolojik bilimler sahasında, öğrenci sıklıkla yeterli bir mikroskopik bilgiye sahip olmadan fonksiyonel problemlerle karşı karşıya kalmaktadır. 1 Histolojik incelemede metodla ilgili olarak iki önemli nokta vardır; kullanılan mikroskobun tipi ve doku veya organın mikroskop ile incelenebilecek şekilde hazırlanması. Bir genelleme yapacak olursak histolojik tekniklerdeki gelişmenin pek çok tip mikroskoplardaki teknik ilerlemeyi takip edemediğini söyleyebiliriz. Mikroskop tekniklerinde ilerlemeye en iyi örnek olarak Elektron Mikroskobu gösterilebilir. Elektron mikroskobu, her ne kadar 1932’de Knoll ve Ruska tarafından geliştirildiyse de, ancak ince kesit alma tekniklerinin geliştirildiği 1940 sonları ve 1950 başlarında biyolojik alanda kullanılabilmiştir. Mikroskobi tarihi, Robert Hooke (1665, şişe mantarında hücreyi tanımladı) ve Marcello Malpighi'nin değişik yapısal özellikleri incelemede basit mercekleri kullandıkları 17. Yüzyıla kadar uzanır. 1673-1716 tarihleri arasında Leeuwenhoek bileşik mercek sistemini geliştirmiş ve protozoa, bakteri, kas, sinir ve pek çok diğer yapılar hakkında gözlemlerini yayınlamıştır. Mikroskopik anatomi 18. Yüzyılda çok az gelişmiştir. 19. Yüzyıl başlarında ise bileşik mercekler oldukça geliştirilmiştir. 1827'de Amici'nin gelişmiş mercekleri bileme tekniği sonucu bileşik mikroskoplar uyumlu bir şekilde bir araya getirilmiş ve bunun sonunda hücrenin temel canlı ünit olduğu kavramı ortaya çıkarılmıştır. Robert Brown 1831’de çekirdeği keşfetmiştir. 1838’de Schleiden ve 1839’da Schwann hücre teorisini ortaya atmışlardır. 1841’de Henle insan histolojisinde o zamanlar için ilk geniş makaleyi yayımlamıştır. Her ne kadar "dokular" tabiri ilk kez 1802’de Bichat tarafından postmortem spesimenlerin gross incelenmesi sonucu ileri sürüldü ise de insan vücudunun bir "hücreler devleti" olarak tanımlanması 1863’de Virchow tarafından yapılmıştır. 19. Yüzyılın son yarısında, kesit almada kullanılan mikrotomlar oldukça geliştirilmiştir. Bunu tespit, gömme ve boyama tekniklerinde gelişmeler takip etmiştir. Boyama teknikleri, özellikle yeni mikroskop tiplerinde kullanılmaları yönünden, hala bir gelişme süreci içerisindedir. Bugünkü histolojik bilgiler pek çok mikroskop tiplerinin bu sahada kullanılması ve farklı histolojik tekniklerin uygulanması sonucu elde edilmiştir. Elde edilen sonuçların değerlendirilmesinin, kullanılan mikroskop ve tatbik edilen metoda göre olduğu hiçbir zaman akıldan çıkarılmamalıdır. Dolayısı ile bugün kullanılan değişik tip mikroskopların kullanılış şekli ve sınırlılığı ile doku hazırlanmasında uygulanan metodların temel prensipleri oldukça önemlidir. Histolojik incelemelerde; • Histokimya, sitokimya • İmmunositokimya ve hibridizasyon teknikleri • Otoradyografi • Hücre ve doku kültürü • Mikroskobik teknikler ve mikroskoplar kullanılmaktadır. 2 MİKROSKOBİ Biyolojik materyallerin incelenmesinde, bugün pek çok tip mikroskop kullanılabilmektedir. Bu mikroskoplar temel olarak ışık kaynaklarına göre sınıflandırılabilir. Şüphesiz, en çok kullanılan mikroskop, görülebilen ışık kaynağına sahip olanlarıdır. Bu ışık mikroskoplarının da pek çok modifikasyonları vardır: 1- Işık mikroskobu 2- Polarize mikroskop 3- Faz-Kontrast mikroskop 4- İnterference mikroskop 5- Karanlık saha mikroskobu 6- Floresan mikroskop 7- Konfokal mikroskop Mikroskobide son gelişmeleri yansıtan ve ışık kaynağı olarak gözle görülmeyen radyasyonu kullanan mikroskopları da şöyle sıralayabiliriz: 1- Ultraviyole mikroskobu 2- Elektron mikroskoplar, SEM: (Tarayıcı-Scanning Elektron Mikroskop), TEM: (Geçirimli-Transmission Elektron Mikroskop) 3- Atomic Force Microscope (AFM) POLARİZE MİKROSKOP Işık mikroskobunun basitçe modifiye edilmiş şeklidir. Yüksek düzeyde düzenlenmiş moleküllerden oluşan yapıları incelemeye olanak verir. 2 adet polarize edici filtreden (polarizer-analyzer) biri ışık kaynağı ve nesne arasına yerleştirilirken diğeri objektif mercek ile araştırma arasında yer alır. Moleküler yapılar polarizörden çıkan ışığın eksenini saptırır ve koyu zemin üzerinde yapılar parlak görünür. Bu şekilde ışığı saptırma yeteneğine çift kırma denir. Çizgili kas ve kristalloid içeren yapılar (Ör.Leydig hücreleri) bu özelliktedir. FAZ-KONTRAST MİKROSKOP Çalışma prensibi; farklı kırma indislerine sahip boyanmamış, saydam hücre ve hücre dışı yapılardan geçen ışığın, hızının ve yönünün değişmesine dayanır. Bu şekilde yapıların açık ya da koyu görünmesini sağlar. 2 modifikasyonu vardır: İnterferens Mikroskop ve Diferensiyel interferens mikroskop. KARANLIK SAHA MİKROSKOBU Karanlık alanda özel bir kondansör yardımı ile ışıklı bir görüntü oluşturmaktadır. İncelenen partiküllerden yansıyan ışınlar karanlık alan içinde parlak aydınlık görüntüler oluşturur. Otradyografide gümüşlenen kısımların ayırt edilmesinde kullanılır. 3 FLORESAN MİKROSKOP İnceleme yapılacak materyalde özel floresan boyalar ve özel inceleme işlemleri kullanılır. Floresan maddeler UV (ultraviyole) maruz kaldığında daha uzun dalga boyunda ışık yayarlar. Floresan maddeler karanlık bir zemin üzerinde parlak parçaçıklar şeklinde görünür. Araştırıcının mor ötesi ışıktan korunması için objektif merceklerden sonra özel bir filtre bulunmaktadır. KONFOKAL MİKROSKOP Bir hücre ya da kesitin çok ince bir düzlemine odaklanabilmeyi sağlar. Örnek çok ince bir ışık demetiyle aydınlatılır ve örnekten gelen görüntü küçük bir delikten geçerek algılayıcıya ulaşır. Odaklanan kısım dışında kalan nesneler görülmez. Bu şekilde odaklanılan bir kaç ince düzlem birleştirerek 3 boyutlu görüntü elde etmek mümkündür. ULTRAVİYOLE MİKROSKOBU Işık kaynağı olarak UV ışını kullanılır. Işınlar, ultraviyole için özel olan bir optik sistemi geçtikten sonra, floresan bir ekran üzerinde görüntü oluştururlar. Ultraviyole ışınları görülmeyen ışınlar oldukları için doğrudan izlenemezler. Dolayısıyla florasan bir ekrandan yararlanma zorunluluğu vardır. Görüntü, duyarlı bir plak üzerine alınarak mikrofotoğraflar alınabilir. Özellikle nükleik asitler ve aminoasitler bu mikroskopla incelenir. ATOMİC FORCE MİKROSKOP (AFM) Biyojik materyallerin incelenmesinde yararlanılan en kullanışlı mikroskoptur. Çalışma prensibi tıpkı parmak uçlarımızla cildimize dokunduğumuzda beynimizin cilt yüzeyinin topografisini algılamasına benzer. Ucu sivri bir konsol atomik kuvvet yoluyla incelenecek örneğin yüzeyini tarar. Laser huzmesi konsola odaklanır ve konsoldan yansıyarak bilgisayara bağlı bir photodiode ulaşır. Photodiode laser huzmesini ölçer, elektriksel akıma dönüştürür ve bilgisayarda taranır. Biyolojik materyallerin incelemesinde AFM’nin TEM ve SEM’e göre avantajı; yüksek çözünürlüklü optik aletlerden farklı olarak vakum içermeyip canlı hücrelerin çevreleriyle birlikte su içerisinde incelenmesine olanak vermesidir. Herhangi bir mikroskop tipinin kullanışlılığı, yalnızca büyütme gücü ile sınırlı olmayıp, bundan daha önemlisi rezolüsyon (ayırma) gücü ile ifade edilmektedir. Belirli limitlerden sonra daha fazla büyütmenin ek bir yararı yoktur. Herhangi bir ışık mikroskobunda büyütme x1000 civarındadır. Büyütme gücü oküler ve objektif merceklerin büyütme gücünün çarpımı ile hesaplanır, bu durumda rutin ışık mikroskoplarda en yüksek büyütme, oküler mercek x10, objektif x100 kullanıldığında; 10x100= x1000 olmaktadır. Ancak oküler merceğin x20 büyütmeli formu da bulunmaktadır. Bu durumda ışık mikroskopta maksimum büyütme gücü x2000 olmaktadır. Rezolüsyon gücü, birbirine bitişik iki noktayı ayrı noktalar halinde gösterebilme gücüdür. Bir mikroskobun rezolüsyon gücünün ötesinde kalan iki ayrı nokta, tek bir 4 nokta halinde gözlenecektir. Rezolüsyon gücü kullanılan mercek sistemleri ve kullanılan ışığın dalga boyu ile ilgilidir. En gelişmiş bir ışık mikroskobunda maksimum rezolüsyon gücü 0,2 µm (mikron) kadardır. Birbirine 0,2 µm’dan yakın olan 2 nesne tek bir nesne olarak izlenir ve 0,2 µm’den küçük nesneler seçilemez. İnsan gözünün ayırma gücü ise 0,2 mm’dir IŞIK (OPTİK) MİKROSKOBU Işık mikroskobu temel olarak iki basamaklı büyütme cihazıdır. Objektif mercek ilk büyütmeyi (magnifikasyon) sağlar. Oküler (projektör) mercek de ilk büyütmeyi tekrar büyütecek şekilde cihaza yerleştirilmiştir. Toplam magnifikasyon (büyütme), objektif ve oküler merceklerin çarpımı ile hesaplanmaktadır. Ek bir toplayıcı (Kondansör) mercek, normalde mikroskop şaryosunun altına yerleştirilir. Bu mercek, ışığı, kaynağından konsantre ederek çok parlak bir huzme oluşturur ve objeyi aydınlatır. Böylece büyütülmüş görüntünün incelenmesi için yeterli ışık sağlanmış olur. Her ne kadar kondenser mercek, toplam büyütmeyi etkilemiyorsa da, görüntünün kalitesini iyileştirmektedir. Oküler (projektör) mercek yaygın olarak x10 büyütme yapmaktadır. Bununla birlikte farklı büyütmeler yapabilen alternatif mercekler de kullanılmaktadır. Genellikle, objektif merceklerin bir kaç tipinin bağlı olduğu, bir disk bulunur. Bu disk mikroskop tüpüne monte edilmiş şekildedir. Bu disk döndürülerek istenilen objektif merceğine ayarlanabilir. Rutin kullanımda genellikle x10, x25, x40 ve x100 büyütmeli objektif mercekler kullanılır. x10 objektif düşük büyütmeli objektif mercek olup, x10 oküler mercek ile birlikte toplam 100 büyütme elde edilir. Benzer şekilde x25 objektifler medium büyütmeli objektif adını alır ve x40 objektif yüksek büyütmeli objektif adını alır ve x10 oküler büyütme ile birlikte sırası ile 250 ve 400 büyütmeler elde edilir. x100 objektife aynı zamanda oil-immersiyon objektifi adı verilir ve toplam olarak bu objektif ile x1000 büyütme sağlanır. Oil-immersiyon objektif merceği kullanıldığında preparat ile mercek arasına immersiyon yağı girer ve böylece uygun kırılma indeksi elde edilir. Objektif, preparat ile çok yakın olduğundan, objektif merceğin fokus ayarlanması çok dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. 5 Işık Miksoskop (Zeiss Company Germany’den alınmıştır) ELEKTRON MİKROSKOP VE KULLANIM ALANLARI İnsan vücudunu oluşturan hücrelerin varlığı 17. yüzyılda ilkel ışık mikroskoplarının yapılmasından sonra gösterilmiş ve 19. yüzyılda bileşik ışık mikroskoplarının geliştirilmesinden sonra hücre kavramı ortaya atılabilmiştir. Hücre kavramı ile özellikle temel tıp bilimleri olan histoloji ve anatomi başta olmak üzere biyolojik bilimlerde önemli gelişmeler olmuştur. Işık mikroskobunun keşfinden sonra, bütün hücre, doku ve organların yapıları incelenmiş ve o zamana kadar bilinmeyen pek çok yapısal ve fonksiyonel bilgiye ulaşılmıştır. Günümüzde en gelişmiş ışık mikroskobunun maksimum büyütme (magnifikasyon) gücü x2000 kadardır. Elde edilen bu büyütme gücü tüm hücresel yapıları göstermeye yeterli değildir. Mikroskopide büyütme gücünden daha önemli bir faktör ise rezolüsyon (ayırma) gücüdür. Rezolüsyon gücü, kullanılan ışığın dalga boyunun yarısına eşittir. Görünen ışığın dalga boyu 0,4-1,7 µm’dir. Bu durumda ışık mikroskobunun maksimum ayırma gücü 0,2 µm olmaktadır. Bu sebeple birbirine 0,2 6 µm’dan daha yakın olan objeler ışık mikroskopta tek bir yapı olarak gözlenmektedir. Işık mikroskopta hücre ve hücresel elemanların görüntülenmesindeki bu yetersizlik, bu alanda yeni bir mikroskobun keşfi ile sonuçlanmıştır. İlk elektron mikroskop 1932 yılında, Alman fizik mühendisleri Ernst Ruska ve Max Knoll tarafından yapılmıştır. 1950’lerin erken dönemlerinde elektron mikroskobun biyolojik alanda kullanıma başlanmasıyla birlikte hücre ve hücresel elemanların yapı ve fonksiyonları hakkındaki bilgiler önemli ölçüde değişmiştir. Elektron mikroskobunun keşfi Nobel Bilim Komitesi tarafından yüzyılın buluşu olarak kabul edilmiş ve 1986 yılında, Ruska’ya bu keşfinden dolayı Nobel Fizik Ödülü verilmiştir. Bilim dünyasına kazandırılmasıyla beraber Elektron Mikroskop, kimya, tıp, mühendislik, moleküler biyoloji ve genetik gibi pek çok alanda kullanılmış ve bu alanlarda önemli gelişmeler kaydedilmiştir. Bu gelişmeler daha sonraki yıllarda baş döndürücü bir hızla devam etmiş ve sonuçta objeleri yaklaşık 2.000.000 X büyütme imkanına sahip elektron mikroskoplar yapılmıştır. Elektron mikroskop, elektronlarla dokuların etkileşmesi temeline dayanan, yüksek ayırma gücüne sahip bir görüntüleme cihazıdır. Bugün biyolojik bilimlerde en yaygın kullanılan elektron mikroskobu olan transmisyon elektron mikroskobu (TEM), temel olarak ışık mikroskobu sistemine eşdeğer bir sistemi içerir. Elektron mikroskobunda ışık kaynağı olarak, ışık mikroskobunda kullanılan gözle görünür ışık yerine tungsten filamanı tarafından üretilen ve gözle görünmeyen elektronlar kullanılır. Yüksek hızlı olan elektronlar havası alınmış bir tüp içerisinde daha da hızlandırılırlar. Işık mikroskobunda elde edilen görüntü ayrıntıları, kullanılan ışığın dalga boyunun yarısı ile sınırlıdır. Görünür ışığın dalga boyu 0,4-1,7 mikron arasında olduğuna göre birbirlerine 0,2 mikrondan daha yakın olan iki nokta birbirlerinden ayrı noktalar olarak ayırt edilmeyecek ve tek bir yapı gibi görüleceklerdir. İncelenecek dokudan görüntü elde edebilmek için görünür ışık yerine dalga boyu çok daha küçük olan elektronlar kullanılarak rezolüsyon gücü oldukça arttırılabilir. Elektron mikroskobunda elektronların dalga boyu kullanılan voltaja göre değişmekle birlikte 60 kV elektrik enerjisi uygulandığında elektronların dalga boyları 0.05 nm kadardır. Buna göre 0.025 nm olması gereken ayırma gücü bugün kullanılan gelişmiş bir elektron mikroskobunda ancak 1-3 nm arasındadır. Bu değerler elektron ışınlarının dalga boylarının teorik limitlerinden çok daha uzaktır. Bunun nedenleri de elektron mikroskobunda mercek olarak kullanılan elektromanyetik alanların en iyi mercekler olmaması ve doku hazırlama yöntemlerinin henüz yeterli olmamasıdır. Transmisyon elektron mikroskobunda elektronlar tungsten filamanının yüksek derecede ısıtılmasıyla elde edilir. Katot ve anot arasında bir potansiyel farkı nedeniyle sürekli bir elektron dalgası oluşturulur. Elektronlar elektromanyetik mercekler ile demet getirilir. Hızlandırılmış elektronlar demet şeklinde dokuyu geçer ve ışık mikroskobundaki cam mercekler yerine bir seri elektromanyetik veya elektrostatik alanlardan geçerek bir floresan ekrana yansır. Görüleceği üzere elektron mikroskobunda görüntü doğrudan doğruya insan gözüne yansımamaktadır. Floresan ekrandaki görüntü istenilen büyütmede incelenir. Görüntü ve ışık ayarı yapılarak resim çekilir. Elektron mikroskopide doku kalıcı olarak fotoğraf filmi şeklinde saklanabilir. Film elektron mikrograf haline getirilir. Bu işlemde film agrandizör yardımı ile büyütülür ve siyah-beyaz 7 olarak fotoğraf kağıdına basılır. Daha ileri teknolojiyle üretilen elektron mikroskoplarda görüntü digital kamera ile bilgisayar ekranına yansıtılır ve fotoğraf çekilir. Modern bir elektron mikroskobunda büyütme gücü x200.000-x1.000.000 arasında değişmektedir. Yukarıda belirtildiği gibi, büyütme gücü en gelişmiş ışık mikroskobunda x2000’ i geçememektedir. Gerçek büyütme değerlerini agrandizör kullanarak 2-3 kez daha artırma olanaklarını da düşünecek olursak, elektron mikroskopide 600.000-3.000.000 kez büyütülmüş elektron mikrofotograflar elde edebiliriz. Hemen şunu belirtmeliyiz ki elektron mikroskopide önemli olan büyütme gücü değil, ayırma gücüdür. Elektron mikroskopide büyütme ve ayırma güçleri ışık mikroskopide uzun süredir kullanılan milimetre ve santimetre gibi ölçüm birimlerinin çok ötesine geçmiştir. Milimetre ve santimetre gibi ölçüm birimleri yerlerini önceleri 1 milimetrenin binde biri olan mikrona (µm) bırakmış, bunun da yerini daha sonra Angstrom birimi (A°) almıştır. Ölçüm birimlerinde görülen bu karışıklıklar yeni kabul edilen uluslararası sistemde bir temele bağlanmışlardır. Örneğin, milimikron yerini nanometreye (nm) bırakmış ve elektron mikroskopistler arasında geçerliliğini koruyan Angstrom (A°) uluslararası sistemde, ölçüm birimi olarak değerini yitirmiştir. Eski İsimlendirme Mikron (µm) Milimikron (mµ) Yeni İsimlendirme Mikrometre (µm) Nanometre (nm) 1 Mikron (µm) = 1/1000 Milimetre 1 Milimikron (mµ) = 1/1000 Mikrometre (Nanometre, nm) 1 Angstrom (A°) = 1/10 Nanometre Elektron mikroskobunun biyolojik alanda kullanılması sonucu hücre elemanlarının yeni ölçüm birimleri ile tanımlanması yanında yeni terimlere de gereksinim duyulmuştur. Bir makromolekülden daha küçük yapıları bugün elektron mikroskop ile görebilmekteyiz. Bu şekildeki ayrıntılı yapıların bütünü için "ince yapı" (fine structure) ve "ultrastrüktür" terimleri kullanılmaya başlanmıştır. Bunlardan "ince yapı" yalnızca elektron mikroskop ile görülebilen yapı elemanları için kullanılmaktadır. Halen pek çok elektron mikroskopist tarafından kullanılan "ultrastrüktür" terimi ise lügat anlamında "yapı ötesi" anlamına geldiğine göre bu amaç için kullanılmasından vazgeçmek daha doğru olacaktır. Işık ve elektron mikroskoplarında incelenecek dokular farklı laboratuvar yöntemleri ile hazırlanır. Işık mikroskobunda incelenecek hücre ya da dokular genellikle formalin gibi fiksatifler (tespit edici) ile tesbit edilir ve parafin bloklara gömülür. Bu bloklardan elde edilen ve kalınlıkları mikron ile ölçülen doku kesitleri mikrotom yardımı ile elde edilir ve lam üzerine alınır. Elde edilen kesitler renkli boyalar ile boyanır ve görünür ışık ile incelenir. Biyolojik yapının ayrıntıları ışık mikroskobunda kullanılan ışığın 8 fiziksel özelliğine bağlı olarak sınırlı olarak görülürse de, kullanılan görünür ışık bütün renkleri içerdiğinden örnekleri renkli olarak görebilmekteyiz. Elektron mikroskobunda ise gözle görünmeyen elektronlar herhangi bir renk içermediğinden görüntüler ancak siyahbeyaz alınabilmektedir. Diğer taraftan değişik tip ışık mikroskobu kullanarak hücreleri canlı olarak incelemek olası iken, elektron mikroskobu ile bu tür bir inceleme yapılamamaktadır. Elektron mikroskobunda elektronlar yüksek vakum altında birbirlerine yapışıp bir demet şeklinde seyreder ve dokuyu büyük bir hızla geçerler. Bu nedenle, en azından şimdilik elektron mikroskobunda hücreleri canlı olarak incelemek olası değildir. Bu durumda elektron mikroskobuyla canlılığını yitirmiş ve dehidrate edilmiş dokular incelenebilmektedir. Buna bağlı olarak elektron mikroskopide hücreleri canlı duruma en yakın şekilde inceleyebilmek için dokunun tespiti, dokudan kesit alınması ve kesitlerin boyanması ile ilgili yöntemlerin geliştirilmesi zorunluluğu doğmuştur. Tespit işlemine bağlı artefaktların ve yapısal bozuklukların elektron mikroskopide, yüksek büyütme gücüne bağlı olarak ışık mikroskopiye oranla çok daha belirgin olarak görülmesi ve elektron mikroskobunun yüksek ayırma gücü, elektron mikroskopide kullanılacak fiksatifin önemle seçilmesini gerektirmektedir. Bu nedenle elektron mikroskopide, çok daha az yapı bozukluğuna neden olan osmik asit (OsO4), glutaraldehit ve akrolein gibi fiksatifler kullanılmaktadır. Fiksatiflerin pH'sının hücre pH'sına yakın (7.2-7.4) olması için de değişik tampon solusyonları kullanılmaktadır. Elektron mikroskopide kullanılan fiksatiflerden en yaygın olanı % 1 veya %2'lik osmik asittir. Elektron mikroskopide siyah-beyaz dışında renkli boyaları kullanmak elektron optik sistemde renk seçimi yapılmadığından, olası değildir. Osmik asit ise kimyasal olarak lipoprotein membranlara ve atomik değerinin yüksek oluşu nedeni ile hücrenin diğer bileşimlerine bağlanarak elektron mikroskopik görüntülerin kontrastlığını sağlar. Diğer bir fiksatif olan gluteraldehid dokuyu ve hücreyi boyamaz, ancak dokuyu osmik asit ile ikincil tespite ve özellikle de osmik asit ile boyanmaya hazırlar. Tespit edilen doku sonradan etil alkol veya aseton ile dehidrate edilir, akrilik plastik veya epoksi resinlere gömülür. Bu bloklardan cam veya elmas bıçakların kulanıldığı ultramikrotom ile kesitler alınır. Biyolojik alanda kullanılan elektron mikroskoplarda elektron demetinin penetrasyon gücü çok kısıtlıdır, bu nedenle doku kesitleri oldukça ince (50 nm) olmalıdır. Bunun yanında kesitlerde baskı, çizik, katlantılar olmamalıdır. Doku kesitleri daha sonra kontrastı arttırmak için uranil asetat ve kurşun sitrat ile boyanır. Işık ve elektron mikroskopi arasında diğer bir önemli fark ise çalışma için gereken süredir. Elektron mikroskopide doku hazırlama süresi ışık mikroskobiye oranla çok daha uzundur. Bunun yanında istenilen bölgenin fotoğrafının çekilmesinde alanın taranması için ışık mikroskobunda birkaç dakika yeterli iken, aynı amaçla alan taranması elektron mikroskopta günlerce sürebilmektedir. Elektron mikroskobunun kendisi, dokuların özel bir şekilde hazırlanması için gerekli gereçlerle donatılmış elektron mikroskopi laboratuarı ve kesitlerin alındığı ultramikrotom cihazı hep birlikte oldukça karmaşık ve pahalı olan elektron mikroskobi ünitesini oluşturur. Elektron mikroskobik çalışmalar ancak yeterli parasal destek, çok iyi teknik bakım ve uzmanlaşmış personel ile gerçekleştirilebilir. 9 Işık mikroskobunun kullanımı elektron mikroskobuna oranla çok daha pratiktir. Öğrenci eğitiminde öğrencinin kendisi bu mikroskopları kullanabilir. Ayrıca ışık mikroskoplarının çok daha ucuz olmaları nedeni ile her öğrenciye bir mikroskop sağlanabilir. Elektron mikroskobunun maliyeti ise milyonlarla ölçülmekte ve kullanılması için beceri ve tecrübe gerekmektedir. Işık mikroskopide en iyi sonuçlar çıplak göz ile inceleme sonucu elde edilirken ışık mikroskobik fotoğraflar aynı ölçüde doyurucu değildir. Elektron mikroskopta ise bunun tam tersi söz konusudur. Diğer bir deyimle en iyi sonuç mikrograflardan sağlanabilmektedir. Dolayısı ile elektron mikroskopist istenilen alanları tarayarak mikrograf haline getirebilir ve bu mikrografları inceleyerek ince yapı hakkında gerekli bilgiyi öğrenir. Elektron mikroskobu ile yapılan çalışmalar sonucu bugüne kadar elde edilen bilgiler ve gelecekteki araştırmalara katkısı göz önünde bulundurulacak olursa bu araştırma aracının pahalı olmasının ve güç çalışma koşullarını gerektirmesinin pek önemli olmadığı görülecektir. Işık mikroskobunun temel prensiplerini içermekle birlikte bu modern araç doku yapılarının ayırma (rezolüsyon) sınırlarını yüzlerce defa aşmış ve böylece daha önce bilinmeyen pek çok biyolojik yapıların keşfini sağlamıştır. Özellikle 1950'lerden sonra elde edilen yeni bilgiler ışığında yapısal organizasyon, hücre alt yapıları ve hücre fonksiyonlarında karanlık kalmış pek çok nokta aydınlığa kavuşturulmuştur. Bu araç özellikle histoloji başta olmak üzere hücre ile ilgili bilim dallarına büyük bir canlılık getirmiştir. Günümüzde araştırma laboratuvarlarında rutin kullanım alanına da girmiş olan elektron mikroskobu ile hücre ve hücre organelleri düzeyindeki pek çok patolojik bozukluklar gösterilebilmiştir. Bütün hücrelerde ortak olan ince yapı özellikleri elektron mikroskopik çalışmalar sonucu bulunmuştur. Farklı hücre tiplerinde, farklı ince yapı özellikleri ve fonksiyonları, farklı patolojik durumlarda görülebilecek ince yapı değişiklikleri hala araştırılmakta ve tanımlandırılmalarına çalışılmaktadır. Günümüzde yaygın olarak kullanılan bir diğer elektron mikroskop ise Taramalı Elektron Mikroskobu (Scanning Electrone Microscope - SEM)’ dur. SEM, hücre doku ve organ yüzeylerinin üç boyutlu olarak görüntülenmesini sağlar. Elektron-numune etkileşimlerinden köken alan sinyaller, örneğin dış morfolojisi, kimyasal bileşimi ve kristal yapısına ilişkin bilgileri ortaya koyar. Tarayıcı (Scanning) Elektron Mikroskobunun geliştirilmesi, elektro-manyetik merceklerde ve voltaj güçlerindeki yeni gelişmeler ve laboratuvar çalışmalarında kullanılan yeni yöntemler bizlere çok daha gelişmiş ayırma gücüne sahip ve dehidrate edilmemiş (canlı) dokuları incelememizi sağlayacak elektron mikroskopların yapılacağı umudunu vermektedir. Son yıllarda TEM üzerine yerleştirilen SEM ataçmanı ile, TEM ve SEM kısmen birleştirilmiş ve STEM (Scanning Transmission Electron Microscope) oluşturulmuştur. 10 Transmisyon Elektron Mikroskop, Jeol JEM 1400 (Japan). Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı “Elektron Mikroskop Ünitesinde” halen kullanılmaktadır. DOKU HAZIRLANMASI Hücre, doku ve organlar mikroskopik gözlem için özel bir şekilde hazırlanmadıkça yeterli bir şekilde incelenemezler. Doku hazırlama metodlarını genel olarak 2 gruba ayırabiliriz: 1) Direkt olarak canlı hücrenin incelenmesinde uygulanan metodlar, 2) Cansız hücrelerin (tesbit edilmiş ya da korunmuş) incelenmesinde uygulanan metodlar. Öğrenciler inceleyecekleri preparatları tespit edilmiş ve boyanmış halde bulacaklarından, dokuların hazır hale gelmelerine kadar geçirdikleri süreçleri, özet bir şekilde öğrenmeleri faydalı olacaktır. Canlı dokuların incelenmesi daha zor ve komplikedir, aynı zamanda canlı doku incelenmesi kısa bir süre için geçerlidir. Öğrenci yine de canlı doku inceleme metodlarını bilmelidir. Canlı hücrede, yapı ve fonksiyon aynı anda incelenebilmektedir. Canlı hücrelerin bu metodlarla, hareketleri, yabancı maddeleri fagosite etmeleri, seyrek olarak bölünmeleri ve diğer bazı fonksiyonları gözlenebilmektedir. 11 Canlı Doku İncelenmesi Tek hücreli (unicellular) organizmaları ve seyrek olarak da kompleks bir organizmadan ayrılmış serbest hücreleri canlı durumda, direkt olarak mikroskopla inceleyebiliriz. Serbest hücreler renksiz olup, içlerindeki oluşumlar bir kontrasta sahip değildir. Bu güçlük bir faz-kontrast mikroskop kullanılarak giderilebilir. İnsan kan hücrelerini temin etmek kolaydır ve bu hücreleri kendi doğal şartlarında, plazma içerisinde ince bir film tabakası haline getirerek gözleyebiliriz. Bu şekilde lökositlerin ameboid hareketlerini ve fagositik aktivitelerini saptayabiliriz. Hücre zarları mikroskop altında direkt olarak incelenebilecek kadar ince olabilir; (Örneğin, kurbağa ayağı zarları, yarasa kanatları, kobay yanak kesesi gibi). Karaciğer ve böbrek gibi nisbeten kalın organların ince kesitleri transluminasyon ile gözlenebilir. Transluminasyonda kuartz çubuklar kullanılmaktadır. Bu çubuklardan çıkan soğuk ışınlar protoplazmanın koagüle olmasını önlemektedir. Doku rejenerasyonu veya vasküler aktiviteler gibi olaylar, uzun süreli olarak tavşan, kobay gibi deney hayvanlarının kulak veya diğer uygun vücut kısımlarına, Cam pencereler yerleştirilerek takip edilebilir. Mikroskopik incelemeler için; küçük doku parçalarını çıkartarak serum veya serum fizyolojik ( SF), solusyonu gibi nisbeten zararsız sıvılar içine almak ve çok ince çelik ya da cam iğneler yardımı ile bu doku parçalarını oluşturan lif veya hücreleri birbirlerinden ayırmak mümkündür. Canlı hücrelerin vücut dışında uzun süre hayatiyetini koruması doku kültürü tekniği ile sağlanabilir; doku parçaları aseptik olarak alınır ve bir fizyolojik ortam içerisine transfer edilerek dokunun alındığı hayvanın normal ısısında korunur. Kültür ince bir cam boru veya cam bir yüzey üzerine damla şeklinde yerleştirilir. Bu şekilde hücreler mikroskop ile incelenebilmektedir. Böyle kültürlerde, büyüme, çoğalma ve bazı durumlarda hücrelerin diğer hücre tiplerine differensiyasyonları direkt olarak gözlenebilir. Doku kültürleri aynı zamanda kanser ve pek çok virüslerin incelenmesinde oldukça kıymetli bir yöntemdir. Mikrodiseksiyonda, mikroskop altında oldukça ince cam iğneleri çok hassas bir şekilde hareket ettiren bir cihaz kullanılır. Bu yolla, bir hücrenin çekirdek gibi küçük bir kısmı çıkartılabilir ve bunun hücreye etkisi gözlenebilir. Canlı hayvan veya hücrelerde başarılı şekilde iki boyama metodu uygulanır. Vital boyamada boyalar canlı hayvana enjekte edilir. Belirli hücrelerin aktivitesi, bu hücrelerin renkli maddeleri seçici bir şekilde absorbsiyonu ile sonuçlanacaktır. Bu olaya örnek olarak makrofajların trypan mavisi ile boyanmasını gösterebiliriz; bu şekilde boyama makrofajların kendileri için yabancı bir madde olan trypan mavisini fagosite etme temeline dayanmaktadır. Supravital boyamada organizmadan çıkarılmış olan hücrelerin ortamına bir boya maddesi ilave edilir. Bu boyama metoduna da canlı hücrelerde mitokondriyonların Janus Green (Janus yeşili), lizozomların Neutral Red (Nötral kırmızısı), sinir hücreleri ve sinir liflerinin Methylene Blue (Metilen mavisi) ile boyanmasını gösterebiliriz. Son olarak, hareket filmi ile hücre hareketlerini kayıt edip analizini yapabiliriz. Bu şekilde mitoz, fagositoz ve ameboid hareketler gibi olaylar canlı hücrelerde veya 12 doku kültürlerinde gözlenerek, ayrıntıları saptanabilir. Silyumların hareketi gibi süratli olayların analizi de yavaş hareket filmleri ile yapılabilmektedir. Cansız Dokuların Hazırlanması Işık Mikroskobu: Histolojik çalışmanın en uygun yolu, herbiri aşağı yukarı kalıcı bir şekilde korunabilen preparatların mikroskop altında incelenmesidir. Bir kesit tesbit edilmiş doku parçasından ince bir dilim alınarak hazırlanır. Sonradan kesit boyanır, lam üzerine monte edilir ve lamel ile kapatılarak preparat haline getirilir. Bir kesitin hazırlanmasında takip edilen çeşitli yollar histolojik teknikleri oluşturur ki bu konuda pek çok referans kitaplarına başvurabiliriz. Histolojik teknikler hakkında ayrıntılı bilgi bir histoloji öğrencisi için gerekli olmamakla beraber, kesit hazırlanmasındaki genel prensipler bilinmelidir. Bu şekilde öğrenci elindeki preparatları daha iyi bir şekilde değerlendirebilir. Bir histolojik kesitin hazırlanmasında aşağıdaki yollar takip edilir. a-Parça Alınması: Sitolojik amaçlar ve en iyi histolojik kesitlerin hazırlanabilmesi için doku anestezi altındaki bir canlıdan veya canlının ölümünü hemen takiben alınmalıdır. Eğer parça insandan alınacaksa çok süratli ve hassas hareket etmelidir. Ameliyatlar sırasında alınan doku parçaları en iyi kaynaktır. Patolojik ya da abnormal doku çıkarıldığında bu doku ile birlikte çoğunlukla bir miktar da normal doku alınmaktadır. Bu normal dokular histolojik çalışmalar için oldukça yararlı olabilmektedir. b- Fiksasyon (Tespit): Fiksasyonda primer amaç; protoplazmayı canlı haline en yakın şekliyle koruyabilmektir. Tespit solusyonu koruyucu göreviyle otolitik değişiklikleri ve bakteriyel üremeyi en aza indirir. Tespit solusyonu (fiksatif) protoplazmayı koagüle eder, dolayısı ile çözülmez hale getirir ve kesit almayı sağlayacak şekilde sertleştirir. Bazı fiksatifler karbonhidrat ve lipidleri korurken bazıları yetersizdir. Pek çok fiksatif de protoplazmanın bazı boyalara karşı ilgisini (affinitesini) arttırmaktadır. Formalin, alkol, merkurik biklorid, potasyum bikromat ve belirli bazı asitler (pikrik, asetik, osmik asit gibi) tesbit edici ajan olarak en yaygın şekilde kullanılan reagentlerdir. Hiçbir fiksatif tek başına istenilen niteliklere sahip değildir, bu nedenle birkaç reagent karıştırılarak tespit solüsyonları hazırlanabilir; Bouin solüsyonu, Zenker solüsyonu ve Susa solüsyonu gibi. Bir fiksatif tipinin seçimi, genellikle, doku tipine ya da o dokuda incelenecek kısmın özelliğine ve tatbik edilecek boyama tipine göre yapılır. Sık kullanılan formalin, %37 oranında sıvılaştırılmış formaldehit solüsyonudur. Çeşitli dilüsyon oranları ile ve başka kimyasallar ve tampon solüsyonları ile çeşitli kombinasyonlar şeklinde fiksatif olarak kullanılmaktadır. Formaldehit, proteinlerin amino grupları ile reaksiyona girerek hücrenin genel yapısını ve hücredışı yapıları korumaktadır. Fakat lipidler ile reaksiyona girmemekte, bu nedenle hücre membranı için zayıf bir fiksatif olarak kabul edilmektedir. Nötral lipidleri korumak için ise, permanganat veya osmium tetroksit gibi fosfolipidlere bağlanan ağır metal içeren özel fiksatifler seçilmelidir. 13 c- Gömme (Bloklama): Gömmeden önce doku artık fiksatifin giderilmesi için yıkanır ve takiben derecesi giderek artan alkol (%70’den %100’e) veya benzeri dehidrate edici ajanlar (aseton) ile dehidrate edilir (suyu giderilir). Daha sonra şaffaflandırılır. Bu olayda dehidratasyon ajanı uzaklaştırılmakta, yerini hem dehidratasyon ajanı ve hem de gömme materyali ile karışabilen sıvılara bırakmaktadır. Bu sıvılar şeffaflandırıcı ajanlar olarak bilinir. Bu sınıfta ksilol, kloroform, benzen ve cedarwood yağı gösterilebilir. Şeffaflandırmadan sonra doku genellikle parafin veya selloidin olan gömme materyali ile infiltre edilir. İnfiltrasyondan sonra doku parçaları taze hazırlanmış gömme materyali içerisine gömülerek bloklar elde edilir. Özel çalışmalar için doku, fiksatif, dehidratasyon solusyonları veya şeffaflandırıcı maddelerle muamele edilmeden direkt parafin içine gömülebilir. Freeze -Drying (dondurarak kurutma) denilen bu metod ile taze doku süratle dondurulur ve donmuş halde iken düşük ısıda bir vakum içerisinde dehidrate edilir, kurutulmuş doku sonradan gömülür. Bu metodun bir modifikasyonu olan Freeze-Substition tekniğinde donmuş doku içerisindeki donmuş suyun gömmeden önce çok düşük ısıda alkol ile yer değiştirmesi sağlanır. d- Kesit Alma: Parafin bloklar içine gömülmüş dokudan oldukça ince kesitler alınabilir. Mikroskobik çalışmaların çoğunluğunda istenilen kesit kalınlığı 3 ile 10 mikron (mikrometre) arasındadır. En uygun kalınlık 5 mikrondur. Bu tip kesitlerin alınmasında mikrotom adı verilen özel cihazlar kullanılmaktadır. Kesit alındıktan sonra temiz bir lam üzerine geçirilir. Bu işlemden önce, kesitin lam üzerinden düşmesini engellemek amacıyla lamın üzerine bir miktar yumurta albumini sürmek faydalı olacaktır. Üzerinde kesit bulunan lam süzmeye bırakılır ve sonradan da hot plate (sıcak metal levha) üzerine yerleştirilir. Geri kalan su buharlaşır ve doku kesitinin lam üzerine sıkıca yapışması sağlanmış olur. Kesit şimdi boyamaya hazırdır. e- Boyama: Boyamada amaç doğal kontrastı arttırmak ve değişik tip hücre ve doku bileşimleriyle hücre dışı materyalleri daha belirgin hale getirmektir. Boyaların çoğunluğu aqueous solüsyonlar içerisinde tatbik edildiğinden, bir parafin kesitinin boyanabilmesi için, parafinin, bir parafin çözücü ya da decerating ajan içerisine alınarak uzaklaştırılması gerekmektedir. Parafin giderici maddeler genellikle ksilol veya tolüoldür. Eğer doku parafin değil de selloidin içerisine gömülü ise yukarıdaki metod kullanılmaz. Parafini giderilen kesitler boyamadan önce derecesi giderek azalan alkol serisinden geçirilerek hidrate edilir ve istenilen boyalarla kesitler boyanır. f- Monte: Boyamadan sonra fazlalık boyayı gidermek için boyanın çözücüsüne göre kesit su veya alkol ile yıkanır ve daha sonra kesit derecesi giderek artan alkol serilerinden geçirilerek dehidrate edilir. Son dehidratasyon ajanı olan absolüte (saf) alkolden sonra kesitler şeffaflandırıcı ajan içerisine alınır. Şeffaflandırmayı takiben kesit üzerine bir damla monte maddesi damlatılır. Kanada balsamı, entellan veya benzeri bir madde olan monte maddelerinin ışığı kırma indeksleri camınkine eşdeğerdir. Monte maddesi damlası üzerine dikkatle bir lamel konur ve kurutulur. Kurutmadan sonra preparat hazırlanmıştır. 14 BOYALAR Histolojide kullanılan boyalar genellikle kompleks organik kimyasal maddeler olup, etkinliklerinde bazı farklılıklar gösterirler. Boyaları değişik şekillerde sınıflandırmak olası ise de en basiti boyanın doku ve hücre bileşimleri ile ilgili olarak kullanılması temeline dayanan sınıflandırmadır. Genel olarak kullanılan boyalar ya çekirdeği ya da sitoplazmayı boyar ya da bazı hücre bileşimlerine özgü olabilir. Pek çok boya için dokuların özel bir şekilde tespit edilmesi ve hazırlanması gerektiği de bilinmelidir. Kullanılan boyalar asidik veya bazik olarak kabul edilirler, fakat gerçekte boyalar nötral tuzlar olup, hem asidik ve hem de bazik radikallere sahiptir. Boyanın renklendirici maddesi nötral tuzun bazik radikali içerisinde ise boya bazik olarak kabul edilir ve bu boya ile boyanan yapılar da bazofil olarak tanımlanır. Çoğu durumlarda, bazik boyalarla boyanan bazofil yapıların kendileri asittir; bunlara örnek olarak çekirdeğin nükleik asitlerini (DNA) ve ribonükleik asit (RNA) gibi sitoplazmanın asidik bileşimlerini verebiliriz. Aynı şekilde, renklendirici nötral tuzun asidik radikali içerisinde ise, boya asidiktir ve bu boya ile boyanan yapılar da asidofildir (örnek olarak bütün sitoplazma gösterilebilir). Bazik boyalardan en yaygın şekilde kullanılan nüklear boya hematoksilen'dir. Boyama yeteneği solüsyon içerisinde hematein denen oksidatif maddenin varlığına bağlıdır (Dolayısı ile taze hazırlanmış hematoksilen solüsyonu olgunlaştırılır, diğer bir deyimle kullanmadan önce oksidasyonun olması için bekletilir). Böyle bir boya ile boyandığında çekirdek mavi görülür. Çekirdekteki heterokromatin ve nukleolus kısımları nükleik asitlerdeki iyonize fosfat grupları nedeniyle bazofili gösterir. Ayrıca ergastoplazma gibi sitoplazmik yapılar (içeriklerindeki ribozomal RNA’lardaki iyonize fosfat grupları nedeniyle) ve kıkırdak matriksindeki karbonhidratlar (iyonize sülfat grupları içerirler) gibi hücredışı yapılar da bazofiliktir. Yaygın şekilde tatbik edilen demirli hematoksilen boyamasında çekirdek koyu mavi veya siyah renk alır. Demirli hematoksilen boyama metodlarıyla bir yapı aşırı boyanırsa zayıf asit veya ferrik tuz solüsyonları içerisinde differensiye edilebilir. Differensiyasyon direkt olarak mikroskop ile gözlenebilir. Dikkatli bir differensiyasyonla kromozomlar, mitokondriyonlar, Golgi apparatus ve kasın kontraktil elemanları görünür hale gelebilir. Çekirdeği kırmızı veya pembe renge boyayan Carmine önceleri çok yaygın kullanılırdı, fakat bugün çok az tatbik edilmektedir. Bazik anilin boyalar yaygın şekilde kullanılan bir grup boyadır; Azure A, toluidin mavisi ve metilen mavisini de içeren bu grup proteoglikanların (mukopolisakkaritlerin) tanısı için de kullanılmaktadır. Proteoglikanlar metakromatik boyanırlar (meta=ötesi, chroma=renk). Bunun anlamı proteoglikanlar yukarıdaki boyalardan birisi ile boyandığında boyanın esas rengini değil de başka bir rengi alırlar. Yapıların metakromazi göstermelerinin, boyaları konsantre etmelerine veya boyaların moleküler yapılarını değişikliğe uğratmalarına bağlı olduğu düşünülmektedir. Müsin, kıkırdak matriksi ve mast hücre granüllleri, metakromatik boyalarla kolaylıkla 15 gösterilebilmektedir. Yaygın olarak kullanılan diğer bazik anilin boyalar parlak cresly mavisi, nötral kırmızısı ve janus yeşilidir, bütün bu boyalar toksik olmayıp vital veya supravital olarak kullanılabilirler. Genel sitoplazma için yaygın olarak kullanılan asidik boyalar; Eosin, Pikrik asit, Kromotrop gibi asit azo boyalar ve asit diazo boyalar, Trypan mavisi ve Trypan kırmızısı'nı içerir. Trypan mavisi ve trypan kırmızısı vital boya olarak da kullanılır. Asidik boyalar ile çoğu sitoplazmik filamanlar ve membranla çevrili organeller ile çoğu hücredışı lifler (içerdikleri iyonize amino grupları nedeniyle) boyanmaktadır. Histolojik kesitlerin çoğunluğu hem asidik ve hem de bazik boyalarla birlikte boyanmaktadır. En yaygın olarak kullanılan kombinasyon Hematoksilen ve Eozindir (H.E.). H.E.'de çekirdeksel yapılar koyu mor veya mavi, bütün sitoplazmik yapılar ile hücrelerarası maddeler pembe boyanır. Trikrom metodlarındaki avantaj ise, sitoplazmik yapılar ile hücrelerarası maddeleri arasındaki farklılığın ayırt edilmesidir. Trikrom metodlarına örnek olarak Mallory'nin bağ dokusu boyasını ve Mallory-Azan metodunu gösterebiliriz. Bu boyalarla bazı bağ dokusu lifleri parlak mavi, çekirdek kırmızı veya portakal rengi ve hücreyi oluşturan diğer yapılar mavi, kırmızı, portakal rengi veya mor boyanır. Yaygın olarak kullanılan diğer bir trikrom metodu da Masson'un boyama metodudur. Bunda ise bağ dokusu lifleri yeşil, çekirdek mavi veya mor, sitoplazmik yapılar kırmızıya boyanır. Her ne kadar kollajen için gerçekten özel bir boya yok ise de en iyi şekilde trikrom metodu içerisinde asit anilin boyalar ile gösterilir. Elastik lifler seçici olarak Orcein veya Resorcin fuchsin ile boyanırlar ve parlak şekilde asidofildirler. Retiküler lifler bir alkali solüsyon içerisinde gümüş ile presipite edilirler, dolayısı ile bu lifler Argyrophil olarak tanımlanır. Görüleceği üzere bir kesit içindeki bütün yapıları tek bir boyama metodu ile ayırt etmek mümkün değildir ve istenilen yapıları görebilmek için onlara özgün boyama metodlarını uygulamak zorundayız. ARTEFAKTLAR Unutulmamalıdır ki, hazırlanan preparatların hepsi tamamen mükemmel olmayabilir. Kullanılan tekniğe bağlı olarak, doku kesitlerinin hazırlanmasında bazı eksiklikler gözlenebilir. Preparat hazırlanmasına bağlı olarak oluşan bu değişikliklere artefaktlar adı verilir. Yaygın olarak rastlanan bazı artefakt tipleri şu şekilde sıralanabilir: a) Büzüşme: Dokuların muamele edileceği, özellikle fiksatifler veya sıcak parafine bağlı olarak dokular büzüşebilir. Böylece canlı halinde bulunmamasına rağmen, kesitlerde hücreler ve dokular etrafında boşluklar meydana gelmektedir. b) Presipitatlar: Eğer kullanılan fiksatif yeterince tamponlanmamışsa veya dokulardan uzaklaştırılmamışsa, kristaller şeklinde hücre ve dokular üzerinde birikintiler şeklinde kalırlar. c) Kırışıklık ve katlantılar: Genellikle, alınan ince kesitler birbiri üzerine katlanırlar veya tam olarak yüzeyleri açılmaz, böylece daha koyu bir şekilde boyanırlar. 16 d) Mikrotom bıçağı hataları: Kullanılan mikrotom bıçağının ucunda çentik gibi hatalar varsa kesitlerde çizgilenme meydana gelir. e) Dokuların zedelenmesi: Dokuların nazik bir şekilde alınmaması veya kullanılan kesici veya tutucu aletlerin sert bir şekilde dokuya uygulanması hücre ve dokularda ezilmeye ve parçalanmalara sebep olacaktır. f) Postmortem dejenerasyon: Postmortem dejenerasyon her ne kadar bir artefakt olarak değerlendirilmese de ileride kesitlerin kalitesini büyük ölçüde etkilemektedir. Dokuların canlıdan alınır alınmaz hızlı bir şekilde fiksasyonu son derece önemlidir. Eğer dokular hızlı bir şekilde fikse edilmezlerse hücrelerde enzimlerin açığa çıkması ile otoliz meydana gelir. Ve böylece postmortem dejenerasyon dediğimiz hücresel değişiklikler ortaya çıkar. HİSTOKİMYA Özel boyaların belirli bölgelerde yoğun şekilde tutulma gerçeği dokular içerisinde temel olarak bulunan kimyasal veya fiziksel maddelere bağlıdır ve histokimyanın temelini oluşturur. Histokimya bugün hızla gelişen bir araştırma sahasıdır ve biyokimyasal metodlarla varlıkları bilinen kimyasal bileşiklerin hücre veya doku içerisindeki özel yerlerini gösterir. Bu şekilde hücresel ve hücredışı yapıların fonksiyonları hakkında da bilgi elde edilmesine yardımcı olmaktadır. Histokimyasal metodlar şimdi pek çok inorganik ve organik maddeleri göstermek için uygulanmaktadır. İnorganik maddeler için uygulanan histokimyasal metoda örnek olarak ferrik iyonların ayırt edilmesinde kullanılan Prusya mavisi reaksiyonunun değiştirilmiş bir şeklini verebiliriz. Kesitler potasyum ferrosiyanid ile hidroklorik asit içeren bir solüsyonda inkübe edildiğinden çözülmez hale gelen ferrik ferrosiyanid tortuları koyu mavi renkte boyanırlar. Deoksiribonükleik asitin (DNA) teşhisinde tatbik edilen Feulgen reaksiyonu da histokimyasal teste bir örnektir. Bir histokimyasal testte kesitin önceden bazı maddelerle muamele edilmesi gereklidir, bu şekilde istenilen madde ya serbest bıraktırılır ya da diğer bir madde meydana getirilir ki bu da özel bir test ile açığa çıkartılır. Bazik fuksin kırmızı-eflatun renginde bir boya olup, hidroklorik asit ve sodyum bisülfit ile soluklaştırılabilir. Soluklaştırılmış boya içerisinde aldehitler karşılıklı tepkime sonucu rengi gene kırmızı-eflatun olan yeni bileşiklere dönüşür. Doku kesitinin hidroklorik asit ile hafif şekilde hidrolize edilmesi DNA'dan aldehitlerin açığa çıkmasına neden olacaktır. Eğer kesit sonradan bazik fuksinin renksiz formu içerisinde immerse edilirse DNA'dan açığa çıkan aldehitler boya ile reaksiyona girecek ve kırmızı-eflatun rengini alacaktır. Deoksiribonükleik asit (DNA) ve ribonükleik asit (RNA)’in her ikisi de bazofil olduğundan, Fuelgen reaksiyonunun sonucu ikisi arasında ayırım yapılmasına müsaade edecektir (Bu şekilde bazofil maddenin DNA olduğu anlaşılacaktır). Benzer bir histokimyasal teknik de Peryodik Asid-Schiff reaksiyonudur (PAS reaksiyonu). PAS reaksiyonu, karbonhidratları ve kardonhidrattan zengin makromolekülleri (proteoglikanlar, glikoproteinler gibi) boyamaktadır. Bu yapılar, 17 periyodik asit ile zayıf bir şekilde okside edildiğinde bir aldehit grubu kazanırlar. Bu aldehit sonradan Schiff reagenti ile muamele edilir. Schiff reagenti, bazik fuksinin SO4 (sülfat) ile muamele edilmesi sonucu oluşan renksiz ikincil bir üründür. PAS reaksiyonunun son ürünü kırmızı-eflatun renktedir. PAS reaksiyonu, hücrelerdeki glikojeni, hücreler ve dokulardaki mukusu, epitel dokusunda hücrelerin üzerine oturduğu bazal laminayı göstermek için kullanılmaktadır. Bununla birlikte, glikojen için en iyi metod Best'in carmine boyasıdır. Gerek PAS ve gerekse Best'in carmine boyamasında glikojeni diğer polisakkaritlerden ayırt edebiliriz. PAS reaksiyonu birçok histokimyasal test için geçerli olan belirli prensipleri simgeler. Bunlar: 1- Birincil kimyasal reaksiyon ürünü renksizdir. 2- Oluşan ürün meydana geldiği orijinal yerden belirgin şekilde etrafa yayılmaz. 3- Birincil ürün diğer bir reagentle muamele edilerek renkli bileşik haline dönüştürülebilir. 4- Bu renkli bileşik de 2. maddedeki özelliği gösterir. Enzimler de kimyasal olarak ayırt edilebilirler. Buradaki prensip kimyasal olaylar yardımı ile özel enzimlerin yerlerini belirlemektir. Kimyasal olaylar, enzimlerin in vivo olarak gösterdiği kimyasal reaksiyonların prensiplerine dayanmaktadır. İncelenecek kesit, uygun substratın da bulunması ile vücut ısısında inkübe edilir ve enzimlerin kimyasal reaksiyonu sonucu oluşan ürün belirli renkteki kimyasal bir maddeye dönüştürülür. Örneğin alkaline fosfataz enzimini göstermek için tatbik edilen Gomori metodunda bir alkali ortam içerisinde glycero-phoshate substrat olarak kullanılır ve enzim aktivitesine bağlı olarak açığa çıkan fosfat, kalsiyum iyonlarının varlığında kalsiyum fosfat haline gelir. Kesit kobalt asetat (veya gümüş asetat) içerisinde immerse edilerek kalsiyum fosfat daha kolay görülebilen kobalt sülfid (veya metalik gümüş) siyah çökeltisi haline dönüştürülür ve kesit sonradan ammonium sülfit ile çalkalanır. Bugün fosfatazlar, lipazlar, oksidazlar ve esterazlar dahil pek çok enzim için değişik metodlar uygulanabilmektedir. Histokimyadaki bütün reaksiyonlar kimyasal ilgiye dayanmamaktadır. Yağ çözücüleri ile tespit edilmemiş doku kesitlerindeki yağ Sudan III, Sudan IV ve Sudan Black-B gibi boyalarla gösterilebilir. Bu boyalar lipide fiziksel ilgi göstererek yağ tarafından absorbe edilirler. Bu boyaların kullanılması Sudanofili teriminin temelini oluşturur. İmmunositokimya, histokimyanın bir dalıdır ve günümüzde çok yaygın olarak kullanılmaktadır. Işık mikroskobu düzeyinde floresan antikor tekniği spesifik polisakkaritler veya proteinlerin yerlerinin saptanmasında duyarlı bir metoddur. Bu tekniğin temeli vücudun antijenler olan yabancı maddelere karşı antikorlar olan özel maddeleri yapması gerçeğine dayanır. Antikorlar antijenlerle birleşerek bunları inaktif hale getirir. Floresan boya molekülleri (florokromlar), antikor molekülleri ile kimyasal olarak birleşir ve üzerinde boya molekülleri taşıyan antikorların antijenler ile olan reaksiyon bölgeleri, bu sayede ultraviyole mikroskobu ile görüntülenebilir. Bu metod protein hormonları sentez eden hücreleri, enzimlerin hücre içerisindeki yerlerini ve miyozin gibi proteinlerin bulunduğu yerleri tayin etmede tatbik edilir. Bu metod bir antikoru ferritin gibi bir metalloprotein ile işaretleme suretiyle elektron mikroskopiye de 18 uyarlanmıştır. Ferritin doğal olarak elektron mikroskopta belirgin şekilde görülür. Bu şekilde antikor-antijen reaksiyonunun yeri kesinlikle saptanabilir. İmmümositokimyada kullanılan antikorlar, monoklonal ve poliklonal olmak üzere iki tiptir. Monoklonal antikorlar, antijen molekülü üzerindeki, antikorun kendisini tanıma bölgesi olan epitopun tek bir tanesi ile tek bir antikor üreten hücre tipinin reaksiyon vermesi sonucu üretilirler. Laboratuvarlarda tek bir hücreden özel olarak üretilen hücre klonlarından elde edildiğinden, antijen-antikor kompleksi son derece özgündür. Poliklonal antikorlar ise, antijenin birçok epitopuna karşı, farklı çok sayıdaki antikor üreten hücre tarafından üretilir. Antijenin, farklı bir canlı vücuduna verilmesi ile (bu metodla gösterilmek istenen protein diğer canlı için yabancı olduğundan antijen olarak kabul edilmektedir) vücudun tepki olarak farklı savunma hücreleri tarafından ürettiği antikorlardan elde edilmektedir. Poliklonal antikorların elde edilmesi daha kolay olmakla birlikte, antijene karşı özgünlüğü daha azdır. İmmünohistokimyasal yöntemler ile bir antijenin lokalizasyonunun belirlenmesinde, direkt ve indirekt metodlar olmak üzere 2 metod kullanılmaktadır: 1) Direkt metodda; bir antijen (protein X) içeren kesitler bu antijene spesifik antikor ile birlikte inkübe edilir. Antikor önceden floresan bir boya ile boyanır. Sonuçta antijen, antikor kompleksi ışık ya da elektron mikroskop ile gösterilebilir. 2) İndirekt metod; doku kesitleri öncelikle işaretlenmemiş bir antikor ile inkübe edilir ve sonuçta görünmeyen antijen-antikor kompleksi oluşur. 2. aşama; primer antikora karşı işaretlenmiş, sekonder antikorun üretilmesidir. Bu işlem primer antikorun başka bir hayvana enjeksiyonu ile yapılabilir. Diğer hayvandan elde edilen sekonder antikor, florasan bir boya ile boyanır ve antijeni göstermek istediğimiz doku kesitlerine uygulandığında primer immün kompleks görünür hale getirilir. Bu metod kullanılan tekniğin duyarlılığını daha da arttırmaktadır. OTORADYOGRAFİ Doku kesitlerinden yayılan radyasyonun, fotoğraf emülsiyonları üzerindeki etkileri ile radyoaktif maddelerin yerlerini belirleyerek biyolojik olayların araştırılmasını sağlar. Dokulardaki radyoaktiviteyi saptayan mikro algılayıcılar kullanılır. Araştırma amacına göre farklı moleküller kullanılabilir (radyoaktif aminoasit, radyoaktif nükleotid, radyoakitf şeker). Böylelikle proteinler, nükleik asitler, polisakkarilert ve glikoproteinler işaretlenebilir. Hazırlanan doku kesitleri fotoğraf emülsiyonu ile kaplanır. Radyasyon alan gümüş bromür kristalleri küçük metal tanecikler halinde radyoaktif molekülleri içeren yapıları örter. Böylelikle dokuda radyoaktivite gösteren yapılar seçilebilir. Bir organ ya da dokuda neyin, nerede, ne kadar sentezlendiği, nereye göç ettiği araştırılabilir. Işık ve elektron mikroskopta kullanılabilen bir uygulamadır. HÜCRE VE DOKU KÜLTÜRÜ Canlı hücreler vücut dışında da çoğaltılıp üzerinde çalışılabilir. Çünkü organizmada dokular ve organlar karmaşık bir düzen içerisinde işlev görmektedir ve bu karmaşa içerisinde tek bir molekülün bir hücre ya da doku üzerindeki etkilerini belirlemek güçtür. Hücre ve doku kültürü in vitro ortamda bunu mümkün kılmaktadır. 19 Hücreler ve dokular belli bileşimleri (tuzlar, aminositler, vitaminler) içeren çözelti içerisinde çoğaltılır. İstenilen hücreler enzimlerle yalıtıldıktan sonra süspansiyon halinde petri kutusu veya lam üzerinde çoğaltılır. Hazırlanan bu hücre kültürü birincil hücre kültürüdür. Çoğalan hücrelerin önemli bir miktarı kültürün ilerleyen zamanlarında yaşlanma ve bölünmenin durması gibi süreçlere girerler. Bu nedenle bazı değişikliklerle belirlenen hücre hattının ölümsüzleşmesi sağlanabilir. Bu sürece dönüşüm (transformasyon) denir. HÜCRE Vücut Komponentleri Vücut 3 temel elemandan meydana gelmiştir; bunlar hücreler, hücrelerarası maddeler ve vücut sıvılarıdır. Vücut sıvıları; kan, lenf ve doku sıvısıdır. Kan vasküler sistem içerisinde yer alırken, doku sıvısı (hücrelerarası sıvı) hücreler arasında ve çevresinde bulunur ve lenf venöz sisteme drene olan doku sıvısından oluşur. Kan ile hücrelerarası sıvı arasında serbest değişim söz konusudur. Kanın şekilli elemanları olan hücreler dışında, vücudun bu sıvı bileşikleri preparasyon esnasında kayboldukları için normal histolojik kesitlerde, görülmezler, fakat varlıklarını unutmamak gerekir. Hücrelerarası madde adından da anlaşılacağı üzere hücreler arasında yer alır, hücrelere desteklik eder ve onları besler. Bu madde primer olarak dokuların sağlamlığından sorumludur ve histolojide iki ana tip hücrelerarası madde ayırt edilir; fibröz (şekilli) ve amorf (şekilsiz) hücrelerarası madde. Şekilli hücrelerarası madde kollajen, elastik ve retiküler lifler içerir. Amorf (şekilsiz) hücrelerarası madde ground substance (temel madde) ise glikozaminoglikanlar, multiadheziv glikoproteinler ve proteoglikanlardan meydana gelmiştir. Bu maddeler proteinlere bağlı karbonhidratlardır. Glikozaminoglikanlar genellikle bir üronik asit ve bir hekzozamin içeren doğrusal disakkarit ünitlerinden oluşan polisakkaritlerdir. Glikoproteinler ise dallı monosakkarit zincirlere sahiptir. Hyaluronik asit dışındaki glikozaminoglikanlar, bir proteine bağlanarak proteoglikanları oluşturur. İlk kez 1665 yılında, İngiliz bilim adamı Robert Hooke tarafından Latince “cellula” olarak tanımlanan hücre, tüm canlı organizmaların yapısal ve fonksiyonel ünitidir. Birbiri ile ilişkili, benzer özelliğe sahip hücreler bir araya gelerek dokuları oluşturur. Vücudumuzda epitel, bağ dokusu, kas dokusu ve sinir dokusu olmak üzere 4 temel doku bulunur. Bu dokular bir araya gelerek organları, organlar da birlikte organ sistemlerini oluşturacaklardır. Her bir organ sistemi de sindirim, solunum, üreme gibi fonksiyonlar için özelleşmiştir. İnsan vücudu farklı fonksiyonlara sahip yaklaşık 200 hücre tipinden oluşmuştur. Bu hücrelerin tamamı oosit ve spermin birleşmesi ile oluşan zigottan meydana gelirler. Hücre farklılaşması ile kendilerine özgü proteinler sentezlerler, şekillerini değiştirirler kısacası belli işlevler için özelleşirler. Hücreler tüm canlı organizmaların yapısal birimleridir. Her ne kadar bütün sınırları tam olarak görülemezse de çoğu kesitlerin en belirgin özelliği hücrelerin 20 varlığıdır. Her bir hücre, bir bütün halinde zar ile çevrelenerek dış ortamdan izole edilmiştir Hücreler protoplazmadan oluşmuştur. Hücrenin canlı kısmını oluşturan protoplazma heterojen yapıda olup içerisinde metabolik olaylar için gerekli kimyasal maddeler ve genetik materyal yer almaktadır. Bakteriler gibi primitif, küçük (1-5 µm çapında) hücreler, genetik materyali hücrenin diğer elemanlarından ayıran bir zara sahip değildir, bu tip hücreler prokaryotik hücreler olarak tanımlanırlar. Ayrıca prokaryotik hücrelerde genellikle membranla sarılı organeller bulunmaz. Bitki ve hayvan hücrelerinde ise genetik materyallerin büyük bir kısmı bir zarla örtülü olan çekirdek içerisinde izole edilmiştir, bu tip hücreler ise ökaryotik hücreler olarak tanımlanırlar. Ökaryotik hücrelerde membranla çevrili çok sayıda organel de bulunmaktadır. Hücrenin çekirdek ve ve hücre zarı (plazmalemma) arasında kalan yerleri sitoplazma olarak adlandırılır. Kesitlerde çekirdeğin bazen görülemeyeceği unutulmamalıdır ve hücrelerin bazılarında da sitoplazma farkedilir halde değildir. Ender olarak birden fazla olan çekirdek, genellikle düzgün ovoid veya sferikal şekillidir ve koyu boyanır. Çevresinde yer alan sitoplazma ise, daha açık boyanmaktadır. Hücrelerin görünüm, büyüklük ve şekillerinde büyük farklılıklar görülür. Bu farklılıklar değişik hücre tiplerinin farklı fonksiyonlarını yansıtmaktadır. PROTOPLAZMA Hücrenin canlı kısmını oluşturan Protoplazma 2 temel bölümden oluşur. Sitoplazma ve Çekirdek. Protoplazma ve sitoplazma sıklıkla birbirlerinin sinonimleri olarak kullanılırsa da gerçekte çekirdek içerisinde de protoplazma bulunur. Çekirdek protoplazması nükleoplazma veya karyoplazma olarak adlandırılır. Her bir hücre yaşayan dinamik bir bütündür. Protoplazmanın yaklaşık % 75'i sudur ve bunun da bir kısmı serbest, bir kısmı da protoplazmanın yapısal bileşiği olan proteine bağlı halde bulunur. Serbest su metabolik olaylarda kullanılmaktadır. Vücut materyallerinin yaklaşık % 1 kadarı da tuzlardır. Tuzlar; katyonlar ve anyonlar halindedir. Katyonlar özellikle potasyum ve magnezyum, anyonlar ise fosfat ve bikarbonatlardır. Bunlar olmaksızın fizyolojik olayların gerçekleşmesi imkansızdır. Hücre içi ve dışı osmotik basınç, kas kontraksiyonu, sinir impulslarının geçişi, doku rijiditesi (kemik gibi), hücrelerin yapışması ve enzimlerin aktivasyonu gibi çeşitli fizyolojik fonksiyonları gerçekleştirirler. Vücudun diğer bileşimleri ise 3 ana gıda maddesidir: % 10-20 proteinler, % 2-3 yağlar (lipid) ve % 1 de karbonhidratlardır. Bütün yüzdeler yaklaşık değerler olup, hücreden hücreye ve hatta aynı hücrede, değişik metabolik sikluslarda varyasyon gösterebilir. Hücrelerin kendilerine özgü yapısından sorumlu olan proteinler, amino asitlerden oluşan yüksek moleküler ağırlıklı moleküllerdir. Yaklaşık 20 tip amino asit vardır. Lipidler hücre içerisinde hem yedek gıda maddesi hem de yapı bileşiği olarak fonksiyon görür ve hepsi de yağ çözücülerinde çözülürler. Rutin mikroskobik preparat hazırlanmasında yağ çözücüler de kullanılmaktadır. Bu nedenle lipidleri koruyabilmek için özel fiksatifler veya özel teknikler kullanılmalıdır. Karbonhidratlar protoplazmada monosakkaritler, disakkaritler, polisakkaritler ve protein-polisakkaritler şeklinde bulunmaktadır. Diğer 21 önemli bir protoplazma bileşiği de vitaminlerdir. Hücrelerin büyümesi ve normal metabolizması için vitaminlerin küçük bir miktarı yeterlidir. Hücrelerin canlı olan protoplazması ve hücreler arasındaki cansız materyalleri (hücrelerarası madde) kolloid halinde bulunur. Bir kolloidi tam olarak tayin etmek oldukça güçtür. Bu kolloid solüsyonunun partikülleri bir elek fonksiyonu gören doğal membranlardan süzülemeyecek kadar büyüktür. Kristalloidler, örneğin glukoz ise bu membranları katedebilirler. Proteinler kolloidal durumun bütün özelliklerine sahiptir ve bazıları ya sol ya da gel halindedirler. Kolloidlerin sıvı solüsyonları sol olmasına rağmen, bir dereceye kadar da viskozdur (örnek yumurta albumini beyazı). Yumurta albumini ısıtılırsa veya hidrojen iyon konsantrasyonu bir değişikliğe tabi tutulursa solid hale geçerek jel durumunu alır. Bu şekildeki sol-jel değişiklikleri hücre protoplazmasında da görülebilir ve sıklıkla reversibledir (geriye dönüşebilir). Bu durum, jelatin solüsyonunun pıhtılaşması veya erimesi şeklinde düşünülebilir. Protoplazmanın şeklinden ve organizasyonundan sorumlu olan maddeler başlıca makromoleküllerdir. Bunlar en küçük organik yapı taşları olan monomerlerin birleşmesiyle oluşur. Örneğin bir makromolekül olan proteinler, amino asit monomerlerinin birleşmesiyle oluşur. Polisakkaritler de şeker monomerlerinden meydana gelmiştir. Polimerizasyonun derecesi tek bir makromolekül şeklinde birleşmiş monomer ünitleri sayısına bağlıdır. Hayvan hücrelerinde makromoleküller 3 ana grupta toplanırlar; bunlar polisakkaritler, proteinler ve nükleik asitlerdir. Polisakkaritler Çok sayıda monosakkaritin dehidrasyonu ile oluşmuş karbonhidratlardır. Temel yapı birimi glukoz molekülüdür. Kolloid yapıda olan bir bileşiktir. Biyolojik önemliliğe sahip polisakkaritler glikojen ve protein-polisakkaritleri içerir. D-glukozun oldukça dallı polimeri olan glikojen, hücrede depo edilir. Glukoz buradan gereksinim duyulduğunda serbest bırakılabilir. Glikojene hücrelerdeki pek çok kimyasal aktiviteler için gereksinim vardır. Sıklıkla histolojik kesitlerde görülebilen protein-polisakkaritler, çoğunlukla bağ dokusu proteinleri olan kollajen ve kondroitin sülfatlara bağlanmış olarak bulunur. Kondroitin sülfatlar, kıkırdak temel maddesi içerisinde oldukça fazla bulunurlar. Histolojik materyallerde bulunan protein-polisakkaritler hyaluronik asiti de içerir. Proteinler Proteinler belirli bir sıra takip eden ve peptid bağları ile bağlanmış bir seri amino asitlerden meydana gelmiş büyük moleküllerdir. Proteinler ya yapı proteinleri ya da enzimler şeklindedir. Yapı proteinlerine örnek olarak kollajen, kıl ve tırnak keratinlerini ve kas proteinlerini gösterebiliriz. Enzimler proteinlerin önemli bir gurubunu oluşturur ve pek çok kimyasal olaylar da katalizör olarak rol oynar. İnsulin ve gonadotropinler gibi pek çok hormonlar da yine proteinlerdir. Nükleik Asitler Nükleik asitler bütün canlı hücrelerde ve virüslerde bulunan, nükleotid birimlerden oluşmuş polimerlerdir Makromoleküller yapıda olup yerleşimleri sınırlıdır. Protein sentezinde de rol alan nükleik asitler 2 ana sınıfa ayrılır: DNA (Deoksibonukleik asit) ve RNA (Ribonukleik asit). Bu polimerleri oluşturan nükleotid 22 birimlerin her biri üç bölümden oluşur: 1) Azotlu heterosiklik bir baz, 2) beş karbonlu (pentoz) bir şeker ve 3) bir fosfat grubu. RNA'da bulunan şeker riboz, DNA'da ise deoksiribozdur. DNA ve RNA içerdikleri azotlu bazlarda da farklılık gösterirler, adenin, guanin ve sitozin her ikisinde, timin yalnızca DNA'da, urasil ise yalnızca RNA'da bulunur. DNA başlıca çekirdekte bulunur ki burada genetik materyali oluşturur. RNA ise hem çekirdekte ve hem de sitoplazmada yer alır. Protoplazma makromoleküllere ek olarak, lipidleri de içerir. Lipidler daha küçük moleküllerdir ve sıklıkla proteinlerle birlikte biyolojik zar formasyonunun yapısal temelini oluştururlar. Lipidler, hücre için enerji kaynağı olarak da görev yaparlar. Lipidler uzun alifatik zincirlerden meydana gelmişlerdir ve kendilerini su yüzeylerinde organize ederek monomoleküler tabakalar meydana getirme özelliğine sahiplerdir. Lipid-protein-su komplekslerini, sinir myelin kılıfları, mitokondriyon, Golgi apparatus ve endoplazmik retikülüm zar (membran) sistemlerinde görebiliriz. Birbirlerini takip eden böyle iki kompleks kombinasyon bir ünit membranı meydana getirir. Hücre Fonksiyonları (Hücrenin Canlılık Belirtileri)-Protoplazmanın Özellikleri Protoplazma bir kısım fizyolojik özelliklere sahiptir. Bu özellikler hücre fonksiyonlarına ve hücrenin canlılığına işarettir. Herhangi bir tip hücrenin fonksiyonları o hücrenin protoplazmasındaki bir ya da daha fazla özelliklere direkt bir işarettir. Bu fizyolojik özellikleri şöyle sıralayabiliriz. Uyarılabilme (İrritabilite) Canlılar sürekli olarak iç ve dış ortamdan kaynaklanan uyaranların etkisi altındadırlar. Uyarılabilme protoplazmanın bir uyarıya (stimülüse) karşı cevap verme kapasitesidir. Hücrenin uyarıya tepkisi protoplazmadaki bir ya da daha fazla oluşumlar tarafından gösterilebilir. Uyarılabilmenin kendisi canlılığın bir işaretidir. Hücre ölünce kaybolur. Uyarılabilme sinir hücrelerinde belirgin olarak izlenir. Uyarıyı iletebilme (Konduktuvite) Uyarıyı iletebilme, protoplazmanın bir eksitasyon dalgasını (elektrik impulsı) uyarıyı aldığı noktadan bütün hücreye nakletmesi olayıdır. Bu özellik sinir hücre membranında oldukça gelişmesine rağmen kas hücreleri membranında daha az gelişmiştir. Kasılma (Kontraktilite) Kasılma genellikle boyda kısalma olarak gözlenen, şekil değiştirme özelliğidir ve kas hücrelerinde oldukça gelişmiştir. Solunum (Respirasyon) Solunum çeşitli enerji verici organik besin maddelerinin oksijen varlığında ya da yokluğunda kimyasal reaksiyonlarla daha küçük moleküllere yıkılması ve bağlarındaki enerjinin ATP'nin yapısına aktarılması olayına denir. Solunum gıda 23 maddeleri ve oksijenin kimyasal olarak birbirlerine etkisi ile enerji, karbondioksit ve su oluşturmaları olayıdır. Bu olay şüphesiz hayat için esasdır. Emilim (Absorbsiyon) Absobsiyon belirli çözülmüş maddelerin daha sonra metabolizmada kullanılmak üzere emilimidir. Sıvılar, diffüzyon veya pinositozis yoluyla plazma membranını geçerek hücreye girebilirler. Pinositoziste bir sıvı damlacığı hücre membranı tarafından sarılır ve çöküntü meydana gelir. Bu çöküntü zardan ayrılarak vakuol şeklinde sitoplazmaya dahil olur. Hücreler aynı zamanda katı parçacıkları fagositozis ile hücreye alabilme yeteneğine sahiptir. Salgı ve Atılım (Sekresyon ve Ekskresyon) Salgı ve artık materyallerin hücre dışına çıkartılmaları olayıdır. Eğer hücre dışına atılan materyal, sindirim enzimleri veya hormonlar gibi faydalı bir ürünse bu olay sekresyon, artık maddeler ise ekskresyondur. Büyüme ve Çoğalma Hücre büyüklükleri farklı olmakla beraber insan hücrelerinin büyük bir kısmı 5-50 mikron (mikrometre) arasında bir büyüklüğe sahiptir. Hücreler arasında diffüzyon süratlidir ve bu hücre büyüklüğü ile düzenlenir. Hücre büyüklüğü arttıkça diffüzyonun görülebileceği yüzeysel alan artar ve bu artış kare ile ölçülür, protoplazmadaki artış ise kübik olarak ifade edilir. Dolayısıyla, bazı hücreler hacimce büyürken, maksimal büyüme yüzeysel alan ile sınırlanmıştır, eğer doku daha da büyüyorsa hücre sayısında artış gerçekleşmek zorundadır. Bu da ancak hücre bölünmesi ile mümkündür. Metabolizma Canlıların yapısına giren maddelerin yapım ve yıkım ürünü halini alıncaya kadar uğradığı kimyasal ve fizyolojik değişikliklere metabolizma (madde değişimi) denir. Hücre metabolizması ikiye ayrılır. Hücrelerin sindirimle aldıkları moleküllerin enerji elde etmek için yıkılmasına katabolizma ve elde ettikleri enerjiyi kendi yapılarında kullanabilecekleri yeni moleküllerin sentezlemesi olayında kullanmasına anabolizma denir. 24 HÜCRE KOMPONENTLERİ (BİLEŞENLERİ) Vücutta çekirdek ve sitoplazmadan oluşan pek çok farklı tipte hücre vardır (farklı şekil, büyüklük ve fonksiyona sahip hücreler). Normal bir histolojik kesitte, hücrenin bu iki bileşeni, farklı boyaları alırlar. Sitoplazma bileşenleri, rutin boyama teknikleriyle (Hemotoksilen-Eozin) genellikle belirgin olarak ayırt edilemez. Buna karşın çekirdek koyu boyanmış olarak görülür. SİTOPLAZMA Sitoplazma, yarı sıvı formda olup plazma zarı ile çekirdek arasını doldurur. Hücrenin yaşamsal olaylarının gerçekleştiği yerdir. Stoplazmanın miktarı hücrenin boyutuna göre değişir. Sitoplazmik matriks inorganik iyonlar (Na, K, Ca) ve organik moleküller (karbonhidrat, protein, RNA)’den oluşur. Organik ve inorganik moleküllerin oranı hücredeki metabolik aktiviteyi gösterir. Işık mikroskobide sitoplazma düzgün, homojen ve amorf olarak görülür fakat granüllü, fibrilli veya vakuollü sahalara da sahip olabilir. Sitoplazma gerçekte değişik tipte ve farklı fonksiyonlara sahip küçük cisimcikleri de barındırır. Sitoplazmik cisimcikler, sitoplazmik matriks veya sitozol (cytosol) adı verilen bir komponent içerisinde asılı haldedirler. Sitoplazmanın bu kısmı, pek çok tip enzim, çözünebilir proteinler, besin maddeleri ve makromolekül sentezinde kullanılan yapıları içerir. Farklı fonksiyonlara sahip hücreler tiplerinin (enzim salgılayan hücre ve sinir hücresi gibi) sitoplazmaları da farklı görünümüe sahiptir. Bir hücre tipinin farklı görünüme sahip olması aynı zamanda o hücrenin metabolik aktivitesine ve sitoplazmada küçük sitoplazmik cisimciklerin değişik tip ve sayıda olmalarına bağlıdır. Sitoplazmik cisimcikler iki ana grupta toplanır; a- Organeller; hücrenin canlı yapısal elemanlarıdır. b- İnklüzyon cisimcikleri; hücrenin cansız olan metabolit veya hücre ürünleridir. Hücrelerin çoğunluğunda sitoplazma bölgesel özelleşmeler gösterir. Sentrozom (hücre merkezi) ve Golgi apparatus genellikle çekirdeğe yakın yerleşmiştir. Lizozomlar ise sıklıkla Golgi apparatusa çok yakın komşuluk gösterir. Protein salgılayan hücrelerde granüler endoplazmik retikülüm (GER) ve mitokondriyonlar bazal sitoplazmada (subnuklear sitoplazmada) yoğunlaşmışken, sentrozom çekirdeğin üst tarafında ve salgı granülleri ya da damlacıkları apikal sitoplazmada yer alırlar. Mikrotübüller, mikrofilamanlar ve kontraktil proteinler gibi kas hücrelerinin diğer organelleri özel şekilde dağılmışlardır. Şüphesiz her hücre bir plazma membranı (zar) ile sarılıdır. Plazmalemma olarak da adlandırılan plazma membranı canlı olup hücre organellerinden biridir. 25 Hücre: Organeller ve inklüzyonların genel görüntüsü. Hücrenin Canlı Yapıları (Organeller) I II Hücre Zarı Sitoplazma: Mitokondriyonlar Endoplazmik Retikülüm (Granüler ve Agranüler ER) Ribozomlar Golgi Apparatus Lizozomlar Mikrocisimcikler Mikrotübüller Sentriyoller Silya ve Flagella Fibriller ve Filamentöz yapılar Annulate lamellae *Hücrenin Cansız Yapıları (Inklüzyonlar) A- Depo edilmiş gıda maddeleri 1- Karbonhidrat 2- Yağ B- Pigmentler 1- Endojen pigmentler a-Melanin b-Hemoglobin 2- Eksojen pigmentler - Karotenler - Tozlar (Karbon tozu) - Mineraller (Kurşun, Gümüş) - Döğme boyaları C- Kristaller *Salgı granülleri, canlı olan membran ile örtülü olduklarından bu gruba alınmamışlardır. III Çekirdek 26 Hücre Organelleri Hücre (Plazma) Zarı: Sitoplazmayı hücre dışındaki çevreden ayıran hücrenin en dış bileşeni hücre zarı (plazmalemma)’dır. Plazmalemma 7-10 nm (Nanometre) kalınlıkta olup, elektron mikroskobunda incelenebilirken, ışık mikroskobu ile görülemez. Ancak oblik olarak kesildiğinde kalınlığı artacağı için veya dış yüzeyi ile ilişkili materyallerin bulunması durumunda daha koyu boyanacağı için belirgin olarak izlenebilir. Plazmalemma hücre yüzeyinde ışık mikroskobu ile ayırt edilebilen en ince tabaka olarak tanımlanmıştır. Plazmalemma hücreyi dıştan sınırlamış olsa da hücre içi ve dışındaki makromoleküllerin geçisine izin veren dinamik bir yapıdır. İleri derecede seçici bir filtre olup, hücre içi ve dışındaki farklı iyon konsantrasyonun korunmasını, besin maddelerinin hücreye girmesini ve artık iyon konsantrasyonun korunmasını, besin maddelerinin hücreye girmesini ve artık ürünlerin ise hücreyi terketmesini sağlar. Tüm ökaryotik hücreler; fosfolipitler, kolesterol, proteinler ve oligosakkarit zincirlerinden oluşan sınırlayıcı bir zarla çevrelenmiştir. Ökaryotik hücrelerin plazma membranları ve hücre içi membranlarını da kapsayan tüm biyolojik membranlar ortak bir yapıya sahiptir. Kalınlığı hücreden hücreye değişkenlik gösterir ve genellikle hücre içi membranlar plazma membranından daha incedir. Elektron mikroskobu ile incelendiğinde, bu membranın üç belirgin tabakadan oluştuğu görülür. “Ünit membran” olarak adlandırılan bu düzenleme 2,5 nm kalınlığında iki koyu bölgeyi birbirinden ayıran 3 nm kalınlığındaki merkezi elektron lusent tabakadan oluşmaktadır. Plazma membranı ile ilgili çeşitli modeller ileri sürülmüştür. Deneysel çalışmaların çoğunun temelinde Danielli ve Dawson’un ileri sürmüş olduğu; merkezi bimoleküler bir lipid tabakası ile ayrılmış, iç ve dış protein tabakalarından oluşan membran yapısı modeli bulunmaktadır. Bugün için bu model geçerli değildir. Fosfotidilkolin (lesitin), fosfotidiletanolamin (sefalin), fosfotidilserin, sfingomiyelin ve fosfotidilinositol gibi membran fosfolipidleri; bir hidrofilik fosfat (polar) uç ile iki uzun hidrokarbon zincire sahip bir hidrofobik (non-polar) uca sahiplerdir. Membran içerisinde iki monomoleküler tabaka şeklinde düzenlenen fosfolipidlerin hidrofilik fosfat uçları yüzeydeki protein tabakası ile temas halindeyken, hidrofobik uçları membran merkezinde birbirlerine karşılık gelecek şekilde yerleşim gösterirler. Kolesterol de hücre zarının bir bileşenidir. Sıkıca paketlenmiş uzun fosfolipit zincirlerini kırarak zarı daha akışkan yapar. Dolayısıyla hücrede kolesterol miktarı zar akışkalığını kontrol eder. Glikolipitler ise hücre zarından dışarı uzanarak lipitlerin asimetrik yapısına katkıda bulunurlar. İki tabakanın herbirindeki lipit tabakası da farklıdır. Örneğin eritrositlerde fosfotidilkolin ve sfingomyelin miktarı zarın dış yarımında, fosfotidilserin ve fosfotidiletanolamin miktarı ise iç yarımda daha çoktur. Son yıllarda plazma membranının özellikleri ile ilgili yeni bilgilerin edinilmesi ile birlikte plazma membranının moleküler yapısı ile ilgili yeni görüşler ileri sürülmüştür. 27 Günümüzde kabul edilen en uygun membran modeli “Singer ve Nicholson’un sıvı mozaik modeli” dir. Bu modelde; amfipatik lipid tabakasına değişik aralıklarla gömülü integral proteinler ve zar yüzeyinde periferal proteinlerin, lipid tabakası ile birlikte bir mozaik oluşturduğu ileri sürülmektedir. Bu integral membran proteinleri hidrofobik ve hidrofilik bölgelere sahiptirler. Hidrofobik kısımları membranın merkezi lipid tabakası içerisine gömülü iken, hidrofilik kısımları yüzeye doğrudur. Hücre zarının sıvı mozaik modeli: Hücre zarı çift fosfolipit tabakasından oluşmuştur. Lipit tabakası; hidrofobik (nonpolar) zincirleri zarın merkezinde, hidrofilik (polar) baş kısımları ise dışa doğru olacak şekilde en karalı halini alır. İntegral proteinler lipit tabakasını boydan boya geçerken, periferal proteinler lipit tabakasının yüzeyine tutunmuştur. Ayrıca hücre zarı yüzeyinde oligosakkarit zincirleri de yer almaktadır. (Histology; A text and atlas. MH Ross, W Pawlina, Lippincott Williams&Wilkins, 2011’den alınmıştır.). Protein dağılımı membranlar arası farklılık gösterir. Proteinler toplam membran kütlesinin yaklaşık yarısını oluşturur. Bazı integral proteinler zarı bir taraftan diğer tarafa bir ya da birkaç kez geçer. Bu nedenle bunlara tek geçişli ya da çok geçişli transmembran (zarı kateden) proteinler denir. Uzun yıllardır integral proteinlerin membran düzlemindeki hareketi okyanusta buzdağlarının hareketine benzetilirdi. Son kanıtlar proteinlerin lipid tabakasında dağılım ve hareketinin rastgele olmadığını göstermiştir. Kolesterol ve glikosfingolipid konsantrasyonu “lipid raft(sal)” bölgelerinde yüksektir. Lipid raft bölgeleri, proteinlerin lipid tabakası içinde hareket ve dağılımını 28 kontrol eder. Lipid raft alanları, hücre sinyalizasyonuyla ilgili integral ve periferal proteinler içerir. Bu nedenle sinyal transdüksiyonu lipid raft bölegelerinde daha hızlıdır Zar proteinleri granüllü endoplazmik retikülümde sentezlenir, moleküllülleri Golgi kompleksinde olgunlaşır ve veziküller içinde hücre yüzeyine taşınırlar. Bu proteinler; hücre membranını sitoiskeletal filamentlere ve hücreleri ekstrasellüler matrikse bağlar. Enzimatik aktiviteleri dışında küçük iyon ve moleküllerin geçişini sağlayan pompa, kanallar sahiptirler. Glikolipitler ve glikoproteinlerin karbonhidrat bölümleri plazma zarının dış yüzeyine uzanarak özelleşmiş reseptör bölgelerini oluştururlar. Reseptörler, hücre yapışması, hücre tanınması ve hormonlara yanıt verme gibi fonksiyonlarda görev alır. Membran içerisindeki protein ve fosfolipidler arasındaki gerçek kimyasal bağlantıların çok hafif derecede oluşması nedeniyle, bu yapıların büyük ölçüde birbirlerinden bağımsız olduklarına inanılmaktadır. Elektron mikroskobik ve dondurmakırma çalışmaları plazma membranın rijid bir yapısı olduğu izlenimi vermesine rağmen, özellikle membran proteinleri olmak üzere bir çok bileşenleri serbestçe hareket etmektedirler. Bu hareket sırasında membran proteinlerinin polar özelliklerine uygun olarak membran içerisindeki pozisyon ve oryantasyonlarını korudukları tahmin edilmektedir. Canlı hücrede maddeler membran boyunca seçici olarak hareket ederler. Eğer hücre ölürse veya plazma membranı onarılamayacak şekilde zarar görürse moleküller membranı serbestçe geçer ve denge sağlanabilir. Çünkü canlı sistemlerde nadiren hücre içi ve dışı arasında denge sağlanır. Canlı membranlar moleküllerin ve partiküllerin giriş ve çıkışını düzenleyici dinamik bir bariyerdirler. Hücre içi ortamın korunması için besin maddelerinin hücreye girişini diğer materyallerin ise dışarı çıkışını sağlayan aktif ve pasif seçici membran transportu gereklidir. Bir molekülün plazma membranını geçiş oranı büyük ölçüde molekülün büyüklüğüne ve lipid içerisindeki çözünürlüğüne bağlıdır. Yağda çözünürlüğü yüksek olan (oldukça hidrofobik veya non-polar) ve daha küçük hacimli moleküller lipid tabakasını daha hızlı geçerler. Morfolojik olarak gösterilememesine karşın fizyolojik olarak membranda porların bulunduğuna inanılmaktadır. Bunlar membran kalınlığı boyunca proteinlerin geçtiği kanalları simgelemektedirler. Bu transport proteinler yalnızca özel bir uyarıya cevap olarak açılırlar, diğer durumlarda geçişe kapalıdırlar. Bu plazma membranları hormonlar ve nörotransmitterler aracılığı ile uyarı alırlar. Plazmalemmanın en dış yüzeyi glikoprotein ile kaplanmıştır. Bu nedenle plazmalemma diğer bütün membranlardan farklıdır. Bu glikoprotein tabakası hücre örtüsü veya glikokaliks (glycocalyx) adını alır. Kalınlığı 10-20 nm arasında değişmektedir. Örneğin, barsak epiteli luminal yüzeyinde PAS tekniği ile gösterilebilecek kadar kalın olabilir. İnce barsak epiteli luminal yüzeyinde mikrovilluslar adında parmak şeklinde sitoplazmik uzantılar bulunur. Intestinal hücreler yüzeylerine yapışan çeşitli maddelerden dolayı daha kalın bir glikokalikse sahiptir. Elektron mikroskopta içte amorf madde ve dışta “antennulae microvillares” denilen ince filamentler şeklinde görülür. Önceki çalışmalarda bütün hücrelerin yüzeylerinde değilse bile, çoğunluğunda, çok ince bir örtü şeklinde de olsa gösterilebilir kalınlıkta glikokaliks olduğu saptanmıştır. Glikokaliks, yalnızca hücrelerin birbirleri ile temas ettikleri yerlerde 29 bulunmaz. Hücre örtüsü, kimyasal olarak, glikoproteinleri içeren sialik asitten meydana gelmiştir. Glikoproteinler plazma membranına gömülmüşlerdir. Görüleceği üzere plazmalemma ünit membranı simetrik değildir. Glikolipidler ve kolinfosfolipidler hücre örtüsünün bir kısmını oluştururlar ve dış yüzeydeki glikoproteinin karbonhidrat kısımları ile birlikte lipid tabakasının en dış yarısında yer alırlar. Kolesterolün çoğunluğunda olduğu gibi aminofosfolipidler başlıca lipid tabakasının en iç sitoplazmik yarısında bulunurlar. Hücre örtüsü kompozisyonu hücre tipinden hücre tipine hafif farklılıklar gösterir. Hücre örtüsünün görevi hücre yüzeyini elektrostatik olarak yüklemektir. Bu yükleme hücresel temaslarda, hücrelerarası yapışmada ve hücresel tanınmada oldukça önemlidir. Hücreleri mekanik ve kimyasal etkenlere karşı korur ve reseptör özelliğe sahip proteinler içerir. Yüzeysel yüklemede ve hücre örtüsünde bir bozukluk belki de neoplastik veya kanser hücrelerinin birbirlerinden ayrılmalarına neden olmaktadır. İlaveten antijenler de hücre örtüsü içerisinde yer alırlar. Küçük moleküller hücre membranı yapısında bir değişiklik olmadan kolayca plazma membranını katedebilirler. Daha büyük moleküllerin hücre tarafından içeri alınması membran ile çevrili vesikül oluşumunu kapsayan endositozis olayı ile gerçekleşir. Endositozis enerji gerektiren aktif bir olaydır, 3 şekilde gerçekleşir; küçük bir miktar sıvı ya da materyal önce hücre membranı ile sarılır, bu kısım hücre içine doğru membrandan kopar ve küçük bir pinositotik vezikül (yaklaşık 80 nm çapında) haline gelir. Pinositotik veziküller genellikle lizozomlarla birleşirler. Eğer bu şekilde vezikül içeriği sıvı materyal ise pinositozis, vesikül içeriği solid bir materyal ise fagositozis denir. Mononüklear fagositer sistem üyesi hücreler fagositoz için özelleşmişlerdir. Antikorlarla sarılan hücre kalıntıları ve bakteri gibi biyolojik materyaller hücre yüzeyinde Fc reseptörlerine tutunur, aktin filamentlerinin depolarizasyonuyla plazma membranında pseudopod oluşur. Hücre içine alınan vezikül (250 nm’den büyük çapta) Fagozom formasyonunun içine hapsolur. Fagozomun lizozomalarla birleşmesiyle lizozomal sindirim gerçekleşir. Biyolojik olmayan materyaller için antikor Fc reseptörleri kullanılmaz. Reseptör aracılı endositozis sırasında ise; hücre yüzeyinde yer alan reseptör bölgelerine bağlanan ligandlar Klatrin kaplı veziküller şeklinde Adaptin molekülü Dynamin protein kompleksi araclığıyla bellirli bölgelerden plazma membranı içerisine alınır. Daha sonra klatrin kılıf kaybolur, veziküller endozomla birleşir. Endozomlardan hücre yüzeyine yakın olanlar genç (erken) endozom, sitozol derininde olanlar yaşlı (geç) endozom adını alır. Ayrılan klatrin molekülleri ise yeni veziküller oluşturmak üzere hücre zarına geri dönerken kılıfsız kalan veziküller de sitoplazmik organellerle birleşir. 30 Lizozomal sindirim yolları. Kırmızı oklar, küçük partiküllerin klatrin kaplı veziküller içinde hücreye alındığı reseptör aracılı endositozis ve sıvı materyalin alındığı pinositozisi göstermektedir. Mavi oklar: bakteri ya da hücresel artıklar gibi büyük partiküllerin hücre içine alındığı fagositozis olayını belirtmektedir. Yeşil oklar, lizozomların hücre içi sindirimini özetlemektedir. Hücreye ait organeller veya proteinler SER izolasyon membranı ile sarılarak sitoplazmik matriksten izole edilir ve otofagozom halini alarak, lizozomlar tarafından sindirilirler.(Histology; A text and atlas. MH Ross, W Pawlina, Lippincott Williams&Wilkins, 2011’den alınmıştır.) Endositozis olayının ters yönde işlemesi ekzositozis (atılım)’dir; örnek olarak, membran ile çevrili bir salgı granülünün plazmalemmaya yapışmasını ve içeriğini plazma zar bütünlüğünü bozmaksızın hücrenin dış tarafına doğru serbest bırakmasını gösterebiliriz. Mikropinositotik veziküller ya da Kaveola intrasellülares (caveoloe intracellulares) yaklaşık 50 nm çapa sahiptir ve iki ana tiptir; iki ana tiptir; örtülü ve örtüsüz. Örtüsüz vesiküller düzgün bir sitoplazmik yüzeye sahiptir ve translusent veya düşük elektron densitede, oldukça ince granüllü materyal içerirler. Bu tip vesiküller özellikle endotelyal, mesotelyal ve düz kas hücrelerinde belirgindir ve proteinler ile diğer moleküllerin bu hücrelerin membranları arasında taşınmasında rol oynarlar. Örtülü 31 vesiküller flokulant materyalleri içerirler ve kendilerini sınırlayan membranların dış yüzeyinde, gömülü vaziyette 15 nm kadar uzunlukta küçük çıkıntılar görülür. Örtülü vesiküller yabancı partikül ve proteinleri, bakterileri, metabolik ürün veya artık maddeleri sindiren hücrelerde bulunurlar. Makrofaj, karaciğer hücreleri, barsak iç yüzeyinin örtücü hücreleri ve böbrek proksimal tübül hücrelerinde yaygın şekilde görülürler. Bağ dokusu fibroblastları, kondrosit, odontoblast ve osteoblastlarda ise bu vesiküllerin her iki tipine de rastlanır. Buralardaki görevleri ekzositozis, protein salgılanması ve/veya bağ dokusu ve sıkı dokulardaki hücrelerarası boşluklara karbonhidrat moleküllerinin iletilmesidir. Ekzositozis olayında, sonuçta plazma membranı ile kaynaşan bu vesiküllerin kökeni muhtemelen Golgi apparatustur. Ekzositozise Ca+2 kontrolünde çok sayıda özgül protein aracılık eder. Sitozolde Ca+2 artışı ekzositozisi tetikler. Granüler Endoplazmik Retikülümde (GER) sentezlenen proteinler COP-II (kaplı vezikül-II) vezikülleri halinde Golgi Kompleksine gönderilir. Golgiden ters yönde GER’e doğru taşıma işlemi ise COPI kaplı veziküller aralığıyla gerçekleşir. Vezikül transport yolları; endositozis ve ekzositozis. Endositozis hücre zarından difüzyonla veya aktif taşımayla geçemeyecek büyüklükteki moleküllerin hücre içine taşıyıcı veziküller içinde alınış yöntemidir. Ekzositozisde ise artık madde içeren salgı vezikülü hücre zarı ile kaynaşır, ve zar bütünlüğünü bozmaksızın dışarı atılır. (Histology; A text and atlas. MH Ross, W Pawlina, Lippincott Williams&Wilkins, 2011’den alınmıştır.) 32 Pek çok hücre tipinde plazma membranı fonksiyonlarına göre şekilce modifiye olmuştur. Çoğu durumlarda, böyle modifikasyonlar yalnızca elektron mikroskobu ile görülebilir. Örneğin, absorbsiyon (emilim) için özelleşmiş hücrelerde, sıklıkla luminal (apikal) sınırda, pek çok sayıda küçük silindir şeklinde parmağa benzer uzantılar diğer adı ile mikrovilluslar yer alır. Mikrovilluslar plazmalemmanın tübüler uzantılarıdır, merkezi yerinde sitoplazmik öz yer alır. Eğer mikrovilluslar topluca ve düzenli şekilde bir araya gelmişlerse hep birlikte çizgili ya da fırçamsı kenarı oluştururlar. Çizgili ya da fırçamsı kenarı ışık mikroskobu ile görebiliriz; fırçamsı kenar, hücre yüzey alanını arttırmaktadır. Bir hücrenin bağ dokusuna veya kapiller kan damarlarına en yakın olan taban kısmına ait yüzeysel alan plazmalemmanın içe doğru çöküntüler yapmasıyla arttırılabilir. Hücreler arasında lateralde komşu plazma membranlar birbirlerinden yalnızca yaklaşık 20 nm’ lık dar bir mesafe ile ayrılmışlardır. Her ne kadar burada yüzeyler düzgün ve plazma membranları birbirlerine paralel iseler de, çoğunlukla düzensiz bir görünüme sahiptir. Düzensizlik görülen bölgelerde sistem birbirleri ile kenetlenmiş diş ve yivler şeklindedir. Fermuar şeklindeki bu kenetlenmenin hücre adhezyonunda bir faktör olabileceği düşünülmektedir. Karşıt yüzeyler boyunca dağılmış vaziyette, küçük, dens yapılar bulunabilir, bunlar desmozom ya da makula adherens olarak adlandırılırlar. Ender olarak hücre yan yüzeyleri birbirlerinden "hücrelerarası kanal"ı oluşturacak şekilde ayrılırlar, bu gibi bölgelerde hücrelerden, hücrelerarası boşluğa genellikle mikrovilluslar ya da pseudopodial uzantılar uzanır. Son olarak plazma membranı ile hücrenin diğer membranöz kısımları arasındaki ilişkiden söz edilebilir, muhtemelen, plazma membran endoplazmik retikülüm ile devamlılık göstermekte ve dolayısı ile plazma membranı ile nüklear membran, Golgi apparatus ve belki de mitokondriyonlar arasında dolaylı bir devamlılıktan bahsedilebilir. Bütün bunlara karşın bu membranlar aynı kalınlığa sahip değildir. Plazma membranı, hücre organellerinin membranından % 10-15 daha kalındır. Endoplazmik Retikülüm (ER) Birbiriyle bağlantılı anastomoz gösteren kanal ve keseler şeklinde sisternaları çevreleyen kesintisiz zar sistemidir. Granüllü ve granülsüz olmak üzere 2 tiptir: Granüler Endoplazmik Retikülüm (GER) Işık mikroskobide bazı hücre tiplerinde sitoplazma içerisinde bazik boyalarla boyanmış alanlar görülür. RNA içeriği fazla olan bu bölgelere sitoplazmanın bazofilik komponenti, kromodial madde veya ergastoplazma adı verilir. Ergastoplazma yapılan işe, diğer bir deyimle sitoplazmanın sentez ile ilgili kısmına işarettir. Bu bölgeler elektron mikroskobide granüler endoplazmik retikülüm olarak tanımlanır. Retikülüm, sisterna (sarnıç) veya düzleşmiş kesecik, tübüller ve vesiküller şeklinde membran ile sınırlanmış kanalların oluşturdukları 3 boyutlu bir ağdır. Bu ağı meydana getiren oluşumlar birbirleri ile irtibatlıdır. 6-7 nm kadar bir kalınlığa sahip olan retikülüm membranları plazma membranından daha incedir ve dış (sitoplazmik) yüzeyine ribozom adı verilen küçük, elektron dens cisimcikler yapışmıştır. Retikülüm kaviteleri içesinde flokulant elektron dens bir materyal bulunur. Bazı hücrelerde retikülüm bir 33 veya iki düzleşmiş sisternadan meydana gelirken, bazı hücrelerde pek çok düzleşmiş sisternalardan oluşmuştur ve diğer bir kısım hücrelerde ise oldukça yaygın bir şekilde bulunan, birbirlerine paralel düzenlenme gösteren uzun sisternalar şeklindedir. Yalnızca olgun eritrositler ve belki de bazı küçük lenfositler GER'den tamamen yoksundur. Komşu sisternalar arasındaki bağlayıcı tübüllere ilaveten bazı hücrelerdeki sisternalar pencereli tiptir. Bir hücredeki GER miktarı protein sentezi ile ilgilidir; örneğin sindirim enzimlerini sentezleyen pankreatik asinar hücrelerde, kollajen sentezleyen fibroblastlarda ve immunoglobulin sentezleyen plazma hücrelerinde GER oldukça yaygındır. Bu oldukça ince intrasitoplazmik membranlar sistemi aralıklı şekilde yüzeysel plazma membranı ve çekirdek kılıfı ile birleşip devamlılık gösterebilir ve bazı hücrelerde de düzgün ya da agranüler endoplazmik retikülüm (SER) ile devamlılık gösterir. GER’in esas işlevi protein sentezinin kalite kontrolünü yapmaktır. Bir sorun varsa protein, retrotranslokasyonla sitoplazmaya geri gönderilir. Hasarlı protein glikolizlenir, poliubiquitinlenir, proteozoma indirgenir. GER ribozomları ayrıca lizozom, Golgi, çekirdek kılıfı, plasma membranı integral proteinlerininde daimi komponentlerini oluşturur. COP-II vezikülleri, GER’den Golgi kompleksinin cis yüzüne Anterograde taşıma ile, COP-I vezikülleri ise Golgi kompleksinin cis yüzünden GER’e Retrograde taşıma ile iletilir. Hücreler bir tahribatla karşılaştığında veya ayırıcı santrifüje tabi tutulduğunda GER parçalanarak mikrozomları (100 nm çapta) oluşturur. Mikrozomlar dış yüzeylerinde ribozomlar bulunan küçük, membranla çevrili sferikal cisimciklerdir. Mikrozom lümenleri retikülümün salgı ürünlerini içerir. Biyokimyacılara gore mikrozomlar protein sentez kapasitesine sahip küçük granüler endoplazmik retikülüm parçalarıdır. GER‘in esas fonksiyonu protein sentezidir. Bazı hücrelerde örneğin; (pankreatik asinar hücrelerde) salgı retikülüm membranları içerisinde konsantre edilir. Bununla beraber salgıların esas olarak konsantre edildiği hücre organeli Golgi apparatusudur. GER aynı zamanda, çoğu hücre organellerinin lipid komponentlerinin sentezi ile de ilgilidir. Yaygın GER membranları üzerinde hücrenin lipid sentezinden sorumlu pek çok farklı biosentetik enzimler bulunmaktadır. 34 Pankreas ekzokrin hücrelerinin elektron mikroskopik görüntüsü izlenmektedir. Sitoplazmada çok sayıda salgı vezikülü (S), granüler endoplazmik retikülüm (RER), Çekirdek (Ç) ve unit membran yapısında hücre zarı (PM) görülmektedir.(http://www.visualhistology.com/products/atlas/VHA_Chpt1_Cells.html’ den alınmıştır.) Ribozomlar Ribozomlar bütün hücrelerde ya GER' e yapışmış ve onun bir parçası olarak veya sitoplazma içerisinde serbest halde bulunurlar. Ribozomlar 20x30nm boyutlarında küçük elektron dens partiküllerdir.Ribozomlar rRNA ve protein içerirler ve RNA’da bulunan çok sayıda fosfat grubu nedeniyle sitoplazmik bazofiliden sorumludurlar. Bu nedenle metilen mavisi, toluidin mavisi ve hematoksilen gibi bazik boyalar ile belirgin olarak boyanırlar. Ribozomlar, biri diğerinden daha büyük olan iki subünitten meydana gelmiştir; subünitler farklı sedimentasyon hızlarına sahiptir ve 60 S ve 40 S subünitleri şeklinde tanımlanırlar. 60 S’lik subüniti 50 S protein ve rRNA, 40 S’lik subüniti ise 33 S 35 protein ve rRNA içerir. Ribozomlar sitoplazma içerisinde serbest ya da bağlı olarak 2 şekilde bulunurlar; serbest ribozomlar ve bağlı ribozomlar (GER ribozomları). Serbest ribozomlar; sitoplazmada bulunurlar ve önemli sitoplazmik proteinlerin sentezinde görev alırlar. Serbest ribozomlar olgun eritrositler dışında bütün hücrelerde bulunurlar ve bazofilik karakterdedirler. Sinir hücrelerinde bulunan, bazofilik yapılar olan, Nissl Cisimcikleri de GER ve serbest ribozomlardan oluşur. Serbest haldeki ribozomlar ya tek olarak ya da rozet veya helikal şekillerde topluca bulunurlar, bu bileşik cisimciklere polizom ya da poliribozom adı verilir. Bir polizomda, ribozomlar haberci RNA’nın (mRNA) 1,5 nm uzunluğundaki ince filamenti boyunca dizilmişlerdir. Ribozomlar amino asitlerin peptid ve proteinlere dönüştüğü yerlerdir (Protein sentez bölgeleri). Serbest ribozomlar hücre büyümesi ve bölünmesi için gerekli sitoplazmik proteinleri meydana getirirken, bağlı ribozomlar ise; GER’in dış yüzeyinde olup, membran yapısında yer alan proteinlerin, sitoplazmada vezikül içinde depolanacak proteinlerin ya da hücre dışına salgılanacak proteinlerin sentezinde görev alırlar. Bu nedenle embriyonik hücrelerde, tümör hücrelerinde ve hemoglobin yapan genç (immatur) eritrositlerde serbest ribozomlar oldukça fazladır. Ayrıca mitokondriyonlarda ve nüklear membranın dış yüzeyinde de ribozomlar bulunmaktadır. GER’da protein sentezi; transkripsiyonla DNA’dan pre mRNA sentezi ile başlar. Ribozomlar mRNA’ya bağlanırlar, mRNA’daki sinyal peptidi (15-60 aminoaitlik) SRP (sinyal tanıyan partikül) ile etkileşir. Oluşan polizom bu şekilde SRP ve ribozomal reseptörler aracılığıyla GER’e tutunur Kenetlenmeden sonra SRP ayrılır, translasyon devam eder. Translokator protein, polipeptid zincirini GER lümenine yönlendirir. Sinyal peptidinin sinyal peptidaz tarafından ayrılmasından sonra, sinyal peptit peptidaz kesilen sinyal peptidini yok eder. Protein sentezi tamalanınca ribozom tranlokator proteinden ayrılır. Protein sentezi sırasında ayrıca sisternada hidroksilleme, glikozlama, sülfatlama, fosforlama gibi değişikliklerde gerçekleşir. GER’de sentezlenen protein depolanabilir (lizozom ve lökositlerin özgül granülleri gibi), geçici olarak tutulabilir (pankreas ve bazı endokrin hücreler gibi) veya zar bileşeni olarak kullanılabilir. Agranüler Endoplazmik Retikülüm (SER) Agranüler (düzgün=smooth) endoplazmik retikülüm (SER ya da AER) ribozomlara sahip olmadığından GER'den farklıdırlar. Ayrıca sisternaları GER’deki gibi yassı üstü üste dizilmiş raflar şeklinde değildir, birbiriyle bağlantılı değişik şekil ve büyüklükte tübüller sisternalara sahiplerdir. Çevre sitoplazmik matriksten farklı boyanmadığı için elektron mikroskobik inceleme sonucunda görülebilirler. GER membranlarına benzeyen SER membranları 6-7 nm kadar kalınlığa sahiptir. Tübüler lümen genişliği 50 nm kadardır. Düzgün retikülüm; GER, Golgi apparatus ve plazmalemma ile birleşebilir. SER elemanları sıklıkla glikojen partikülleri, mitokondriyonlar ve lipid damlacıkları ile yakın ilişkidedir. SER membranları lipid ve karbonhidrat metabolizması için gerekli olan enzimlere sahiptir. SER özellikle adrenal korteks, korpus luteum ve testisin intertisyal (Leydig hücreleri) hücrelerinde belirgindir ki buralarda steroid biyosentezi ile ilgilidir. Hepatik parankimal hücrelerinde, pankreas tarafından salgılanan glukagon hormonu yeni glukoza parçalanması ve lipid sentezi olaylarında rol oynar. Aynı zamanda glukagon yağda çözünen pek çok ilaçların 36 (barbitüratlar gibi) metabolizması ile de ilgilidir. Hepatik parankimal hücreler lipoprotein partiküllerinin başlıca üretim yeridir. Lipoproteinlerin lipid komponentlerini sentezleyen enzimler agranüler endoplazmik retikülüm membranlarında yerleşmiştir. Bu organel aynı zamanda metabolizma tarafından oluşturulan zararlı bileşiklerin ve ilaçların detoksifikasyonu için gerekli bir seri reaksiyonu katalize eden enzimleri de içerir. Karaciğer hücrelerindeki SER glikojen formasyonu ve depolanması, kolesterol lipoprotein sentezi ve detoksifikasyon olaylarında rol oynar. Hidrolaz, metilaz, glukoz-6fosfat, ATP az ve lipid oksidaz içerirler. SER barsak epiteli içerisindeki prizmatik absorbtif hücrelerde, monogliserit ve yağ asitlerinden trigliseritlerin sentezlenmesinde rol oynar. Mide parietal hücrelerinde bu organel hidroklorik asit formasyonu ile ilgilidir. Kas hücreleri SER'ü sarkoplazmik retikülüm adını alır ve bu hücrelerde kalsiyum iyonlarını depolar, kas hücrelerinin kontraktil elemanlarının aktivitesini düzenler. SER sitoplazmadaki Golgi apparatus ve pinositotik vesiküller gibi diğer membransal elemanlardan mutlaka ayırt edilmelidir.Granüler endoplazmik retikülüm ile yakın ilişkisinden dolayı SER’ün GER’den ribozomlarını kaybetmesi ile oluştuğu ileri sürülmüştür. Karaciğier hücresinde, Agranüler Endoplazmik Retikülüm (SER), Çekirdek (Ç), Mitokondriyon (M), granüler içeriği ile Lizozom (Liz), kesecikler şeklinde Golgi kompleksi (G) ve vezikülleri (V), tübüler sisternalara sahip Lipofuksin pigmenti (Lf)’nin varlığı elektron mikroskopik olarak görülmektedir.(Duane’s Ophthalmology. Gerald B. Grunwald 2006’den alınmıştır.) 37 Golgi Apparatus 1898’de İtalyan anatomist Camillio Golgi tarafından tanımlanmıştır. Golgi sahası veya Golgi kompleksi olarak da bilinen bu organel "pozitif" veya "negatif" imaj (görüntü) şeklinde ışık mikroskobu ile de görülebilir. Gümüş impregnasyonu veya osmium tetroksit ile uzun süre muamele gibi özel tekniklerden sonra Golgi apparatus çekirdek yakınında yerleşmiş kanal ve vaküollerden oluşmuş bir ağ veya düzensiz granüler küme şeklinde görülür ve bazen multipledir (birden fazla). Özel tekniklerden sonra elde edilen görüntü "pozitif" görüntü olarak adlandırılır. Salgı hücrelerinde (Goblet hücreleri gibi) Golgi apparatus supranüklear olarak (çekirdek üstünde), çekirdek ve salgılama yüzeyi arasında yer alır. Diğer hücrelerde ise genellikle çekirdek yakınındadır ve sıklıkla bütün hücre boyunca çeşitli bölgelere dağılmıştır. Bu organel genel tekniklerle boyanmaz, fakat osteoblast ve plazma hücreleri gibi oldukça bazofilik sitoplazmaya sahip hücrelerde, H.E. ile boyanma halinde, Golgi bölgesinde çoğunlukla soluk, berrak saha olarak görülür. Bu bir "negatif" görüntüdür. Negatif görüntü bize Golgi bölgesinde ribozomların olmadığını düşündürür. Elektron mikroskobide Golgi apparatusun 3 membranöz komponentinin bulunduğu görülür. 1- Sisterna veya kesecik, 2- Küçük veziküller, 3- Geniş vakuoller. Sisternalar yassılaşmış ve hafif açı yapacak şekilde bükülmüş düzgün yüzeyli membranlardan meydana gelmiştir. Bu membranlar birbirlerine paralel raflar şeklinde dizilim gösterirler. Rafların sayısı 3 ile 12 arasında değişir. Her komşu sisterna arasında 20-30 nm kadarlık bir boşluk bulunur ve birbirleriyle ilişkilidir. Bütün apparatus bir kase görünümünde olup, çekirdeğe bakan bir dış, konveks, proksimal yüzeyi (cis yüzeyi) ile çekirdekten uzakta iç, konkav, distal (trans yüzey) yüzeye sahip bulunmaktadır. Proksimal membranlar distal membranlardan daha incedir. Sisterna membranları dış yüzde 6-7 nm ve iç yüzeyde de 7-8 nm kalınlığındadır. Sisterna veya kavitelerin genişlikleri ise 15 nm kadardır, fakat bu genişlik periferde artar. Bir sisterna rafına diktiyozom (dictyosome) adı verilir. Çekirdeğe yakın olan proksimal yüz nisbeten vesiküllerden yoksundur ve konveks, şekillendirici, immatür yüzey olarak adlandırılır. Distal yüz granül oluşumu ile ilgilidir ve konkav, matür, salgılayıcı yüzey adını alır. Vesikül ve vakuoller distal sisternalar ile ilişkilidir. Vesiküller küçük, 40 nm çapında, sferikal şekilli, çoğu düzgün yüzeyli yapılardır. Fakat bazıları yüzeyden uzanan tüy şeklinde ince filamentlerle örtülüdür (örtülü vesiküller). Örtülü vesiküller membran proteinlerinin endoplazmik ketikülüm ile Golgi apparatus arasında ve Golgi aparatus ile plazmalemma arasında taşınmasında rol oynarlar. Vakuoller 0,5 µm veya daha fazla çapta olup, değişik densitede salgı ürünleri içerebilirler. Daha geniş olanlar dens, homojen bir içeriğe sahip olup, yoğunlaşan veya salgılayıcı vakuoller olarak adlandırılır. Pankreas asinar hücrelerinde salgı vakuolleri yoğunlaştırılmış salgı proteinleri (zimojen granülleri) içerir. Bu salgı proteinleri hücreden ekzositoz ile atılır. Atılım sırasında salgı vakuolleri plazma membranı ile kaynaşarak içeriklerini dış ortama boşaltırlar. Sisternalarla ilişkili vesikül ve vakuollerin yerleşimi sıklıkla asimetriktir. Golgi apparatus statik (durgun) değildir, devamlı olarak değişim gösterir. İmmature yüzeye yakın olan GER ribozomlardan yoksundur; işte bu endoplazmik retikülümden tomurcuklanma sureti ile ayrılan transfer vesikülleri Golgi apparatusun dış 38 immatur yüzeyi ile birleşerek içeriğini boşaltır. Aynı zamanda iç matur yüzeyden ve keseciklerin periferinden salgı vakuolleri ayrılır. Bu nedenle Golgi rafları boyunca bir "hareket" vardır. Golgi apparatusun büyüklüğü hücrenin salgılanma aktivitesine bağlıdır. GER içerisinde oluşan proteinden zengin salgı maddesi transfer vesikülleri içerisinde Golgi apparatusa giderek orada yoğunlaşır ve apparatusu salgılayıcı vakuol olarak terkeder. Bundan sonra salgı granülü veya damlacığı olarak hücre yüzeyine ilerler ve içeriğini hücre dışına boşaltır. GER tarafından meydana getirilen salgı (protein) Golgi apparatus içerisinde şekil değişikliğine uğrar. Burada muhtemelen suyun uzaklaştırılması ile yoğunlaştırılır ve çoğu durumlarda karbonhidrat parçacıkları ilave edilir. Örneğin glikoproteinleri (müküs) salgılayan goblet hücrelerinde protein GER içerisinde meydana getirilir, burada bir miktar karbonhidrat ilave edilirse de glikoproteinlerin karbonhidrat yan zincirlerinin çoğunluğu Golgi apparatus içerisinde basamak, basamak ilave edilir ve ürün şekillendirici yüzeyden olgunlaşma yüzeyine kesecikler aracılığı ile ilerledikçe karbonhidrat içeriği artar. Pankreasta Langerhans adacık hücrelerinden beta hücrelerinde, endoplazmik retikülümde sentezlenen proinsulin Golgi apparatus içinde insülin ve C-peptide parçalanır. Golgi apparatus aynı zamanda hücre örtüsü olan glikokaliks formasyonunda da proteine şeker ilave eder, bu madde yüzeye Golgiden köken almış vesiküller içerisinde iletilir. Kıkırdak hücrelerinde karbonhidratlar Golgi apparatus içerisinde sülfatlanır ve yüzeye giderek extrasellülar matrix bileşikleri olarak serbest bırakılır. Bütün bu olaylarda yüzeye bir miktar membran eklenmektedir, bir salgı granülü veya örtülü vesikülün membranı plazmalemma ile kaynaşır. Bu şekilde oluşan yüzeysel membran fazlalığı endositosiz ve lizozomal aktiviteler ile giderilir, böylece bir hücrenin yüzeysel alanı nisbeten aynı kalır. Golgi apparatus aynı zamanda hücre içindeki bazı hidrolitik enzimleri (lizozomlar şeklinde) konsantre ederek paket haline getirir (etrafını membran ile çevirir). Spermatositlerde hyaluronidase enzimi Golgi alanı içerisinde konsantre edilir, bu enzim sonradan olgun spermatozoon akrozomunun şekillenmesinde rol oynayacaktır. Bütün bunlardan dolayı Golgi apparatus salgı maddelerinin hücre içi iletiminde ve hücre yüzeyinden salgılanmalarında büyük rol oynar, aynı zamanda özellikle glikoproteinler olmak üzere bazı salgı ürünlerinin sentezi ile de ilgilidir. Bazı hücrelerde, Golgi apparatusun şekillendirici yüzeyine yakın olarak agranüler endoplazmik retikülüm membranları yerleşmiştir. Bu membranlar özellikle lizozomların (ve belki de salgı vakuollerinin) oluşumu ile ilgilidirler. Bu retikülüm membranları lokalizasyonu, tabiatı ve fonksiyonu dikkate alınarak GERL (Golgi, Endoplazmik Retikülüm ve Lizozom) olarak isimlendirilirler. 39 Golgi aparatusu. Şematik çizim ve elektron mikroskobik görüntü. Yassılaşmış raf şeklinde sisternalara sahip Golgi aparatusunun cis yüzü, endoplazmik retikülümden gelen salgı vezikülleriyle birleşir ve Golgi aygıtında işlendikten sonra trans yüzden transport veziküller şeklinde salınır. Lizozom ve keseler şeklinde Golgi kompleksine ait elektron mikroskop görüntüsü görülmektedir.(http://faculty.une.edu/com/abell/histo/histolab2.htm’den alınmıştır.) 40 Mitokondriyon Mitokondriyonlar sitoplazmadaki metabolitlerin kimyasal enerjisini, hücrenin kolayca kullanabileceği enerjiye dönüştüren organeller olup, kan hücreleri ve terminal keratinositler hariç bütün hücrelerde bulunurlar. Normal H.E. boyaması ile görülemez ise de pinacyanol, demirli hematoksilen ve Janus yeşili B ile supravital boyamadan sonra ayırt edilebilirler. Taze preparatlarda mitokondriyonlar faz-kontrast mikroskop ile farkedilebilir. Mitokondriyonlar ipliğe benzer (mito=iplik, kondros=tanecik), ovoid veya sferikal şekilli 0.5-1 µm eninde, 2-5 µm boyunda yapılar olup (bazen boyaları 7-10 µm kadar ulaşabilir) , sitoplazma içerisinde yer alan cisimciklerdir. Hücre aktivitesine bağlı olarak sayıları hücreden hücreye farklıdır; lenfosit ve epitelyal hücrelerde çok azdır, fakat midenin parietal hücreleri (asit salgılayıcı), böbrek proksimal tübül hücreleri ve adrenal korteks hücreleri gibi yüksek metabolik hıza sahip hücrelerde oldukça fazladırlar. Örneğin, her bir karaciğer parankim hücresinde 1000 veya daha fazla sayıda mitokondriyon bulunabilir. Canlı hücrede mitokondriyonların hareket ettiği, hacim ve şekil değiştirdiği, bölündüğü görülür. Mitokondriyonlar hücrede ana enerji kaynağıdırlar. Elektron mikroskopik mikrograflarda mitokondriyonların karakteristik bir yapıya sahip oldukları izlenir. Mitokondriyonlar her biri 6-7 nm kalınlığında ve trilaminar yapıda olan düzgün yüzeyli iki membran ile sarılmıştır ve iki membran arasında 10-20 nm genişliğinde elektron saydam (lucent) bir aralık bulunur. Dış membran 3 nm çapında voltaj bağımlı anyon kanalları (Mitokondriyal porlar) içerir. Bu porlardan 5000 dalton büyüklüğe kadar moleküller geçebilir. Dış membran, membranlararası boşluğa geçecek olan proteinler ve polipeptidler için reseptörler içerir. Membranlar arası boşluk, sitoplazma benzeri bir yapı gösterir. İç membran hücre merkezine doğru bir seri uzantılar gönderir. Mitokondriyon kristaları (cristae mitochondriales) adını da alan bu uzantılar şekil yönünden farklıdır; transvers (enine) membransal tabakalar şeklinde olabileceği gibi tübüler veya vesiküler de olabilirler. Kristalar belirgin bir şekilde iç membranın yüzeysel alanını arttırmakta ve matriksi çevrelemektedir. Mitokondriyon sayısı ve her bir mitokondriyonda, krista sayısı bulunduğu hücrenin enerji etkinliği ile ilgilidir. Düşük enerji metabolizmasına sahip hücrelerde kısa kristalara sahip az sayıda mitokondriyon bulunur. Çizgili (iskelet) kas ve böbrek tübül hücreleri ile yüksek metabolik aktiviteye sahip diğer hücrelerde karakteristik bir şekilde sıkıca paketlenmiş membranöz tabakalar halindedir, fakat adrenal korteks, korpus luteum ve Leydig hücreleri gibi steroid hormonlarının sentez edildiği hücrelerde kristalar tübüler veya vesikülerdir. Kristaların iç (matrix) yüzeyine pek çok sayıda çok küçük, topuz şeklinde partiküller yapışmıştır; elementar partiküller adını alan bu yapıların, oksidatif fosforilasyon enzimlerini taşıyan başları 10 nm çapında, sapları 5 nm kadar uzunlukta ve 3 nm kadar enindedir. Baş kısımları matrikse bakacak şekilde iç membrana tutunurlar, TEM’de tenis raketine benzer görünüm sergilerler. Bu partikülleri ancak özel teknikler ile görebiliriz. İki membran arasında kalan boşluk dış kompartmanı simgeler, iç kompartman ise iç zar ile çevrelenmiştir ve matrix tarafından doldurulmuştur. Mitokondriyal matriks amorf veya oldukça ince granüllü olup küçük, dens intramitokondriyal granüller içerebilir; bu granüller 50 nm çapında olup, kalsiyum ve 41 magnezyum iyonlarından zengindir. Matriks içerisinde aynı zamanda çift sarmal halde DNA, 3 tip RNA (rRNA, mRNA, tRNA) ve bir kaç adet de ribozom bulunur. Bu çift sarmal DNA mitokondriyonda sentezlenir, dublikasyonu çekirdeğin DNA kopyalanmasından bağımsız olarak gerçekleşir. Sitoplazmik ribozomlara benzeyen mitokondriyal ribozomlar daha küçük olup farklı sedimentasyon hızına sahiptir. Bütün bunların yanında mitokondriyal matriks ender olarak birkaç glikojen partikülü, protein kristali ve myelin (lipid) figürlerini de içerebilir. Mitokondriyonların primer fonksiyonu adenozin difosfat (ADP) ve inorganik fosfatdan adenozin trifosfat (ATP) sentez etmektedir. ATP, bütün hücre için enerji kaynağı olarak kullanılır. Mitokondriyonlar 3 ana enzim sistemine sahiptir; Krebs (trikarboksilik asit) siklusu, hidrojen ve solunum zinciri elektron taşıyıcıları (elektron transport sistemi) ve fosforilasyon enzimleri. Krebs siklusu enzimleri karbonhidrat, yağ asitleri ve bazı amino asitlerin (bütün bunlar matriks içerisinde yer alırlar) son parçalanmaları ile ilgilidir. Solunum zinciri enzimleri ve ilgili fosforilasyon enzimleri muhtemelen krista yüzeylerinde veya krista membranları içerisindeki elementar partiküllerin içerisinde yer almışlardır. Mitokondriyonların çoğalması kendilerinin genetik bilgi içerikleri (DNA ve RNA) ve matriks ribozomları yardımıyla protein sentez yetenekleriyle ilgilidir. Mitokondriyonların karakteristik proteinleri sentez edebildiği bir gerçektir, fakat çoğalma şekli hala açıklığa kavuşamamıştır; çoğalma muhtemelen tomurcuklanma veya basit bölünme ile olmaktadır. Mitokondriyonlar bölgesel enerji ihtiyacına göre sitoplazma içerisinde fonksiyonel dağılım gösterir; örneğin metabolik olaylar için enerjinin kullanıldığı sitoplazmik bölgelerde yer alırlar. Buna örnek olarak kas hücrelerinde mitokondriyonların kontraktil yapılarına yakın bulunmalarını, hareketi sağlamak için spermde orta-parçada ve silyanın tabanında bulunmalarını, aktif taşıma için böbrek proximal tübül hücrelerinin bazal katlantıları arasında yer almalarını gösterebiliriz. Ayrıca mitokondiyonlar kalsiyumu konsantre ederek sitoplazma içerisinde genel bir kalsiyum ortamının devamını da sağlarlar. 42 Mitokondriyon yapısı. a. Pankreatik asinar hücrede mitokondriyon elektron mikroskopik görüntüsü izlenmektedir. İç mitokondriyal membranda kristalar (C) ve dış mitokondriyal membran (ok) gösterilmiştir. b. Mitokondriyonun şematik görüntüsü; iç ve dış mitokondriyal membranlar arasında boşluk yer almaktadır. Kristaların iç yüzeyine elementar partiküller tutunmuştur. Mitokondriyal matrikste kalsiyum ve magnezyum iyonlarından zengin granüller, DNA, RNA ve ribozom bulunmaktadır. (Histology; A text and atlas. MH Ross, W Pawlina, Lippincott Williams&Wilkins, 2011’den alınmıştır.) Lizozomlar Lizozomlar değişik hacim ve şekildeki küçük, membran ile çevrili organeller olup, hücre içi sindirimi için gerekli enzimleri içerirler. Hücre içi sindirim ve hücre içi bileşenlerin yenilenmesi ile ilgili olduklarından görünümleri fonksiyonel durumlarına göre değişir ki, bu olay pleomorfizme neden olacaktır (pleomorfizm; bir yapının değişik şekillerde görünmesi). Lizozomlar olgun eritrositler dışında tüm hücrelerde bulunurlar, fakat böbrek proksimal tübül hücrelerinde, karaciğer hücrelerinde, nötrofil lökositlerde ve makrofajlarda en yoğundurlar. Lizozomların 40'dan fazla tanımlanan enzim içerdikleri bilinmektedir. Bunların hepsi hidrolitik enzimler olup, proteazları, nükleazları, glikosidazları, lipazları, fosfolipazları, fosfatazları ve sülfatazları içerir. Bu enzimlerin bütün hepsi asit hidrolazlar olup, optimal olarak pH: 5 civarında aktiftirler. Asit fosfataz için modifiye Gomori metodu ile elektron sitokimyada teşhis edilirler. Lizozomal membranın, kolesterol ve lizobifosfatidik asit içeren, farklı fosfolipid yapısı, kendi kendini sindirmesini önler. Gerek fonksiyonel ve gerekse morfolojik yönlerden lizozomları iki ana guruba ayırabiliriz; primer lizozomlar ve sekonder lizozomlar. Bir primer lizozom henüz enzimatik faliyete başlamamış, sitoplazma içerisinde yeni 43 şekillenmiş veya dinlenme safhasındaki bir organeldir. Bir sekonder lizozom ise primer lizozom ile hücre içi veya dışından kaynaklanan membranla çevrili cisimciğin (fagozom) birleşmesi ile oluşur ve içerisinde enzimatik sindirim ya başlamıştır ya da başlamak üzeredir. Bir primer lizozomun yapısında bulunan hidrolitik enzimler GER tarafından meydana getirilmektedir. Buradan transfer vesikülleri olarak Golgi sisternalarına gider ve tam bir lizozom olarak Golgi apparatusun mature (salgılayıcı) yüzeyinden tomurcuklanma sureti ile ayrılır. Primer lizozom genellikle 25-50 nm çapındadır ve 6-7 nm kalınlıktaki trilaminar membran ile örtülüdür. Bazı primer lizozomlar 0.8 mikron çapa sahip olacak kadar büyüktürler; bazıları ise nötrofil lokositlerde olduğu gibi elipsoid şekillidir; ve ender olarak da düzensiz kristal huzmeleri şeklinde dens maddeleri içerirler. Primer lizozomlar pinositosiz, fagositosiz ve otofaji veya self-fagositosiz olayları sırasında fonksiyon gösterirler bu olaylar sonucu membran ile çevrili cisimcikler oluşur. Pinositosiz ve fagositosizde yüzey plazmalemma invagine olur(çöküntüye uğrar) ve sonra da koparak, ya yalnızca sıvı içeren ya da hücre dışından köken alan diğer maddeleri içeren, membran ile çevrili vesikül haline gelir. Bu şekilde oluşan cisimcik fagozom veya heterofagozom adını alır. Bir primer lizozomun membranı (veya birden fazla lizozomların membranı) ile bir fagozomun membranı birbirleriyle birleşir, fagozomun içeriği primer lizozomların hidrolitik enzimleriyle muhatap olur ve neticede sekonder lizozom oluşur. Buna benzer bir olay da sitoplazmanın kendisinin bir parçasında oluşabilir; yaşlanan veya tahrip olan bir hücrede görülen bu olayda, sitoplazmanın bir kısmı hücrenin kendi membranı ile çevrilir ya da izole edilir. Hücrenin kendisine ait organeller, sitoplazmik proteinler vs. sindirimi olayına otofaji denir. Bu yolla anabolik ve katabolik hücre fonksiyonları dengelenir istenmeyen gereksiz organeller ortadan kaldırılır. Sindirilen organel komponentleri geri dönüştürülür, hücre büyümesi ve gelişmesi için kullanılır. Besinsel açlıkta, hücresel farklanmada, hücre ölümünde ve hücre yaşlanmasında önemli rol oynar. Uygun besin ve büyüme faktörleri, serin/threonin kinaz olarak bilinen Mammalian Target of Rapamycin (mTOR)’in enzimatik aktivitesini stimüle eder. Yüksek mTOR aktivitesi otofajiyi inhibe eder. Açlık, hipoksi, yüksek sıcaklık mTOR aktivitesini engeller bu durum da Atg (autophagyrelated genes) aktivasyonuna neden olur, otofaji başlar. Otofaji 3 şekilde gerçekleşir; makrootofaji de sitoplazmanın bir kısmı ya da bir organel ilk önce ER’un ekstrasellüler membranı ile sarılır. Primer lizozomlar bu yapıyla birleşir ve sekonder lizozom yani otofajik vakuol (otozom=otofagozom) meydana gelir. Bu vakuoller ribozom, mitokondriyon, endoplazmik retikülümün bir kısmı, lipid damlacığı veya membran parçalarını içerebilir. Oluşan otofagozom hidrolitik enzimlerle parçalanır. Mikrootofaji de ise küçük sitoplazmik materyaller parçalanır. Şaperon aracılı otofajide de Hsc73 şaperon proteini gereklidir. İndirgenecek protein Hsc73’e bağlanır ve lizozoma transfer edilir. Her şekilde de oluşan sekonder lizozomun içeriği sindirildikten sonra faydalı ürünler hücre bileşimlerinin sentezinde kullanılmak üzere tekrar sitoplazmaya döner, fakat geride sindilmemiş kalıntılar kalabilir; işte bu inaktif cisimcikler residüel cisimcik (kalıntı-artık cisimcik) olarak adlandırılır. Akciğer makrofajları içerisindeki residüel cisimcikler slika veya asbestos, adrenal korteks hücrelerindeki residüel cisimcikler kolesterol veya boya partiküllerine sahip olabilir. Yaşlanan hücrelerde görülen diğer bir özel tip de lipofuscin granülleridir; burada sekonder lizozomlar lipid damlacıklarını, 44 granüler pigment maddelerini ve vakuolleri barındırabilir. Eğer bu şekildeki cisimcikler bir hücrede oldukça fazla ise hücre kahverengimsi-sarı rengi alır. Uzun ömürlü bazı hücrelerde (Ör: nöronlar, kalp kası ve karaciğer hücreleri) yaşlanmayla birlikte çok miktarda residüel cisimcikler (lipofuscin) birikir. Diğer bir sekonder lizozom tipi de multivesiküler cisimcik olarak adlandırılır. Multivesiküler cisimcikler 0,2-0,3 mikron çapında vakuollerdir ve asit fosfataz karakteri gösteren makriksinde, küçük vesiküller bulunur. Multivesiküler cisimciklerin kökeni ve önemliliği henüz açıklığa kavuşmamıştır fakat muhtemelen bir primer lizozom içerisindeki pinositotik vesikül inklüzyonlarından meydana gelmişlerdir. Lizozomlar, esas olarak hücrenin kendini korumasında rol oynamaktadır; bakteri ve funguslar gibi yabancı maddelerin tahrip edildikleri yerlerdir ve normalde görülen hücre bileşimleri ve organellerinin yenilenmesinde rol oynarlar. Tahrip olan hücrelerde membran ile örtülü lizozomların membranları yırtılabilir veya geçirgen hale gelebilir, bu durumda hidrolitik enzimler sitoplazmanın kendisini etkisi altına alacaktır, neticede hücrenin lizisi (erimesi) ve ölümü meydana gelecektir. Böyle bir olay enfeksiyonlar sırasında nötrofil lökositlerde, hücrelerin öldüğü bakterilerin fagositosizinde görülür; ve buna benzer bir olay muhtemelen dokuların büyümesi ve yeniden şekillendirilmesi sırasında da görülmektedir. Lizozomal enzimler, extrasellüler boşluklara, eksositozis ile salınırlar örneğin; osteoklastlarda tipik olan bu fonksiyon, kemiğin resorpsiyonu ile ilgilidir. Bazı salgı hücrelerinde salgılama azaldığında veya durduğunda yeni oluşan salgı granülleri direkt olarak lizozomal siklusa dahil olarak yıkılırlar. Böylece hücre içerisinde fazla miktarda salgı materyali birikimine engel olunur. Bu olaya krinofaji (crinophapy) adı verilmektedir. Tay-Sachs hastalığı lizozomları içeren önemli bir genetik hastalıktır. Lizozomlardaki enzimler fonksiyon yapamazlar ve substratlar parçalanamadığı için sitoplazma içerisinde birikerek hücrenin fonksiyonunu engellerler. Tay-Sachs hastalığında serebral korteksteki nöronlarda galaktosidaz enzimi bulunmamaktadır. Bunun sonucunda hücrelerdeki substratlar parçalanamadığından nöron sitoplazmasında birikmektedirler. Elektron mikroskopik incelemelerde sinir hücrelerinde tipik tanıya yardımcı olan laminar şeklinde düzenlenen elektron dens cisimcikler izlenmektedir. 45 L L L Lizozomların (L) elektron mikroskopik görünümü izlenmektedir. Proteozomlar Protein yıkımının lizozomal yollara ilaveten diğer bir yolu da lizozom harici protein yıkımıdır. Bu tip bir yıkım, proteozomlar olarak adlandırılan geniş sitoplazmik veya nuklear protein komplekslerinde meydana gelmektedir. Proteozomlar, ATP bağımlı proteaz kompleksleridir ve yönlendirilen proteinleri parçalarlar. Denatüre olmuş, gereksiz, anormal aminoasit içeren proteinleri yıkarlar. Ayrıca hızlı bir şekilde inaktive edilmesi gereken regulatör proteinler ve transkripsiyon faktörleri, tümör supresörleri, tümör promoterları gibi mitotik siklinleride indirgerler. Lizozomlar hücre içindeki maddeleri, organel ve vezikülleri sindirirken, proteozomlar doğrudan proteinlerle ilgilenir. 76 aminoasitlik bir protein olan ubiquitin ayrıştırılacak olan proteine bağlanır. İlk ubiquitinin bağlanmasıyla diğer ubiquitinler ardışık olarak linear bir zincir oluşturur. Varil şeklindeki proteozomun her iki ucunda ATPaz ve ubiquitinle işaretlenmiş parçaları tanıyan düzenleyici parçalar yer almaktadır. Tanınan işaretli proteinler ATPaz tarafından, proteozom merkezine alınır ve 8 amino asitlik peptidler şeklinde kırpılır, zıt uçtan sitozole salınır. Sitozolde ya daha küçük parçalara ayrılır ya da başka bir işlemde 46 kullanılır. De-ubiquitinating enzimler (DUBs) tarafından salınan serbest ubiquitinler ise yeniden kullanılmak üzere serbest kalırlar. Peroksizomlar (Mikrocisimcikler) Mikrocisimcikler olarak da adlandırılan, peroksizomlar yapısal yönden lizozomlara benzerler ancak bunlar lizozomal hidrolazlara sahip değillerdir. Peroksizomlarin bazıları primer lizozomlardan daha geniş olup, agranüler endoplazmik retikülüm ile devamlılık gösterebilirler. Peroksizomlar membran ile çevrili granüler cisimcikler olup sferikal veya ovoid şekle sahiptir, çapları 0.5-1.2 mikron (µm) arasında değişir. Peroksizom membranı trilaminar yapı gösterir ve 6 nm kalınlığındadır. Mitokondriyonlar gibi oksijen kullanırlar ancak, ATP üretmezler ve hücresel metabolizmaya doğrudan katılmazlar. Peroksizomlar; makrofajlarda, böbrekte proksimal tübül hücrelerinde, bronşiollerin silyasız hücrelerinde, karaciğer parankim hücrelerinde ve odontoblastlarda bulunurlar; son iki tip hücredeki peroksizomların granüler matriksi bir kristalloid cisimciğe veya nukleoide sahip olabilir. Peroksizomlar, muhtemelen GER tarafından meydana getirilmişlerdir. Peroksizomlar özgül organik maddeleri okside ederek, hücre için çok zararlı olan hidrojen peroksit (H2O2) oluşumuna neden olurlar. Bununla beraber hidrojen peroksiti parçalayan katalaz ve peroksidaz gibi oksidatif enzimleri de içerirler. Oksidazlar hidrojen peroksiti (H2O2) oluştururlar bu da katalaz ile yıkılır. Peroksizomlar, muhtemelen hücreleri aşırı hidrojen peroksit yapımından koruma yönünden oldukça önemlidir ve yağların karbonhidratlara dönüştürülmesi olan glukoneogenesizde rol oynayabilirler. Karaciğer ve böbrek tübül hücrelerinde çok sayıda peroksizomların bulunması bu organellerin bir çok farklı molekülün detoksifikasyonunda rol oynadıklarını göstermektedir. Ayrıca kristalloid bir inklüzyon olan ürat oksidaz insan dışında, birçok hayvan hücre peroksizomunda da bulunur. Lizozoma yapısal benzerlik gösteren peroksizomların ve Golgi kompleksi sisternalarının elektron mikroskobik görüntüsü izlenmektedir. (http://faculty.une.edu/com/abell/histo/histolab2.htm’den alınmıştır.) 47 Annulate Lamella Hücre içerisinde yassılaşmış membran sisternalarının oluşturduğu aktif bir ağ sistemidir. Her bir lamella 30-50 nm genişliğinde, sisternalar oluşturan iki paralel membrandan (7-9 nm kalınlığında) oluşur. Bu sisternalar sirküler porlar (40-50 nm çapında) tarafından sıklıkla kesilir. Porlar ya da annuluslar nuklear (çekirdeğe ait) membran porlarına benzemektedir, her iki tip de porların periferinde çepeçevre 8 globular subünite sahip 8 katlantılı bir simetri gösterir ve poru örten membran merkezinde de daha küçük merkezi bir granül bulunur. Gerek nuklear membranın ve gerekse annulate lamellaların her ikisinin de adenozin trifosfataz enzimini içerdikleri gösterilmiştir, fakat en azından oositlerde annulate lamellaların por sayısı nüklear membran por sayısından daha fazladır; annulate lamellalarda total por alanı nüklear membran total por alanından iki kez fazladır; bunun önemliliği henüz açıklığa kavuşamamıştır. Nüklear membrana olan bu yapısal benzerlik annulate lamellaların nüklear membrandan köken aldığı hipotezine yol açmıştır. Buna benzer yapılara intranüklear olarak da rastlanmıştır. Her nekadar kuvvetli bir kanıt yoksa da, fonksiyonel olarak, annulate lamellalar çekirdekten sitoplazmaya bilgi taşıyabilir. Bu fonksiyona ek olarak ve gene kesin bir kanıt olmaksızın annulate lamellaların meydana gelmesi olayları bu organelin basitçe değişici ve sonradan parçalanarak sitoplazmik vesikülleri oluşturabileceğini düşündürmektedir. Annulate lamellalar süratli bölünen hücrelerde (embriyonik ve neoplastik hücreler) ve erkek ile dişi germ hücrelerinde tarif edilmişlerdir. Annulate lamellalar sıklıkla endoplazmik retikülüm membranları ile direkt bağlantılara sahiptirler. AL Yassı membran sisternalarının oluşturduğu ağ yapısında, Annulate lamellae (AL)‘nın elektron mikroskopik görüntüsü izlenmektedir. 48 Hücre iskeleti Mikrotübüller, ara (intermediyer) filamanlar ve aktin flamanları (mikrofilamanlar)‘dan oluşan karmaşık bir ağdır. Bu yapısal proteinler; hücrenin şekillenmesi sağlar, organeller ve veziküllerin hatta tüm hücrenin hareketinde rol oynarlar. Mikrotübüller Mikrotübüller 20-25 nm kadar çapta ve uzunlukları tam olarak belirlenemeyen ince, uzun, tübüler yapılardır. Sitoplazmada düz şekilde bulunmaları bunların belirli bir katılığa sahip olduklarını gösterir. Mikrotübüller 15 nm kadar çaplı, merkezi, elektron lusent bir öze sahiptir, dolayısı ile duvar kalınlığı 5 nm’dir. Duvar, protofilament olarak adlandırılan merkezi bir öz çevresinde sirküler düzenlenmiş 13 adet 110 kDa ağırlığında tubulin adı verilen globüler proteinden yapılmış subunitlerden meydana gelmiştir. Her tubulin dimeri de, 55 kDa ağırlığında α ve β-tubulin alt birimden oluşur. Ancak bazen az sayıdaki özel lokalizasyonlarda mikrotübüllerin çapı 12 protofilamentten oluşacak şekilde daha küçük veya 15 protofilamentten oluşacak şekilde daha geniş olabilmektedir. Işık mikroskobunda flamentöz sitoplazmik liflerle karıştırılan mikrotübüller tübülin antikorları kullanılarak florasan boyalarla ayırt edilebilir Hemen bütün hücrelerde bulunur ve sitoplazmada dağılmış tek elemanlar, paralel düzenlenmiş gruplar ve kısmen de iki (doublet) ya da üçünün (triplet) kaynaşmış formları halinde görülürler. Mikrotübüller temel olarak 3 fonksiyona sahiptir; 1- Hücre şeklini korumak için bir sitoiskelet olarak görev yapar. Örneğin disk şeklindeki kan plaketlerinde mikrotübüller yüzeye yakın bir band oluştururlar. 2- Mikrotübüller hücre şeklinin değişmesi ile ilgilidir. Mitozisde, mikrotübüller mitotik iği meydana getirirler, krozomlar bu iğ boyunca ilerlerler. Mikrotübüller spermatidlerin tekrar şekillendirilmesinde rol oynarlar ve silya ile flagellada kayma mekanizmasını oluştururlar sonuçta silya ve flagella hareket edecektir. Mikrotübülün uçlarına yeni subünitlerin eklenmesiyle bu yapıların boyları uzayabilir ki bu da mitotik iğlerin oluşmasında görülür. 3- Su, metabolit ve hatta makromoleküller için bir diffüzyon kanalı olarak fonksiyon görür, dolayısı ile intraselluler (hücre içi) transporta yardım eder. Maddeler uzun bir mesafeye nakledilebilirler; örneğin maddelerin sinir hücresi perikaryonundan uzantılarına iletilmesi. Mikrotübüller aynı zamanda hücre içinde organellerin taşınmasınada aracılık eder. Nöronlardaki aksoplazmik transport, pigment hücrelerindeki melanin transportu, kromozom hareketleri, vezikül hareketleri gibi örneklerin herbirinde kompleks bir mikrotübül ağının varlığı gereklidir. Eğer mikrotübüler kırılıp ayrılmış ise bu aktivasyonlar mümkün olmaz. Mikrotübüllerin bir ucunda polimerizasyon diğer uca göre daha hızlı olur. Bu uca pozitif (+) uç, diğerine negatif (-) uç denir. Tubulin dimerlerinin polimerizasyonu, 49 Guanozintrifosfat (GTP) ve Mg varlığına bağlıdır. Her bir tübülin mikrotübül yapısına katılmadan önce GTP’ye bağlanır. GTP-Tübülin kompleksi polimerize olur, P ayrılır. Polimerizasyondan sonra tüm dimerler aynı yönde yerleşime sahip olur. Polimerizasyon ve depolarizasyon denge içindedir ve MAPs (microtubul associated proteins) tarafından modifiye edilirler. Mikrotübüller protein tübülünden meydana gelmiştir. Protein tübülin çözülebilir karakterdedir. Muhtemelen silya, sentriol ve bazal cisimcikler haricindeki hücrelerde devamlı yıkılması ve yeniden formasyonu söz konusudur. Bu olay kolşisin ve vinblastin ile bloke edilebilir. Antimitotik bir alkoloid olan kolşisin mikrotübüle bağlandığında (+) uca daha fazla tübülin bağlanmasını engellerken, vinblastin mikrotübülü çözer. Bu maddelerin verilmesinden sonra hücrede mikrotübüller kaybolur ve mitosis mitotik iğin yetersiz bir şekilde formasyonundan dolayı durdurulmuş olur. Mikrotübüller; aynı zamanda sentrioller, siller, flagellum gibi çok sayıda kompleks sitoplazmik bileşenin de temel yapını oluştururlar. Mikrotübül polimerizasyonu. Herbir tübülin dimeri α ve β-tubulin alt birimden oluşur. Her mikrotübül 13 tübülin dimeri içerir. Kapak proteini mikrotübül organizasyon merkezi (MTOC)‘ne gömülü durumdadır ve mikrotübüller α ve β-tubulin’in eklendiği γ-tübülin halkasından gelişir. + uçta tübülin dimerleri guanozintrifosfat (GTP)’a bağlanır, - uçta GTP hidrolize olur. (Histology; A text and atlas. MH Ross, W Pawlina, Lippincott Williams&Wilkins, 2011’den alınmıştır.) 50 Sentrioller Işık mikroskopide sentrioller çekirdek yakınında yer alan kısa çubuklar veya granüller şeklinde görülür. Genellikle, interfaz devresinde ya da bölünme halinde olmayan hücrede 2 adet olup diplozom adını alır. Çift olan sentrioller sıklıkla Golgi apparatus tarafından ya çevrelenmiştir, ya Golgi apparatusa yakın ya da çekirdek çöküntüsü içerisinde yerleşim gösterir. Elektron mikroskopide her bir sentriol 150 nm kadar çapta ve 300-500 nm uzunlukta, 42kDa ağırlığında içi boş bir silindir şeklinde görülür. Enine kesitte görüldüğü gibi duvar herbiri 3'er mikrotübülden oluşmuş 9 mikrotübül takımdan meydana gelmiştir; 3'er mikrotübülden oluşan her bir takım triplet olup duvar çeperine bir açı yapacak şekilde silindirin uzun eksenine paralel yerleşmiştir. Herbir triplete ait mikrotübüller A, B ve C, olarak adlandırılır; en içteki A, ortadaki B ve duvara en yakın olanı da C mikrotübülüdür. Tripletler dens amorf bir madde içerisinde gömülmüştür. Her sentriolün bir ucu açıktır, diğer ucu ise dens bir madde tarafından araba tekerleği görünümünde kısmen kapatılmış olabilir. Önceden değinildiği gibi sentrioller genellikle bir çift olup uzun eksenleri birbirine dik açı yapacak şekilde ve orta elektron denste bir miktar amorf madde içerisinde yer alırlar; bu orta elektron denslikte olan materyal çevre sitoplazmaya perisentriolar satellitler veya sentrofer adı altında uzanır. İki sentriol ile birlikte sentrofere beraberce sentrozom veya hücre merkezi adı verilir. Sentrozomal bölge mikrotübül hariç diğer organellerden yoksundur. Sentrioller kendi kendilerine çoğalırlar ve mitozisde daha belirginleşir. Profaz safhasında sentrioller ikiye ayrılır ve herbirinden yeni bir prosentriol gelişir. Yeni oluşan sentriollerin etrafında mikrotübüler, mitotik iğ ve yıldız şeklindeki lifleri meydana getirmek üzere dizilirler. Sentriol ve mikrotübül organizasyon merkezi (MTOC); interfazda mikrotübül sayısı, polaritesi ve organizasyonunu düzenler. Mitoz sırasında dublike olan MTOC mitotik iğ oluşumunu sağlar. Hücre bölünmesinden önce interfazın S evresinde her sentrozom eşini oluşturur; böylece hücre bölünmesinden sonra her bir hücre iki sentriol kazanır. Hem silyum hem de flagellum hücre yüzeyine göç eden sentriolün burada bazal cisim oluşturmasıyla meydana gelirler. Ancak bazal cisimcikler merkezi tübül parçası içermezler. 51 Fibroblast sitoplazmasında sentriollerin elektron mikroskopik görüntüsü izlenmektedir. 9x3’lü mikrotübül organizasyonuna dikkat ediniz. (Histology; A text and atlas. MH Ross, W Pawlina, Lippincott Williams&Wilkins, 2011’den alınmıştır.) Silya Silya, başlıca epitelyal hücrelerde olmak üzere hücre yüzeyinden uzanan hareketli sitoplazmik uzantılardır, fonksiyonları yüzeyde bulunan sıvı film tabakasını hareket ettirmektir. Kıl veya kirpik tipi uzantılar anlamında kullanılan silyum, çoğul şeklinde silya terimi ile ifade edilir. Silya en çok üst solunum yolları epiteli, erkek ve dişi üreme yollarının bir kısım epiteli ve beyin ventrikülleri ile medulla spinalisin merkezi kanalını döşeyen epandim hücrelerinde bulunur. Silya uzunlukları farklı olmakla beraber genellikle 5-15 mikron (µm) arasındadır. Fakat bazan daha uzun veya daha kısa olabilmektedir. Uzunluktaki bu farklılıklara karşın bütün silyumlar aynı 0.2 mikron (µm) çapa sahiptir. Her silyum trilaminar plazmalemma uzantısı ile örtülüdür ve bir uzun silindirik şaft, bir kütleşen uç ve apikal sitoplazmada yer alan bir bazal gövde diğer adı ile kinetozom'dan meydana gelmiştir. Kinetozom ışık mikroskobunda silyumun tabanında dens bir granül şeklinde görülür. Şaft içerisinde düzgün yerleşim gösteren 9 periferal mikrotübül çifti (duplet) ve iki adet merkezi mikrotübül yer alır. Bu şekildeki mikrotübüler filaman kılıfı axonema veya axial filaman kompleksi olarak adlandırılır. Merkezdeki mikrotübüller bir merkezi kılıf ile çevrilirdir. Silyum ucunda, mikrotübül doubletleri ve merkezi yerde bulunan tek mikrotübül kaybolur. Önce doubletler tekleşir ve merkezi mikrotübül kaybolur, son olarak da periferal mikrotübüller sonlanır. Şaft içerisinde periferal doubletlerin iki subüniti A ve B olarak adlandırılır. "A" 13 longitidünal subünite sahip tam bir mikrotübüldür; B ise tam olmayıp 10 veya 11 subünite sahiptir, geri kalan subünitler mikrotübül A ile 52 paylaşılır. Bir doubletin A mikrotübülü iki takım "kol" a sahiptir; iç kol ve dış kol. Bu kollar komşu doubletin B mikrotübülüne doğru uzanır, aynı zamanda mevcut olan çubuklar her dubleti (A mikrotübül) merkezi yerde bulunan iki mikrotübüle bağlar. Kol şeklindeki uzantılar mikrotübül boyunca 24 nm'lik aralıklarla yerleşmişlerdir. Bu uzantılar yüksek molekül ağırlıklı ve ATPaz içeren protein dynein'den oluşmuşlardır. Dynein sap kısmı ile A mikrotübüle tutunmuştur. Baş kısmı ise ATP-az aktivitesi gösterir. Daha geniş aralıklarla bulunan diğer bir protein ise nexin ise komşu dubletler arasında bağlantıyı oluşturur. Bunların bütün axonema etrafında oldukça elastik bağlar oluşturduğu düşünülmektedir. İki merkezi (tek olarak bulunan) mikrotübül hücre yüzeyinde sonlanır; ve apikal sitoplazmada yer alan bazal gövde içerisinde 9 periferal dubletin her biri bir üçüncü, C mikrotübülünün ilavesi ile triplet (üçlü) haline geçer. Dolayısı ile 9 periferal triplet ile bazal gövde yapısal yönden bir sentriolü andırır ve sentrioldeki gibi tripletler de çevreye bir açı yapacak şekilde yerleşim gösterir, herbirinin en içte bulunan mikrotübülü A olarak adlandırılır. Her bir tripletin bazal kısmından apikal sitoplazmaya fibröz maddeden oluşan iplikçikler uzanır bunlara, enine bandlaşma gösterdiklerinden, çizgili kökçük adı verilir. İlaveten basal gövdenin orta bölgesinden sitoplazmaya bir piramidal bazal "ayak" ya da mahmuz şeklinde bir çıkıntı uzanır; bu, basal gövdeye dik açı yapacak şekildedir. Bütün bu yapıların, bir silyumu apikal sitoplazmaya sıkıca tutunmasını sağladıklarına inanılmaktadır. Silya hareketi ileri doğru süratli çarpma (etkili çarpma) ve geriye doğru yavaşca gelme (eski halini bulma) ile karakterizedir. Etkili çarpmada silya şaftının büyük bir kısmı sertliğini korur, bükülme ise şaftın tabana yakın olan kısa bir bölgesinde sınırlıdır. Eski halini bulma sırasında bütün şaft daha yumuşamış görünür ve kıvrılır. Silya hareketi esnasında mikrotübül boyunca bir kısalma olmamaktadır. Kalmodulin kalsiyuma bağlı bir protein olup, kalsiyumu silyar axonema'dan ayırarak, siliyar çarpmayı düzenlediği düşünülmektedir. Dynein kolları ve komşu dubletler arasındaki bağlantı ATP hidrolizini aktive edecektir ve böylece mikrotübüller arasında kayma gücü meydana gelecektir. Nexin gibi yardımcı proteinler, mikrotübül çiftlerini hep beraber yüzük şeklinde sarmakta ve onların kayma limitlerini sınırlamaktadırlar. Gevşeme pasif olarak oluşmaktadır ve muhtemelen nexin bağları ve plazmalemmanın elastikiyeti sonucu oluşmaktadır. Gerçekte silya kasılması kas liflerinde görülen kayan filamanlar mekanizmasına benzer şekilde filamanların (mikrotübüller) kayması ile oluşmaktadır. Bir silyumun kıvrılması sırasında 3 ana değişiklik görülmektedir; 1- 9 dış dublet birbirleri ile ilgili olarak kayar. 2- Her dubletin A subüniti ile komşu dubletin B subünitini birbirine bağlayan kol aktif şekilde kaymakta ve belirgin şekilde kolun B subünitine bağlantı yerinin şekli değişmektedir, bu olay ATP nin ADP ye yıkılması ile birliktedir. 3- Her dubletin A subünitini merkezi tek mikrotübüle bağlayan radyal çıkıntılar kopma ve yapışma şeklinde bir siklik hareket gösterir. Mikrotübül kayma mekanizması oldukça kompleks ise de bugün bu mekanizmanın görüldüğü ve silya çarpma hareketinden sorumlu olduğu saptanmıştır. Şunu da ilave edebiliriz ki bir epitelyal yüzeydeki silya hareketi dalga şeklinde kasılma göstermek üzere senkronize edilmiştir, böylece yüzeysel sıvı filmi ya da mukus hareket ettirilmiş olur. 53 Tek haldeki silyum uzantılarına retinadaki rod ve koni hücrelerinde ve iç kulaktaki kıl hücrelerinde rastlanmaktadır. Bunlar genellikle hareketsizdir ve merkezlerinde çift mikrotübüllere sahip değildirler Silyumların elektron mikroskopik görüntüsünde; üstte boyuna kesit, altta enine kesitleri izlenmektedir. (TS Leeson, CR Leeson, AA Paparo: Text/Atlas of Histology, W.B.Saunders Company, 1988’den alınmıştır.) Flagella Hücre zarıyla çevrili kırbaç şeklinde bir uzantı olan flagellum yapı olarak bir silyuma benzer fakat daha uzundur. Spermatozoonun hareketli kuyruğu bir flagellum olup, 70 mikron kadar bir uzunluğa sahiptir. Flagellumun fonksiyonu, burada erkek gamet hücresinin sıvı bir ortamda ileri doğru hareketini sağlamaktır. Flagelluma aynı zamanda, böbrek ve rete testis gibi diğer bazı epitel hücrelerinde de rastlanmaktadır. Ancak bu hücrelerdeki fonksiyonları bilinmemektedir. Mikrofilamanlar ve İntermediyer Filamanlar Filamentöz yapılar ile ilgili terminoloji bazen karışıklığa neden olmaktadır; ilk önce hücre içi (intrasellüler) fibriller (lifcik) ile hücre dışında ve hücreler arasındaki (ekstraselüler) fibrilleri ayırt etmek gerekmektedir. Esktraselüler fibriller bağ dokusu bahsinde konu edilecektir. İkinci olarak intrasellüler fibröz materyaller için büyüklüklerine 54 bağlı olarak değişik terimlerin kullanıldığını bilmek gerekmektedir. Filaman veya mikrofilaman yalnızca elektron mikroskop ile görülebilir ve çapı 4-15 nm arasında değişir. Fibril (lifcik) bir demet filamanlardan meydana gelmiştir. Fibril ışık mikroskobunda immersiyon ile görülebilmektedir ve çapı 0,2-1 mikron (µm) arasındadır. Fiber (lif) küçük büyütmeli mikroskop ve hatta çıplak göz ile görülebilir; lifciklerden oluşmuş demetlerden meydana gelmiştir. Diğer taraftan fiber terimi ince-uzun, ipliğe benzer hücreler için de kullanılmaktadır (örneğin kas lifi). Bu durumda fiber terimi bütün bir hücre anlamına gelmektedir (Fiber=lif, Fibre=lifler). Bir hücrede her ne kadar elektron mikroskop ile gözlenebilen farklı tipte filamanlar gözlense de, mikrofilaman terimi genellikle her biri 6-7 nm çapında olan ve protein aktinden oluşan özel bir tip fibröz element için kullanılmaktadır. Aktin, kas hücrelerinde bulunan esas kontraktil proteinlerinden birisidir. Kas hücrelerinde mikrofilamanlar, aktin-miyozin sisteminin bir parçasıdırlar ve diğer önemli bir kontraktil protein olan miyozin filamanları üzerinde kayarak kasılmayı sağlamaktadır. Aktin filamanlarının kasılabilen demetler oluşturduğu hücrelerde, miyozin de daima bulunmaktadır. Yapısal ve biyokimyasal çalışmalar çeşitli aktin tiplerinin olduğunu ve bu proteinin tüm hücrelerde bulunduğunu göstermiştir. Kas hücreleri dışındaki diğer hücrelerdeki birçok hücresel hareketin (örneğin; yer değiştirme, hücre bölünmesi, pinositoz ve fagositoz gibi) temelinde kontraktil mekanizma yatmaktadır. Bu hücrelerde de kas hücrelerinde olduğu gibi filamentöz metaryalin fonksiyon gördüğü düşünülmektedir. Pek çok çeşit hücresel uzantıların merkezi kısımlarında çapraz bağlar oluşturmuş aktin filamanları bulunmaktadır. Mikrovilluslar bu tip yapılara en iyi örneği oluştururlar. Mikrovillusun merkezinde yaklaşık 40 kadar aktin filamanı mikrovillus uzunluğu boyunca paralel demetler oluşturacak şekilde yerleşmiştir. Mikrovillusun uç kısmında aktin filamanları şapka şeklinde amorf bir metaryal içerisine gömülmüşlerdir. Taban kısımlarında ise terminal ağ içerisine doğru uzantılar gönderirler. Terminal ağ (terminal web) hem aktin hem de miyozin filamanları içerir. Bu yapıların fonksiyonu, mikrovillusların hücre yüzeyindeki pozisyonlarının korunmasında belirgin bir gerilme oluşturmaktır. Kas hücrelerine benzer kontraksiyonların gerekli olduğu hücrelerin bazı spesifik bölgelerinde aktin filaman demetleri, miyozin ile bağlantılar oluştururlar. Buna örnek olarak hücrelerdeki bölünme sırasında oluşan kontraktil yüzük (halka) ve epitel hücrelerin apikal bölgelerinde kemer desmozomlar verilebilir. Ayrıca birçok diğer hücrede, hücre yüzeylerine yakın 5-7 nm çapında mikrofilamanlardan oluşan bir ağ bulunur. Bu ağın görevi yüzey membranının bölgesel hareketini sağlamaktır. Aktin polimerizasyonunu etkileyen çoğu ilaçların, hücrelerde hareketi bozduğu gösterilmiştir. Örneğin cytochalasin B'nin bir çok omurgalı hücrelerinde hücre hareketi, fagositoz ve sitokinezi inhibe ettiği bilinmektedir. Cytochalasinler, aktin filamanının bir ucuna bağlanmakta ve diğer aktin moleküllerinin bu uca bağlanmasını engellemektedirler. İkinci bir grup intrasellüler filamanlar, mikrofilamanlardan oldukça farklı olan intermediyer filamanlardır. İntermediyer filamanlar,uzun,dallanma göstermeyen, 1012 nm çaplarında 50 kDa ağırlığında filamanlardır ve mikrotübüller ile mikrofilamanlar arasında bir ara formu temsil etmektedirler. Bu filamanlar oldukça sağlam ve dayanıklı protein lifler olup, elektron mikroskopta düz veya hafifçe eğilmiş şekilde izlenirler. Bu 55 yapılar özellikle sinir hücresi uzantıları boyunca oldukça belirgindirler. Komşu epitelyal hücreler arasında yer alan desmozomlara yakın olarak yerleşirler ve düz kas hücrelerinin bütün sitoplazmaları boyunca görülürler. Mikrofilaman ve mikrotübüllerden farklı olarak, intermediyer filamanlar, kimyasal olarak heterejenöz grup yapılardır. Intermediyer filamanlar, protein subünitlerine göre 5 esas gruba ayrılırlar. 1- Sitokeratinler: Pek çok çeşit epitelyal hücrelerde (epidermis, tırnak vb.) bulunurlar ve 42-65 kDa molekül ağırlığında proteinlerden oluşan sitoplazmik filamanlar olup, 8 nm kadar bir çapa sahiptirler ve yapı olarak da α - keratine çok benzerler, bu sitokeratinler sıklıkla demetler oluşturarak desmozomların tonofilamanlarını yaparlar. 2- Vimentin: Mezenşimal kökenli hücrelerde karakteristik olarak bulunan bu tip proteinler, 56-58kDa kadar bir molekül ağırlığına sahiptirler. Bazı çekirdekli eritrositlerde vimentin içeren intermediyer filamanlar plazma membranın iç yüzeyi ile birleşmiş olarak gösterilmişlerdir. Fonksiyonları hücrelere desteklik yapmak ve hücre şekillerinin korunmasını sağlamaktır. Vimentin filamanları sitoplazmada keratin filamanları, glial filamanlar ve desmin filamanları ile polimerizasyon yapabilirler. Vimentin filamanları, aynı zamanda nüklear kılıf ve plazma membranını birbirlerine bağlarlar. Böylece intermediyer filamanların çekirdeğe desteklik yanında, onun hücre içerisinde ki pozisyonun korunmasına da katkıda bulundukları düşünülmektedir. 3- Desmin (skeletin): 53-55 kDa molekül ağırlığında olan, bu tip protein filamanlar 10 nm kadar bir çapa sahiptirler ve kas hücrelerinde bulunurlar. İskelet ve kalp kası hücrelerinde Z bandları içerisinde yerleşmişlerdir ve buradaki görevi komşu sarkomerlerin aktin filamanlarını birbirine bağlamaktır. 4- Glial fibriler asidik protein (GFAP): Glial hücrelerin (Astrositler) sitoplazmasında karakteristik olarak bulunan bu tip intermediyer filamanlar dağınık demetler şeklinde bulunurlar ve 51 kDa molekül ağırlığında proteinlerden oluşan, 8 nm çapında filamanlardır. GFAP, nöron, kas, mezenşim hücreleri ve epitel hücrelerinde bulunmamaktadır. 5- Nörofilamanlar: Nöron sitoplazmasında bulunurlar. Gevşekçe paketlenmiş, 10 nm çapında filamanlardan oluşan demetler şeklindedirler. Nörofilamanlar 3 farklı molekül ağırlıkta proteinlerden oluşmuşlardır (68, 140 ve 210 kDa) bu üç farklı protein birleşerek tek bir filamanı oluştururlar. Sitoplazmik Canlılık (Vitalite) Hücre tiplerinden, eğer varsa, çok az bir kısmı statiktir (hareketsiz). Yapısal ve fonksiyonel olarak hücreler devamlı değişikliğe uğrarlar. Mikrotübüllerin devamlı olarak görülen yıkılma ve yeniden organizasyonları bu olaya bir örnektir. Dinamik duruma diğer bir örnek de sitomembranlar arasındaki alış-veriştir. Hücrelerin devamlı değişime uğraması oldukça ilgi çekicidir; örneğin karaciğer parankim hücreleri muhtemelen 6 ay kadar yaşarken, bu hücrelerin sitomembranlarının ömrü günler ile ifade edilir. Membranlar devamlı olarak hücre içerisinde meydana getirilir ve oluşan membranlar bir yerden diğer bir yere hareket ederler; böyle bir göçe hücre organelleri konusunda değinilmişti. Hücre membranı hareketine nüklear membranın annulate lamellalara olan değişimini, endoplazmik retikülüm membranın transfer vesikülü olarak hareketini, 56 membranların Golgi apparatustan plazmalemma ve lizozomlara hareketini, plazmalemmadan endositotik vesikül ve vakuol oluşmasını ve multivesiküler cisimcik ile fagozomların meydana gelişlerini ekleyebiliriz. Membranlı organellerde membran bu şekilde veziküler, tübüler veya SER’de olduğu gibi kıvrılmış, mitokondri iç zarında olduğu gibi plikalar oluşturmuş olabilir. Membranın bu konfügrasyonu, fizyolojik ve biyokimyasal reaksiyonlar için yüzey alanının artmasını sağlamaktadır. Şunu da hatırda tutmalıyız ki sitomembranların yapıları ve fonksiyonlarındaki bu farklılık ilgili oldukları enzimlerden de kaynaklanmaktadır. Doku kesitlerinin incelenmesi ve elektron mikrograflar, yanlış şekilde, hücrelerin hareketsiz olduğu izlenimini verir. Bu izlenim devamlı olarak yapı ve fonksiyon arasında ilişki kurmakla giderilir. İnklüzyonlar: Önceleri, her ne kadar inklüzyonlar metabolitlerin canlı olmayan kümeleşmeleri olarak düşünülseler de bugün sentez ile oluşan hücre ürünlerinin veya hücre içine dahil edilen dış maddelerin büyük bir kısmının hücrenin normal fonksiyonlarında rol oynadıkları bilinmektedir. İnklüzyon terimi bugün depo edilmiş gıda maddelerini, pigmentleri ve bazı kristallin maddeleri kapsar. Bunlar genelde sitoplazmanın geçici bileşenleridir. Salgı granülleri veya damlacıkları gibi cisimcikler önceleri inklüzyon olarak kabul edilirdi fakat bunlar membran ile çevrilerek paket haline getirilmiş, GER ve Golgi apparatus ile ilgili olarak ele alınmışlardır. 1-Depo edilmiş gıda maddeleri Yağ: Her ne kadar başlıca bağ dokusu hücreleri içerisinde depo edilmişselerde karaciğer, kas hücreleri ve adrenal korteks hücreleri gibi pek çok diğer hücre tiplerinde de bulunurlar. Yağ sitoplazma içerisinde membran ile örtülü vakuol ve damlacık şeklinde dağılmıştır. Yağ vakuolleri ve damlacıkları nötral yağ (trigliserid) yağ asitleri, kolestrol ve kollestrol esterlerini içerir. Yağ normal doku hazırlama metodlarında çözülür ve yerini berrak, sferikal, düzgün boşluklara bırakır; fakat osmium tetroksit ile tespit edilerek korunabilirler ki bu durumda koyu kahverengi ya da siyah damlacıklar şeklinde görülürler. Dondurma suretiyle alınan kesitlerde sudan boyaları ve scharlach kırmızısı ile boyanabilirler. Yağ damlacıkları Golgi apparatus içerisinden veya SER ile ilişkili şekilde oluşmuş izlenimini verir ve 6-7 nm kalınlıkta bir membran ile örtülüdür. Karbonhidrat: Bir gıda maddesi olan karbonhidrat başlıca glikoz olarak barsaklarda absorbe edilir, takiben özellikle karaciğerde olmak üzere depolanmak amacıyla glikojene polimerize edilir. Suda çözülen glikojen normal preparatlarda görülmez ve sitoplazmada yerini karakteristik bir şekilde düzensiz, kaba boşluklara bırakır. Dolayısı ile sitoplazmaya güve yeniği manzarası verir. Özel preparatlarda glikojen Peryodik Asit-Schiff reaksiyonu (PAS) ile parlak kırmızı renge boyanır. Elektron mikroskopide glikojen, sıklıkla SER tübüler profilleri arasında yer alan serbest sitoplazmik partiküller şeklinde görülür. Başlıca 2 tip glikojen partikülü görülür. 57 ß (Beta) partikülleri; düzensiz, sferikal cisimcikler olup 15-30 nm kadar bir çapa sahiptir. α (Alfa) partikülleri; 50-100 nm arası çapta olup, pek çok daha küçük partiküllerden oluşmuş bir komplekstir, burada küçük partiküller rozet şeklinde bir araya gelmişlerdir. Karaciğer hücrelerinde solda Best’in karmin boyası ile parlak kırmızı renkte boyanan glikojen partikülleri izlenmektedir. (TS Leeson, CR Leeson, AA Paparo: Text/Atlas of Histology, W.B.Saunders Company, 1988’den alınmıştır.) 2-Pigmentler Hücre içinde kendi doğal renklerindeki maddelerdir ve diğer hücre bileşimleri gibi boyanma istemezler. Pigmentler 2 tip olarak sınıflandırılırlar; a-Eksojenöz (Exogenous, dış kaynaklı) Pigmentler: Vücut dışında meydana gelmiş ve sonradan içeri alınmışlardır. b- Endojen (Endogenous) Pigmentler: Hücre tarafından sentezlenebilirler. Vücut içerisinde oluşmuşlardır. Eksojen pigmentler bitkilerin sarımsı-kırmızı renkteki ve yağda çözünen (Lipochrome) pigmenti olan karotenleri, özellikle akciğerde belirgin olan karbon gibi tozları ve kurşun, gümüş gibi minarelleri içerirler. Deriye döğme yapmada kullanılan boyalar da exogen pigment olarak sınıflandırılır. Endojen pigmentler ise başlıca 2 tiptir; 1-Melanin, 2-Hemoglobin ve hemoglobin yıkım ürünleri olan hemosiderin (demir içerir) ile bilirubin (hematoidin, demir içermez). Her iki tipte sarımsı-kahve rengindedir. Koyu kahverengi veya siyah renkte olan melamin pigmenti deri ve göz yapısında bulunur. Güneş yanığı pigmenti (derinin güneş 58 ile bronzlaşması) olan melanin zenci ırkların epidermisinde oldukça fazla bulunur. Lipofuscin sarımsı-kahverengi granüller halinde pek çok hücrede görülür (özellikle yaşlılarda) ve kalıntı cisimcikler içerisinde yer alır (lipofuksin granüllerinin, sekonder lizozomlarda sindirilmeyen madde birikintileri olduğu düşünülmektedir). 3-Kristaller ve Kristalloidler Kristal ve kristalloidler muhtemelen proteinöz yapılar olup, testisteki Sertoli hücreleri ve Leydig hücreleri gibi bir kaç hücre tipinde görülürler. Kristal ve kristalloidler, sitoplazma içerisinde serbest haldedir ve membran ile örtülü değillerdir. Kristalloidler, eozinofilik lökosit granülleri, bazı mikrocisimcikler (peroksizomlar) ve ender olarak da mitokondriyonlar içerisinde kristalar ile ilişkili olarak görülürler. RK RK Testiste Leydig hücrelerinde Reinke kristallerinin (RK) elektron mikroskopik görünümü izlenmektedir. (TS Leeson, CR Leeson, AA Paparo: Text / Atlas of Histology, W.B.Saunders Company, 1988’den alınmıştır.) 59 ÇEKİRDEK (NUKLEUS) Hücre çekirdeği, ökaryotik hücrelerde bulunan, zarla sınırlandırılmış şekilde genetik materyali içeren hücrenin en büyük yapısıdır. Hücresel yapılar ve bu yapıların fonksiyonlarına ait şifreler, çekirdek içerisinde bulunan kromozomlarındaki DNA’da kodlanmıştır. Çekirdek ayrıca, DNA replikasyonu ve 3 tip RNA sentezi için (rRNA, mRNA, tRNA) gerekli moleküler mekanizmaya da sahiptir. Çekirdek RNA’sı henüz sitoplazmaya geçmemiş, yeni sentezlenmiş mRNA, tRNA ve rRNA’dır. Çekirdeğin 4 esas bileşeni vardır. 1) Nüklear Kromatin: Ökromatik ve heterokromatik bölgeler şeklinde organize olan hücrenin genetik materyalidir. 2) Çekirdekcik: rRNA sentez merkezi ve ribozomal subünitelerin oluşturulduğu bölgedir. 3) Nuklear kılıf: Çekirdeği saran membran sistemi. 4) Karyoplazma (Nukleoplazma): Kromatin ve çekirdekçik dışında kalan nüklear materyaldir. Çekirdek olgun eritrositler ve kan plaketleri (trombositler) dışında, bütün hücrelerde bulunur. Hücre şekline bağlı olarak değişik şekillerde olabilirse de genellikle sferikal veya ovaldir ve hücrenin merkezinde yerleşim gösterir. Fincan şeklinde olabildiği gibi, çöküntülere de sahip olabilir ve birkaç hücre (Ör. Granüler lökositler) tipinde de lobcukludur. Çekirdek çapı genellikle 3-14 mikron (µm) arasında değişir, fakat ovum ve bazı büyük ganglion hücrelerinde (nöronlarda) 25 mikron veya daha fazla da olabilir. Bir hücrede normalde tek bir çekirdek bulunmakla beraber karaciğer hücreleri gibi bazı hücrelerde iki, çizgili kas ve osteoklastlar gibi bazı hücrelerde ise ikiden fazla, (multinuclear) çekirdek bulunur. Osteoklastlar 25 veya daha fazla sayıda çekirdek içerebilirler. Çekirdek karakteristik bir şekilde maviye boyanır; nükleik asitler bazik proteinler (histonlar) içerdiklerinden bazofiliktir, fakat bazı asidik proteinleri de içerir. Çekirdek içerdiği deoksiribonükleik asit’e bağlı olarak Feulgen reaksiyonuna kuvvetli pozitif reaksiyon verir. Çekirdek büyüklüğü DNA içeriğine ve dolayısı ile kromozom sayısına bağlıdır. Hücrenin sentez aktivitesi arttıkça çekirdek hacminin de arttığına dair kuvvetli kanıtlar vardır. Çekirdek hücrenin genetik materyalini taşır ve sitoplazmanın metabolik aktivitelerine doğrudan doğruya etkide bulunur. Çekirdek hücre hayatiyeti için mutlaka gereklidir. Çekirdekte protein sentezi yapılmaz. Çekirdeğin kendi aktiviteleri için gerekli olan protein molekülleri çekirdeğe sitoplazmadan alınır. Hücere çekirdeği, deneysel olarak çıkarıldığında sitoplazmada protein sentezi durur ve kısa zamanda hücre ölür. Çekirdek ile sitoplazma arasında devamlı bir madde alış-verişi vardır. Hücrelerin metabolik aktivitelerin başlatılması ve kontrolü için gerekli tüm bilgiler çekirdekte bulunur. İnterfaz veya istirahat halindeki (bölünmeyen) hücre çekirdeği çekirdek membranı ile örtülüdür ve nüklear sap ya da karyoplazma ile doldurulmuştur. Çekirdekte ayrıca nüklear kromatin ve çekirdekçik (nukleolus) yer alır. 60 Elektron mikroskop mikrofotografında çekirdekte, nükleoplazmada elektron dens, koyu boyanan heterokromatin (HK) kitleleri ve daha az kıvrıntılı, dağınık halde ince granüler yapıda ökromatin (ÖK) kitleleri ile çekirdekçik (Çck) izlenmektedir. Çekirdek seçici geçirgen bir membran sistemi ile sarılı olup nükleoplazmasında yoğun kıvrıntılı kromozom kitleleri içeren heterokromatin bölgeleri ve dağınık daha az kıvrıntılı kromozom kitleleri içeren ökromatin bölgeleri şematik olarak görülmektedir. Çekirdek Kılıfı Çekirdeğin etrafını saran ve nükleoplazmayı sitoplazmadan ayıran seçici geçirgen membran sistemidir. Elektron mikroskopide iki tabakalı olarak izlenen çekirdek kılıfı ya da çekirdek membranı 40 nm kalınlığa sahiptir. Çekirdek kılıfının iç yüzeyine kromatin materyali yapışmıştır, bundan dolayı ışık mikroskobunda çekirdek 61 kılıfı görülebilmektedir. Kılıf iç ve dış olmak üzere iki unit membrandan meydana gelmiştir. Bunlardan herbiri 7-8 nm kadar kalınlıktadır ve birbirlerinden yaklaşık 10-30 nm genişliğinde bir boşluk olan perinüklear sisterna ile ayrılmıştır. Her iki membran da trilaminar yapıdadır. Dış membranın sitoplazmik yüzeyine ribozomlar yapışmıştır. Dış membran bazı kısımlarında granüler endoplazmik retikülüm membranı ile devam eder; böylece perinüklear sisterna retikülüm sisternası ile birleşmiş olur. Perinüklear sisterna boşluğu dens, protein materyali içerir. İç nüklear membranın iç yüzeyi, intermediate filamentlerle desteklenmiştir. Lamin A, B, C proteinlerinden oluşan bu ağsı yapıya nuklear (fibröz) lamina adı verilir. Bu laminaya nüklear kromatin kümeleri sıkıca yapışmıştır. Fibröz lamina kalınlığı hücre tiplerine göre değişir (80-100 nm). Çekirdek zarı ve altında uzanan kromatinin organizasyonunda rol oynadığına dair biyokimyasal kanıtlar bulunmaktadır. Diğer sitoplazmik intermediate filamentlerden farklı olarak, mitoz sırasında ve sonrasında laminler çözünüp yeniden oluşurlar. Nüklear kılıfın iç ve dış membranının birleştiği yerde, 8 kenarı açıklıklar (octagonal gap) şeklinde nüklear porlar yer alır. Bu porların çapları 40-80 nm arasında değişir ve porlar, aralarında 130 nm kadar uzaklık olacak şekilde sık dizilmişlerdir. Nüklear porlar, çekirdek ile sitoplazma arasındaki iletişimi ve makromolekül hareketini sağlarlar. Porların sayıları total nüklear yüzey alanının % 20-25'ine ulaşacak kadar fazla olabilir. Nüklear porların geçirgenliği ve sayıları, hücrenin fonksiyonel durumu ve aktivitesine göre değişir. Her bir porun kenarında, iç ve dış membranlar birbirleri ile devam eder. Bu porlar nuklear lamina aracılığı ile birbirleri ile ilişkilidirler. Porlar oldukça ince unilaminar (tek laminalı) bir membran ile kapatılmıştır. Nuklear por kompleksi denilen silindirik yapının periferinde 8 adet oktagonal yapıda protein alt ünitleri yer alır, ortada bir kanal bulunur. Bu nuklear por kompleksleri nukleoporin adı verilen 50’den fazla proteinden oluşmaktadır. Nüklear por kompleksinin sitoplazmaya bakan sitoplazmik halkasından 8 adet kısa protein fibriller sitoplazmaya uzanırken, karyoplazmaya bakan yüzündeki nuklear halkada nuklear basket flamentöz yapı yer alır. Çekirdek kılıfı her boyuttaki iyon ve moleküle geçirgen olmadığı için 9 nm çapındaki iyonlar ve moleküller bu noktalardan sitoplazmaya serbestçe geçebilirler. Bütün bu taşınma işlemlerinin gerçekleştiği 9 nm’den büyük metabolitler, makromoleküller ve ribozomal subünitler aktif bir yöntemle sitoplazmadan karyoplazmaya taşınır. Ancak büyük molekül ve bileşiklerin çekirdekten siyoplazmaya geçiş mekanizması henüz tam olarak bilinmemektedir. Karyoplazma Nüklear sap ya da karyoplazma terimi, çekirdeğin berrak ya da belirgin şekilde boş kısımlarını tanımlayan bir terimdir; bu bölgeler çekirdekçik veya kromatinin bulunmadığı alanlardır. Her nekadar karyoplazma, dağılmış vaziyette interkromatin ve perikromatin granülleri, metabolitler, iyonlar ve proteinleri içerse de, elektron mikroskopta daha elektron-saydam görülür. Çekirdek kılıfının fibröz laminası da karyoplazmanın bir bölümüdür. Karyoplazma, içerisinde kromatin materyali ve çekirdekçiğin asılı vaziyette bulunduğu yarı-sıvı, kolloidal bir solüsyondur ve metabolitler ile daha büyük makromoleküllerin diffüzyonu için, bir ortam fonksiyonuna sahiptir. 62 Nüklear Kromatin Her bir ökaryotik hücre, toplam uzunluğu 1,8 m olan ve DNA’da kodlanan, yaklaşık 6 milyar bit bilgiyi içerir, bu kadar fazla uzun yapının çekirdek içerisine yerleşebilmesi için, sıkıca paketlenmesi gerekmektedir. Bu da ancak nukleoprotein kompleks olan kromatin ile mümkün olmaktadır. DNA ve protein kompleksi olan kromatin, çekirdeğin karakteristik bazofilitesinden sorumludur. Kromatin, bölünen hücredeki kromozomların, interfaz çekirdekteki yapısal belirtisidir. İnterfaz çekirdekte kromozomlar görünür halde değildir. Fakat fiksasyondan sonra kromatin materyal, bazik boyalar ile boyanan, düzensiz, dens, kaba granüllü bölgeler şeklinde görülür. İnterfaz çekirdek kromozomları gerçekte tam olarak korunmuştur ve nüklear kromatin yoğunlaşmış ya da sıkıca kıvrılmış kromozomlar bölgesini simgeler. Dağınık vaziyette, daha az kıvrıntılı kromozomlar bölgesi çekirdeğin berrak, boyanmayan yerlerinde bulunur. Hücre interfazdan çıkıp mitoz veya mayoza hazırlanırken kromatin, kromozomu oluşturmak üzere sıkıca paketlenir ve bölünme sırasında metafaz kromozomu olarak görünür hale gelir. Metabolik olarak çok aktif olmayan hücrelerde bol bulunan, kromozomları yoğunlaşmış veya kıvrıntılı, elektron mikroskopta, elektron dens, koyu boyanan kitleler heterokromatin, daha az kıvrıntılı dağınık vaziyette, elektron mikroskopta, ince granüler bir yapıda, ışık mikroskobunda ise soluk, bazofilik boyanmış alanlar şeklinde görülen kromatin kitleleri de ökromatin olarak adlandırılır. Heterokromatin, çekirdek içerisinde 3 bölgede yer alır; 1- Düzensiz granüller şeklinde, karyoplazmada karyozom adını alırlar, 2- Nüklear porları kapatmayacak şekilde nüklear kılıfın iç yüzeyine yapışmış vaziyette marginal kromatin adını alırlar, 3- Çekirdekçiğe (nükleolus) oldukça yakın vaziyette, çekirdekçik ile ilişkili kromatin. İnterfaz çekirdekte ökromatin miktarı genellikle geniş bir çekirdekçik ile ilişkilidir. Hücrenin metabolik aktivitesinin bir göstergesi olarak kullanılabilir. Çünkü ökromatin genellikle RNA sentezinde aktiftir, tersine heterokromatinin fazla olması hücrede metabolik aktivitenin düşük olduğunu gösterir. Kromatin başlıca; DNA zinciri, histon (H1,H2A, H2B, H3,H4,H5) denilen 5 temel protein ve histon olmayan proteinlerden oluşur. Histon proteinleri DNA iplikciği ile sarılarak nukleozomları oluşturmaktadır. Nükleozomlar kromatine; boncuk dizilmiş ip görünümü verir. Nukleozomların merkezinde H2A, H2B, H3 ve H4 histonlarından birer çift bulunurken, H1 ve H5 histonları, nukleozomların birbirine bağalanmasını sağlarlar. Komşu nükeozomlar, daha ileri bir organizasyon gösterek paketlenir ve oluşan yapı Solenoid olarak adlandırılır. Bu yapı elektron mikroskopta 30 nm kalınlığında bir lif şeklinde görülür. Hücrelerde bulunan çekirdekler, kromatin içeriğine göre iki tiptir; 1- Fibroblast ve bazı kan hücrelerinde görüldüğü üzere, boyayı oldukça fazla alan kromatine sahip, küçük, koyu boyanan, metabolik yönden nispeten inaktif, zengin heterokromatin kitlelerine sahip çekirdekler, yoğun veya hiperkromatik çekirdek olarak adlandırılır. 63 2-Sinir hücreleri, mezenşimal hücreler ve karaciğer hücrelerinde görüldüğü üzere, daha büyük ve daha soluk boyanan, metabolik olarak aktif, ökromatin kitleleri yönünden zengin bu tip çekirdekler de veziküler veya açık-yüzlü (hipokromatik) çekirdek olarak adlandırılmaktadır. Canlılığını kaybeden hücrelerde, nüklear bozulmadan önce, heterokromatin oldukça yoğun hale geçer ve böyle hücrelerdeki çekirdek piknotik (pyknotic) çekirdek olarak tanımlanır. Çekirdek yapısı. Çekirdek kılıfı; sitoplazmik yüzde GER ile devam eden bir dış membran ve nükleoplazma periferinde nüklear laminanın tutunduğu bir iç membran ve bu iki membran arasında perinüklear sisternadan oluşan bir sistemidir. İç ve dış membranın kaynaştığı noktalarda çekirdek ve sitoplazma arasında madde alış verişini sağlayan nuklear por kompleksleri yer almaktadır. (Histology; A text and atlas. MH Ross, W Pawlina, Lippincott Williams&Wilkins, 2011’den alınmıştır.) Çekirdekçik (Nukleolus) Çekirdekçik, primer rRNA sentez ve toplanma yeridir. Her interfaz çekirdek bir veya daha fazla çekirdekciğe sahiptir, fakat yoğun kromatin (heterokromatik) tip çekirdekte çekirdekcik kromatin tarafından maskelendiğinden görünmeyebilir. Farklı büyüklüklerde olmakla beraber, çekirdekçik genellikle 1 mikron ve daha fazla çaptadır ve aynı hücre tiplerinde bu büyüklük degişkenlik göstermez. Aktif şekilde protein sentez 64 eden hücrelerde, çekirdekcik büyüktür ve genellikle birden fazladır. Hücre bölünmesi sırasında çekirdekcik kaybolur ve oluşan iki yavru hücrede tekrar ortaya çıkar. Çekirdekçikler hücrede ayrı olarak bulunan, sferikal veya ovoid cisimciklerdir, bir membran ile örtülü değillerdir ve karyoplazmada serbest halde ya da nüklear kılıfın iç yüzeyine yapışmış olarak bulunurlar. Çekirdekçikler, kromatin kümelerinden daha büyük, daha dens ve daha düzgün sınırlıdır. Çekirdekçik, % 5-10 oranında RNA, protein ve az miktar DNA’dan oluşmuştur ve sıklıkla çekirdekçik ile ilişkili kromatin olarak adlandırılan bir kromatin halkası ile çevrelenmiştir. Her bir çekirdekçik; özel bir çekirdekçik düzenleyici kromozom ( nucleoluos organizing chromosome) üzerindeki özel bir bölgede yerleşen, spesifik bir çekirdikçik düzenleyici bölge (nucleoulus organizing region) ile ilişkili olarak oluşur. Çoğunlukla çekirdekçik düzenleyici bölge kromozomun terminal kısmı yakınında, küçük bir çıkıntı veya satellit şeklinde yerleşim gösterir. RNA ve bazik protein oranıyla ilişkili olarak çekirdekçiğin boyanması değişiklik gösterir, fakat genellikle RNA içeriğine bağlı olarak bazik boyanır. Çekirdekçik Toluidin mavisi gibi boyalarla metakromatik olarak boyanabilir ve genellikle Feulgen negatiftir. Ancak çekirdekçik etrafındaki kromatin halkası Feulgen pozitiftir. Özel teknikler kullanılarak çekirdekçiğin nükleolonema denilen granüler ve fibriller belirgin bir iç yapıya sahip, amorf bir komponent içerisine gömülü olduğu görülür. Elektron mikroskop ile çekirdekçikte 3 ayrı komponent ayırtedilmiştir. 1- Granüller; 12-15 nm çapında olup, ribozom subünitlerinin paketlenme bölgelerini simgelemektedir. Pars granülozayı oluştururlar. 2- Fibriller; 5-10 nm çapındaki nükleoprotein fibrilleri şeklinde olup, transkripsiyona girecek ribozomal genleri ve RNA gelişiminin ilk kopyalarının teşkil edildiği, sıkıca paketlenmiş ribonukleoprotein liflerden oluşur. Pars fibroza olarak da adlandırılır. 3- rRNA genleri; RNA polimeraz I ve transkripsiyon faktörleri içeren kromozoma sahip DAN içeren kısımdır. Fibiriller merkez adını alır. Bu komponentler fibriller bir merkezi çevreleyen granüllerden meydana gelen Kompakt bir kitle oluşturur. Fibriller ve granüller birlikte kalın anastomoz gösteren bir sütun oluştururlar. Çekirdekçik aktif hücrelerde genişleyebilir ve inaktif hücrelerden çapı azalabilir. Çekirdekçik ribozomal RNA'nın sentez edildiği yerdir, ribozomal prekürsörler ya da subünitler, sonradan nüklear porlar aracılığı ile sitoplazmaya transfer edilir ve burada fonksiyonel ribozomlar haline getirilirler. Nukleostemin, çekirdekte yeni tanımlanmış bir protein olup, hücre siklusu ve hücre farklanmasını regüle eden p53 proteinini bağlamaktadır. Nukleostemin’in varlığı, malign hücrelerin kontrolsüz çoğalmasına neden olmaktadır.. HÜCRE SİKLUSU Yenilenme özelliği olan hücre topluluklarında (Ör.Sindirim yolları epiteli gibi.), hücreler düzenli bir şekilde, periyodik olarak bölünürler. Genom, yavru hücrelere geçer. Hücre döngüsünde birbirini takip eden başlıca 2 olay gerçekleşir; a. Hücrenin 65 büyümeye devam ettiği evre olan interfaz, b. Genomun bölündüğü evre olan mitoz. İnterfaz ve mitoz evreleri birlikte hücre siklusu‘nu oluşturmaktadır. Hücre siklusu yaklaşık 24 saatte tamamlanır. Herhangi bir hücre tipine ait hücre siklusu zamanı saptanabilir. İnterfaz iki mitoz arasındaki evredir. Bu evrede çekirdek mikroskobik olarak normal görünür. İnterfaz 3 evreye ayrılır: 1-Mitozun sonunda, hücre interfazın predublikasyon veya G1 evresine girer; bu evre bir sonraki mitozdan önce görülen DNA dublikasyonuna kadar devam eder. G1, DNA replikasyonu için gerekli protein sentezinin, RNA ve enzim sentezinin başlaması ile hücre siklusunu kontrol eden proteinlerin sentezinin yapıldığı interfazın en uzun dönemidir. 2-G1 evresinden sonra DNA sentezi ve sentrozom duplikasyonunun başladığı evre, DNA dublikasyonu veya S (sentez) evresi olarak tanımlanır. Yaklaşık 7,5-10 saat sürer. DNA zinciri boyunca, replikasyonun başladığı farklı bölgelere replikon adı verilmektedir. 3- S evresinden sonra, mitozdan hemen önce, hücre nisbeten sakin bir evreye girer ki; bu da postdublikasyon veya G2 evresi olarak adlandırılır. Mitoz bölünmeye hazırlık için, bu evrede hücrenin metabolik aktiviteleri oldukça kısıtlanmıştır. Mitoz evrelerinde kullanılacak enerjinin üretimi ve toplanmasının yanı sıra, mikrotübüllerde tübülin sentezi de yapılır. DNA hasarında; G1 ve G2’deki kontrol noktaları (K) harekete geçer ve varsa DNA hasarının tamiri beklenir. G1-S arası K noktasında, p53 geni - tümör baskılayıcı gen- mutasyona uğrarsa, kontrol bozulur ve kanser gelişebilir. G2-M arası K noktasında; siklin ve siklin bağımlı kinazlardan oluşan MPF protein kompleksi (Maturasyonu sağlayan faktör) yoğunlaşır ve mitozun başlamasını kontrol eder. Sürekli olarak bölünmeyen hücrelerde, hücre döngüsü geçici (karaciğer ve böbrek hücreleri gibi.) ya da kalıcı (kas ve sinir hücreleri gibi.) olarak durdurulabilir. Bu evreye ise G0 (stabil evre) denir. G0, hücrelerinin doku hasarı sırasında, hücre siklusuna katılan stok kök hücreler olduğu düşünülebilir. İnterfaz evrelerini tamamlayan hücre sırasıyla profaz, metafaz, anafaz ve telofaz evrelerinden oluşan mitoza geçer. Farklı hücre tiplerine göre, hücre siklusunun uzunluğu da farklılık gösterir; bu süre, örneğin barsak epitelinde kısa süreli iken, karaciğer hücrelerinde çok daha uzundur. KROMOZOMLAR Kromozomlar belirgin bir şekilde boyanabilen çubuk şekilli cisimcikler olup, bölünme halindeki hücrelerde, hücrenin iki kutbu arasında bulunurlar. Kromozomlar kromatin iplikçiklerinden oluşmuştur. Kromatin iplikçikleri, DNA ve protein kompleksi olup, az miktarda RNA da içerirler ve ökaryotik hücrelerde, kromozomun temel yapısal birimidirler. 66 Kromozomların İnce Yapısı Her kromozom; her biri tamamen replike olmuş kromozomlar olan bir çift kromatin iplikçiğinden oluşmuştur. Bu kromozomların kromatinleri elektron mikroskopta 30 nm çapındaki fibrillerden oluşan bir ağ şeklindedir. Bu fibriller, belirli aralıklarla yerleşmiş, üzerlerinde 7-10 nm çapındaki kromatin subünitleri (nükleozom) içeren, yaklaşık 2 nm çapında, süperheliks oluşturan iplikçiklerdir. Nükleozomlar bir histon özüne bağlı bir çift DNA iplikçiği içerirler. Nükleozom zinciri daha ileri bir organizasyon göstererek solenoidleri oluştururlar. Bunlar da gittikçe daha kıvrıntılı hale gelirler. DNA Yapısı ve Dublikasyon Deoksiribonükleik asit (DNA) molekülü bir çift heliks oluşturan iki paralel moleküler zincirden meydana gelmiştir. Her zincir fosforik asit köprüleri ile birbirine bağlanmış pentoz-şeker (deoksiriboz) grublarından oluşmuştur. Pentoz grublarından ayrılan yan zincirler 4 nitrogenöz bazlardan birine gider. Bu iki zincirin bazları çapraz bağlantılar ile bağlanmıştır. Bu 4 baz; adenin ve guanin (pürinler) ile sitozin ve timin (pirimidinler)‘dir. Baz çiftlerinin bağlantısı daima adenin-timin veya sitozin-guanin arasındadır. Mitozda, meydana gelen iki yavru hücre, ana hücredekinin aynısı DNA'ya sahip olacağından, DNA içeriği hücre bölünmesinden önce iki katına çıkar. Bu olay DNA duplikasyonu ya da DNA replikasyonu olarak adlandırılır (hücre siklusunun S evresi). Olayda, DNA molekülünün iki iplikçiği baz çiftlerinde birbirlerinden ayrılır ve her bir eski iplikçiğin yanında, yeni bir DNA iplikçiği oluşur. Yeni iplikçiğin adenin bazı daima eski iplikçiğin timin bazı ile yeni iplikçiğin sitozin bazı da guanin bazı ile eşlenir. Dolayısı ile her yeni iplikçik eski iplikçiğin tamamlayıcısıdır ve çift iplikçikli, helikal DNA molekülü iki yeni iplikçik haline gelir ki bu da eskisinin aynıdır. Yeni iplikçiklerden her biri mitozda oluşan yavru hücrelerden her birine gider. DNA molekülü baz eşlemesinde görülen bu şekildeki rijidite (devamlı suretle adenin-timin, sitozin-guanin eşleşmesi) genetik şifrenin temelidir. Bir gen triplettir (bir sıra üzerinde 3 baz) ve bu da oluşan protein içerisindeki tek bir amino asite tekabül eder. Tek bir polipeptid (amino asitler zinciri) pek çok tripletlerin birbirini sırası ile takip etmesiyle şifrelendirilir; böyle bir sıra takibi yapısal gen ya da sistron (cistron) olarak adlandırılır. Kromozom Sayıları Erkek, insan somatik hücreleri (vücut hücreleri ya da germinal olmayan hücreler) 23 çift halinde düzenlenmiş 46 tek kromozoma sahiptir; 22 çifti otozomal, 1 çifti de seks (cinsiyet) kromozomlarıdır. Seks kromozomları, X ve Y dir. Dişilerde 22 çift otozomal ve 2 tek X kromozomu bulunur. 46 adet olan bu kromozomlar diploid olarak adlandırılır. Gonadlarda üretilen seks hücreleri (ovum ve spermatozoon) bu diploid sayının yarısına, diğer bir deyişle, 23 tek kromozoma sahiptir. Buna da haploid sayı denir ve mayoz veya redüksiyon bölünmesi olarak bilinen, özel bir tip hücre bölünmesi ile ilgilidir. Bu nedenle her bir ovum (dişi seks hücresi) 22 otozomal ve 1 adet X kromozomuna sahiptir, her bir spermatozoon (erkek seks hücresi) ise 22 otozomal ve 1 adet X veya 1 adet Y kromozomuna sahiptir. Dişi ve erkek seks hücrelerinin birleşmesi olan 67 fertilizasyondan sonra, fertilize ovum (zigot) ya 44 otozomal + 2 X kromozomu ya da 44 otozom + X + Y kromozomlarını içerecektir (2 X kromozomuna sahip olan zigot dişiliğe, X+Y kromozomlarına sahip olan zigot ise, erkekliğe farklanacaktır). Bazı durumlarda, insan somatik hücreleri sahip olması gereken normal kromozom miktarına sahip olmayabilir. Poliploidi (poliploidy) kromozomların hücrelerde haploid sayısının katları şeklinde fazla olmaları durumudur; örneğin tetraploidide kromozom sayısı haploid kromozomların dört katı diğer bir deyişle, 92'dir. Poliploidi karaciğer hücrelerinde yaygın olarak görülür ve büyük bir çekirdek ile karekterizedir. Bu durum anormal mitoz sonucu oluşur. Anöploidi (Aneuploidy) hücrelerin normal diploid sayıdan daha az veya daha çok (bu durumda katları değildir) kromozom içermesi durumudur. Bu şekildeki kromozomal sayı bozukluğu bireyde bir patoloji ile sonuçlanabilir. Böyle bir duruma konjenital bir bozukluk olan Down sendromunu (Mongolizm) gösterebiliriz; somatik hücrelerin 1 fazla kromozoma sahip olduğu Down sendromunda, çocuklar zeka yönünden geri kalmışlardır. Anöploid tip kromozomal bozukluklar yaygın şekilde sex kromozomları ile de ilgili olmaktadır; Klinifelter ve Turner sendromlarında olduğu gibi, seks organlarında değişik derecelerde anormallikler gözlenmektedir. Seks Kromatini (Barr Cisimciği) Önceden açıklandığı gibi, kromozomlar uzunlukları boyunca boyanma yönünden düzensiz koyu sahalar gösterebilirler; bu koyu boyanan heterokromatik kısımlar, kromozomal iplikçiklerin sıkıca kıvrıldığı bölgelerdir. 2 X kromozomunun bulunduğu normal dişilerde, X kromozomlarından birisi oldukça heterokromatik olup, interfaz çekirdekte görünür bir küme oluşturur, diğer X kromozomu ise sarmal yapmamıştır ve mikroskopta görülmez. İşte bu görünür küme, Barr cisimciği (Seks kromatini) olup, 1 mikron (µm) kadar çapa sahiptir ve yaygın bir şekilde nüklear kılıfın iç yüzeyine yaslanmış olarak bulunur; yaslanma yüzeyi düz ve serbest yüzeyi ise konveks şekildedir; buna örnek olarak epitelyal hücre çekirdeklerini gösterebiliriz. Kan yayması preparatlarında nötrofil lökositlerin gibi bazı hücrelerde, Barr cisimciği "bateri çubuğu" veya ince uzun çekirdek uzantısı şeklinde görülür, ya da diğer bazı hücrelerde çekirdekçik ile ilişkili küçük bir cisimcik görünümündedir (sinir hücrelerindeki nükleolar satellit). Ender olarak da karyoplazma içerisinde bağımsız kümeler şeklindedir. Barr cisimciği, özellikle yanak iç yüzeyinden dökülen yassı epitelyal hücrelerde çok iyi görülür, fakat yayma preparatlardaki çekirdek pozisyonu veya kesit yüzeyinin geçtiği sitoplazmik bölgelerden dolayı, dişi somatik hücrelerin ancak % 2070'inde Barr cisimcikleri görülebilmektedir. Kanıtlar Barr cisimciğinin genetik olarak inaktif olduğunu göstermektedir. Normal erkek somatik hücrelerde Barr cisimciği görülmez. Dişi hücrelerinde, her iki X kromozomu da aktif ise aynı genetik akivite iki misli görülecektir. Bu nedenle, Dişi interfaz çekirdeğinde X kromozomlarından bir tanesinde bükülme ya da kıvrılma yoktur ve görülemez haldedir. İkinci X kromozomu ise inaktif olarak kalır ve oldukça kıvrıntılıdır; bu kromozom heterokromatik yapıda görünebilen Barr cisimciği’dir. Dolayısıyla bir Barr cisimciği, hücrenin ikinci bir X kromozomuna sahip olduğunu gösterir; bunun anlamı hücrenin bir dişiden alındığıdır. Yine de bu 68 durumda şaşırmalara neden olabilecek, bazı genetik bozukluklar vardır; örneğin Turner sendromunda (Kısırlık, vücut ve meme gelişiminde gerilikle karekterize olan bir hastalık.) dişi somatik hücreleri yalnızca bir tek X kromozomuna sahiptir ve fert her nekadar dişi ise de, Barr cisimciği görülemez. Buna karşın Klinefelter sendromunda (Kısırlık, küçük testisler ve belirgin meme gelişimi ile karakterize bir bozukluktur.) hücreler 1 Y ve 2 veya daha fazla X kromozomuna sahiptir. Bu durumda erkek olmasına karşın, bireyin somatik hücrelerinde, 1 veya daha fazla Barr cisimciği görülmektedir. Bazı durumlarda da hücreler, 4 X ve 1 Y kromozomuna sahip olabilir, böyle bir olguda ise hücre çekirdeklerinde 3 Barr cisimciği görülmektedir. Bir somatik hücre çekirdeğinde Barr cisimciğinin görülmesi, o hücre çekirdeğinin en azından 2 X kromozomuna sahip olduğunu göstermektedir. Bireyin cinsi (dişilik veya erkeklik) gerçekte Y kromozomu ile tayin edilmektedir. HÜCRE BÖLÜNMESİ Hücre bölünmesi, dokuların büyüme ve yenilenmesiyle ilgilidir. Merkezi sinir sistemi hücreleri (nöronlar) ve kalp kası hücreleri dışında bütün yetişkin hücre tiplerinde görülür. Bölünme olayı oldukça süratli gerçekleşir (örneğin, özellikle aşınma ve sürtünmeye uğrayan çoğu epitelde, barsak bezlerinde, kan yapıcı dokularda ve yara iyileşmesi sırasında). Hücre bölünmesi olayı hem sitoplazma bölünmesini (sitokinezis) ve hem de çekirdek bölünmesini (karyokinezis) içerir. Sitokinezis ve karyokinezis genellikle birlikte görülür, fakat karyokinezis, sitokinezis olmadan da görülebilir; bunun sonucunda iki çekirdekli (binuklear) bir hücre meydana gelir. Diğer taraftan sitokinezis olmadan bir kaç kez karyokinezis olursa sonuçta çok çekirdekli (multinuklear) bir hücre oluşacaktır; bu tip hücrelere örnek olarak bazı karaciğer hücrelerini ve kemikte osteoklastları gösterebiliriz. Somatik hücrelerde çekirdek bölünmesi mitoz adı verilen bir olay ile meydana gelir. Mitozdan önce, hücre siklusunun S evresinde, DNA replike olur, dolayısı ile hücrenin küçük iki yavru hücreye bölünmesinden sonra, her bir yavru hücre, ana hücredekinin aynısı bir DNA içeriğine sahip olacaktır. Seks hücreleri olan gametlerin (ovum ve spermatozoon) oluşumları sırasında, mitozu takip eden karyokinezis mayoz adı verilen diğer bir tip hücre bölünmesi ile ilgilidir. Mayoz bölünmede bir gametin kromozom sayısı yarıya indirgenir (haploid); iki ayrı cinse ait gamet hücrelerinin birleşmesi olan fertilizasyondan sonra meydana gelen zigot diploid kromozom miktarına tekrar sahip olacaktır. Mitoz Bölünme Yukarıda da açıklandığı üzere mitoz, bir somatik hücrenin birbirlerinin ve ana hücrenin aynısı olan iki yavru hücre meydana getirmek üzere bölünmesi olayıdır. Mitoz, DNA içeriğinin replikasyonu ve sonuçta bu genetik materyalin iki yavru hücreye eşit olarak dağılımı ile ilgilidir. Her nekadar G2 ya da postduplikasyon safhasındaki bir hücre replike olmuş DNA içeriğine sahip ise de, bu görünür halde değildir ve kromozom sayısı, diploid yani 46 olarak izlenir, yeni DNA eski kromozomlar içerisindeki ayrı haldeki kromotin iplikçikleri içerisinde yerleşim gösterir. Yaklaşık 1 saate tamamlanan mitoz sırasında da 2 kontrol noktası bulunmaktadır; biri anafaz evresine girerken iğlerin 69 kontrolünü yapar, diğeri de kromozomların tamamı tam olarak ayrılana kadar sitokineze geçişi engeller Anlaşılması yönünden mitoz 4 evreye bölünmüştür; şunu hatırda tutmak gerekir ki; bu 4 evre devamlı olan tek bir olayın kısımlarıdır. Bu evreler bir seri yapısal değişiklikler üzerine oturtulmuştur. Profaz Profaz safhasında hemen hemen aynı zamanda oluşan 4 ana yapısal değişiklik görülür. a- Kromatin iplikcikleri yoğunlaşır (kısalır ve kalınlaşır) böylece kromozomlar kısa, koyu ve çubuğa benzer yapılar şeklinde görünür hale geçer. Her kromozom birbirlerine uzunlukları boyunca sentromer (cohesin protein halkası) denilen noktada birleşmiş iki kardeş kromatidten oluşmuştur. Gerçekte, mitozdan önce görülen DNA dublikasyonuna bağlı olarak, her kromatit tam olarak replike olmuş kromozomdur, fakat bu evrede artık bu şekilde adlandırılamazlar. b- Genellikle interfaz hücre çekirdeğine çok yakın komşu olan bir çift sentriol dublike olmaya başlar, oluşan yavru sentrioller ana sentriollere bitişiktir ve sonradan sentriol çifti zıt kutuplarda ya da hücre uçlarındaki yerlerini almak üzere birbirlerinden ayrılmaya başlar. Kutuplara çekilen sentriol çiftleri arasında mirotubullerden oluşan mitoz mekiği şekillenir. Hücrenin zıt kutuplarındaki mikrotübül organizasyon merkezlerinde (MTOC) gelişen mitotik iğ 3 tip mikrotübülden oluşur. Oluşan ilk mikrotübül astral mikrotübüller olup, herbir çift sentriol etrafında ışınsal şekilde düzenlenmiştir ki insan hücrelerinde çok belirgin değillerdir. Bütün astral iplikçik kompleksi ile sentriollere birlikte aster adı verilir. Daha uzun olan ikinci tip mikrotübüller ise asterler arasında iğ iplikçikleri olarak gelişir; daha sonra bunlardan bazıları asterlerden diğer kutuptaki astere devamlılık gösteren (polar) mikrotübüller şeklinde uzanacaktır. Üçüncü tip olan kinetakor (kromozomal) mikrotübüller ise, sitoplazmada yayılıp karşı kutba ulaşır, fakat bunlar yalnızca çekirdek kılıfının yok olmasından sonra tamamlanırlar. cÇekirdekçik aşamalı olarak kaybolur, içeriği ise bazı kromatitlere bağlanmıştır. d- Çekirdek kılıfındaki nüklear laminlerin fosforlanmasıyla çekirdek kılıfı çözülmeye başlar. Kromatin materyalinin çekirdek kılıfı iç yüzeyinden uzaklaşması sonucu kılıf daha ince ve daha az belirgin hale geçer ve sonradan da GER elemanlarından ayırt edilemeyen küçük veziküllere parçalanır ve sitoplazmaya dağılır. Kesitlerde, profazın erken evrelerini ayırt etmek zordur, fakat geç profaz evresi oldukça belirgindir. Metafaz Metafazda, bütün kromozomlar (kromatit çiftleri) iğlerle ilişkili olarak hücre merkezine doğru hareket ederler ve ekvatorial bölgede iğlerin uzun eksenine dik açı yapacak şekilde ve sitokinezisin görüleceği eksene paralel olarak dizilirler. Bu evrede bir kromozum iki kromatidi soluk boyanan sentromerde birbirlerine bağlanmışlardır. Bağlantı, kromatitlerin dışa doğru uzantısı olan "kollar" aracılığı ile olur. Hangi kutupdan 70 bakılırsa bakılsın kromozomlar yıldıza benzer, halka şeklinde düzenlenmiştir. İğlere ait mikrotübüllerin ileri gelişmesi, iğ iplikçiklerinde görülmektedir; ekvatoral yüzey bölgesinde devamlılık gösteren mikrotübülleri meydana getirmek üzere karşılaşan her bir sentriol çiftine ait iplikçikler incelenip, uzamaya devam eder ve bundan dolayı sentriol çiftlerini daha da birbirinden ayırır. Ekvatoral yüzeyde, bu devamlılık gösteren mikrotübüller, kromozomlar arasında dağılır. Aynı zamanda, her kromozom sentromeri de diske benzer iki küçük cisimciğe sahiptir, bu cisimcikler yalnızca elektron mikroskop ile görülebilir. Kinetokorlar adı verilen bu cisimcikler (her kromatit için birer adet) daha fazla mikrotübül oluşmasını düzenler, bu mikrotübüller kromozomal (kinetokor) mikrotübüller adını alır ve hücrenin iki kutbuna doğru uzanırlar. Kinetekorlar, sentromerde hem DNA hem protein içeren, mikrotubullere bağlanarak kromozom hareketini düzenleyen ve kromatidleri zıt kutuplara çeken yapılardır. Sentromerin kromozom stabilitesi açısından önemli görevleri vardır. Kromozom ve kromatidlerin mitoz ve mayoz sırasında, düzgün biçimde ayrılmalarını sağlayan yoğunlaşmış bölgelerdir. Herbir mikrotübül takımı herbir kinetokor ve dolayısı ile her bir kromatit ile ilişkilidir. Bir kromozomal mikrotübül takımı, dolayısı ile bir kromatid kinetokorundan hücrenin bir kutbuna doğru uzanmaktadır. Son olarak da Metafazın sonunda her kromozomun iki kromatidi sentromerde tam olarak birbirinden ayrılır, bu şekilde kinetokorlar da ayrılmaktadır. Bu evrede, kromatitler yavru kromozomlardır ve dolayısı ile metafazda hücre tetraploid sayıda (92) kromozoma sahiptir (iki tam kromozom takımı). Anafaz Cohesin proteinlerinin kromozomları kendi sentromerlerinden tam olarak ayrılmalarından sonra, yavru kromozomlar hücrenin zıt kutuplarına doğru hareket eder; bu anafaz hareketleri boyunca kromozomal mikrotübüller kromozomların kutuplara ulaşması için kısalırlar, aynı zamanda devamlılık gösteren mikrotübüller uzar ve porlar iğin iki kutbu birbirinden daha da uzaklaşır. Kromozomal, mikrotübüller kutuplar yakınında jel benzeri bir ağ aracılığı ile kuvvetli bir şekilde iğe tutunmuşlardır. Bu yapışma kromatidlerin hareketinde etkilidir. Devamlılık gösteren mikrotübüllerin serbest uçlar tübülin subünitlerinin ilave edilmesi ile uzarlar. ATP’nin hidrolize sonucu açığa çıkan enerji ve dynein benzeri bir molekül aracılığı ile gerçekleşir. Bu olay devamlılık gösteren mikrotübülllerin iki asterinden ayrılma, en son sitokinezis bölgesine yakın bulunan hücre merkezine doğru hareket ve bu bölgede toplanma ile birliktedir. Burada mikrotübüllerin toplanması "orta cisimcik" (midbody) adı verilen bir dens kümeyi oluşturur. Anafazın sonuna ve telofaza doğru,"orta cisimcik" bölgesinde hücre etrafında banda benzer bir yapı meydana gelir (bölünme izi) ve mitokondriyonlar ile diğer sitoplazmik yapılar, hücre periferi etrafında düzenli şekilde dağılmışlardır. Telofaz Hücrenin her bir kutubunda, kromozomlar kromozomal mikrotübüllerden ayrılır ve mikrotübüller parçalanıp dağılır. Kromozomlar incelip uzayarak veya dağılarak daha az belirgin hale geçer ve sonunda yalnızca bir kısmı heterokromatin olarak sıkıca kıvrılır, dağınık kısmı ise ökromatindir. Her çekirdeğin çekirdekçiği özgül kromozomlarla 71 ilişkili olarak yeniden ortaya çıkar ve nuklear kılıf sitoplazmik membranöz veziküller tarafından yeniden meydana getirilir; bu vesiküller muhtemelen granüler endoplazmik retikülümden köken almıştır. Bu olaylar her çekirdeğin interfaz görünümü almasına kadar devam eder. Aynı zamanda, bölünme (yarıklanma) izi orta cisimcik etrafında derinleşir. Çoğu hücre tiplerinde, bölünme izi içerisinde mikrofilamanlardan oluşan bir yüzeysel kontraktil halka (kasılma halkası) tarif edilir ve aktin filamentleriyle ilişkili miyozin II molekülü içeren bu oluşumun kasılması, muhtemelen bölünme izinin orta cisimcikte sıkı bir şekilde karşı karşıya gelmesine kadar derinleşmesinden sorumludur. Bu safhada, iki yavru hücre arasında geride yalnızca ince bir sitoplazmik köprü kalır ve sonunda bu köprü koparak iki tam yavru hücre meydana gelir. Sitoplazmik yapılar, iki yavru hücre arasında eşit olarak dağılmıştır ve önceden orta cisimcik içerisinde bulunan mikrotübülüsler parçalanarak dağılırlar. Kesitlerde, bölünen hücreler mitotik figürlerin bulunması ile ayırt edilir; bu terim mitoza uğrayan hücreler için kullanılır. Daha yoğun olan kromatin materyal genellikle interfaz çekirdek kromatininden daha dens boyanır. Çoğu durumlarda, bir hücre şeklini ve mitoz gösterdiğinde bulunduğu pozisyonu değiştirir; örneğin, basit epitelde, hücre daha yuvarlaklaşır ve epitel yüzeyine doğru hareket eder, bu durumda bazal lamina ile ilişkisini koparır. Colchicine ve Vinblastine'nin Mitoza Etkisi Colchicine, colchicine'nin bazı türevleri ve vinblastine önceden izah edildiği gibi mikrotübülüs oluşmasını bloke eder. Mitoz bölünme sırasında dolayısı ile iğ mikrotübül oluşması görülmez. Eğer bu maddeler bir deney hayvanına verilecek olursa, hücre bölünmesine uğrayan bir hücre metafaz safhasında tutulacaktır. Kromozomlar metafaz safhasında çok iyi bir şekilde incelenebildiğinden bu metod sitogenetik çalışmalar ve hücre yenilenmesinin incelenmesinde çok iyi bir tekniktir. Mayoz Bölünme Bütün somatik hücreler diploid sayıda kromozoma (46 tek veya 23 homolog çift) sahiptir, fakat gametler (ovum ve spermatozoon) haploid sayıda (her kromozom çiftinden teki olmak üzere 23 adet) kromozoma sahiplerdir. Erkek ve dişi germ hücrelerinde haploid kromozom miktarı mayoz adı verilen özel bir tip hücre bölünmesi ile sağlanır; burada birbirini takip eden iki hücre bölünmesi görülür. İlk bölünmeden önce herbir germ hücresi mitoz bölünmede olduğu gibi DNA dublikasyonuna uğrar ve tetraploid miktardaki DNA (4n DNA) ile I. mayoza girer, , fakat kromozom sayısı hala diploiddir. İlk bölünmede, DNA diploid (2n DNA) sayıya varmak üzere ortadan ikiye bölünür, fakat kromozomlar haploid sayıya ortadan ikiye bölünür, her yavru hücre her homolog çiftten bir kromozom kazanır. İkinci mayoz bölünmede kromozom sayısı değişmez, fakat DNA haploid (n DNA) miktara ortadan ikiye bölünür. Mayoz, kromozomların yeniden dağılımını gerçekleştirmek için mitoz sırasında gerçekleşen aynı biyokimyasal mekanizmaları kullanır. Mayoza özgü birçok özellik bulunmaktadır. Bunlardan en önemlisi homolog kromozomlar arasında meydana gelen eşleşme ve genetik rekombinasyondur. Mayozda da, mitozda olduğu gibi, profaz, metafaz, anafaz, 72 telofaz olarak adlandırılan dört evre vardır. Bu evreler arada interfaz ve DNA duplikasyonu olmaksızın peş peşe iki kez gerçekleşir ve sonuçta dört yavru hücre meydana gelir. Mayoz bölünme ile mitoz bölünme arasındaki en büyük fark, profazda ortaya çıkar. Mayoz bölünme iki aşamada gerçekleşir. Bu aşamalar, 1. Mayoz ve 2. Mayoz olarak adlandırılır. Birinci Mayoz Bölünme Profazda, DNA iplikleri kısalıp kalınlaşmaya başlar. Mitoza oranla profaz burada daha uzundur ve leptoten, zigoten, pakiten, diploten ve diakinez olmak üzere alt safhalara ayrılır. 1- Leptoten: Bu safhada kromozomlar diploid sayıda ince iplikçikler şeklinde yoğunlaşmış olarak görülür. 2- Zigoten: Daha sonra homolog kromozomlar çiftler şeklinde bir araya gelirler (sinaps veya birleşme) ve her bir çift bivalent olarak adlandırılır (Herbir çiftin, bir üyesinin babadan, diğerininde anneden geldiği unutulmamalıdır). Birinci mayoz bölünmenin ilk karakteristik bulgusu homolog kromozom eşleşmesidir. Aynı gen bölgeleri karşı karşıya gelecek şekilde, sinaps yaparlar ve tetrat oluşur. 3- Pakiten: Kromozomlar kısalır ve kalınlaşır. Her kromozom sentromerde birleşmiş iki kromatidden meydana gelmiştir, dolayısı ile her bivalentte 4 kromatid (tetraploid DNA = 4n DNA) ve iki sentromer vardır. belli bölgelerde her kromozoma ait iki kromatidden birisi birbirleri ile yapışır ki; bu da genetik materyallerden bazılarının birbirleri arasında değişimini sağlar; bu olay birinci mayoz bölünmenin ikinci karakteristik bulgusudur ve krosing over (çaprazlaşma) olarak bilinir; krosing over‘de homolog kromozomların kardeş olmayan kromatidleri arasında parça değişimi gerçekleşir. 4- Diploten: Kromatidler arasındaki yapışma çarpraz şeklinde görülür. Bu çaprazlaşma bölgeleri kiazma olarak adlandırılır. Kiazma anında homolog kromozomlar arasında gen blokları karşılıklı taşınır: Genetik rekombinasyon gerçekleşir. Diplotende her çiftin rekombine olmuş kromozomları kiazma alanları dışında birbirinden ayrılmaya başlar. 5- Diakinez: Kromozomlar ayrılmaya devam eder, bu sırada çekirdekçik kaybolmuştur ve profazın sonuna doğru nüklear membran parçalanıp dağılır. Metafazda kromozom çiftleri tetratlar halinde ekvatorial plakta yerleşmişlerdir. Anafazda homolog kromozomlar birbirinden ayrılarak karşı kutuplara göç ederler. Her kromozomda hala bir çift kromatid vardır. Telofazda kromozomlar karşı kutuplara gider. Çekirdek zarı tekrar oluşur ve sitokinez gerçekleşir. Yeni gelişen yavru hücrelerden her biri, 2n DNA yani, çift halde kromatid içeren diploid sayıda, 23 çift kromozoma sahip olur. İkinci Mayoz Bölünme Interkinez olarak adlandırılan kısa bir aradan sonra, bu safha başlar ve herhangi bir DNA dublikasyonu olmaz, kromozomlar zaten sentromerde birbirine bağlanmış kromatid çiftlerinden oluşmuştur. Profazda iğ iplikçikleri oluşur, nüklear kılıf parçalanır ve kromozomlar ekvatoryal plağa doğru hareket ederek, metafaz plağını oluştururlar. 73 Metafazda, kromatidler tamamen ayrılır ve her biri bir yavru kromozom haline gelir; daha sonra anafazda hücrenin zıt kutuplarına göç eder. Telefazda çekirdek zarı yeniden oluşur ve yavru hücreler birbirlerinden ayrılır. Bu ikinci bölünmenin tamamlanmasından sonra, haploid sayıda (23) kromozoma ve haploid DNA (nDNA) içeriğine sahip 4 yavru hücre meydana gelir. Erkek grem hücrelerinin mayoz bölünmesinde, sitokinez sırasında, sitoplazmanın yavru hücrelere eşit şekilde dağılması sağlanır. İki birbirini takip eden bölünme sonucu oluşan dört hücreden ikisi 22+X kromozomlarına, diğer ikisi ise 22+Y kromozomlarına sahip olacaktır. Dişi germ hücrelerinin mayoz bölünmesinde ise, oluşan bütün yavru hücreler 22+X kromozoma sahip olacaklardır, fakat sitoplazmik dağılım eşit değildir ve sitoplazmanın büyük çoğunluğuna sahip olan, yalnızca bir hücre, oosit (ovum) olarak gelişecektir. HÜCRE DİFFERENSİYASYONU (FARKLILAŞMASI) Gelişme esnasında, fertilize ovum (zigot) olan tek bir hücre bölünür ve çoğalır, sonuçta vücudun bütün hücrelerini oluşturur. Bu olaya hücre proliferasyonu yanında, hücre differensiyasyonu da katılır (değişik hücre tiplerinin farklı fonksiyonlar için özelleşmesi). Pek çok hücre tiplerinin hepsi de aynı ortak bir hücreden köken aldıklarına göre, bu hücrelerinin birbirlerine eş kromozom (dolayısı ile de gen) takımlarına sahip olacaklarını düşünmek normal olacaktır. O halde niçin bütün hücreler aynı proteini sentez etmezler ve aynı fonksiyonlara sahip değillerdir? Bütün ihtimaller içerisinde, farklı hücrelerin genetik potensiyelleri değişikliğe uğramamıştır, her nekadar hücre içinde var olsa da, bazı genler kendilerini göstermezler. Bunun nedeni bir genin sahip olabildiği değerlerin hücre içinde bulunmamasına bağlı olabilir. Belki de bu değerler sitoplazma veya bir kısmı ile ilişkilidir, gelişme sırasında bazı sitoplazmik bileşimlerin iki yavru hücreye eşit olmayan dağılımı vardır. Hücre differensiyasyonunda rol oynayan gerçek ne olursa olsun bir pankreatik asinar hücre, örneğin, özel bir enzim veya enzimleri meydana getirecektir ve eğer bölünürse oluşan iki yavru hücre de aynı enzim veya enzimleri meydana getirme kapasitesine sahip olacaktır. HÜCRE ÖLÜMÜ Organizmanın homeostazisi; hücre ölümü ve hücre çoğalması arasında sabit bir dengeye bağlıdır. Apopitoz, embriyonik dönemden ölüme kadar pek çok fizyolojik veya patolojik olayda izlenen programlı hücre ölümüdür. Apopitozda, hücre yüzeyinde, hücre organellerinde ve çekirdekte parçalanmalar izlenir. Hücre içi veya dışı kaynaklı ölüm sinyalleri eşliğinde, hücre ölüm reseptörleri ve mitokondriyon aracılığıyla apopitotik mekanizma aktive olur ve sonuçta DNA kırılması, sitoplazmada büzülme ve membranda parçalanma meydana gelir. Apopitotik hücreler, apopitotik cisimciklere ayrılarak, çevredeki hücreler tarafından fagosite edilirler. Bir diğer hücre ölüm tipi olan nekroz ise; programlı hücre ölümü olan apopitozdan farklı olarak, rastgele, kontrolsüz gerçekleşen bir süreç olup, enflamasyonla sonuçlanan patolojik hücre ölümüdür. 74 Son yıllarda apopitozdan farklı morfoloji ve biyokimyasal özelliklere sahip birçok programlı hücre ölüm tipleri de tanımlanmıştır; bunlar arasında mitotik katastrof, anoikis eksitotoksisite, paraptozis ve pyroptozis sayılabilir. KAYNAKLAR 1- MH Ross, W Pawlina. Histology a Text and Atlas, 6th Edition. Wolters Kluwer, Lippincott Williams&Wilkins, London, 2011. 2- TS Leeson, CR Leeson, AA Paparo. Text and Atlas of Histology, 6th Edition. WB Saunders Company, Tokyo, 1988. 3- A Stevens, J Lowe. Human Histology, 2th Edition. Mosby, Newyork, 1997. 4- WM Copenhaver, DE Kelly, RL Wood. Bailey’s Textbook of Histology, 17th Edition. Williams&Wilkins, London, 1979. 5- DH Cormack. Ham’s Histology, 9th Edition. JB Lippincott Company, Sydney, 1987. 6- W Bloom, DW Fawcett. A Textbook of Histology, 9th Edition. WB Saunders Company, Philadelphia, 1962. 7- AL Kierszenbaum, LL Tres. Histology and Cell Biology: an Introduction to Pathology, 3th Edition. Elsevier Saunders, Philadelphia, 2007. 8- LP Gartner, JL Hiatt. Color Textbook of Histology, 3th Editon. Elsevier Saunders, Philadelphia, 2007. 9- LC Junqueira, J Carneiro. Basic Histology Text&Atlas, 10th Edition. McGrawHill Companies, Chicago, 2003. 75