Clostridium Difficile, Enfeksiyonlarının

Clostridium difficile
Enfeksiyonlarının Mikrobiyolojik Tanısında
Yenilikler
Uludağ Üniversitesi Tıp Fakültesi
Mikrobiyoloji Anabilim Dalı
Yrd.Doç.Dr. Melda SINIRTAġ
Antibiyotikle
iliĢkili
diyareler
Antibiyotikle iliĢkili ishaller
Clostridium difficile
Salmonella spp
Clostridium perfringens Tip A
Staphylococcus aureus
Campylobacter jejuni
Candida albicans
Gram pozitif
Sporlu
Zorunlu anaerob
Kapsülsüz
Zayıf hareketlidir
Pozitif regülatör
sitotoksin
enterotoksin
Negatif regülatör
Pozitif regülatör
sitotoksin
enterotoksin
Negatif regülatör
NAP1/027
Kanada 2002/Ġngiltere 2005, Hollanda, Belçika,Fransa
Klinik
Klinik
Enterokolit/Psödomembranöz enterokolit (PME)
Antibiyotik kullanımından 5-10 gün sonra semptomlar baĢlar
DıĢkı
Kahverengi-sulu
Kanlı
PME mukuslu
(%90-95)
(%5-10)
(%85)
Karın ağrısı-bulantı-kusma
AteĢ
(%26-66)
Lökositoz
(%40-50)
C. difficile enfeksiyonlarında tanı
 Hasta için önemi :
etkili tedavi
 Hastane için önemi:
çevreye yayılım ve salgınları
önlemek
C. difficile
Mikrobiyolojik Tanı
Kimden?
Ne zaman?
Nasıl?
2010
Zaman hastalıkların
karekteristiğini
değiĢtirdiği gibi
tanısal
yaklaĢımlarıda
değiĢtirmektedir
değiĢenler

• %42Diyare
hastane
•%34
toplum
Antibiyotik
kullanım
öyküsü
hafta içinde)
– Genç (8
sağlıklı
En •azGebe
3 gündür hastanede
• Gençler
yatıĢ
> 65 yaĢ
Kutty PK. Infect Control Hosp Epidemiol 2005;29:197-202.
Candiotto A. J Med Microbiol 2010; 59:124-6.
Clostridium difficile infection in Europe: the first pan-European
hospital-based survey
M.P. Bauer,1,2 D.W. Notermans,1 B.H.B. van Benthem,1 J.S.
Brazier3, M.H. Wilcox,4 M. Rupnik,5 D.L. Monnet,6 J.T. van
Dissel2 and E.J. Kuijper,2 on behalf of the ECDIS Study Group.
Turkey: B. Levent (N.C.), Refik Saydam National Hygiene Center,
Ankara; S. Kacar (L.C.), Yuksek Ihtisas Hospital, Ankara; G. Hascelik
(L.C.), Hacettepe University Medical Faculty, Ankara; B. Sener (L.C.),
Hacettepe University Medical Faculty, Ankara; O. Azap (L.C.),
Baskent University Hospital, Ankara; H. Arslan (L.C.), Baskent
University Hospital, Ankara; M. Sinirtas (L.C.), Uludag University,
Bursa; H. Akalin (L.C.), Uludag University, Bursa; N. Ulger (L.C.),
Marmara University, Kadikoy, Istanbul; G. Soyletir (L.C.), Marmara
University, Kadikoy, Istanbul;
19. ECCMID
Clostridium difficile infection in Europe: the first pan-European
hospital-based survey
M.P. Bauer,1,2 D.W. Notermans,1 B.H.B. van Benthem,1 J.S.
Brazier3, M.H. Wilcox,4 M. Rupnik,5 D.L. Monnet,6 J.T. van
Dissel2 and E.J. Kuijper,2 on behalf of the ECDIS Study Group.
Characteristic
n/ N
%
Female sex
287/ 509
56
Age ≥ 65 years
319/ 509
63
healthcare-associated
408/ 506
80
indeterminate association
28/ 506
6
community-associated
70/ 506
14
441/ 507
87
Epidemiological characteristics:
Age distribution [years]: median 71; IQR 56 – 81
Epidemiological association:
Explicit request to test for CDI
19. ECCMID
– Toksinotip V
078/NAP7/BK
• Hayvan+insan yemeklerinde saptandı
• Binary toksin pozitif
• Salgınlar?????
Mikrobiyolojik tanı için optimal koĢullar
Sadece sulu dıĢkı
Epidemiyolojik araĢtırmalar hariç
Eküvyon ile gelen örnek kabul edilmemelidir
Taze alınmıĢ dıĢkı örneği
Hızlı çalıĢılmalı
 4°C’de saklanmalıdır (2-3 gün)
Uzun dönem saklamalarda -70°C
(-20°C’de değil)
Brazier JJ;Clinical Infectious Diseases 16:228-33,1993
Freeman J; J Clinical Pathology 56:126-8,2003
Hangi yöntem
Yöntem
2004
2008
Sitotoksin nötralizasyon
Immunokromotografik testler
(GDH ve/yada Toksin)
EIA toksin A
EIA Toksin A/B
Diğer
%5
%26
%1
%46
%18
%42
%9
%2
%43
%8
College of American Pathology 2004, p:9
College of American Pathology 2008, p:9
Moleküler yöntemler
Enzim
immünoassay
(Toksin A/B)
Clostridium
difficile
Toksijenik kültür
(Kültür+sitotoksin nötralizasyon)
Glutamat
dehidrogenaz
Sitotoksin
nötralizasyon
TOKSĠJENĠK KÜLTÜR
SĠTOTOKSĠN
NÖTRALĠZASYON
TOKSĠJENĠK KÜLTÜR
Sikloserin Sefoksitin
Fruktoz Agar
(Cycloserine Cefoxitine
Fructose Agar) CCFA
Taze dışkı
ısı/alkol ile yapılan işlem
sonrası, selektif sikloserin
sefoksitin fruktoz anaerobik
agar besiyerine ekim
C. difficile : Koloni yapısı
2 mm çaplı, buzlu cam görüntüsü veren,
sarımsı-beyazımsı renkli koloniler oluşturur
Kültür at gübresi gibi kokar
365 nm UV’de yeşil floresan
beyin kalp infüzyon buyyona pasaj
24 saat 35-37 ºC’de inkübe edilir
Bu kültür invitro toksin araştırılması için kullanılır
• Toksijenik kültür
– Üreyen suĢların toksin yapıp yapmadığı kontrol
edilmelidir
– Sitotoksin nötralizasyon kadar spesifik değil
– Sonuçlanma süresi uzun
• 4 gün
– Tercih edilmiyor
• Amerika %77 tercih etmiyor1
• Avrupa
%55 tercih ediyor (2003)2
1Gilligan
2Barbut
PH. Clin Micro Net 2008;Oct,31.
F. Clin Microbiol Infect 2003;9:989-96.
SĠTOTOKSĠN NÖTRALĠZASYON
HeLa
• 10 pg’lık sitotoksin düzeylerini saptayabilen bir
yöntemdir
• Sıvı dışkı örnekleri santrifüje edilir
• Süpernatan, filtrelerden geçirilir
• 1/40 bazı çalışmalarda 1/5 dilüe edilerek
hücre dizilerinin üzerine eklenir
• 37 ºC de 24-48 saat anaerob inkübasyondan
sonra ışık mikroskobunda sitopatik etki
(yuvarlaklaşma) aranır
• Nötralizan antikorlar (anti-C. sordellii
antiserum) eklendiğinde bu sitopatik etki ortadan
kalkar
• Sitotoksin Nötralizasyon
Testi
– Duyarlılık %80-100
– PPD %90’ın üzerinde
– Zaman
Zaman alıcı
zor bir
teknik
• Pozitif sonuç 24 saat
• Negatif sonuç 48 saat
– Tercih edilmemekte
• %1
CAP profciency test survey 2008
Moleküler yöntemler
Enzim
immünoassay
(Toksin A/B)
Clostridium
difficile
Toksijenik kültür
(Kültür+sitotoksin nötralizasyon)
Glutamat
dehidrogenaz
Sitotoksin
nötralizasyon
• Enzim immüno assay (EIA)
– Toksin A
– Toksin A+B
– Glutamat dehidrogenaz (GDH)
• Ġmmünokromotografik testler
– Toksin A+B
– GDH
– Toksin A+B+GDH
•
•
•
•
•
HIZLI
UCUZ
KOLAY
EKĠPMAN UCUZ
TEK/BĠRDEN ÇOK
ÖRNEK
ÇALIġILABĠLĠR
test
hedef
zaman
toxA test
Oxoid
Immunocard
Meridian
ColorPAC tox A
BD
CdTox A OIA
Biostar
Vidas CDA II
BioMérieux
Premier toxin
A&B
C.diff tox A/B
Techlab
Immunocard A/B
Meridian
Triage
BMD
A
45'
A
20'
A
20'
A
20'
A
60'
A ve B
80'
A ve B
80'
A ve B
30
A ve GDH
20'
B ve GDH
45’
C.DIFF Quik
Chek Complete
EIA testlerinde duyarlılık nasıl?
dilüsyon
Premier
sitotoksin
tox A/B
Techlab
tox A/B
Vidas
(A)
ColorPAC
Immuno Oxoid CD
rapid
card (A) toxin A
tox A
1
+
+
+
+
+
+
+
1/2
+
+
+
+
+
+
+
1/4
+
-
-
-
-
-
-
1/8
+
-
-
-
-
-
-
1/16
+
-
-
-
-
-
-
1/32
+
-
-
-
-
-
-
1/64
+
-
-
-
-
-
-
1/128
-
-
-
-
-
-
-
DUYARLILIK
ÖZGÜLLÜK
PPD
NPD
%32-98.7
%92-100
%76.4-96
%88-100
1-5
1.Stampe PD. J Clin Microbiol 2009;47:373-8
2.Musher DM. J Clin Microbiol 2007;45:2737-9
3.Sloan LM J Clin Microbiol 2008;46:1996-2001
4.Gilligan PH. J Clin Microbiol 2008;46:1523-25
5.Tirehurst JR. J Clin Microbiol 2006;44:1145-9
hasta
yöntem
pozitiflik (%)
diyareli
EIA Toksin A
16
Büyükbaba Boral Ö; KLİMİK Derg 7:105-7,1994
diyareli
EIA Toksin A
34
Öztürk R;5. Ulusal İnfeksiyon Hastalıkları Kongresi,1995
5.2
(Toksin %0.8)
Karaer P;5. Ulusal İnfeksiyon Hastalıkları Kongresi,1995
Kocazeybek B;Türk Mikrobiyol Cem Derg 31:69-72,2001
diyareli
kültür
diyareli
EIA Toksin A
5
diyareli
EIA Toksin A
18,4
diyareli
EIA Toksin A
referans
Altuğlu İ; İnfeksiyon Derg 15:495-7,2001
4.7
Büyükbaba Boral Ö; Türk Mikrobiyoloji Cem Derg 32:220224,2002
diyareli
EIA Toxin A/B
12
Büyükbaba Boral Ö; Türk Mikrobiyoloji Cem Derg 32:220224,2002
diyareli
EIA Toksin A/B
3.2
Aygün G;ANKEM Derg 16:82,2002
diyareli
EIA Toksin A/B
9
Ercis S;Mikrobiyol Bült 38:45-50,2004
Toksin
• Toksinin dıĢkıda stabil kalmaması
• Mutasyon
– Toksin A-/B+
– Binary toksin +
Glutamat dehidrogenaz
• Hücre yüzey proteini
• Clostridium spp.
• Toksin A ve B den daha dayanıklı
(dıĢkıda)
• Tüm pozitif örneklerde doğrulama
gereklidir
Antijen temelli testlerin duyarlılığı
C. difficile ribotiplerinin saptanmasında
değişiyor mu?
Ribotip
027
027 dışındakiler
002
027
106
Duyarlılık
GDH
PZR
%90.1
%90.1
%72.2
%91.7
Toksin A+B
%15.4
%78.4
%18.8
Tenover FC.
PZR
%100
%100
%75
other
3
001 (9.3%)
002 (4.6%)
012 (4.3%)
14
014/020 (15.7%)
19
28
015 (3.3%)
017 (3.5%)
18
018 (5.8%)
16
43
023 (2.5%)
15
027 (4.8%)
14
22
12
078 (7.8%)
6
26
1
12
26
6
11
27
106 (5.1%)
21
126 (3.0%)
1
1
29
014
2
19
3
1
Moleküler yöntemler
Enzim
immünoassay
(Toksin A/B)
Clostridium
difficile
Toksijenik kültür
(Kültür+sitotoksin nötralizasyon)
Glutamat
dehidrogenaz
Sitotoksin
nötralizasyon
Moleküler Yöntemler
45
dakika
Cepheid
75-90
dakika
BD GeneOhm
~3 saat
Gen-Probe
45
dakika
Meridian
ALGORĠTMALAR
Algoritmalar
•
•
•
•
Hızlı
Kolay uygulanabilen
Duyarlılığı yüksek
Özgüllüğü biraz düĢük
+
• Özgüllüğü yüksek bir yöntemin
3’lü algoritma
GDH
(+)
Toksin A+B
(-)
(+)
Son rapor: C. difficile negatif
-
30 dakika
Son rapor: C. difficile pozitif
30 dakika
(-)
*Sitotoksisin
Nötralizasyon
*PZR
(+)
Son rapor: C. difficile pozitif
(-)
Son rapor: C. difficile negatif
45 dakika-48 saat
(-)
test
(+)test
antijen,
toksin
2’li algoritma
30 dakika
GDH / Toksin
GDH (+)/Toksin A+B (+)
1.aĢama
GDH (+)/Toksin A+B (-)
GDH (-)/Toksin A+B (-)
Son rapor:
C. difficile pozitif
Son rapor:
C. difficile negatif
*Sitotoksisin
Nötralizasyon
*PZR
2 aĢama
ALGORĠTMALARDA DUYARLILIK
EIA
GDH+EIA
örnek sayısı
432
432
Duyarlılık
58.3
Özgüllük
GDH+EIA+
sitotoksin
nötralizasyon
GDH+Xpert
Xpert
431
432
428
55.6
83.1
86.1
94.4
94.7
98.3
96.7
97.8
96.3
PPD
68.9
87.0
83.1
88.6
84
NPD
91.9
91.7
96.7
97.2
98.8
Novak-Weekley SM. J Clin Microbiol 48:889-93, 2010
C DIFF Quik Check
Complete
Sitotoksin
nötralizasyon
Toksijenik
kültür
GDH
CDT
VIDAS
Xpert PZR
BD PZR
%Duyarlılık
100
73.3
53.3
100
100
% Özgüllük
94.8
100
100
97
97.8
% PPD
68.2
100
100
78.9
83.3
% NPD
100
97.1
95.1
100
100
%Duyarlılık
100
61.1
44.4
100
94.4
% Özgüllük
97
100
100
99.2
99.2
% PPD
81.8
100
100
94.7
94.4
% NPD
100
95
93
100
99.2
Swindells J. J Clin Microbiol 2010;48:606-8.
QUIK CHEK
COMPLETE TM
GDH pozitif (22)
GDH negatif (128)
Son rapor:
C. difficile negatif
Toksin pozitif (11) Toksin negatif (11)
%7.3
(+)
%7.4
%85.3
(-)
Swindells J. J Clin Microbiol 2010;48:606-8.
• Algoritmaların dezavantajları
– GDH test duyarlılıklarındaki farklı
raporlar
– Zaman
– Birden çok yöntemi laboratuvar düzeninde
bulundurmak gerekliliği
– Maliyet
• Hangi hastalar test edilmeli?
• Hangi test laboratuvarda kullanılmalı?
• Testi tekrarlamalı mıyım, ne zaman?
Benim hastamda C. difficile
enfeksiyonu var mı?
Peterson LR. Ann Intern Med 2009;151:176-9.
C. difficile: Test tekrarı için kriterler
 Negatif sonuç:
 3 örnek (aynı günde birden fazla olmamalı)
 Duyarlılığı düĢük bir yöntem/kit kullanıyorsanız,
klinisyenlerin tekrar taleplerini dikkate alın
 Pozitif sonuç:
 Tedavinin baĢarısını ölçmek için kullanılmamalı
 Klinik=tedavide baĢarı
Barenfanger J, Khardori N: Clin Micro Newsl 18:142, 1996
Renshaw AA, et al: Arch Pathol Lab Med 120:49-52, 1996
Laboratuvarda ÇalıĢılacak Testlerin ve Malzemenin
Seçilmesi
• DOĞRULUK
• SONUÇLANMA
SÜRESĠ
• MALĠYET
• KULLANIM
KOLAYLIĞI
TOPLUMDAKĠ PREVALANS
Onlar kaçmak istesede
Toksin üreten tüm
izolatları yakalayın
TARAMA TESTĠ,
DOĞRULAMA TESTĠ
Prevalans düĢük ise
duyarlılığı yüksek
bir test kullanılmalı
18.70 TL
• Firma var mı?
– Toksin A+B kit sayısı?
• Ücret
– 96 test/519,38 $
– 50 test/663,75 $
– 25 test/371,25 $
– 25 test/500,00 $
• Parasını geri alabilecek misiniz?
2008
905.810
907.180
907.190
Clostridium difficile
kültürü
Clostridium difficile
toxin-A
Clostridium difficile
toxin-A ve B
36
29
29
2010
21,20
21,20
17,00
17,00
17,00
17,00
905810 "Clostridium difficile kültürü",
907180 "Clostridium difficile toxin-A"
907190 "Clostridium difficile toxin-A ve B“
den yanlızca biri ödenebilir
TeĢekkürler