Kozmetik Ürün Bileşimlerinin Kontrolü İçin Gerekli Analiz Yöntemleri

Kozmetik Ürün Bileşimlerinin Kontrolü İçin Gerekli Analiz Yöntemleri Hakkında
Tebliğ
Tebliğ No:İEG-2005/2
01.07.2005
R.G. Sayısı:25862
Amaç
Madde 1- Bu Tebliğin amacı, saç bakım ürünlerindeki okside edici ajanların
tanımlanması ve hidrojen peroksidin saptanması, saç boyalarındaki belirli oksidasyon
renklendiricilerinin tanımlanması ve yarı nicel (semi-kantitatif) olarak saptanması, nitritin
tanımlanması ve saptanması, serbest formaldehidin tanımlanması ve saptanması, şampuan ve
saç losyonlarında rezorsinolün tayini ve etanol ve propan-2-ol ile bağlantılı olarak metanolün
saptanması konularındaki analiz yöntemleri ile ilgili usul ve esasları belirlemektir.
Kapsam
Madde 2- Bu Tebliğ, aşağıdaki analiz metodlarının uygulamalarını kapsar:
a) Saç bakım ürünlerindeki okside edici ajanların tanımlanması ve hidrojen
peroksidin saptanması EK’teki Yöntem I’e göre yapılır.
b) Saç boyalarındaki belirli oksidasyon renklendiricilerinin tanımlanması ve
yarı nicel (semi-kantitatif) olarak saptanması EK’teki Yöntem II ’ye göre
yapılır.
c) Nitritin tanımlanması ve saptanması EK’teki Yöntem III’e göre yapılır.
d) Serbest formaldehidin tanımlanması ve saptanması EK’teki Yöntem IV’e
göre yapılır.
e) Şampuan ve saç losyonlarında rezorsinolün tayini EK’teki Yöntem V’e göre
yapılır.
f) Etanol ve propan-2-ol ile bağlantılı olarak metanolün saptanması EK’teki
Yöntem VI’ya göre yapılır.
Hukuki Dayanak
Madde 3 - Bu Tebliğ, 23/5/2005 tarihli ve 25823 sayılı Resmi Gazete’de yayımlanan
Kozmetik Yönetmeliği’nin 16 ncı maddesine dayanılarak hazırlanmıştır.
Uyumlaştırılan Avrupa Birliği Mevzuatı
Madde 4- Bu Tebliğ, 82/434/EEC sayılı Kozmetik Ürün Bileşimlerinin Kontrolü
İçin Gerekli Analiz Yöntemleri Hakkında İkinci Komisyon Direktifi dikkate alınarak
Avrupa Birliği mevzuatına uyum kapsamında hazırlanmıştır. Bu Tebliğ,
laboratuarların denenmiş ve bilimsel geçerliliği olan yöntemleri kullanmasını
engellemez.
Yürürlük
Madde 5- Bu Tebliğ yayımı tarihinde yürürlüğe girer.
Yürütme
Madde 6- Bu Tebliğ hükümlerini Sağlık Bakanı yürütür.
EK
YÖNTEM I- SAÇ BAKIM ÜRÜNLERİNDE OKSİDE EDİCİ AJANLARIN
TANIMLANMASI VE HİDROJEN PEROKSİD TAYİNİ
KAPSAM VE UYGULAMA ALANI
Kozmetik ürünlerde hidrojen peroksidin iyodimetrik tayini sadece, iyodürlerden
iyot oluşturan diğer oksitleyici ajanların yokluğunda mümkün olabilir. Sonuç
olarak, hidrojenperoksidin iyodimetrik tayininden önce, mevcut olan diğer tüm
oksitleyici ajanların saptanması ve tanımlanması önemlidir. Bu tanımlama iki
aşamaya ayrılır; birinci aşama persülfatlar, bromatlar ve hidrojen peroksidi kapsar.
İkinci aşama baryum peroksidi kapsar.
APERSULFATLARIN, BROMATLARIN VE HİDROJEN PEROKSİDİN
TANIMLANMASI
1.
2.
PRENSİP
Sodyum persülfat, potasyum persülfat ve amonyum persülfat; potasyum
bromat, sodyum bromat ve hidrojen peroksit (baryum peroksitten meydana gelsin
veya gelmesin) Kağıt Kromatografisi Yöntemiyle, iki yürütme solvanı kullanılarak
yapılır.
REAKTİFLER
Bütün çözeltiler analitik saflıkta olmalıdır.
2.1.
Kullanılan tüm kimyasallar analitik saflıkta olmalıdır.
2.1.1.
Sodyum persülfat
2.1.2.
Potasyum persülfat
2.1.3.
Amonyum persülfat
2.1.4.
Potasyum bromat
2.1.5.
Sodyum bromat
2.1.6.
Hidrojen peroksit
2.2.
Yürütme Solvanı A, 80% (v/v) etanol
2.3.
Yürütme solvanı B, benzen-metanol-3-metil butan-1-ol-su (34:38:18:10, v/v/v/v)
2.4.
Püskürtme reaktifi A, % 10 m/v sulu potasyum iyodür.
2.5.
Püskürtme reaktifi B, % 1 m/v nişasta çözeltisi
2.6.
Püskürtme reaktifi C, % 10 m/m hidroklorik asit
2.7.
4N HCl
3.
DÜZENEK VE EKİPMAN
3.1.
Kromatografi kağıdı (whatman paper No: 3 ve No: 4 veya eşdeğeri)
3.2.
Mikropipet 1 mikrolitre
3.3.
Standart balonlar 100 ml.
3.4.
Oluklu filtreler
3.5.
Kağıt Kromatografisi için gerekli düzenekler
4.
ÖRNEK HAZIRLAMA
4.1.
Suda çözünebilir ürünler:
1 gr ve 5 gr örnek tartılıp, 100’er ml suda çözünür. Her solüsyondan 1 µl
kullanılmak üzere bölüm 5’de bahsedildiği şekilde Kağıt Kromatografisine
uygulanır.
4.2.
Suda az veya zor çözünen ürünler
4.2.1.
1 gr ve 5 gr numune tartılıp, 50’şer ml suda dispers hale getirilir ve su ile 100 ml’ye
tamamlanır, karıştırılır. Bu iki dispersiyon oluklu filtreden (3.4) süzülür.
Süzüntülerin her birinden 1 µl kullanılmak üzere, bölüm 5’de bahsedildiği şekilde
Kağıt Kromatografisine uygulanır.
4.2.2.
Bir kez daha her örnekten 1 gr ve 5 gr tartılır. 50 ml distile su içinde dispers hale
getirilir ve dilüe HCl (2.7) ile asitlendirilir ve su ile 100 ml’ye tamamlanarak
karıştırılır. Bu karışımlar oluklu filtreden (3.4) isüzülür. Her bir süzüntüden 1’er µl
kullanılmak üzere bölüm 5’de bahsedildiği şekilde Kağıt Kromatografisine
uygulanır.
4.3.
Kremler
5 gr ve 20 gr’lık örnekler alınır ve 100 ml suda dispers hale getirilir. Bölüm 5’de
bahsedildiği şekilde Kağıt Kromatografisine uygulanır.
5.
METOD
5.1.
Uygun miktarlarda A (2.2) ve B (2.3) solvanları kağıt kromatografisi uygulanmak
üzere iki ayrı yürütme tankına koyularak en az 24 saat doyurulur.
5.2.
1 µl örnek solsüyonundan ve referans solüsyonundan (4 ve 2.1 bölümlerine göre
hazırlanmış) kromatografi kağıdına damlatılır. (Whatman No: 3 veya eşdeğeri) “40
cm uzunluğunda 20 cm genişliğinde (3.1)” veya diğer uygun formatta açık havada
kurutulur.
5.3.
Kromatografi kağıdı (5.2) içinde A (5.1) yürütme solvanı bulunan tank içine
daldırılır ve 35 cm yüksekliğine kadar (yaklaşık 15 saat) yürütülür.
5.4.
(5.2) ve (5.3) bölümünde belirtilen yol izlenerek ve (3.1)’de belirtilen whatman No:
4 kromatografi kağıdı veya eşdeğeri kullanılarak damlatma işlemi tekrarlanır ve B
yürütme solvanında 35 cm (10 cm) yüksekliğe kadar (yaklaşık 5 saat) yürütülür.
5.5.
Yürütme işlemi tamamlandıktan sonra tanktan çıkartılan kromatogramlar havada
kurutulur.
5.6.
Noktalar aşağıdaki şekilde püskürtme reaktifleri yardımıyla belirlenir.
5.6.1.
Püskürtme reaktif A (2.4) ve arkasından kısa bir süre sonrada püskürtme reaktifi B
(2.5) püskürtülerek izlenir. İlk önce persülfatlar belirginleşmeye başlar, arkasından
hidrojen peroksit noktaları belirginleşir. Bu noktalar kalemle işaretlenir.
5.6.2.
Yukarıdaki kromatograma (5.6.1) püskürtme reaktif C (2.6) uygulandıktan sonra
bromatlar grimsi mavi renkli noktalar halinde kromatogram üzerinden
belirginleşeceklerdir.
5.7.
Yukarıdaki şartlara göre yürütme solvanı A (2.2) ve yürütme solvanı B (2.3)’e göre
referans maddelerinin (2.1) Rf değerleri yaklaşık aşağıdaki şekildedir.
Sodyum persülfat
Potasyum persülfat
Amonyum persülfat
Sodyum bromat
Potasyum bromat
Hidrojen peroksit
Yürütme Solvanı
A (2:2)
Yürütme Solvanı
B (2.3)
0.40
0.10
0.40
0.50
0.40
0.40
0.80
0.02+0.05
0.10+0.20
0.20
0.10+0.20
0.80
B-
BARYUM PEROKSİD TANIMLANMASI
1.
PRENSİP
Baryum peroksit, (A.4.2)’deki örneğin asitlendirilmesinden sonra hidrojen peroksit
oluşumuna göre ve Baryum iyonları varlığında tanımlanır:
Persulfatların (A) mevcut olmadığı durumlarda, asidik numune
solsüyonunun bir kısmına (B.4.1) dilüe H2SO4 ilave edilerek baryum sülfat
beyaz çökelek halinde oluşur. Örnekte (B.4.1) bulunan baryum iyonları
aşağıdaki şekilde Kağıt Kromatografisi metoduyla (B.5), tekrar doğrulanır.
Eğer baryum peroksit ve persülfatlar birlikte mevcut bulunuyorlarsa (B.4.2),
bir alkali içinde solüsyondan (B.4.2) elde edilen bakiye HCl’de çözündükten
sonra eriyikte (B.4.2.3) yer alan baryum iyonlarını Kağıt Kromatografisi
Yöntemiyle veya baryum sülfat çökeleği oluşturularak teşhis edilir.
2.
REAKTİFLER
2.1.
Metanol
2.2.
% 36 (m/m) konsantre hidroklorik asit
2.3.
6N Hidroklorik asit
2.4.
4N Sülfürik asit
2.5.
Rodizonik asit di sodyum tuzu
2.6.
Baryum klorür (BaCl2-2H2O)
2.7.
Susuz sodyum karbonat
2.8.
% 1( m/v) Baryum klorür çözeltisi
2.9.
Yürütme solvanı; metanol-% 36 HC-H2O (80:10:10, v/v/v)
2.10.
Püskürtme reaktifi; % 0.1 (m/v) Rodizonik asit disodyum tuzunun sulu çözeltisi
(Kullanımdan hemen önce hazırlanmalıdır.)
3.
DÜZENEK VE EKİPMAN
3.1.
Mikropipet, 5 mikrolitre
3.2.
Platin krozeler
3.3.
Standart balonlar 100 ml
3.4.
Schleicher ve Schull 2043b veya eşdeğeri kromatografi kağıtları, yürütme tankında
(A.3.5) yürütme solvanı (B.2.9) ile bir gece bekletilerek temizlenir ve kurutulur.
3.5.
Oluklu filtre kağıdı
3.6.
Genel kullanımlı kağıt kromatografi düzeneği
4.
ÖRNEK HAZIRLAMA
4.1.
Persülfat içermeyen ürünler
4.1.1.
4.1.2.
2 gr örnek 50 ml su içinde dispers hale getirilir HCl (B.2.3) kullanılarak
civarına ayarlanır.
pH: 1
Yukarıda dispers hale getirilmiş olun örnek 100 ml ölçülü bir balona transfer edilir.
Su ile hacme tamamlanır ve karıştırılır. Bu dispersiyon bölüm 5’de anlatılan kağıt
kromatografisinde ve sülfat halinde çöktürülerek baryum teşhisinde kullanılır.
4.2.
Persülfat içeren ürünler için
4.2.1.
2 gr örnek 100 ml suda dispers hale getirilir ve süzülür.
4.2.2.
Kurutulmuş bakiyenin ağırlığının 7-10 katı kadar sodyum karbonat (B.2.7)
karıştırılır ve karışım platin krozede yarım saatte eritilir.
4.2.3.
Eriyik oda sıcaklığına kadar soğutulur, 50 ml suda çözülür ve süzülür (B.3.5)
4.2.4.
Kalıntı HCl’de (B.2.3) çözülür ve su ile 100 ml’ye tamamlanır. Bu solüsyon
bölüm 5’de anlatıldığı şekilde Kağıt Kromatografisinde ve sülfat halinde
çöktürülerek baryum teşhisi yapmak üzere kullanılır.
5.
METOD
5.1.
Uygun miktarlarda yürütme solvanı (B.2.9) yürütme tankına konulur ve en az 15
saat doyurulur.
5.2.
Bölüm (B.3.4)’de bahsedilen şekilde işlem görmüş kağıda bölüm (B.4.1.2) ve
bölüm (B.4.2.4)’e göre hazırlanan solüsyonlardan ve referans solüsyon
(B.2.8)’dan 5’er µl uygulanır.
5.3.
Kağıt havada kurutulur ve tanka konulduktan sonra 30 cm yürütülür.
5.4.
Tanktan alınan kağıt havada kurutulur.
5.5.
Kağıda (B.2.10)’daki püskürtme reaktifi püskürtülür. Rf yaklaşık 0.10’da kırmızı
noktalar halinde baryum teşhis edilir.
C.
HİDROJENPEROKSİT TAYİNİ
1.
PRENSİP
Hidrojen peroksidin iyodimetrik olarak tayini aşağıdaki reaksiyona dayanır.
H2O2 + 2H++2Ι-
Ι2+2H2O
Bu reaksiyon yavaş ilerler ama amonyum molibdat eklenerek hızlandırılabilir.
Meydana gelen iyot sodyumtiyosülfata karşı titrimetrik olarak tayin edilir ve
hidrojen peroksit miktarı hesaplanır.
2.
TANIM
Aşağıda anlatılacağı şekilde tayin edilen H2O2 miktarı yüzde kütle cinsinden (%
m/m) ifade edilir.
3.
REAKTİFLER
Kullanılan tüm kimyasallar analitik saflıkta olmalıdır.
3.1.
2N Sülfürik asit
3.2.
Potasyum iyodür
3.3.
Amonyum molibdat
3.4.
0.1N Sodyum tiyosülfat
3.5.
% 10 (m/v) potasyum iyodür solüsyonu kullanımdan hemen önce taze olarak
hazırlanır.
3.6.
% 20 (m/v) amonyum molibdat solüsyonu
3.7.
% 1 (m/v) nişasta solüsyonu
4.
DÜZENEK VE EKİPMAN
4.1.
100 ml’lik beherler
4.2.
50 ml büret
4.3.
250 ml’lik ölçülü balonlar
4.4.
25 ve 100 ml’lik mezürler
4.5.
10 ml’lik bullu pipetler
4.6.
250 ml’lik erlenler
5.
METOD
5.1.
Yaklaşık 0.6 gr Hidrojen peroksit ihtiva eden 10 gr örnek 100 ml’lik behere tartılır,
su ile 250 ml’lik ölçülü balona aktırılır ve su ile hacme tamamlanarak karıştırılır.
5.2.
Örnek çözeltisinden (5.1) 10 ml alınıp 250 ml’lik erlene (4.6) konulur ve üzerine
sırayla 100 ml 2N H2SO4 (3.1), 20 ml potasyum iyodür solüsyonu (3.5) ve 3 damla
amonyum molibdat solüsyona (3.6) ilave edilir.
5.3.
Oluşan iyod hemen 0.1 N sodyum tiyosülfata karşı (3.4) titre edilir ve dönüm
noktasına varmadan hemen önce birkaç damla nişasta indikatörü (3.7) ilave edilir.
Harcanan 0.1N sodyum tiyosülfat (3.4) mililitre olarak kaydedilir (v).
5.4.
(5.2) ve (5.3)’te anlatıldığı şekilde işlem 10 ml örnek çözeltisi yerine 10 ml su ile
tekrarlanarak kör deney yapılır. 0.1N Na2S2O4 sarfiyatı ml olarak kaydedilir (Vo
ml).
6.
HESAPLAMA
% kütle olarak H2O2 miktarı (% m/m) aşağıdaki formülden hesaplanır:
% H2O2 = (V-Vo) x 1.7008 x 250 x 100
m x 10 x 1000
= (V-Vo) x 4.252
m
Burada:
m = Analiz için tartılan örnek miktarı (5.1) gr olarak
Vo = Kör için harcanan 0.1 N sodyum tiyosülfat miktarı (5.4)
V = Numune için harcanan 0.1 N sodyum tiyosülfat miktarı (5.3)
7.
TEKRARLANABİLİRLİK (Norm ISO 5725)
Yaklaşık % 6 (m/m) H2O2 ihtiva eden ürünlerde paralel olarak çalışılan iki örnek
sonucu arasındaki fark % 0.2’yi geçmemelidir.
YÖNTEM II-SAÇ BOYALARINDAKİ BELİRLİ OKSİDASYON
RENKLENDİRİCİLERİNİN TANIMLANMASI VE
SEMİKANTİTATİF MİKTAR TAYİNİ
1.
KAPSAM VE UYGULAMA ALANI
Bu metod, krem veya likit formundaki saç boyalarında aşağıdaki maddelerinin
tanıma veya semikantitatif tayinleri için uygundur.
Maddeler
Sembol
Fenilendiaminler
O-Fenilendiamin
(OPD)
m-Fenilendiamin
(MPD)
P-Fenilendiamin
(PPD)
Metilfenilendiaminler
4-metil-1,2-fenilendiamin (toluen 3,4-diamin)
(OTD)
4-metil-1,3-fenilendiamin (toluen-2,4-diamin)
(MTD)
2-metil-1,4-fenilendiamin (toluen-2,5-diamin)
(PTD)
Diaminofenoller
2,4-diaminofenol
(DAP)
Hidrokinon
1,4 Benzendiol
(H)
α-Naftol
(α-N)
Pirogallol
1,2,3 trihidroksibenzen
(P)
Rezorsinol
1,3-dihidroksibenzen
(R)
2.
PRENSİP
Oksidasyon boyaları, pH 10’da % 96’lık etanol ile ekstre edilerek krem yada likit
saç boyalarından ayrılır ve İnce Tabaka Kromatografi Yöntemiyle (bir veya 2
boyutlu) teşhis edilir.
Bu maddelerin semikantitaf tayini, aynı zamanda ve mümkün olduğunca aynı
şartlarda hazırlanmış örnek ve standartların dört ayrı yürütme solvanında
gösterdikleri kromatogramlar karşılaştırılarak yapılır.
3.
REAKTİFLER
Kullanılan tüm kimyasallar analitik saflıkta olmalıdır.
3.1.
Etil alkol (susuz)
3.2.
Aseton
3.3.
Etil alkol % 96 v/v
3.4.
Amonyak solüsyonu % 25 (d420 = 0.91)
3.5.
L (+) Askorbik asit
3.6.
Kloroform
3.7.
Siklohekzan
3.8.
Azot, teknik saflıkta
3.9.
Toluen
3.10.
Benzen
3.11.
n-Butanol
3.12.
butan-2-ol
3.13.
Hidrofosforus asit %50 v/v solüsyonu
3.14.
Diazo reaktifi: Aşağıdakilerden biri olabilir.
3-Nitro-1-benzendiazonyumklorobenzensülfonat, (stabilize tuz şekli) (Red
2JN-Francolor) gibi
2-Kloro-4 nitro-1-benzendiazonyumnaftalenbenzoat, (stabilize tuz formunda)
(NNCD Reaktifi-referans no: 74 150 Fluka) gibi veya eşdeğeri
3.15.
Gümüş nitrat
3.16.
p-Dimetilamino benzealdehit
3.17.
2,5 Dimetilfenol
3.18.
Ferri klorür hekzahidrat
3.19.
Hidroklorik asit çözeltisi % 10 m/v
3.20.
Referans maddeler
Referans maddeler paragraf 1’de “amaç ve uygulama alanı” bölümünde
gösterilenlerdir.
Amin bileşikleri söz konusu olduğunda referans madde ya hidroklorürü (mono
veya di), yada serbest bazı olmalıdır.
3.21.
Referans Solüsyonlar % 0.5 (m/v)
Bölüm (3.20)’de belirtilen referans maddelerin her birinin % 0.5 m/v solüsyonları
hazırlanır.
50 mg ± 1 mg referans madde 10 ml’lik ölçülü balona tartılır.
Üzerine 5 ml % 96’lık etanol (3.3) ve 250 mg askorbikasit (3.5) ilave edilir.
Bu solüsyon, amonyak solüsyonu (3.4) ilave edilerek alkali yapılır ve indikatör
kağıdı ile kontrol edilerek pH: 10’a ayarlanır.
% 96 etanol (3.3) ile 10 ml’ye tamamlanır ve karıştırılır.
Solüsyon 1 hafta süreyle aydınlık olmayan serin bir yerde muhafaza edilebilir.
Bazı durumlarda, askorbik asit ve amonyak ilavesinden sonra, bir çökelti olabilir.
Bu durumda işleme başlamadan önce çökmesi için bekletilmelidir.
3.22.
Yürütme solvanları
3.22.1.
Aseton-Kloroform-Toluen (35:25:40 ,v/v/v)
3.22.2.
Kloroform-Siklohekzan-mutlak alkol-% 25 amonyak (80:10:10:1, v/v/v/v)
3.22.3.
Benzen-butan-2-ol-su (50:25:25, v/v/v)
Bu karışım iyice çalkalanır ve oda sıcaklığında (20-25oC) üst faz ayrıldıktan sonra
üst faz kullanılır.
3.22.4.
n-butanol-kloroform-reaktif M (7:70:23, v/v/v)
Oda sıcaklığında (20-25oC) dikkatlice ayrılarak alt faz kullanılır.
Reaktif M’in hazırlanışı:
Amonyak solüsyonu % 25 (v/v)
24 hacim
Hipofosforus asit % 50 (3.13)
1 hacim
Su
NOT:
75 hacim
Amonyak ihtiva eden yürütme solvanları kullanılmadan hemen önce iyice
çalkalanmalıdır.
3.23.
İndikatör spreyler (püskürtme solvanı)
3.23.1.
Diazo Reaktifi
(3.14)’de seçilen reaktiften % 5 (m/v) sulu çözelti hazırlanır. Bu çözelti
kullanılmadan hemen önce taze hazırlanmalıdır.
3.23.2.
Ehrlich Reaktifi
p-dimetilaminobenzaldehitden (3.16) 2 gr alınır ve % 10 HCl (3.19) çözeltisinin
100 ml’sinde çözülür.
3.23.3.
2.5-dimetilfenol-ferri klorürhekzahidrat
Solüsyon 1: 1 gr dimetilfenol (3.17) 100 ml % 96’lık etanol (3.3)’de çözülür.
Solüsyon 2: 4 gr ferriklorürhekzahidrat (3.18), 100 ml % 96 etanol (3.3)’de çözülür.
3.23.4.
Amonyaklı gümüş nitrat
% 25 amonyak (3.4), % 5 (m/v) sulu gümüş nitrat (3.15)’a çökeltinin çözünmeye
başlaması gözlenene kadar ilave edilir. Bu reaktif kullanılmadan hemen önce
hazırlanır.
Saklanmaz.
4.
DÜZENEK
4.1.
İnce Tabaka Kromatografisi için gerekli laboratuar düzenekleri
4.1.1.
Plastik veya cam kaplamalar, kromatografik plak damlatılma ve kuruma esnasında
azotla çevrilmiş olacak şekilde yerleştirilir. Belirli renklerin kolay okside olmaları
nedeniyle bu önlemin alınması gerekir.
İğne ucu kare kesilmiş 0,2 µl derecelendirilmiş 10 µl’lik mikro şırınga ve plağı azot
altında tutacak şekilde kıskaçla tutturulmuş 50 µl’lik dağıtıcı.
4.1.2.
4.1.3.
Silikagel ince tabaka plakları, kullanıma hazır 0.25 mm kalınlığında 20 x 20 cm
ebadında (Macherey and Nagel, Silica G-HR plastik tutucu üzerinde veya eşdeğeri)
4.2.
Santrifüj, 4000 devir/dakika
4.3.
Santrifüj tüpleri, 10 ml teflon kapaklı veya eşdeğeri
5.
İŞLEM
5.1.
Test örneği hazırlama yöntemi
Tüpten ilk çıkan 2 veya 3 cm.lik krem atılır.
Önceden azotla temizlenmiş bir santrifüj tüpüne (4.3) 300 mg askorbik asit, 3 gr
krem veya 3 gr homojenize edilmiş likit koyulur.
Üzerine pH 10 oluncaya kadar % 25’lik Amonyak çözeltisi (3.4) damla, damla
ilave edilir ve % 96’lık (3.3) etanol ile 10 ml’ye tamamlanır.
Azot altında (3.8) homojenize edilip, ağzı kapatılır ve 4000 devir/dakika’da 10
dakika santrifüjlenir.
Üstteki likit faz kullanılır.
5.2.
Kromatografi
5.2.1.
Plak damlatma
Azot (3.8) atmosferi altında kromatografi plağına (4.1.3) yukarıda tarif edilen
referans solsüyonlardan 9 nokta halinde birer µl damlatılır. Damlalar birbiri arası
1,5 cm olacak şekilde ve plağın kenarlarından da 1,5 cm kalacak şekilde
damlatılmalıdır.
Referans solüsyon noktaları aşağıdaki gibi düzenlenir:
1
2
3
4
R
P
H
PPD
5
DAP
6
PTD
7
8
9
OPD
OTD
MPD
MTD α-N
Buna ilaveten 10 ve 11. noktalara 2 µl’lik (5.1)’deki bölümdeki örnek test
çözeltilerinden damlatılır.
Yürütmeye koymadan önce plak azot atmosferi altında tutulmalıdır.
5.2.2.
Yürütme
Tank önceden azot (3.8) ile temizlenip, (3.22)’deki 4 solvan sisteminden biri ile
doyurulur ve plak, oda sıcaklığında 20-25oC’de karanlıkta, tabandan 15 cm
yükselinceye kadar yürütülür.
Plak çıkartılıp, oda sıcaklığında azot (3.8) ile kurutulur.
5.2.3.
Püskürtme
4 solüsyondan bir tanesi (3.23) derhal plak üzerine püskürtülür.
5.2.4.
Tanımlama
Örnek ve referansın Rf seviyeleri ve renkleri mukayese edilir.
Tablo 1’de değişik solvan sistemleri ve indikatörlere bağlı olarak maddelerin Rf
değerleri ve renkleri verilmektedir.
Herhangi bir kararsızlık durumunda ise deney, yeterli miktar referansın örnek
ekstraktına ilave edilmesiyle tekrarlanarak çözüme ulaşılabilir.
5.2.5.
Yarı Kantitatif Tayin
Yakın konsantrasyonlarda damlatılmış örnek ve referansın lekelerinin renk
şiddetleri gözle karşılaştırılır.
Eğer bir veya daha fazla madde (örnekte bulunan) konsantrasyonu aşırı görülürse;
örnek ekstraktı dilüe edilerek ölçüm tekrarlanır.
TABLO I
Spreylemeden hemen sonra oluşan renkler ve Rf değerleri
Yürütme solvanı
Püskürtme spreyi
Referans Rf değerleri
Sonuçta oluşan renkler
Maddeler (3.22.1) (3.22.2) (3.22.3) (3.22.4) Diazo
(3.23.1)
Ehrlich
Dimethyl- AgNO
(3.23.2)
Fenol
(3.23.4)
(3.23.3)
OPD
0.62
0.60
0.30
0.57
uçuk
----
----
kahve
MPD
PPD
0.40
0.20
0.60
0.50
0.47
0.30
0.48
0.48
uçuk
kahve
mor kahve sarı
(*)
uçuk
uçuk
kahve
kahve
kahve
mor
gri
parlak
kırmızı(*)
OTD
0.60
MTD
0.40
0.60
0.67
0.53
0.45
0.60
0.60
kahve (*)
uçuk
uçuk
grimsi
turuncu
kahve
kahve
kahve
siyah
kırmızımsı sarı
kahve(*)
PTD
0.33
0.65
0.37
0.70
kahve
turuncu
mor(*)
gri
DAP
0.07
---
0
0.05
kahve(*)
turuncu
mor
kahve
H
0.50
0.35
0.80
0.20
---
turuncu
mor
siyah(*)
α-N
0.90
0.80
0.90
0.75
turuncu-
---
mor(*)
siyah
çok uçuk
çok uçuk
kahve(*)
mor
kahve
kahve
P
0.37
R
0.50
--0.37
0.67
0.80
0.05
0.17
kahve
turuncu
(*)
uçuk mor çok uçuk
kahve
uçuk
kahve
NOT:
1.
2.
OPD sadece zayıf bir şekilde görülür. OPD’yi OTD’den net bir şekilde ayırabilmek için
çözücü (3.22.3) kullanılmalıdır.
(*): Oluşan en iyi rengi gösterir.
6.
İKİ BOYUTLU İNCE TABAKA KROMATOGRAFİSİ İLE İNCELEME
Bu iki boyutlu kromatografi işlemi, ek standartların ve ayraçların kullanılmasını
gerektirir.
6.1.
Ek referans çözeltiler ve maddeler
6.1.1.
β-naftol (β-N)
6.1.2.
2-aminofenol (OAP)
6.1.3.
3-aminofenol (MAP)
6.1.4.
4-aminofenol (PAP)
6.1.5.
2-nitro-1,4-fenilendiamin (2-NPPD)
6.1.6.
4-nitro-1,2-fenilendiamin (4-NOPD)
Ek referans çözeltilerinin her birinden, 3.2.1’de anlatıldığı şekilde % 0.5’lik (m/v)
çözeltisi hazırlanır.
6.2.
Ek yürütme solvanı
6.2.1.
Etil asetat-siklohekzan-% 25’lik amonyak (65:30:05, v/v/v)
6.3.
Ek belirleme sistemi
İnce Tabaka Kromatografisi için, yürütme tankının içine küçük bir beherde 2 gr
kadar kristalize iyot konur ve tankın kapağı kapatılır.
6.4.
Kromatografi
6.4.1.
İnce tabaka plağını (4.1.3) kaplanmış yüzeyine, şekil 1’de gösterildiği gibi iki çizgi
çizilir.
6.4.2.
Bir azot atmosferi altında (4.1.1) ekstrakt (5.1), taban noktasına 1-4 µl damlatılır
(Şekil 1), 2 kenardan da 2 cm uzaklıkta olmalıdır. Kromatogramlardaki (5.2)
lekelerin yoğunluğu çözeltinin konsantrasyonuna bağlıdır.
6.4.3.
Şekil 1’deki gibi 5.2’de tamamlanan noktalar arasındaki boşluk 1.5 cm olmalıdır.
Referans çözeltilerinden her birinden 6 mikrolitre uygulanması gereken DAP hariç
2 mikrolitre uygulanır. Tüm işlem azot altında yürütülür (6.4.2).
6.4.4.
6.4.3’deki işlemi 4 ve 5 için tekrarlayın (Şekil 1) ve Kromatografi başlayıncaya
kadar plak azot altında tutulur. (Noktalar arasındaki aralık 1.5 cm olmalıdır.)
6.4.5.
Bir kromatografi tankı azotla yıkanır ve içine uygun bir miktar yürütme solvanı
konur, 3.22.2 plak (6.4.4) tanka yerleştirilir ve karanlıkta ilk elüsyon yönünde
yürütülür (şekil 1).
Yürütme solvanı plaktaki işaretli çizgiye ulaşıncaya kadar devam edilir. (Yaklaşık
13 cm)
6.4.6.
Plak tanktan çıkartılır, solvanını uçurmak için önceden en az 60 dakika boyunca
azotla yıkanmış olan kromatografi tankına konulur.
6.4.7.
Azotla yıkanmış tanka uygun bir miktar yürütme solvanı konur. Plak 90o çevrilerek
tanka yerleştirilir (karanlıkta). Çizgiye kadar ikinci yönde yürütülür, tanktan
çıkarılır ve havada kurutulur.
6.4.8.
Plak 10 dakika iyot buharlı kromatografi tankına tutulur (6.3) ve aynı anda
kromatografiye tabi tutulan referans maddelerinin Rf değerlerinden ve renklerinden
yararlanarak iki-yollu kromatogram yorumları yapılır (Tablo II, Rf değerleri ve
renk rehberini vermektedir).
NOT: Noktaların maksimum renklenmesini sağlamak için, yürütme bittikten sonra plak yarım
saat boyunca havada kurutulur.
6.4.9.
6.4.8’de bulunan oksidasyon renklendiricilerinin varlığı, 6.4.1’den 6.4.8’e kadar
olan basamaklarda anlatılan işlemler tekrarlanarak ve 6.4.2’de belirlenen örnek
miktarı üzerine, 6.4.8’de belirlenen referans maddesinden 1 mikrolitre, taban
noktası 1’e eklenerek kesin olarak doğrulanabilir. 6.4.8’de elde edilen
kromatogramla karşılaştırıldığında farklı hiçbir başka nokta bulunmazsa
kromatogram 6.4.8’in yorumu doğrudur.
TABLO II
Kromatografi sonrası iyot buharı ile saptanan referans maddelerin renkleri
Referans maddeler
İyot buharı ile saptanan renkler
R
Bej
p
Kahverengi
α-N
Mor
β-N
Uçuk kahve
H
Mor-kahve
MPD
Sarımsı kahve
PPD
Mor-kahve
MTD
Koyu kahve
PTD
Sarımsı kahve
DAP
Koyu kahve
OAP
Turuncu
MAP
Sarımsı kahve
PAP
Mor-kahve
2-NPPD
Kahverengi
4-NOPD
Turuncu
III- NİTRİT TANI VE TAYİNİ
B-
TANIMLAMA
1.
KAPSAM VE UYGULAMA ALANI
Bu metod, kozmetik ürünlerde, özellikle krem ve macunlardaki nitritin
tanımlanması için uygundur.
2.
PRENSİP
Nitritin varlığı, 2-aminobenzaldehidfenilhidrazon (Nitrin®) ile renkli türevlerinin
oluşmasıyla saptanır.
3.
REAKTİFLER
Kullanılan tüm kimyasallar analitik saflıkta olmalıdır.
3.1.
3.2.
Seyreltik sülfürik asit: 2 ml konsantre sülfürik asit (d420=1.19) 11 ml saf su ile
seyreltilir.
Seyreltik hidroklorik asit: 1 ml konsantre hidroklorik asit (d420=1.19) 11 ml saf su ile
seyreltilir.
3.3.
Metanol
3.4.
Menatol içinde 2-amino benzaldehid fenilhidrazon (nitrin reaktifi) solüsyonu
2 gr Nitrin® tartılır. 100 ml.lik ölçülü balona aktarılır, 4 ml seyreltilmiş
hidroklorik asit (3.2) damla damla eklenir ve çalkalanır, hacme kadar metanolle
tamamlanır ve çözelti tamamen berrak oluncaya kadar karıştırılır. Çözelti
kahverengi bir cam şişede saklanır (4.3).
4.
EKİPMAN
4.1.
Beherler, 50 ml
4.2.
Ölçülü balon, 100 ml
4.3.
Kahverengi cam şişe, 125 ml
4.4.
Cam plak 10x10 cm
4.5.
Plastik spatul
4.6.
Filtre kağıdı, 10x10 cm
5.
İŞLEM
5.1.
İncelenecek örneğin bir kısmı cam plak (4.4) üzerine, 1 cm’den daha fazla
olmayacak bir kalınlıkta yüzeyi kaplayacak şekilde eşit olarak yayılır.
5.2.
Filtre kağıdı (4.6) saf suya batırılır. Örneğin üzerine yayılır ve plastik bir spatül
(4.5) ile aşağıya doğru bastırılır.
5.3.
Bir dakika kadar beklenir ve filtre kağıdının ortasına aşağıdakiler uygulanır:
2 damla seyreltilmiş sülfürik asit (3.1) damlatılır.
Bunun ardından da 2 damla Nitrin ® çözeltisi (3.4) damlatılır.
5.4.
Beş, on dakika sonra, filtre kağıdı çıkartılır ve gün ışığına karşı incelenir, Nitritin
varlığı kırmızımsı mor bir renklenmeyle belli olur.
Nitrit içeriği azsa, kırmızımsı mor renk, beş on saniye sonra sarıya dönüşür. (Eğer
nitrit miktarı çok fazlaysa bu renk değişimi sadece 1-2 dakika içinde oluşur.)
6.
YORUM
Kırmızımsı mor rengin yoğunluğu ve sarı renge dönüşmeden önce geçen zaman
numunedeki nitrit miktarının bir göstergesi olabilir.
B-
TAYİN
1.
AMAÇ
Bu metod kozmetik ürünlerde nitrit tayini içindir.
2.
TANIM
Bu metod uyarınca saptanan sodyum nitrit miktarı % kütle cinsinden ifade edilir.
3.
PRENSİP
Numune suyla seyreltilip berraklaştırıldıktan sonra, mevcut olan nitrit,
sülfanilamid ve N-1-Naftiletilendiamin ile reaksiyona sokulur ve elde edilen
rengin optik yoğunluğu 538 nm’de ölçülür.
4.
REAKTİFLER
Kullanılan tüm kimyasallar analitik saflıkta olmalıdır.
4.1.
Berraklaştırma Reaktifleri
Bu reaktifler hazırlandıktan sonra 1 haftadan daha uzun süre kullanılamazlar.
4.1.1.
Carrez Ι Reaktifi
106 gr potasyum ferrosiyanat (ΙΙ) K4Fe(CN)6.3H2O saf suda çözülür ve distile su
ile 1000 ml’ye tamamlanır.
4.1.2.
Carrez ΙΙ Reaktifi
219.5 gr çinko asetat, Zn(CH3COO)2.2H2O ve 30 ml glasial asetik asit saf suda
çözülür ve saf su ile 1000 ml’ye tamamlanır.
4.2.
Sodyum Nitrit Solüsyonu
1000 ml’lik ölçülü balon içinde 0.5 gr sodyum nitrit saf suda çözülür ve saf su ile
hacme tamamlanır. Bu stok standart çözeltinin 10 ml’si 500 ml’ye seyreltilir.
İkinci çözeltinin 1 ml’si 10 mikrogram NaNO2 içerir.
4.3.
1N Sodyum hidroksid çözeltisi
4.4.
% 0.2 Sülfanilamide hidroklorür çözeltisi:
2 gr sülfanilamid ısıtılarak 800 ml suda çözülür, soğutulur ve karıştırılarak 100 ml
konsantre hidroklorik asit ilave edilir, su ile 1000 ml’ye tamamlanır.
4.5.
5N Hidroklorik asit
4.6.
N-1-naftil reaktifi
Bu çözelti kullanılacağı gün hazırlanmalıdır. 0.1 gr N-1-naftiletilendiamin
dihidroklorür suda çözülür ve su ile 100 ml’ye tamamlanır.
5.
EKİPMAN
5.1.
Analitik terazi
5.2.
Volumetrik kaplar, 100, 250, 500 ve 1000 ml.lik
5.3.
Bullu veya dereceli pipetler
5.4.
Mezürler, 100 ml’lik
5.5.
Nitrit içermeyen oluklu filtre kağıdı 15 cm çapta
5.6.
Su banyosu
5.7.
Spektrofotometre (1 cm.lik küvetli)
5.8.
PH metre
5.9.
Mikrobüret, 10 ml.lik
5.10.
Beherler, 250 ml.lik
6.
İŞLEM
6.1.
Homojenize edilmiş numuneden 0.1 mg doğrulukta 0.5 gr kadar tartılır. Sıcak saf
su ile birlikte 250 ml.lik bir behere aktarılır. Saf su ile hacim yaklaşık 150 ml.ye
getirilir, yarım saat süresince 80oC’lik su banyosunda tutulur. Bu süre boyunca
içerik arada bir karıştırılır.
6.2.
Oda ısısında soğutulur ve karıştırılırken sırasıyla 2 ml Karez I (4.1.1) reaktifi ve 2
ml Karez II (4.1.2) reaktifi eklenir.
6.3.
PH’ı 8.3’e getirmek için 1 N Sodyum hidroksit (4.3) çözeltisi eklenir (PH metre
(5.8) kullanılır). İçerik 250 ml’lik bir dereceli kaba (5.2) aktarılır ve işaret
çizgisine kadar saf su ile tamamlanır.
6.4.
İçeriği karıştırın ve oluklu filtre kağıdında süzün (5.5).
6.5.
25 ml’den fazla olmayacak şekilde, berrak süzüntüden uygun bir miktar (V ml)
100 ml’lik bir erlen (5.2) içine pipetlenir (5.3) ve 60 ml.ye tamamlayıncaya kadar
distile su ilave edilir.
6.6.
Karıştırdıktan sonra 10 ml sülfanilamid hidroklorür solsüyonu (4.4) ilave edilir,
sonra 6 ml 5 N hidroklorik asit eklenir (4.5). Karıştırılır ve 5 dakika bekletilir. 2 ml
N-1 naftil reaktifi (4.6) eklenir, karıştırılır, 3 dakika bekletilir. Su ile hacime
tamamlanır ve karıştırılır.
6.7.
6.5 ve 6.6 işlemleri tekrarlanarak N-1 naftil reaktifi (4.6) eklemeden bir kör deney
yapılır.
6.8.
Kör deney çözeltisini (6.7) referans olarak kullanarak (6.6)’da elde edilen
çözeltinin optik yoğunluğu 538 nanometrede ölçülür (5.7).
6.9.
Çözeltinin, 6.8’de ölçülen optik yoğunluğuna karşılık gelen sodyum nitrit içeriği
100 ml’de mikrogram cinsinden kalibrasyon grafiğinden (6.10) okunur (m1
mikrogram).
6.10.
10 µg/ml’lik sodyum nitrit çözeltisini kullanarak (4.2), 100 ml’de 0, 20, 40, 60, 80,
100 mikrogram sodyum nitrit konsantrasyonları için bir kalibrasyon grafiği
hazırlanır.
7.
HESAPLAMA
Aşağıdaki formül yardımıyla sodyum nitrit içeriği, yüzde kütle cinsinden
hesaplanır:
% NaNO2 = 250 x m1 x 10-6 x 100
V
m
=
m1_____
V x m x 40
m : Analiz için alınan örneğin gram cinsinden kütlesi
m1: 6.9’daki sodyum nitrit içeriğinin mikrogram cinsinden ifadesi
V : Ölçümde (6.5) kullanılan süzüntünün mililitre cinsinden ifadesi
8.
TEKRARLANABİLİRLİK (Norm ISO 5725)
Yaklaşık % 0.2 m/m sodyum nitrit içeriği için, aynı örnekte yürütülen iki paralel
çalışmanın sonuçları arasındaki fark % 0.005’i aşmamalıdır.
YÖNTEM IV. SERBEST FORMALDEHİT TANI VE TAYİNİ
1.
KAPSAM VE UYGULAMA ALANI
Bu metot formaldehitin varlığına veya formaldehit vericilerinin yokluğuna bağlı
olarak iki tayin ve tanınmayı açıklar. Bütün kozmetik ürünlere uygulanır.
1.1.
Tanınma
1.2.
Pentan 2,4-dion ile kolorimetrik tayini
Bu metod formaldehit tek başına ise veya formaldehit vermeyen diğer koruyucular
ile birlikte iken uygulanır.
Eğer durum böyle değil ise ve sonuçlar izin verilen maksimum konsantrasyonu
aşıyorsa, aşağıdaki metod kullanılmalıdır.
1.3.
Formaldehit vericilerinin varlığında tayin
Yukarıdaki bahsedilen metotta (1.2) türevlendirme işlemi sırasında formaldehit
vericileri ayrılır ve yüksek sonuçlara sebebiyet verirler. (Kombine ve polimerize
formaldehit)
Serbest formaldehiti likit kromatografiyle ayırmak gerekir.
2.
TANIM
Bu metoda göre numunedeki serbest formaldehit miktarı yüzde kütle olarak verilir.
3.
TANIMLAMA
3.1.
Prensip
Sülfürik asit ortamında serbest ve bağlı formaldehit schiff’s reaktifini pembe veya
pembeye bakan leylak rengine dönüştürür.
3.2.
Reaktifler
Kullanılan tüm kimyasallar analitik saflıkta olmalı ve suda demineralize olmalıdır.
3.2.1.
Fuksin
3.2.2.
Sodyum sülfit 7H2O
3.2.3.
Konsantre hidroklorik asid (d= 1.19)
3.2.4.
Sülfürik asit yaklaşık 1 M
3.2.5.
Schiff reaktifi
100 mg füksin (3.2.1) bir behere tartılır, 75 ml 80oC’de suda çözülür, soğuduktan
sonra 2.5 gr sodyum sülfit (3.2.2) ilave edilir 100 ml’ye tamamlanır. Bu çözelti iki
hafta içinde kullanılmalıdır.
3.3.
İşlem
3.3.1.
10 ml.lik bir behere 2 gr örnek tartılır.
3.3.2.
2 damla sülfürik asit (3.2.4) ve 2 ml schiff reaktifi (3.2.5) ilave edilir. Bu reaktif
kullanıldığında tamamen renksiz olmalıdır.
Çalkalanır ve 5 dakika bekletilir.
3.3.3.
5 dakika içinde pembe veya pembemsi mor renk görülürse, formaldehit % 0.01
fazlalıkla mevcut anlamındadır ve bu formaldehit serbest ve bağlı metod (4) ile ve
eğer gerekirse prosedür (5) ile tayin edilir.
4.
PENTANE-2,4 DIONE İLE GENEL KOLORİMETRİK TAYİNİ
4.1.
Prensip
Formaldehit, amonyum asetat varlığında pentane –2,4 dione ile reaksiyona girer ve
3,5 diasetil-1,4 dihidrolutidin oluşturur. Bu butan-1-ol ile ekstre edilir ve 410
nm’de ekstraktın absorbansı ölçülür.
4.2.
Reaktifler
Kullanılan tüm reaktifler analitik saflıkta olmalı ve suda demineralize olmalıdır.
4.2.1.
Susuz amonyum asetat
4.2.2.
Konsantre asetik asit d420 = 1.05
4.2.3.
Vakum altında (25 mm Hg 25oC) taze distillenmiş Pentan-2,4-dion
(410 nm’de herhangi bir apsorbsiyon vermemelidir.)
4.2.4.
Butan-1-ol
4.2.5.
Hidroklorik asit 1 M
4.2.6.
Hidrklorik asit yaklaşık 0,1 M
4.2.7.
Sodyum Hidroksid 1M
4.2.8.
Avrupa Farmakopesine (2. baskı 1980 kısım-I-VII-I-I) göre taze hazırlanmış
nişasta çözeltisi (1 gr/50 ml suda)
4.2.9.
% 37-% 40 w/v formaldehit
4.2.10.
Standart iyot solüsyonu 0,05M
4.2.11.
Standart sodyum tiyosülfat solüsyonu 0,1 M
4.2.12.
Pentan 2,4dion reaktifi:
1000 ml.lik bir ölçülü balona
150 mg amonyum asetat (4.2.1)
2 ml pentan-2,4 dion (4.2.3),
3 ml asetik asit (4.2.2) konulur.
Su ile 1000 ml’ye tamamlanır. (PH’sı yaklaşık 6.4)
Bu reaktif taze hazırlanmalıdır.
4.2.13.
Pentan-2,4-dion içermeyen reaktif (4.2.12)
4.2.14.
Formaldehit Standardı: stok solüsyonu
5 gr formaldehit (4.2.9) 1000ml.lik bir ölçülü balonda 1000 ml su ile tamamlanır.
Solüsyon aşağıdaki şekilde ayarlanır.
10 ml alınır, üzerine 25 ml standart iyot solüsyonu (4.2.10) ve 10 ml sodyum
hidroksit solüsyonu (4.2.7) eklenir.
5 dakika bekletilir.
11 ml hidroklorik asit (4.2.5) eklenerek asidik ortam sağlanır. İndikatör olarak
nişasta solüsyonu (4.2.8) kullanarak standart sodyum tiyosülfat solüsyonu ile iyot
fazlası tayin edilir.
1 ml 0.05 M iyot (4.2.10) 1,5 mg formaldehite ekivalandır.
4.2.15.
Formaldehit Standardı: seyreltik solüsyon
Formaldehit stok solüsyonu önce 1/20 su ile sonra 1/100 su ile seyreltilir.
Bu solüsyonun 1 ml.si 1 µg formaldehit içerir.
Kesin miktar hesaplanır.
4.3.
Ekipman
4.3.1.
Standart laboratuar aletleri
4.3.2.
Faz ayırma filtresi, whatman 1PS (yada eşdeğeri)
4.3.3.
Santrifüj
4.3.4.
60oC’ye ayarlanmış su banyosu
4.3.5.
Spektrofotometre
4.3.6.
1 cm.lik cam küvetler
4.4.
İşlem
4.4.1.
Örnek Solüsyon
150 µg formaldehite karşı gelen test örneği tartılır, 0,001 gr hassasiyetle ve 100
ml’lik ölçülü balona aktarılır.
100 ml su ile tamamlanır ve karıştırılır (Solüsyon S).
(PH kontrol edilir, yaklaşık 6 olmalıdır. Değilse hidroklorik asit solüsyonu ile
seyreltilir. (4.2.6))
50 ml’lik erlen içine
4.4.2.
10 ml solüsyon S
5 ml pentan-2,4 dion reaktifi (4.2.12) eklenir.
30 ml’ye su ile tamamlanır.
Referans Solüsyon
Oluşabilecek renk etkileşmesi, referans solüsyon kullanılarak elimine edilir.
50 ml’lik erlen içerisine
-
10 ml solüsyon S
-
5.00 ml reaktif (4.2.13) eklenir
-
30 ml’ye su ile tamamlanır
4.4.3.
Kör Test
50 ml’lik erlen içerisine
4.4.4.
-
5 ml pentan-2,4 dion reaktifi (4.2.12) eklenir.
-
30 ml’ye su ile tamamlanır.
Tayin
4.4.4.1.
4.4.1, 4.4.2, 4.4.3 karışımları çalkalanır, erlenler 60oC’de su banyosunda tam 10
dakika bekletilir, buzlu su banyosunda 2 dakika soğutulur.
4.4.4.2.
10 ml butan-1-ol (4.2.4) içeren 50 ml’lik ayırma hunilerine transfer edilir.
(Erlenler 3-5 ml su ile yıkanır.) 30 sn kadar şiddetlice çalkalandıktan sonra fazların
ayrılması beklenir.
4.4.4.3.
Butan-1-ol fazları ayırma hunilerinden süzgeç kağıdı yardımıyla ölçüm cam
küvetine süzülür (4.3.2), gerekirse 5 dakika 3000 g santirfüj edilirler.
4.4.4.4.
4.4.1’den örnek solüsyonun ekstraktı 4.4.2 referans solüsyonunun ekstraktına karşı
apsorbansı (A1) 410 nm’de ölçülür.
4.4.4.5.
Benzer şekilde kör solüsyonun ekstraktının (4.4.3) butan-1-ol’e karşı apsorbansı
(A2) ölçülür.
NOT: Bütün bu işlemler, erlenler 60oC’deki su banyosuna yerleştirildiği andan itibaren 25
dakika içinde tamamlanmalıdır.
4.4.5.
Kalibrasyon eğrisi
4.4.5.1.
50 ml’lik bir elen içerisine:
-
5 ml seyreltik standart solüsyon (4.2.15)
-
5 ml pentan-2,4-dion reaktifi (4.2.12)
-
Demineralize su ile 30 ml’ye tamamlanır.
4.4.5.2.
4.4.4.’de tarif edildiği gibi devam edilir ve butan-1-ol’e karşı (4.2.4) absorbans
ölçülür.
4.4.5.3.
Aynı işlemi 10, 15, 20 ve 25 ml seyreltik standart solüsyon (4.2.15) ile tekrar
edilir.
4.4.5.4.
Reaktiflerin renklenmesine karşı gelen sıfır değerini elde etmek için 4.4.4.5
uygulanır.
4.4.5.5.
4.4.5.1 ve 4.4.5.3’den elde edilen absorbanslardan sıfır değer çıkartıldıktan sonra
kalibrasyon eğrisi çizilir. Beer kanunu 30 µg formaldehite kadar geçerlidir.
4.5.
Hesaplamalar
A2, A1’den çıkartılır ve kalibrasyon eğrisinden (4.4.5.5) numunedeki (4.4.1)
formaldehit miktarı (C), µg olarak okunur.
4.5.2.
Aşağıdaki formül yardımıyla örneğin formaldehit miktarı (% m/m) hesaplanır:
C
formaldehit miktarı % =
103.m
Burada:
m= test edilen örneğin ağırlığı (gr)
4.6.
Tekrarlanabilirlik (Norm ISO 5725.)
% 0.2’lik formaldehit miktarı için, aynı örnek ile paralel çalışılarak (pentan-2,4dion kolorimetrik tayini) bulunan iki deney sonuçları arasında fark % 0.005’i
geçmemelidir.
Eğer serbest formaldehitin test sonuçları, Kozmetik Yönetmeliğinde bildirilen
maksimum konsantrasyondan daha büyükse;
a) % 0.05 ve% 0.2 arasında etiketsiz ürününde
b) % 0.2’den büyükse etiketli veya etiketsiz üründe
5’de tanımlanan prosedür uygulanmalıdır.
5.
FORMALDEHİT VERİCİLERİNİN VARLIĞINDA TAYİN
5.1.
Prensip
Ayrılmış formaldehit bir post-kolon reaktörde pentane-2,4-dione ile reaksiyona
sokularak sarı lutidinic türevi oluşturulur. Elde edilen bu türev 420 nm’de saptanır.
5.2.
Reaktifler
Kullanılan tüm kimyasallar analitik saflıkta olmalı ve suda demineralize olmalıdır.
5.2.1.
HPLC veya eşdeğer kalitede su
5.2.2.
Susuz amonyum asetat
5.2.3.
Konsantre asetik asit
5.2.4.
Pentan-2.4-dion (4oC’da tutulan)
5.2.5.
Susuz disodyum fosfat
5.2.6.
Ortofosforik asid % 85 (d= 1,7)
5.2.7.
HPLC kalitede metanol
5.2.8.
Diklorometan
5.2.9.
Formaldehit % 37-% 40 w/v
5.2.10.
1M sodyum hidroksit
5.2.11.
1M hidroklorik asit
5.2.12.
0,002M hidroklorik asit
5.2.13.
Avrupa Farmakopesine göre taze hazırlanmış nişasta solüsyonu (4.2.8)
5.2.14.
0.005M standart iyot solüsyonu
5.2.15.
0,1M standart sodyum tiyosülfat solüsyonu
5.2.16.
Mobil Faz
0.006M disodyum fosfat sudaki solüsyonu, pH 2.1’e ortofosforik asit ile (5.2.6)
ayarlanır.
5.2.17.
Post kolon reaktifi
-
1000 ml.lik ölçülü balon içerisine
-
62.5 gr amonyum asetat (5.2.2)
-
7.5 ml asetik asit (5.2.3)
-
5 ml pentan-2.4-dion (5.2.4)
Su (5.2.1) ile 1000 ml’ye tamamlanır:
Bu reaktif karanlık yerde saklanır.
Saklama zamanı: 25oC’de maksimum 3 gün.
Renginde bir değişme gözlenmemelidir.
5.2.18.
Formaldehit standardı: stok solüsyonu
10 gr formaldehit 1000 ml’likölçülü balona tartılır ve su ile hacme tamamlanır.
Solüsyon aşağıdaki şekilde ayarlanır:
Bu solüsyondan 5 ml alınır, üzerine 25 ml standart iyot solüsyonundan (5.2.14) ve
10 ml’de sodyum hidroksit solüsyonundan (5.2.10) ilave edilir.
5 dakika dinlenmeye bırakılır.
11 ml hidroklorik asit ile (5.2.11) asitlendirilir, nişasta (5.2.3) indikatörü
kullanılarak iyot fazlası standart tiyosülfat solsüyonu ile titre (5.2.15) edilir.
1 ml iyot solüsyonu (5.2.14), 1,5 mg formaldehide ekivalandır.
5.2.19.
Formaldehit standardı: seyreltik solüsyon
Stok solüsyon 1/100 oranında mobil faz (5.2.16) ile seyreltilir.
Bu solüsyonun 1 ml.si yaklaşık 37 mg formaldehit içerir.
Tam miktarı hesaplanır.
5.3.
Ekipman
5.3.1.
Standart laboratuar ekipmanları
5.3.2.
HPLC pompa, vuruntusuz
5.3.3.
Reaktif için düşük basınçlı vuruntusuz pompa (veya 2. bir HPLC pompası)
5.3.4.
10 µl lup’lu enjeksiyon valfi
5.3.5.
Aşağıdaki parçalarla beraber Post-kolon reaktörü
+ 1 adet 1 litrelik 3 boyunlu balon
+ 1 adet 1 litrelik balon ısıtıcısı
+ 2 adet min. 10 plakalı vigreux kolonu, 2 hava soğutuculu
+ Paslanmaz çelik tüp (ısı transferi için) 1.6 mm-iç çap 0.23 mm, uzunluk 400 mm
+ 1.6 mm teflon tüp-iç çapı 0.3 mm, uzunluğu 5 m (Fransız örgüsü)
(EK 1’e bakınız.)
+ 1 adet ölü hacimsiz T borusu (Valco veya eşdeğeri)
+ Ölü hacimsiz üç birleşme
veya: 1 ml reaktörlü 1 adet post-kolon modülü. Applied Biosystems PCRS 520
veya eşdeğeri.
5.3.6.
Membran filtre, 0.45 µm
5.3.7.
SEP-PAKR C18 kartuş veya eşdeğer
5.3.8.
Kullanıma hazır kolonlar:
Bischoff hypersil RP 18 (type NC referans C 25.46 1805).
( 5 µm, uzunluk: 250 mm, iç çap: 4.6 mm)
veya Dupont, Sorbax ODS
(5 µm, uzunluk: 250 mm, iç çap: 4.6 mm)
veya Phase SEP, spherisorb ODS2
(5 µm, uzunluk: 250 mm, iç çap: 4.6 mm)
5.3.9.
Pre-kolon
Bischoff K1 hypersil RP 18 (referans K1G6301 1805)
(5 µm, uzunluk: 10 mm veya eşdeğeri)
5.3.10.
Kolon ve prekolon Ecotube sistemi, vasıtasıyla birleştirilmiştir. (Referans A
15020508 Bischoff) veya eşdeğeri
5.3.11.
Ek 2’deki blok diyagramda gösterildiği şekilde (5.3.5) düzenek kurulur.
Enjeksiyon sonrası bağlantılar mümkün olduğu kadar kısa olmalıdır. Bu durumda
reaktör çıkışı ile dedektör girişi arasındaki paslanmaz çelik tüp, dedeksiyon öncesi
karışımın soğuması içindir. Dedektör içindeki sıcaklık bilinmez, fakat sabittir.
5.3.12.
UV-VIS dedektör
5.3.13.
Kaydedici
5.3.14.
Santrifüj
5.3.15.
Ultrasonik banyo
5.3.16.
Titreşimli karıştırıcı (vortex veya eşdeğeri)
5.4.
İşlem
5.4.1.
Kalibrasyon Eğrisi
Kalibrasyon eğrisi, formaldehit seyreltik standardının oluşturduğu pik
yüksekliklerinin konsantrasyona karşı oluşturulan eğrisidir.
Formaldehit referans solüsyonu (5.2.19) mobil faz (5.2.16) ile seyreltilerek
aşağıdaki standart solüsyonlar elde edilir.
-
1.00 ml (5.2.19) çözeltisi 20 ml’ye seyreltilir. (Yaklaşık 185 µg/100 ml)
-
2.00 ml (5.2.19) çözeltisi, 20 ml’ye seyreltilir (Yaklaşık 370 µm/100 ml)
-
5.00 ml (5.2.19) çözeltisi, 25 ml’ye seyreltilir. (Yaklaşık 740 µg/100 ml)
-
5.00 ml (5.2.19) çözeltisi, 20 ml’ye seyreltilir. (Yaklaşık 925 µg/100 ml)
Standart çözeltiler yaklaşık 1 saat laboratuar sıcaklığında tutulmalı ve taze
hazırlanmalıdır.
Kalibrasyon eğrisinin linearitesi 1.00 ile 15.00 µg/ml arasındaki konsantrasyonlar
için iyidir.
5.4.2.
Örneklerin Hazırlanması
5.4.2.1.
Emülsiyonlar (kremler, make up base, eye liner)
100 ml’lik kapaklı erlene 0.001 gr hassasiyetle 100 µg formaldehit içerdiği
düşünülen miktarda örnek (mg) tartılır. 20 ml diklormetan (5.2.8) ve 20 ml HC
(5.2.12) tam olarak ilave edilir. Ultrasonik banyoda karıştırılır (5.3.15). Santrifüjle
2 faz ayrıştırılır (3000 g iki dakika). Bu arada bir kartuş (5.3.7) 2 ml metanol ile
(5.2.7) yıkanır ve 5 ml su ile (5.2.1) şartlandırılır.
Ekstraktın sulu fazının 4 ml’si bu kartuştan geçirilir ilk 2 ml’si atılır, geri kalan
süzüntü kullanılır.
5.4.2.2.
Losyon ve Şampuanlar
100 ml’lik kapaklı ölçülü balona 0.001 gr hassasiyetle 500 µg formaldehit içerdiği
düşünülen miktardaki örnek (mg) tartılır.
Mobil fazla (5.2.16) ile hacme tamamlanır.
Solüsyon bir filtre (5.3.6) yardımıyla süzülür ve daha önceki gibi (5.4.2.1)
şartlandırılmış kartuştan (5.3.7) geçirilir. Tüm solüsyonlar hazırlandıktan sonra
hemen enjekte edilmelidir.
5.4.3. Kromatografik şartlar
-
Mobil faz, akış hızı: 1 ml/dak.
-
Reaktif, akış hızı: 0.5 ml/dak.
-
Dedektör çıkışı toplam akış: 1.5 ml/dak.
-
Enjeksiyon hacmi: 10 µl
-
Kolon sıcaklığı: Zor ayırımların olduğu durumlarda, kolon buzlu su banyosuna
daldırılır ve ısının stabil olması için 15-20 dakika beklenir.
-
Post-kolon reaksiyon sıcaklığı: 100oC
-
Saptama dalga boyu: 420 nm
NOT: Tüm kromatografik sistem ve post-kolon analizden sonra su ile yıkanmalıdır (5.2.1).
Eğer sistem 2 gün içinde tekrar kullanılmayacaksa, sudan sonra metanol geçirilmelidir
(5.2.7). Sistemi tekrar şartlamadan önce kristallenmeyi önlemek için su geçirilir.
5.5.
Hesaplama
Emülsiyonlar (5.4.2.1)
Formaldehit miktarı % (m/m)
C.10-6.100
=
5m
C.10-4
5m
Losyon ve Şampuanlar:
C.10-6.100
m
=
C.10-4
m
Burada:
m= Analiz edilen örnek kütlesi gr olarak (5.4.2.1)
C= Kalibrasyon eğrisinden okunan (5.4.1) formaldehit konsantrasyonu µg/100 ml
cinsinden.
5.6.
Tekrarlanabilirlik (Norm ISO 57)
-
% 0.05’lik formaldehit içeriği için, örnekteki 2 paralel tayin sonucu arasındaki
fark % 0.001’i geçmemelidir.
-
% 0.2 formaldehit içiriği için, örnekteki iki paralel tayin sonucu arasındaki fark
% 0.005’i geçmemelidir.
EK 1
FRANSIZ ÖRGÜSÜ
GEREKLİ MALZEMELER
- Bir tahta makara
Merkez boyunca açılmış 1.5 cm çaplı deliğe sahip 5 cm dış çap 4 çevik çivi yerleştirilir
(Şekil 1 ve 2’de gösterildiği gibi), 2. çivi arasındaki mesafe 1.8 cm ve delikten uzaklığı 0.5
cm olmalıdır.
- Bir bükülmeyen iğne (tığ tipi) (Teflon boruyu ilmeklemek için)
- İç çapı 0.3 mm olan 1.6 mm teflon borudan 5 m
PROSEDÜR
Fransız örgüsüne başlarken, teflon boru mavnanın tepesinden sonuna kadar merkezi delik
yolu ile geçirilir (örgü prosesi sırasında zincirin çekilmesini kolaylaştıracak şekilde tüpü
makaranın altından 10 cm dışarı çıkararak); sonra şekil 3’de gösterildiği gibi boruyu 4 çivi
etrafından sırasıyla sarın, fransız örgüsünün üstü ve altı metal halka ve sıkıştırma vidaları ile
korunur. Sıkı çekerken teflonu ezmemeye dikkat edilir. Boruyu her bir vidanın etrafında
ikinci defa sarın ve aşağıdaki gibi “dikişler” yapın.
- Aşağıdaki boruyu çengelle yukarıdaki boruya asın (Şekil 4’e bakın); 5 m veya istenilen
uzunluktaki örgü elde edilinceye kadar bu prosesi her bir çivi üzerinde sırasıyla tekrarlayın
(1, 2, 3, 4 saat yönünün tersine)
- 10 cm boruyu zinciri kapatmak için ayırın. Boyu her dört ilmekten geçirin ve zinciri kapatın.
NOT: Fransız örgüsü post-kolon reaktörleri için (Supelco tarafından üretilmiş olup, piyasada
mevcuttur.)
EK-2
1- Likit kromatografi pompası
2- Enjeksiyon valfi
3- Prekolonlu kolon
4- Reaktif pompası
5- T-boru (ölü hacimsiz)
51- T-boru (vortex)
6-61- Birleşme (ölü hacimsiz)
7- Fransız örgüsü
71- Reaktör
8- 3 boyunlu kaynama su erleni
9- Erlen ısıtıcısı
10- Soğutucu
11- Paslanmaz çelik ısı transfer tüpü
111- Eşanjör
12- UV-VIS dedektör
13- PCRS 520 post-kolon modülü
YÖNTEM V- ŞAMPUAN VE SAÇ LOSYONLARINDA REZORSİNOL TAYİNİ
1.
KAPSAM VE UYGULAMA ALANI
Bu yöntem, şampuan ve saç losyonlarındaki rezorsinolün gaz kromatografisi ile
tayinini kapsar. Bu metot örnekte % kütle olarak
% 0.1’den % 2’ye
kadar olan konsantrasyonlar için uygundur.
2.
TANIM
Bu yöntemle saptanan örnekteki rezorsinol miktarı % kütle cinsinden belirtilir.
3.
PRENSİP
Rezorsinol ve internal standart olarak kullanılan 3.5 dihidroksitoluen, (5-metil
rezorsinol) ince tabaka kromatografisi ile ayrılır. Her iki bileşenin lekeleri
kazınarak metanol ile ekstre edilir, kurutulur, silanize edilir ve gaz kromatografi ile
tayin edilir.
4.
REAKTİFLER
Kullanılan tüm kimyasallar analitik saflıkta olmalıdır.
4.1.
Hidroklorik asit % 25 (m/m)
4.2.
Metanol
4.3.
Etanol % 96 (v/v)
4.4.
Floresans indikatörlü hazır TLC plaklar (plastik yada alüminyum) aşağıdaki gibi
deaktive edilir:
Silika kaplı plaklar üzerine, parlayıncaya kadar su püskürtülür. Su püskürtülmüş
plaklar oda ısısında bir-üç saat havada kurumaya bırakılır.
NOT: Plaklar deaktive edilmezse silika üzerine geriye dönüşümsüz adsorbsiyondan dolayı
rezorsinol kaybı meydana gelir.
4.5.
Yürütme solvanı
Aseton-kloroform-asetik acid (20:75:5 v/v/v)
4.6.
Rezorsinol standart solüsyonu
400 mg rezorsinol 100 ml % 96’lık etanol (4.3) içinde çözülür. (Bu çözeltinin 1
ml.si 4000 mikrogram rezorsinol içerir.)
4.7.
İnternal standart solüsyonu
400 mg 3.5-di-hidroksitoluen DHT’i 100 ml % 96’lık etanol (4.3) içinde çözülür.
(Bu çözletinin 1 ml’si 4000 mikrogram DHT içerir.)
4.8.
Standart karışım
10 ml çözelti (4.6) 10 ml çözeltide (4.7) alınıp, 100 ml’lik bir ölçülü balona
konulur. Hacme kadar %96’lık etanol (4.3) ile tamamlanır ve karıştırılır. (Bu
çözeltinin 1 ml.si 400 mikrogram rezorsinol ve 400 mikrogram DHT’yi içerir.)
4.9.
Silanize edici ajanlar
4.9.1.
N, 0-bis-(trimetilsilil) trifluoroasetamid (BSTFA)
4.9.2.
Hekzametildisilazan (HMDS)
4.9.3.
Trimetilklorosilan (TMCS)
5.
EKİPMAN
5.1.
İnce tabaka düzenekleri ve gaz kromatografisi cihazı
5.2.
Cam malzeme
6.
İŞLEM
6.1.
Örneğin hazırlanışı
6.1.1.
150 ml’likbir erlen içine yaklaşık 20-50 mg rezorsinol içeren örnekten tam tartım
alınır.
6.1.2.
Karışım asidik hale gelinceye kadar hidroklorik asit (4.1) ilave edilir (yaklaşık 2-4
ml gereklidir). İnternal standart çözeltisinden (4.7) 10 ml (40 mg DHT) eklenir ve
karıştırılır. Etanol (4.3) ile birlikte 100 ml’lik bir balona aktarılır, hacme kadar
etanol ile tamamlanıp, çalkalanır.
6.1.3.
Çözelti (6.1.2)’den 250 mikrolitre deaktive edilmiş bir silika plağa (4.4) yaklaşık 8
cm uzunluğunda düz çizgi halinde damlatılır. Çizginin dar olması için özen
gösterilir.
6.1.4.
Standart karışım (4.8)’den 250 mikrolitre aynı plağa aynı şekilde uygulanır (6.1.3)
6.1.5.
Plak yürütüldükten sonra lokalizasyona yardım için 4.6 ve 4.7 solüsyonlarından
5’er µl iki nokta halinde başlangıç çizgisine damlatılır.
6.1.6.
Plak, solvent 4-5 içeren doyurulmamış tank içerisinde damlatma çizgisinden
itibaren 12 cm yürütülür. Genelde bu 45 dakika alır. Hava ile kurutulur ve UV 254
nm altında rezorsinol/DHT lekeleri tespit edilir. Bu iki bileşen yaklaşık aynı Rf
değerlerine sahiptir. Lekeler kazınır ve 10 ml.lik şişelere alınır.
6.1.7.
Örneği ve standart karışımı içeren absorbanların her biri aşağıdaki yolla ekstre
edilir:
2’şer ml metanol ilave edilip, 1 saat karıştırılır, süzülür ve ekstraksiyon 2 ml
metanol ile 15 dakika tekrarlanır.
6.1.8.
Ekstraktlar birleştirilir ve bir gece boyunca solvanı uygun bir desikan madde
içeren vakum desikatöründe uçurulur. Herhangi bir ısı uygulanmaz.
6.1.9.
Bakiyeler (6.1.8) 6.1.9.1 veya 6.1.9.2’deki gibi silanize edilir.
6.1.9.1.
Bir mikroenjektörle 200 µl BSTFA (4.9.1) eklenir ve karışım 12 saat oda ısısında
kapalı bir kapta tutulur.
6.1.9.2.
Bir mikro enjektörle sırasıyla 200 µl - HMDS (4.9.2) ve 100 µl – TMCS (4.9.3)
eklenir ve karışım kapalı bir kapta 30 dakika 60oC’de ısıtılır, karışımı soğutulur.
6.2.
Gaz Kromatografi
6.2.1.
Kromatografi koşulları
Kolonun rezolüsyonu (R) aşağıdaki formülle hesaplandığında 1,5 veya daha büyük
olmalıdır.
R= 2d1 (r2-r1)
w1 + w2
Burada:
r1 ve r2 : iki pikin dakika cinsinden alıkonma zamanları
w1 ve w2: aynı piklerin yarı yükseklikte milimetre cinsinden genişlikleri
d1: kağıt hızı, mm/dakika cinsinden
Aşağıdaki kolon ve gaz kromatografisi koşulları uygun bulunmuştur:
Kolon materyali: Paslanmaz çelik
Uzunluk: 200 cm
İç çap: 3 mm
Dolgu materyali: % 10 OV-17 chromosorb WAW 100-120 mesh
Alev iyonizasyon dedektörü:
Sıcaklıklar:
Kolon: 185oC (Izotermal)
Dedektör: 250oC
Enjeksiyon portu: 250oC
Taşıyıcı gaz: Azot
Akış: 45 ml/dakika
Hidrojen ve hava akımı için üreticinin talimatlarına uyulur.
6.2.2.
6.1.9’da elde edilen çözeltilerden 1-3 mikrolitre gaz kromatografına enjekte edilir.
Her çözelti (6.1.9) için 5 enjeksiyon yapılır, alanlar ölçülür, ortalaması alınır ve
pik alan oranı S: rezorsinol pik alanı/DHT pik alanı hesaplanır.
S= Rezorsinolun pik alanı/DHT’nin pik alanı.
7.
HESAPLAMA
Örnekteki rezorsinol konsantrasyonu % kütle (m/m) olarak aşağıdaki formül
kullanılarak hesaplanır.
% rezorsinol= 4
M
x
S örnek
S standart karışım
Burada;
M
= Gram cinsinden test miktarı (6.1.1)
8.
Sörnek
= Örnek çözelti için 6.2.2’ye göre ortalama pik alan oranı
Sstandart karışım
= Standart karışım için 6.2.2’ye göre ortalama pik alan oranı
TEKRARLANABİLİRLİK (Norm ISO 57)
Yaklaşık % 0.5’lik bir rezorsinol içeriği için, aynı örnekte yürütülen iki paralel
deney sonuçları arasındaki fark % 0.025’i aşmamalıdır.
YÖNTEM VI. ETANOL YADA PROPAN-2-OL İLE BAĞLANTILI OLARAK
METANOL TAYİNİ
1.
KAPSAM VE UYGULAMA ALANI
Bu metod her tür kozmetik üründe (aerosoller dahil) metanolün gaz kromatografisi
ile analizini tarif eder.
% 0-10 relatif seviyeler saptanabilir.
2.
TANIM
Bu yöntem metanol miktarını etanol yada propan-2-ol ile bağlantılı olarak,
metanolü % kütle cinsinden ifade eder.
3.
PRENSİP
Tayin, gaz kromatografisi ile yürütülür.
4.
REAKTİFLER
Kullanılan kimyasallar analitik saflıkta olmalıdır.
4.1.
Metanol
4.2.
Absolü etanol
4.3.
Propan-2-ol
4.4.
Kloroform, su ile yıkanarak alkollerden arındırılmış
5.
EKİPMAN
5.1.
Gaz Kromatografisi
Aerosol örnekleri için Katharometer dedektör ile aerosol olmayan örnekler için
alev iyonizasyon dedektörü ile donanımlı
5.2.
Erlenler 100 ml.lik
5.3.
Pipetler 2 ml, 20 ml, 0-1 ml
5.4.
Mikroenjektörler 0-100 µl ve 0-5 µl
(sadece aerosoller için) özel-gaz kaçırmayan enjektörler (Şekil 5).
6.
İŞLEM
6.1.
Örneklerin hazırlanması
6.1.1.
Aerosol ürünler, Kozmetik Ürünlerin İçerdiği Maddelerle İlgili Birinci Analiz
Yöntemleri Tebliği Ekinin II. Kısmına göre örneklenir ve sonra 6.2.1’deki
şartlar altında gaz kromatografisi ile analiz edilir.
6.1.2.
Aeresol olmayan ürünler yine aynı tebliğe göre örneklenip % 1-2 etanol veya
propan-2-ol seviyesine su ile seyreltilip 6.2.2’deki şartlar altında gaz
kromatografisi ile analiz edilir.
6.2.
Gaz Kromatografisi
6.2.1.
Aerosol ürünler için Katharometer dedektörü kullanılır.
6.2.1.1.
Kolon dolgusu
% 10 Hallcomid M 18 Chromosorb WAW 100-200 mesh.
6.2.1.2.
Kolonun rezolüsyonu (R) 1.5 veya daha büyük olmalıdır.
R= 2 d’ r2 – d’ r1
w1 + w2
Burada:
r1 ve r2 = 2 pikin dakika cinsinden alıkonma zamanı
w1 ve w2 = piklerin yarı yükseklikte mm cinsinden genişlikleri
d’ = kağıt hızı mm/dakika cinsinden
6.2.1.3.
Bu rezolüsyon aşağıdaki koşullar kullanılarak elde edilir.
Kolon materyali: Paslanmaz çelik
Uzunluk: 3.5 metre
Çap: 3mm
Katharometre köprü akımı: 150 mA
Taşıyıcı gaz: Helyum
Basınç: 2.5 bar
Akış: 45 ml/dak.
Sıcaklıklar:
Enjeksiyon portu: 150oC
Dedektör: 150oC
Kolon: 65oC
6.2.2.
Aerosol olmayan örnekler için
6.2.2.1.
Kolon chromosorb 105 yada Propak QS ile doldurulur ve alev iyonizasyon
dedektörü kullanılır.
6.2.2.2.
Kolonun rezolüsyonu 1.5 veya daha büyük olmalıdır.
R= 2 d’ r2 – d’ r1
w1 + w2
Burada;
r1 ve r2 : iki pikin alıkonma zamanları, dakika olarak
w1 ve w2: piklerin yarı yükseklikte mm cinsinden genişlikleri
d’ : mm/dakika cinsinden kağıt hızı
6.2.2.3.
Bu rezolüsyon aşağıdaki koşullar kullanılarak elde edilmiştir.
Kolon materyali: Paslanmaz çelik
Uzunluk: 2 metre
Çap: 3 mm
Elektrometre hassasiyeti: 8 x 10-10A
Gazlar:
Taşıyıcı: Azot
Basınç: 2.1 bar
Akış: 40 ml/dakika
Yedek gaz: Hidrojen
Basınç: 1.5 bar
Akış: 20 ml/dakika
Sıcaklıklar:
Enjeksiyon portu: 150oC
Dedektör: 230oC
Kolon: 120-130oC
7.
STANDART GRAFİK
7.1.
Gaz kromatografisi işlemi 6.2.1 (Hallocomid M18 kolonu) için şu standart
karışımlar kullanılır (Bu karışımlar pipetlenerek hazırlanır, tam miktarı bulmak
için her ilaveden hemen sonra pipet veya kap tartılır).
Relative Miktar
(% m/m)
Metanol Etanol yada
(ml)
Propan-2-ol
Hacme eklenen
Kloroform
(ml)
Yaklaşık % 2.5
0.5
20
100 ml
Yaklaşık % 5.0
1.0
20
100 ml
Yaklaşık % 7.5
1.5
20
100 ml
Yaklaşık % 10
2.0
20
100 ml
6.2.1’deki koşullar kullanılarak kromatografa 2-3 mikrolitre enjekte edilir. Her
karışımın (metanol/etanol) veya (metanol/propan-2-ol) pik alan oranları
hesaplanır.
Aşağıdakiler kullanılarak standart grafik çizilir.
X – ekseni: etanol yada propan-2-ol ile bağlantılı metanol yüzdesi
Y – ekseni: (metanol/etanol) yada (metanol/propan-2-ol pik alan oranı
7.2.
Gaz Kromatografisi işlemi için 6.2.2 (propak QS yada chromosorb 105) aşağıdaki
standart karışımlar kullanılır (Bu karışımlar mikroenjektör ve pipetle hazırlanır,
her eklemeden sonra pipet yada kabı bekletilmeden tartılarak kesin miktar bulunur.
Relative Miktar
(% m/m)
Metanol Etanol yada
(µl)
Hacme eklenen su
Propan-2-ol
(ml)
Yaklaşık % 2.5
50
2
100 ml
Yaklaşık % 5.0
100
2
100 ml
Yaklaşık % 7.5
150
2
100 ml
Yaklaşık % 10.0
200
2
100 ml
6.2.2’deki koşullar kullanılarak kromatografa 2-3 mikrolitre enjekte edilir. Her
karışımın pik alan oranı (metanol/etanol) veya (metanol/propan-2-ol) hesaplanır.
Aşağıdakiler kullanılarak standart grafik çizilir.
X – ekseni: etanol yada propan-2-ol ile bağlantılı olarak % metanol
Y – ekseni: pik alan oranı (metanol/etanol) yada (metanol/propan-2-ol)
7.3.
Standart grafik düz çizgi olmalıdır.
8.
TEKRARLANABİLİRLİK (Norm ISO 5725)
Etanol yada propan-2-ol’e relatif % 5 metanol içeriği için aynı örnekte yürütülen
iki paralel tayinin sonuçları arasındaki fark % 0.25’i geçmemelidir.