Microsoft PowerPoint - Molek\374ler Genetik_Hafta

Yorumlar

Transkript

Microsoft PowerPoint - Molek\374ler Genetik_Hafta
31.10.2007
GENETĐK
111-503
Hafta VIII
Rekombinant DNA Teknolojileri
Doç.Dr. Hilâl Özdağ
Rekombinant DNA Teknolojisi
Amaç
• Spesifik DNA dizilerinin yerlerinin belirlenmesi.
• DNA’nın belirli noktalardan kesilmesi
• Belirli bir DNA parçasının milyarlarca kopyasının
çıkarılarılarak müteakip işlemlerin mümkün
kılınması.
• DNA parçalarının mutasyona uğratılıp biraraya
getirilmesi
suretiyle
istenen
dizilimlerin
oluşturulması.
• Oluşturulan DNA diziliminin transferi.
1
31.10.2007
Rekombinant DNA Teknolojisi
Aşamaları
• Doku veya hücrelerden DNA izolasyonu.
• DNA’nın belirlenen restriksiyon endonükleazlarla kesilmesi.
• Restriksiyon enzimleri ile oluşturulan DNA parçalarının vektörlerle
birleştirilmesi. Rekombinant DNA molekülünün oluşturulması.
• Rekombinant DNA’nın konakçı hücreye aktarılması. Konakçı hücre içinde
çoğalarak klonlarını oluşturması.
• Konakçı hücrenin çoğalarak rekombinant DNA molekülünü oğul
hücrelere aktarması.
• Klonlanmış DNA’nın konakçı hücrelerden izole edilip incelenmesi.
• Klonlanmış DNA’nın gerekirse konakçı hücrede ifadelenmesi. İlgili
proteinin tayin ve analizi.
Restriksiyon Endonükleazlar
HindIII
Yapışkan Uç
PvuII
Küt Uç
Pierce B., Genetics: A conceptual Approach,
2
31.10.2007
Restriksiyon Endonükleazlar
Palindrom
Pierce B., Genetics: A conceptual Approach,
Kes Yapıştır
Küt uç oluşturan enzimlerle yapılan kesimler
sonrası
oluşan
fragmentleri
biraraya
getirebilmek
için
önce
terminil
deoksinükleotidil transferaz enzimi ile polyT
ve/veya polyA kuyruğu takılır sonrasında DNA
ligaz ile fragmentler birleştirilir.
Pierce B., Genetics: A conceptual Approach,
3
31.10.2007
Vektörler (Taşıyıcılar)
• Kendisini ve taşıdığı DNA molekülünü bağımsız olarak replike
edebilmelidir.
• Vektör üzerinde pekçok restriksiyon enzimin sadece bir kesilme bölgesi
olmalıdır. Bu bölge restriksiyon enzimi ile kesilerek aynı enzimle kesilen
başka bir DNA parçasının bu bölgeye sokulması için kullanılır.
• Üzerinde seçilebilir bir belirteç (marker) taşımalıdır bir antibiyotik direnç
geni veya konakçı hücreden olmayan bir enzime ait gen). Bu belirteç
vektör içeren konakçı hücreleri vektör içermeye konakçı hücrelerden
ayırmak için kullanılır.
• Vektör konakçıdan kolayca izole edilebilir olmalıdır.
Vektörler (Taşıyıcılar)
• Plazmid vektörler
• Bakteriyofaj vektörler
• Kozmit ve mekik vektörler
• Bakteriyel yapay vektörler (BAC)
• Maya yapay vektörler (YAC)
4
31.10.2007
Vektörler (Taşıyıcılar)
• Plazmid vektörler
– Küçüktürler.
– Mesela pUC19 konakçısında 500 kopya olacak şekilde
çoğalabilir.
– Çoklu klonlama bölgesi barındırırlar.
– Belirteç olarak lacZ genini taşır pUC19.
Pierce B., Genetics: A conceptual Approach,
Vektörler (Taşıyıcılar)
• Bakteriyofaj vektörler
– Lambda fajı genlerinin hepsi tanımlanmış bütün genomu
çıkarılmış bir bakteriyofajdır.
– Genomunun 1/3’lük kısmı çok hayati olmadığı için fajın
hücreleri enfekte etmesini ve plak oluşturmasını engellemeden
yabancı bir DNA ile değiştirilebilir.
– M13 ise tek zincirli bir fajdır. Bakteri hücresini enfekte ettiğinde
çift zincirli, replikatif formu (RF) alır.
5
31.10.2007
Vektörler (Taşıyıcılar)
• Bakteriyofaj vektörler
http://bioweb.wku.edu/courses/biol566/Images/LambdaGenome.jpg
Pierce B., Genetics: A conceptual Approach,
Vektörler (Taşıyıcılar)
• Kozmit vektörler
– Kozmit vektörler lambda kromozomunun bir kısmı ile
plazmit DNA’nın birleştirilmesiyle oluşturulmuştur.
– Lambdanın protein kılıfının paketlenmesi için gerekli
olan cos dizileri ile plazmitin replikasyonu için gerekli
dizileri taşır.
– Belirteç olarak antibiyotik direnç geni taşır.
– Hemen bütün faj genomu çıkarıldığı için 50 kb
büyüklüğünde fragmentleri taşır (fajlar 15 kb,
plazmitler ise 5-10 kb taşıyabilir).
6
31.10.2007
Vektörler (Taşıyıcılar)
Pierce B., Genetics: A conceptual Approach,
Vektörler (Taşıyıcılar)
• Mekik vektörler
– Değişik kaynaklardan türetilen ve kendi replikasyon
başlama bölgelerini içeren diğer hibrit vektörler
birden fazla konakçı hücrede replike olabilirler.
– İki konakçı sistemde de seçilebilen belirteçler taşırlar.
– Genellikle gen ifadesi çalışmalarında kullanılırlar.
7
31.10.2007
Vektörler (Taşıyıcılar)
• Bakteriyel yapay vektörler (BAC)
– Ökaryotik genomların analiz ve haritalanmasında
ihtiyaç duyulan büyük DNA parçalarının
klonlanabilmesi için geliştirilmiş vektörlerdir.
– Bakterilerdeki üreme plazmitleri (F plazmit) kendi
kendine eşleyebilme özelliğine sahiptir.
– BAC’lar yaklaşık 300 kb DNA taşıyabilir.
– Replikasyon için F faktör genlerini, belirteç olarak
antibiyotik direnç genlerini ve çoklu klonlama
bölgesini taşırlar.
Vektörler (Taşıyıcılar)
• Maya yapay kromozomları (YAC)
– Bir YAC her iki uçta telomer yapısı, bir replikasyon
odağı (otonom olarak replike olan diziler, ARS) ve
mayaya ait bir sentromer içerir.
– İki adet belirteç (TRP1 ve URA3) bulunur.
– Çoklu klonlama bölgesi mevcuttur.
– 2 megabaz (2 milyon bç) uzunluğunda DNA parçaları
YAC’ların içine girebilir.
8
31.10.2007
Vektörler (Taşıyıcılar)
• Maya yapay kromozomları (YAC)
Hartl Jones, Genetics
Konakçı Hücreler
• Prokaryotlar
Bakteriler
• Ökaryotlar:
Özellikle YAC gibi vektörler ökaryotik hücrelere DNA
aktarımında kullanılır. Vektör plazmit ise hücre içine DNA girişi transformasyon
olarak eğer vektör virus ise transfeksiyon olarak adlandırılır.
Bitki hücreleri
Memeli hücreleri
9
31.10.2007
Konakçı Hücreler
Bitki Hücreleri
Pierce B., Genetics: A conceptual Approach,
Konakçı Hücreler
Memeli Hücreleri
Hartl Jones, Genetics
10
31.10.2007
Mutajenez
Pierce B., Genetics: A conceptual Approach,
Genomik Kütüphaneler
• Bir genomik kütüphane genomdaki
dizilerden en az bir kopya içerir.
tüm
• DNA izolasyonu
• Restriksiyon endonükleazlarla muamele
• Uygun vektörün seçilmesi
11
31.10.2007
Genomik Kütüphaneler
N =
N:
P:
f:
ln ( 1 − P)
ln ( 1 − f)
Gerekli klonların sayısı
Verilen DNA parçasını alma olasılığı
Her bir klondaki genom fraksiyonu
Genomik Kütüphaneler
Pierce B., Genetics: A conceptual Approach,
12
31.10.2007
Kromozoma Özgül Kütüphaneler
• Flow cytometry
www.chrombios.com/Service/FlowKar.jpg
• Pulsed Field Gel Electrophoresis
cDNA Kütüphaneleri
• mRNA üzerinden reverse transcriptase ile cDNA
sentezi
• Sentezlenen cDNA’nın her iki ucuna bir
restriksiyon enziminin tanıma dizisini içeren kısa
çift zincirli DNA takılıp klonlanması
• cDNA kütüphaneleri hücre/doku spesifik olarak
hazırlanır
13
31.10.2007
cDNA Kütüphaneleri
Pierce B., Genetics: A conceptual Approach,
Genom ve Transkriptom Kütüphanelerinden
Yararlanmak
• DNA probları
• Kütüphanenin taranması: plak hibridizasyonu
• Komşu genlerin
yürüme
tanımlanması:
Kromozomda
14
31.10.2007
Genom ve Transkriptom Kütüphanelerinden
Yararlanmak
DNA probları
Pierce B., Genetics: A conceptual Approach,
Genom ve Transkriptom Kütüphanelerinden
Yararlanmak
Plak hibridizasyonu
Pierce B., Genetics: A conceptual Approach,
15
31.10.2007
Genom ve Transkriptom Kütüphanelerinden
Yararlanmak
Kromozomda Yürüme
Bağlantı analizi sonrası belirlenen
bağlantılı bölgelerden başlayıp hedef
gene ulaşmayı hedefleyen bir yaklaşımdır.
Her aşamada DNA dizi analizini ve açık
okuma çerçevesini bulmayı hedefler.
Pierce B., Genetics: A conceptual Approach,
Polimeraz Zincir Reaksiyonu
(PCR)
Pierce B., Genetics: A conceptual Approach,
16
31.10.2007
Southern Blot
Pierce B., Genetics: A conceptual Approach,
Restriksiyon Haritalama
faculty.plattsburgh.edu/.../restmap/Figure6.GIF
Pierce B., Genetics: A conceptual Approach,
17
31.10.2007
DNA Dizi Analizi
Hartl Jones, Genetics
18

Benzer belgeler