PapilloCheck - Greiner Bio-One

Transkript

4°
8°
IVD
Avusturya'da üretilmiştir
hr-HPV DNA-Chip
PapilloCheck® high-risk
kullanım kılavuzuna Bakınız
servikal numunelerde 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 insan
papillomavirüs tiplerinin genotiplemesine yönelik tanı kiti
Xn
reF 505 060
Yalnızca profesyonel laboratuar personeli tarafından
in-vitro tanılarda kullanılması içindir
greiner Bio-one gmbh
Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • Almanya
Tel: +49 (0) 7022 948-0 • Faks +49 (0) 7022 948-514
[email protected] • www.gbo.com/bioscience
revizyon: BQ-065-01
Ağustos 2011
seMBoLLer sÖZLÜĞÜ
tr
Karanlık
yerde
saklayınız
Son
kullanma
tarihi:
Kullanmadan önce
talimatı
okuyun
Katalog
numarası
Üretici
firma
In vitro
diagnostik
tıbbi tanı
ürünü
Sıcaklık
sınırlaması
içeriği
<n> test
için yeterlidir
P V kodu
D N A - Önemli
Chip
Tahriş h r - HParti
edici
Not
en
Store in
the dark
Use by
Consult
Instructions For
Use
Catalog
Number
Manufacturer
In Vitro
Dianostic
Medical
Device
Temperature
limitation
contains
sufficient
for <n>
tests
Irritant
Batch
code
Important
Note
de
Im
Dunkeln
lagern
Mindestens
haltbar bis
Vor
Gebrauch
Anweisung
lesen
Katalognummer
Hersteller
In-VitroDiagnostika Medizinprodukt
Temperaturbegrenzung
Inhalt
ausreichend für
<n> Tests
Reizend
Chargenbezeichnung
Wichtiger
Hinweis
fr
À stocker
à l'abri de
la lumière
Date
limite de
conservation
jusqu'au
lire les instructions
avant
utilisation
Numéro
de référence
Fabricant
Produit
médical de
diagnostic
in-vitro
limite de
température
Contenu
suffisant
pour <n>
tests
irritant
Code du
lot
Note importante
es
Conservar en
un lugar
oscuro
A utilizar
preferiblemente
antes de
Antes
de usar,
lea las
instrucciones
Número
de catálogo
Fabricante
Producto
medicinal
de
diagnóstico in vitro
limitación
de
temperatura
Contenido
suficiente
para <n>
ensayos
Irritante
Código de
lote
Nota importante
it
Conservare al buio
Da
utilizzare
entro e
non oltre
leggere
le istruzioni prima
dell'uso
Numero
catalogo
Produttore
Dispositivo
medicodiagnostico in-vitro
limitazione temperatura
Contenuto
sufficiente
per test
<n>
Irritante
Codice
del lotto
Nota importante
pt
Conservar
num local
escuro
A utilizar
preferívelmente
antes de
Antes de
usar, leia
as instruções
Número
de catálogo
Fabricante
Producto
medicinal
de
diagnóstica in vitro
PapilloCheck high-risk
limitação
de
temperatura
Conteúdo
suficiente
para <n>
ensaios
irritante
Código do
lote
Aviso importante
nl
Xn
®
Donker
bewaren
Tenminste
houdbaar
tot
Gebruiksaanwijzing lezen
Catalogusnummer
Fabrikant
In vitro
diagnostisch
medisch
product
Temperatuurbeperking
Voldoende inhoud
voor <n>
tests
Irriterend
lot
nummer
Belangrijke opmerking
da
Opbevares mørkt
Anvendes
senest
Læs
brugsanvisningen
Katalognummer
Producent
In vitro
meskdicin
doagnoseapparat
Temperaturbegraensær
Indeholder nok til
<n> test
lokalirriterende
lotnummer
Vigtig
henvisning
sv
Förvaras
mörkt.
Sista förbrukningsdag
läs brukKatalogTillverkare In vitroTempeInnehållet irriterande lot
sanvisnin- nummer
medicinsk ratur-beräcker till
nummer
gen före
doaggränsning <n> tester
servikal numunelerde
45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 insan
använd- 16, 18, 31, 33, 35, 39,
nostisk
ning
papillomavirüs tiplerinin
genotiplemesine apparatur
yönelik tanı kiti
Viktigt
meddelande
pl
Przechow- Termin
ywa ć w
zydatności
reF
505 060
ciemności
Ważne
4°
8°
IVD
!
no
Przed
użyciem
przeczytać
instrukcję
Numer
katalogowy
Producent
Ograniczenie
temperatury
Oppbeva- holdbar til les
katalogprodusent in vitro-di- tempein-vitro
kullanılması
res mørkt tanılarda bruksannummeriçindir
agnostisk raturbevisning før
bruk
el
Diagnostyka
in vitro
Produkt
yw
Αποθηκεύεται
στα σκοτεινά
το λιγότερο
διατηρείται
πριν την
χρήση
διαβάστε τις
οδηγίες
Αριθμός
Καταλόγου
Παραγωγός
medisinsk
utstyr
grensning
In vitro
διαγνωστικά
ιατρικά
προϊόντα
περιoριoμός
θερμοκραο
ίας
Tel: +49 (0) 7022 948-0 • Faks +49 (0) 7022 948-514
PapilloCheck® high-risk - Kullanım Kılavuzu
Revizyon: BQ-065-01 / Ağustos 2011
Zawartość
wystarcza
na <n>
testów
drażniący
Innhold
tilstrekkelig for <n>
tester
irriterende
Περιεχόμενο
αροκετό για
<n> τεοτ
ερεθιστικό
Kod partii
revizyon: BQ-065-01
batch nr.
Viktig
Ağustos
merknad 2011
κωδικός
παρτίδας
Σημαντική
υπόδειξη
2
iÇiNDekiLer
1. kiTiN iÇeriĞi ................................................................................................................ 5
h r - H P V D N A - C h i p6
2. gerekLi sArF MALZeMeLeri, ekiPMANLAr Ve DoNANIMLAr ........................
3. NAkLiYe Ve sAkLAMA ............................................................................................... 8
4. gÜVeNLik TALiMATLArI ............................................................................................ 8
5. ATIkLArIN Yok eDiLMesi .......................................................................................... 9
6. giriŞ ............................................................................................................................ 10
6.1 kullanım amacı ............................................................................................................................... 10
6.2 PapilloCheck® high-risk ile saptanabilir hPV tipleri .................................................................... 10
6.3 Miktar tayini prensibi ..................................................................................................................... 11
4°
8°
IVD
6.4 PapilloCheck® high-risk DNA çipinin tasarımı.............................................................................. 13
6.4.1 PapilloCheck® high-risk çipi yerleşim planı ......................................................................... 13
6.4.2 Çip üstü kontroller ................................................................................................................ 14
7. PAPIlloCheCk® hIgh-rIsk iŞ AkIŞI TALiMATLArI ............................................. 15
7.1 genel talimatlar .............................................................................................................................. 15
7.2 oda ayrımı....................................................................................................................................... 15
7.3 Uyarılar ve önlemler ....................................................................................................................... 16
®
7.3.1 Kontaminasyonun önlenmesi ............................................................................................... 16
7.3.2 DNA çipleri ile işlem yapma talimatı ..................................................................................... 16
7.3.3 Genel önlemler..................................................................................................................... 16
7.3.4 Güvenli çalışma ................................................................................................................... 17
8. PAPIllOCheCk® hIgh-rIsk ProseDÜr ............................................................... 18
8.1 Örnek toplama ve DNA izolasyonu ............................................................................................... 18
8.1.1 Örnek toplama ..................................................................................................................... 18
8.1.2 DNA izolasyonu.................................................................................................................... 20
Xn
8.2 Polimeraz zincir reaksiyonu (PCr) ............................................................................................... 21
8.2.1 Termal döngüleyici kurulumu ............................................................................................... 21
8.2.2 Urasil-N-Glikosilaz
(UNG) uygulaması yönelik
................................................................................
22
papillomavirüs
tiplerinin genotiplemesine
tanı kiti
8.2.3 PCR reaksiyon kurulumu ..................................................................................................... 23
8.3
hibridizasyon
ve yıkama ............................................................................................................... 25
reF
505 060
8.3.1 Hazırlama ve kurulum .......................................................................................................... 25
Yalnızca
laboratuar personeli tarafından
revizyon: BQ-065-01
8.3.2 profesyonel
Hibridizasyon .......................................................................................................................
27
in-vitro
kullanılması
içindir
Ağustos
8.3.3 tanılarda
Yıkama ve
kurutma ..............................................................................................................
29 2011
8.4 PapilloCheck® high-risk çipinin taraması ve değerlendirmesi ................................................... 31
Tel: +49 (0) 7022 948-0 • Faks +49 (0) 7022 948-514
3
9. sorUN giDerMe ....................................................................................................... 32
10. TekNik YArDIM ......................................................................................................... 33
11. PAPIlloCheCk® hIgh-rIsk PerForMANs ÖZeLLikLeri.................................. 34
h r - H P V D N A - C h i34
p
11.1 PapilloCheck® high-risk’in analitik performansı ..........................................................................
11.1.1 Analitik hassasiyet ............................................................................................................... 34
11.1.2 Analitik özgüllük – HPV türleri .............................................................................................. 35
11.1.3 Analitik özgüllük – HPV dışı organizmalar ........................................................................... 35
11.2 Tekrarlanabilirlik ............................................................................................................................. 36
11.3 Yeniden Üretilebilirlik..................................................................................................................... 37
11.4 Dayanıklılık ..................................................................................................................................... 38
11.5 PapilloCheck® high-risk'in klinik Performansı ............................................................................. 39
12. PAPIlloCheCk® hIgh-rIsk kIsA ProTokoL ...................................................... 40
12.1 oda 2: PCr - reaksiyon karışımının kurulumu ........................................................................... 40
12.2 oda 2: PCr - DNA şablonu ekleme / PCr reaksiyonu ............................................................... 41
12.3 oda 3: hibridizasyon - hazırlama / hibridizasyon reaksiyonu................................................... 42
4°
8°
IVD
12.4 oda 3: Yıkama ve kurutma / Tarama ve değerlendirme .............................................................. 43
Xn
reF 505 060
Tel: +49 (0) 7022 948-0 • Faks +49 (0) 7022 948-514
revizyon: BQ-065-01
Ağustos 2011
4
1. kiTiN iÇeriĞi
1
2
3
4°
8°
IVD
4
PapilloCheck® high-risk test kiti1
içerik
Miktar
PCR MasterMix
5 x PapilloCheck® high-risk
PCR MasterMix2
5 x 300 µl
Slide kutusu, 5 x 12 Dizi
1 x PapilloCheck® high-risk Slide Kutusu
5 PapilloCheck® high-risk çipi ile3
5 x 12 Dizi
Hibridizasyon Tamponu
2 x PapilloCheck® high-risk
Hibridizasyon Tamponu4
2 x 1.000 µl
TAMPON A konsantrasyonu
2 x PapilloCheck® high-risk Tampon A
konsantratı
2 x 40 ml
TAMPON B konsantrasyonu
1 x PapilloCheck® high-risk Tampon B
konsantratı
1 x 15 ml
hr-HPV DNA-Chip
Bir PapilloCheck® high-risk test kiti, 60 numunenin analizi için yeterlidir.
DNA Taq Polimeraz ve Urasil-N-Glikosilaz dışında PCR için gerekli olan tüm bileşenleri içerir. Flakon etiketlerinde
PapilloCheck® high-risk, PapilloCheck® hr. olarak kısaltılmış şekilde bulunmaktadır.
Bir PapilloCheck® high-risk çipi 12 PapilloCheck® high-risk mikrodizisi içerir. PapilloCheck® high-risk çip barkodları
üzerinde, PapilloCheck® high-risk, PapilloCheck® hr. olarak kısaltılmış şekilde bulunmaktadır.
Flakon etiketlerinde PapilloCheck® high-risk, PapilloCheck® hr. olarak kısaltılmış şekilde bulunmaktadır.
Xn
reF 505 060
Tel: +49 (0) 7022 948-0 • Faks +49 (0) 7022 948-514
revizyon: BQ-065-01
Ağustos 2011
5
2. gerekLi sArF MALZeMeLeri, ekiPMANLAr Ve
DoNANIMLAr
PapilloCheck® high-risk'in listelenen sarf malzemeleri, ekipmanlar ve donanımlar ile birlikte ve
yalnızca profesyonel personel tarafından kullanılması önerilmektedir.
hr-HPV DNA-Chip
sarf Malzemeleri
greiner Bio-one kat. No.
Miktar
PapilloCheck® high-risk test kiti
505 060
60 reaksiyon için test kiti
PapilloCheck® Toplama Kiti
465 070
10 numune
oCheck® DNA izolasyon Kiti / Tek Kolon Hazırlama
515 040
50 hazırlama için test
kiti
oCheck® DNA izolasyon Kiti / 8 Kolon Hazırlama
515 050
12 x 8 hazırlama
765 288
774 288
772 288
739 288
750 288
96/960
96/960
96/960
96/960
60/600
616 201
683 201
673 210
373 270
500/4000
500/1000
125/1250
125/1250
210 261
25/450
steril, DNase içermeyen mikropipet filtre ucu1
0,5-10 µl filtre uçları
0,5-20 µl filtre uçları
10-100 µl filtre uçları
DNase-içermeyen reaksiyon tüpleri
IVD
Reaksiyon tüpü 1.5 ml
Reaksiyon tüpü 0,2 ml2
8 x 0,2 ml PCR şeritleri
8 x 0,2 ml PCR şeritleri için kapak şeritleri
50 ml polipropilen tüp3
®
Pipetleyici için plastik pipetler
4°
8°
Pipet 10 ml
Pipet 25 ml
Pipet 50 ml
1
2
3
607 180 veya 607 160
760.180 veya 760.160
786.180 veya 768.160
1/200
1/200
1/200
Belirtilen uç boyutlarından bazıları kullanılabilir mikropipetlere bağlı olarak isteğe bağlıdır.
Prensip olarak 8'li tüp PCR şeridi kullanılması önerilmektedir. Şeritler mevcut değilse tekli reaksiyon tüpleri (0,2 ml)
isteğe bağlıdır.
Yalnızca slide santrifüj mevcut değilse gerekir.
Xn
reF 505 060
Tel: +49 (0) 7022 948-0 • Faks +49 (0) 7022 948-514
revizyon: BQ-065-01
Ağustos 2011
6
ekipman
greiner Bio-one kat. No.
Miktar
862 070
1
CheckReportTMYazılımı Temel
862 080 / 862 0904
1
CheckReportTMYazılımı PapilloCheck® high-risk eklentisi
862 088 / 862 0984
1
Slide tutuculu oCheck® Hibridizasyon Odası
447 070
hr-HPV D
1N A - C h i p
Slide tutucu kolu
447 001
1
oCheck® Yıkama Teknesi5
447 020
1
oCheck® VacSet6
863 080
1
oCheck® VacPump6
863 070
1
CheckScannerTM
gerekli enzimler
• Taq Polimeraz: HotStarTaq® DNA Polimeraz 5 U/µl (Qiagen; 203203, 203205, 203207, 203209)
• Urasil-N-Glikosilaz: Urasil-DNA Glikosilaz 1 U/µl (Fermentas; #EN0361, #EN0362)
gereken ek sarf malzemeleri
• PCR-kalitesinde su
• Distile veya deiyonize su
• Tek kullanımlık eldivenler
gereken ek ekipmanlar
IVD
• 1.5 ve 2 ml reaksiyon tüpleri için mikrosantrifüj
• 50 ml polipropilen tüpler için santrifüj (örn: BeckmanCoulter; Allegra X-22 Santrifüj; C0650 Sabit Açılı Rotor) veya
slide santrifüj (örn: labnet: Slide Spinner; VWR International: Galaxy MiniArray Santrifüj)
• Tekli 0,2 ml reaksiyon tüpleri veya 8'li tüp PCR şeritleri için mikrosantrifüj (örn: labnet: Spectrafuge Mini Santrifüj)
• PCR termal döngüleyici:
GeneAmp® PCR sistem 9700 (Uygulamalı Biyosistemler)
veya Veriti™ 96-Kuyucuklu Termal işlemci (Uygulamalı Biyosistemler)
®
• Su banyosu (50 °C)
• Mikropipetler (1 - 1000 µl arası farklı aralıklar)
• 8-Kanallı multipipet (aralık: 5 - 50 µl), örn. Brand Transferpette®-8 (Marka)
• Cam ve plastik pipetler için pipetleyici
• Vortex çalkalayıcı
• Farklı reaksiyon tüpleri için raflar
4°
8°
gerekli ek donanımlar
• Bilgisayar (sistem gereksinimleri için CheckScannerTM ve CheckReportTMYazılımı Kullanım Kılavuzuna bakınız)
4
5
6
CheckReportTM Software'in iki adet sürümü vardır. Cat. No. 862 090 / 862 098, 21CFR 11. Kısım gerekliliklerini de yerine
getirmektedir.
®
®
PapilloCheck
yıkama prosedürü
adet
teknesi
gerekmektedir.
servikalhigh-risk
numunelerde
16, 18, için
31, üç
33,
35,oCheck
39, 45,Yıkama
51, 52,
56, 58,
59, 66, 68 insan
Yalnızca Kat. No. 515 050 ile birlikte kullanıldığında gereklidir.
Xn
reF 505 060
Tel: +49 (0) 7022 948-0 • Faks +49 (0) 7022 948-514
revizyon: BQ-065-01
Ağustos 2011
7
3. NAkLiYe Ve sAkLAMA
PapilloCheck® high-risk test kitinin nakliyesi oda sıcaklığında gerçekleştirilir. Bununla birlikte kit teslim
alındıktan hemen sonra 4-8 °C'de saklanmalı ve ışıktan korunmalıdır. Doğru bir şekilde saklanan
PapilloCheck® high-risk test kiti ve bileşenleri belirtilen son kullanma tarihine kadar kullanılabilir.
Ayrıca bu koşullar altında raf ömrü, kitin ve bileşenlerinin ilk kez açılmasından sonra son kullanma
hr-HPV DNA-Chip
tarihinden sapmaz.
4. gÜVeNLik TALiMATLArI
PapilloCheck® high-risk test kiti yalnızca laboratuar kullanımına yöneliktir ve ilaç, evsel veya diğer
amaçlar doğrultusunda kullanım için tasarlanmamıştır. Her zaman uygun bir laboratuar önlüğü giyin,
tek kullanımlık eldivenler ve koruyucu gözlük takın ve bu bölümde verilen güvenlik talimatlarını
izleyin.
PapilloCheck® high-risk test kitinin aşağıdaki bileşenleri zararlı veya tehlikeli bileşenler içerir.
IVD
Bileşen
hibridizasyon
Tamponu
Tampon B
Tehlike
Ürün içeriği
Tehlike
sembolü
Guanidin
tiyosiyanat
(% 25-60 )
<% 20 Sodyum
Dodesilsülfat
risk
ifadeleri
risk
ifadeleri
güvenlik
ifadeleri
Zararlı*
R 20/21/22
R 32
R 52/53
S13
S61
S36/37
Tehlikeli*
R 21/22
R 36/37/38
S26
S36/37
®
4°
8°
* 125 g veya ml'ye kadar olan küçük ambalajlar için tehlike etiketine gerek yoktur (67/548//EEC Md. 25, 1999/45/EC Md.
12 ve German GefStoffV § 20 (3) ve TRGS 200 7.1 uyarınca). Daha fazla bilgi için bkz. Güvenlik Veri Formu.
risk ifadeleri
R 21/22
Ciltle teması veya yutulması zararlıdır
R 20/21/22 Solunması, ciltle teması veya yutulması zararlıdır
R 32
Asitlerle temasında çok toksik gaz çıkarır
R 36/37/38 Gözleri, solunum sistemini ve cildi tahriş eder
R 52/53
Sudaki organizmalar için zararlıdır, su ortamında uzun süreli olumsuz etkilere neden olabilir
Xn
güvenlik ifadeleri
S13
Yiyeceklerden, içeceklerden ve hayvan yemlerinden uzak tutun
S26 servikal
Gözlerle
temas etmesi16,
durumunda
derhal
yıkayın
tıbbi
alıninsan
numunelerde
18, 31, gözleri
33, 35,
39, bol
45,suyla
51, 52,
56,ve
58,
59,yardım
66, 68
S36/37papillomavirüs
Uygun koruyucu
giysi giyin
ve eldiven takın
tiplerinin
genotiplemesine
yönelik tanı kiti
S61
Çevreye salınmasından kaçının. Özel kullanım talimatına/güvenlik veri formuna bakın.
reF 505 060
Bu ürüne ait güncel Güvenlik Veri Formu, Greiner
Bio-One internet sitesinden indirilebilir: www.gbo.com/bioscience/biochips_download
revizyon: BQ-065-01
Ağustos 2011
Tel: +49 (0) 7022 948-0 • Faks +49 (0) 7022 948-514
8
5. ATIkLArIN Yok eDiLMesi
PapilloCheck® high-risk çipi yıkandıktan ve kurutulduktan sonra yıkama çözeltileri I, II ve III özel bir
tedbir olmaksızın atılabilir. Kullanılmış PapilloCheck® high-risk çipi, kullanılmamış kit bileşenlerini ve
kullanılmamış hibridizasyon karışımını laboratuar kimyasal atıklarıyla birlikte bertaraf edin. Bertaraf
etme ile ilgili tüm ulusal düzenlemelere, devlet düzenlemelerine ve yerel düzenlemelere riayet edin.
4°
8°
IVD
hr-HPV DNA-Chip
Xn
reF 505 060
Tel: +49 (0) 7022 948-0 • Faks +49 (0) 7022 948-514
revizyon: BQ-065-01
Ağustos 2011
9
6. giriŞ
Hemen hemen tüm rahim boynu kanseri vakalarında karsinojenik insan papillomavirüs (HPV) ile
kalıcı enfeksiyon tespit edilmiştir – ikincisi tüm dünyada kadınlarda en yaygın görülen kanserdir.
Bugüne kadar 100'den fazla HPV tipi saptanmıştır, bunların yaklaşık 40 tanesi cinsel yolla bulaşır ve
genital mukozayı enfekte eder. Rahim boynu HPV tipleri hem yüksek risk (yüksek riskli HPV, hrHPV)
hr-HPV DNA-Chip
hem de düşük risk grubunda (düşük riskli HPV, lrHPV) sınıflandırılır. Yüksek riskli HPV tipleri yüksek
rahim boynu kanseri riski ile ilişkiliyken düşük riskli HPV tipleri çoğunlukla iyi huylu genital siğillere
neden olur. Bununla birlikte, yüksek risk grubunda dahi kanser veya rahim boynu interepitelyal
lezyonların (CIN) görülme riski tipe bağlıdır. Tüm rahim boynu kanser vakalarının yaklaşık % 70'i
HPV 16 veya 18 ile bağlantılı kalıcı enfeksiyon ile ilişkilidir. En çok rastlanan düşük risk tipleri HPV
6 ve 11'dir. Karsinojenik HPV ile rahim boynu kanseri arasındaki hemen hemen kesin olan etyolojik
ilişkiye göre hrHPV'nin test edilmesi birincil rahim boynu kanser taraması için düşünülmektedir.
6.1
kullanım amacı
PapilloCheck® high-risk, in Vitro Tıbbi Tanı Cihazları Direktifinin (98/79/EC) koşullarına uyduğundan
dolayı CE uyum işareti taşımaktadır. PapilloCheck® high-risk kullanılarak elde edilen her tanı sonucu
diğer klinik bulgular veya laboratuar bulguları ile birlikte yorumlanmalıdır.
6.2
4°
PapilloCheck® high-risk ile saptanabilir hPV tipleri
®
PapilloCheck® high-risk insan papillomavirüsünün kanserojen açıdan yüksek risk taşıyan 14 tipinin
(hrHPV) saptanmasına olanak tanır. (Tablo 1).
8°
IVD
PapilloCheck® high-risk bir tanı kitidir ve insan rahim boynu smear'larından alınan DNA
preparatlarında 14 türde genital yüksek riskli insan papillomavirüsünün (hrHPV) kalitatif tespiti ve
genotiplemesinde kullanılmak üzere tasarlanmıştır. Kitin yalnızca uygun niteliklere sahip personel
tarafından kullanılması amaçlanmıştır.
Tablo 1: PapilloCheck® high-risk ile saptanabilir hPV tipleri
hPV 16
hPV 51
hPV 18
hPV 52
hPV 31
hPV 56
hPV 33
hPV 58
hPV 39
hPV 66
hPV 45
hPV 68
hPV
35
hPV
59
papillomavirüs
tiplerinin
genotiplemesine yönelik tanı kiti
reF 505 060
Xn
1
2
3
4
revizyon: BQ-065-01
Ağustos 2011
Walboomers, J. et al (1999). Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide. J Pathol. 189(1):12-9.
Burd EM. Human papillomavirus and cervical cancer. Clin Microbiol Rev. 2003;16:1–17.
Bosch F.X. et al. (2008). Epidemiology and natural history of human papillomavirus infections and type-specificimplications in cervical neoplasia.
Vaccine. 26 Suppl 10:K1-16.
gmbh
Meijer, C.J. et al. (2009).greiner
GuidelinesBio-one
for human papillomavirus
DNA test requirements for primary cervical cancer screening in women 30 years
and older. Int J Cancer. Maybachstr.
124(3):516-20. 2 • 72636 Frickenhausen • Almanya
Tel: +49 (0) 7022 948-0 • Faks +49 (0) 7022 948-514
10
6.3
Miktar tayini prensibi
PapilloCheck® high-risk, insan papillomavirüs (HPV) genomu E1 geninin bir parçacığının tespit
edilmesine ve genotiplemesine yönelik mikrodizi tabanlı bir test kitidir. Miktar tayini prosedürü Şekil
1'de özetlenmiştir.
hr-HPV DNA-Chip
DNA izole
PapilloCheck® high-risk analizinden önce bir rahim boynu smear'i numunesinden
®
edilmelidir. Numune toplama ve DNA izolasyonu PapilloCheck high-risk test kitinin parçaları değildir.
Greiner Bio-One numune toplama (PapilloCheck® Toplama Kiti) ve DNA izolasyonuna (oCheck®
DNA izolasyon Kiti) yönelik özel ürünler de sunmaktadır ve bu ürünler ayrı olarak satın alınmalıdır
(Bölüm 2'de bulunan sipariş verme bilgilerine bakınız).
4°
8°
IVD
Bir rahim boynu numunesinden viral ve insan genomik DNA'sının izolasyonundan sonra viral E1
geninin 350 bp'lik parçacığı HPV'ye özgü primerler grubunun bulunduğu polimeraz zincir reaksiyonu
(PCR) ile amplifiye edilir. Aynı reaksiyonda insan tek kopya geni ADAT1 (insan tRNA-özgül adenozin
deaminaz1), rahim boynu numunesinde insan numunesi materyalinin varlığını (numune kontrolü)
ve PapilloCheck® high-risk'de bulunan dahili kontrol şablonunu izlemek için amplifiye edilir. PCR
MasterMix, PCR (PCR kontrolü) performansını izlemek için amplifiye edilir. Ayrıca PapilloCheck®
high-risk PCR MasterMix, dUTP içerir. Böylece, önceki PCR reaksiyonlarından kaynaklanan taşınma
kontaminasyonu Urasil-N-Glikosilaz (UNG) uygulaması ile giderilebilir (bkz. bölüm 8.2.2).
PCR ürünleri daha sonra spesifik DNA problarına hibridize edilir ve PapilloCheck® high-risk çip
yüzeyine çip üstü kontrolleri eklenir. Her çip 12 DNA-mikrodizisi içerir, 12 rahim boynu numunesinin
eş zamanlı analizine olanak tanır. Hibridizasyon sırasında bağlı DNA floresanla etiketlenir ve bağı
çözülmüş DNA sonraki yıkama adımlarında çıkarılır. Hibridizasyon etkinliği izlenir (hibridizasyon
kontrolü).
Son olarak PapilloCheck® high-risk çipi sırasıyla CheckScannerTM ve CheckReportTM Yazılımı
kullanılarak otomatik olarak taranır, analiz
® edilir ve değerlendirilir (Bölüm 2'de bulunan sipariş verme
bilgilerine bakınız). CheckScannerTM, iki renkli lazer tarayıcısı olup (532 nm ve 635 nm eksitasyon
dalgaboyları) HPV'ye özgü amplifikasyon ürünlerinin yanı sıra kontrollerinin varlığı ile oluşturulan
floresan sinyalinin tespit edilmesini sağlar (bkz. bölüm 6.4.2). CheckReportTM Yazılımı, sonuçların
görüntülenmesine, analizine ve değerlendirilmesine olanak sağlar ve tespit edilen HPV türlerinin ve
kontrollerin ilgili değerlerini ayrıntılı bir raporda otomatik olarak gösterir.
Rapor, tespit edilebilir bir veya daha fazla 14 yüksek riskli HPV türünün varlığını veya yokluğunu
açıkça gösterir ve kapsamlı çip üstü kontrolleri analizi son derece güvenilir kılar.
Xn
reF 505 060
Tel: +49 (0) 7022 948-0 • Faks +49 (0) 7022 948-514
revizyon: BQ-065-01
Ağustos 2011
11
1. PCr reaksiyonu
hr-HPV DNA-Chip
4°
8°
IVD
2. hibridasyon
3. Yıkama ve kurutma
PapilloCheck® high-riskveya
4. Tarama ve analiz
Xn
reF 505 060
tanılarda
kullanılması
içindir
®
Şekil 1:in-vitro
PapilloCheck
high-risk
miktar tayini
prosedürü
revizyon: BQ-065-01
Ağustos 2011
1. PCr reaksiyonu: DNA izolasyonundan sonra viral E1 geninin 350 bp'lik parçacığı ve iki kontrol hedefinin parçacıkları
PCR ile amplifiye edilir. Amplifikasyon ürünleri daha sonra çip üzerinde tamamlayıcı DNA problarına hibridize edilir.
2. hibridasyon: Her bir HPV türü, beş kopya halinde bulunan spesifik DNA probu ile tespit edilir. Hibridizasyon sırasında
floresan etiketleme uygulanır.
3. Yıkama ve kurutma: Bağı çözülmüş DNA sonraki yıkama adımlarında çıkarılır.
®
4. Tarama ve analiz: greiner
PapilloCheck
high-risk
çipi CheckScannerTM ve CheckReportTMYazılımı kullanılarak taranır, analiz
Bio-one
gmbh
edilir ve değerlendirilir.
Tespit
edilebilir
bir
veya
daha fazla 14 HPV
türünün varlığını veya yokluğunu açıkça gösteren bir
Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen
• Almanya
rapor oluşturulur. Tel: +49 (0) 7022 948-0 • Faks +49 (0) 7022 948-514
12
6.4
PapilloCheck® high-risk DNA çipinin tasarımı
6.4.1
PapilloCheck® high-risk çipi yerleşim planı
Her PapilloCheck® high-risk çipi, kuyucuk A1 - B6 olarak tayin edilmiş 12 mikrodizi içerir. Her
PapilloCheck® high-risk mikrodizisi 28 farklı probdan oluşur ve yükseltilmiş bir alanla sınırlanır. Her
hr-HPV DNA-Chip
gösterilmekte
prob beş kez damlatılır. PapilloCheck® high-risk mikrodizi yerleşim planı Şekil 2'de
ve-çip üstü kontrolleri Bölüm 6.4.2'de daha detaylı bir şekilde açıklanmaktadır.
kırmızı kanalın (635 nm)
oryantasyon kontrolü
hibridizasyon kontrolü
HPV 16
HPV 51
HPV 18
HPV 52
HPV 31
HPV 56
HPV 33
HPV 58
HPV 35
HPV 59
HPV 39
HPV 66
HPV 45
HPV 68
numune kontrolü
PCR kontrolü
yeşil kanalın (532 nm)
a)
oryantasyon kontrolü
HPV 16
HPV 51
HPV 18
HPV 52
HPV 31
HPV 56
HPV 33
HPV 58
HPV 35
HPV 59
HPV 39
HPV 66
4°
8°
IVD
b)
c)
HPV 45
HPV 68
numune kontrolü
PCR kontrolü
Şekil 2: PapilloCheck® high-risk çipinin tasarımı
a) PapilloCheck® high-risk çipinin şematik çizimi. b) ve c) (b) kırmızı kanalın: 635 nm; c) yeşil kanalın: 532 nm taranmasında
kullanılan iki farklı eksitasyon dalgaboyu için CheckReportTM Yazılımı ve PapilloCheck® high-risk mikrodizi yerleşim planının
şematik çizimleri. HPV türü spesifik problar ve çip üstü kontroller belirtilir.
Xn
reF 505 060
Tel: +49 (0) 7022 948-0 • Faks +49 (0) 7022 948-514
revizyon: BQ-065-01
Ağustos 2011
13
6.4.2
Çip üstü kontroller
PapilloCheck® high-risk DNA-çipinin tasarımı kapsamlı çip üstü kontrolleri içerir. Çeşitli kontrol
sistemleri, numune kalitesi ve DNA izolasyonu (numune kontrolü), PCR reaksiyonunun kalitesi
(PCR kontrolü), hibridizasyon etkinliğinin (hibridizasyon kontrolü) yanı sıra nokta homojenliği ve
baskı kalitesi (işletim kontrolü ve baskı kontrolü) de dahil olmak üzere miktar tayini ve çip işlemenin
hr-HPV DNA-Chip
tüm kritik adımlarını izler. HPV türlerinin varlığına veya yokluğuna ek olarak CheckReport™Yazılımı
kontrollerin ve tespit edilen HPV türlerinin ilgili değerlerini ayrıntılı bir raporda gösterir. Farklı
kontrollerin okunması için CheckScanner™'in her iki eksitasyon dalgaboyu kullanılır. Miktar tayini
performansının kontrolü için (numune ve PCR kontrolü) kırmızı kanal kullanılırken (635 nm eksitasyon
dalgaboyu), hibridizasyonun ve çipin kalitesi (hibridizasyon, oryantasyon ve baskı kontrolü) yeşil
kanalda değerlendirilir (532 nm eksitasyon dalgaboyu).
Numune kontrolü
PapilloCheck® high-risk, insan tek kopya geni ADAT1'in (insan tRNA-spesifik adenozin deaminaz1)
bir parçacığını amplifiye ederek numunenin numunenin ve/veya DNA izolasyonunun kalitesini izler.
insan DNA'sı rahim boynu numunesinden izole edilen DNA'da yeterli miktarda mevcut ise numune
kontrol noktalarında bir floresan sinyali verilir.
4°
8°
IVD
ADAT1 amplifikasyonu gerçekleşmez veya yetersiz şekilde gerçekleşirse, CheckReport™Yazılımı
numune kontrolünün "başarısız" olduğunu gösterecektir ve rahim boynu numunesinde yetersiz
miktarda hücre olmasının ve/veya yetersiz izolasyon performansının bir sonucu olarak analizi
tekrarlanmalıdır (bkz. Bölüm 9).
PCr kontrolü
PapilloCheck® high-risk ayrıca PCR reaksiyonunun kalitesini de izler. PapilloCheck® high-risk PCR
MasterMix'de bulunan dahili kontrol şablonunun amplifikasyonu PapilloCheck® high-risk çipindeki
PCR kontrol noktalarında bir sinyal oluşturur. Amplifikasyon reaksiyonunun kalitesi aynı zamanda
CheckReport™Yazılımı ile de otomatik
® olarak değerlendirilir. PCR performansı önceden tanımlanmış
eşiğin altında ise CheckReport™Yazılımı PCR kontrolünü "başarısız" olarak gösterir ve analiz
tekrarlanmalıdır (bkz. Bölüm 9).
Numunedeki HPV DNA çok yüksek ise, PCR kontrol noktalarının floresan sinyali, PCR reaksiyonu
sırasındaki rekabete bağlı olarak düşük olabilir veya olmayabilir. Bu durumda testin geçerli olarak
kabul edilebilmesi için en az bir HPV-spesifik probunun floresan sinyali önceden tanımlanmış eşiği
aşmalıdır.
Xn
PapilloCheck® high-risk, PapilloCheck® high-risk çipinde spesifik DNA dizilerine hibridize olan
PapilloCheck® high-risk Hibridizasyon Tamponu içinde floresan ile etiketlenmiş prob kullanımı ile
hibridizasyonun etkinliğini izler. Yeterli bir hibridizasyon etkinliği her bir dizi noktasında floresan
sinyalleri ile sonuçlanır. PapilloCheck® high-risk çipindeki beş hibridizasyon kontrol noktasının
sonuçları ayrıca CheckReportTMYazılımı ile de değerlendirilir.
reF 505 060
oryantasyon ve baskı kontrolü
PapilloCheck® high-risk çipinin oryantasyon kontrol noktaları, hibridizasyon prosesinin etkinliğine
revizyon: BQ-065-01
bakılmaksızın floresan sinyalleri verir. Bu noktalar, sinyallerin doğru analizi için bir ön koşul olan
Ağustos 2011
doğru nokta tespitine yönelik kılavuz noktaları olarak CheckReportTMYazılımı tarafından kullanılır.
Ayrıca baskı prosesinin kalitesi her bir çip noktasında (baskı kontrolü) yeşil bir floresan sinyali ile
izlenir.
Tel: +49 (0) 7022 948-0 • Faks +49 (0) 7022 948-514
14
7. PAPilloCheCk® high-risk iŞ AkIŞI TALiMATLArI
7.1
genel talimatlar
Moleküler biyolojide halihazırda kullanılan en gelişmiş teknikler bir laboratuvara uygulandığında,
laboratuar personelinin azami güvenliğini ve yüksek kaliteli sonuçlar sağlamak amacıyla
aşağıdaki
hr-HPV DNA-Chip
talimatlar göz önünde bulundurulmalıdır.
DNA izolasyonu, amplifikasyon ve amplifikasyon ürünlerinin tespiti uygun nitelikli personel gerektirir.
Ayrıca DNA bozunması veya amplifikasyon ürünleri ile kontaminasyon nedeniyle ortaya çıkanlar gibi
hatalı sonuçları engellemek için net ve iyi yapılandırılmış bir iş akışı gerekmektedir. Bunu sağlamak
için Bölüm 7.2'de tanımlandığı gibi izolasyon, amplifikasyon ve tespit alanlarının ayrılması gerekir.
Her alanda ayrı ekipman, sarf malzemeleri, laboratuvar önlükleri ve eldivenler bulunmalıdır.
laboratuvar önlüklerini, eldivenleri veya ekipmanları kesinlikle farklı bir alandan bir başka alana
aktarmayın.
oda ayrımı
Şekil 3bir laboratuvarın nasıl 3 farklı bölüme ayrılabileceğine yönelik bir örnek göstermektedir. Bu
odalardan biri yalnızca DNA izolasyonu için, diğeri PCR reaksiyonlarının kurulması ve çalıştırılması
için, sonuncusu ise hibridizasyon ve analiz için kullanılır. Her bir oda, numunelerin kontaminasyonunu
önlemek amacıyla, yalnızca belirtilen uygulama veya teknik için kullanılır. Ekipmanların ve sarf
malzemelerinin alanlar arasında yanlışlıkla yer değiştirmesini önlemek için renk kullanılması yararlı
olabilir.
®
PapilloCheck
high-risk
oda 1
oda 2
oda 3
4°
8°
IVD
7.2
Xn
Şekil 3: oda ayrımı
numunelerde
18, 31,
33, 35,
39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 insan
oda 1: servikal
DNA izolasyon
prosedürünün16,
tamamı
bu odada
gerçekleştirilmelidir.
oda 2:papillomavirüs
Bu odada, PCR reaksiyon
karışımı
ayarlanır ve alikuotlara
bölünür
uygunu bir PCR ocağı altında). Oda 1'de
tiplerinin
genotiplemesine
yönelik
tanı(en
kiti
izole edilen DNA numunelerinin eklenmesi oda 2 içinde ayrı bir alanda gerçekleştirilmelidir.
oda3: Hibridizasyon reaksiyonu, yıkama adımları ve çip kurutma üçüncü laboratuvar odasında yapılır. Ayrıca
reF 505
060
TM
TM
CheckScanner
, CheckReport
Yazılımı ile birlikte PapilloCheck® high-risk miktar tayininin nihai analizi için kullanılır.
!
revizyon: BQ-065-01
Ekipmanlar
ve sarf
malzemeleri, farklı
laboratuvar odaları ve alanları arasında yer değiştirmemelidir.
in-vitro
tanılarda
kullanılması
içindir
Ağustos 2011
Bu nedenle, laboratuvara ekipman temin edilirken ekipmanların ve sarf malzemelerinin çift olarak temin
edilmesine dikkat edilmelidir.
Tel: +49 (0) 7022 948-0 • Faks +49 (0) 7022 948-514
15
7.3
Uyarılar ve önlemler
7.3.1
kontaminasyonun önlenmesi
• Prosedürlerin uygulanması sırasında laboratuvar önlükleri giyilmelidir ve her bir laboratuvar odası
için farklı laboratuvar önlük setleri bulunmalıdır.
hr-HPV DNA-Chip
• Analizin her adımında eldivenler takılmalıdır ve özellikle DNA izolasyonu sırasında sık sık
değiştirilmelidir.
• Çalışma yeri uygun temizlik solüsyonlarıyla dekontamine edilmelidir.
• Reaksiyon tüpü kapağının içine kesinlikle dokunulmamalıdır. Çapraz kontaminasyondan kaçınmak
için, her seferde yalnızca bir tüp açılmalıdır.
• Aerosol bariyerli uygun mikropipet filtre uçları kullanılmalıdır (DNase, Rnase ve insan DNA'sı
içermeyen). Sıvı transferleri arasında pipet uçları daima değiştirilmelidir.
7.3.2
DNA çipleri ile işlem yapma talimatı
• DNA çipleri tozsuz bir ortamda kullanılmalıdır. Çip yüzeyinde toz ve diğer parçacıkların birikmesi
önlenmelidir.
• Çip yüzeyindeki hibridizasyon bölgesine dokunulmamalıdır.
4°
8°
IVD
• Çipin yalnızca etiketli tarafı hibridizasyona yöneliktir.
• Çip üzerinde spesifik olmayan floresana yol açtıklarından DNA çiplerinin tanımlanması için işaret
kalemleri kullanılmamalıdır.
• DNA dizileri yalnızca tek kullanımlıktır. Hibridize edilen çipler yeni,den kullanılamaz.
• Kullanılmamış çipler, teslim edilen ve nem çekici fermuarlı torba içinde, orijinal kutusunda saklanır.
7.3.3
®
PapilloCheck
high-risk
genel önlemler
• Bu kit yalnızca in vitro tanılarda kullanıma yöneliktir ve yalnızca in vitro tanılarda laboratuvar
uygulama deneyimine sahip eğitimli personel tarafından kullanılmalıdır.
• Teslim alındığında kit bileşenlerinin hasarlı olup olmadığını kontrol edin. Bileşenlerden biri hasar
görmüşse (örn. tampon şişeleri), yerel Greiner Bio-One distribütörünüze başvurun. Hasar görmüş
kit bileşenleri kullanılmamalıdır. Bu komponentlerin kullanılması, kit performansını zayıflatabilir.
• PapilloCheck® high-risk test kiti, son kullanma tarihinden sonra kullanılmamalıdır.
• Son kullanma tarihi geçmiş reaktifleri kullanmayın.
• Farklı serilere ait reaktifleri karıştırmayın.
servikal
16, 18,
31, 33,tarafından
35, 39, 45,tavsiye
51, 52,edilen
56, 58,
59, 66,
68 insan kullanın.
• Yalnızca
kitlenumunelerde
birlikte sağlanan
ve üretici
reaktifl
eri/ekipmanları
papillomavirüs
tiplerinin
genotiplemesine
yönelik
tanı
kiti
• Mikropipetler, su banyosu ve termoblok için düzenli kalibrasyon/bakım gerçekleştirilmelidir.
Xn
• Mikrolitre aralığına küçük miktarlarda sıvı pipetlemek zordur. Bu nedenle olabildiğince doğru bir
reF 505 060
şekilde pipetlemeye dikkat edin.
• Reaktifl
erin profesyonel
mikrobik kontaminasyonunu
önlemek
için alikuotlar reaktif tüplerinden
alınırken
Yalnızca
laboratuar personeli
tarafından
revizyon:
BQ-065-01
dikkatli
olunmalıdır.
Ağustos 2011
• Tüm santrifüj adımları oda sıcaklığında gerçekleştirilmelidir (18-25 °C).
Tel: +49 (0) 7022 948-0 • Faks +49 (0) 7022 948-514
16
7.3.4
güvenli çalışma
• insanlara bulaşma potansiyeli taşıyan maddeler içeren biyolojik numunelerle işlem yaparken
dikkatli olun. Bulaşma potansiyeline sahip maddelerden enfeksiyon alma riskini azaltmak için,
numune lizisi tamamlanana kadar, laminar hava akımı şartları altında çalışmanız tavsiye edilir.
Tüm biyolojik numuneleri, enfekte edici ajanlar taşıma kapasiteleri bulunuyormuş gibi kabul
hr-HPV DNA-Chip
ederek kullanın ve bertaraf edin.
• Solüsyonları kesinlikle ağzınızla pipetlemeyin.
• Çalışma alanlarında yiyecek ve içecek bulundurmayın, sigara içmeyin veya kozmetik ürünler
kullanmayın.
• Biyolojik numunelere doğrudan temas etmekten, bu numuneleri sıçratmaktan veya püskürtmekten
kaçının.
• insan numuneleriyle çalışırken daima laboratuvar önlüğü giyin, eldiven takın ve koruyucu gözlük
kullanın.
4°
8°
IVD
• Numuneleri ve reaktifleri kullandıktan sonra ellerinizi iyice yıkayın.
Xn
reF 505 060
Tel: +49 (0) 7022 948-0 • Faks +49 (0) 7022 948-514
revizyon: BQ-065-01
Ağustos 2011
17
8. PapilloCheck® high-risk PROSEDÜR
Aşağıdaki bölümde, her bir analiz edilen rahim boynu numunesinde tespit edilebilir bir veya daha fazla
14 yüksek riskli HPV türünün varlığını veya yokluğunu açıkça belirten ayrıntılı bir raporun hazırlanması
ile sonuçlanan farklı çalışma adımları ayrıntılı bir şekilde açıklanmaktadır. Şekil 4, gerekli olan farklı
çalışma adımlarına bir genel bakış sunar. Ayrıca spesifik miktar tayini adımının tanımlandığı ilgili
alt bölümü de gösterir. Çalışma adımları bu bölümde belirtilen sırada gerçekleştirilmelidir. Her adım
mavi ok ➠ile gösterilmiştir.
!
CheckReportTM Yazılımı ile örnek toplama, DNA izolasyonu ve analiz PapilloCheck® high-risk test kitinin
parçaları değildir. Bu nedenle bu çalışma adımlarının tanımı bu bölümde kısaltılmıştır. Daha ayrıntılı bilgi
için lütfen Kullanım Kılavuzuna bakın, örn: PapilloCheck® Toplama Kitinden, oCheck® DNA İzolasyon Kiti ve
CheckReportTM Yazılımından.
8.1
Örnek toplama ve DNA izolasyonu
8.1.1
Örnek toplama
Örnek toplama, PapilloCheck® high-risk test kitinin bir parçası değildir. Greiner Bio-One tarafından
rahim boynu örneklerine yönelik özel bir toplama kiti (PapilloCheck® Toplama Kiti) de sunulmaktadır
(Bölüm 2'de bulunan sipariş verme bilgilerine bakınız).
PapilloCheck® high-risk, aşağıdaki toplama sistemleri veya araçlarından biri ile toplanan insan rahim
boynu smear'larından oCheck® DNA İzolasyon Kiti ile hazırlanan DNA kullanılarak valide edilmiştir:
• PapilloCheck® Toplama Kiti (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Almanya)
• PreservCyt® (Hologic, Bedford, MA, ABD)
• Surepath™ (BD, Franklin Lakes, NJ, ABD)
• STMTM (Qiagen, Hilden, Almanya).
Uygun taşıma araçları veya DNA izolasyon sistemleri ile ilgili daha fazla bilgi için yerel Greiner BioOne distribütörünüz ile iletişime geçin veya Greiner Bio-One internet sitesine başvurun:
www.gbo.com/bioscience/biochips_download
18
Bölüm 8.1.2 DNA izolasyonu
Bölüm 8.2 PCR
Bölüm 8.3.2 Hibridizasyon
Bölüm 8.3.3 Yıkama ve kurutma
or
Bölüm 8.4. Tarama ve değerlendirme
Şekil 4: Farklı PapilloCheck® high-risk çalışma adımlarına genel bakış
19
8.1.2
DNA izolasyonu
DNA izolasyonu, PapilloCheck® high-risk test kitinin bir parçası değildir. PapilloCheck® high-risk
analizinden önce Greiner Bio-One tarafından sağlanan oCheck® DNA İzolasyon Kiti (Bölüm 2^de
bulunan sipariş verme bilgilerine bakınız) kullanılarak DNA izolasyonu gerçekleştirilmelidir. oCheck®
DNA İzolasyon Kitini kullanırken lütfen Kullanım Kılavuzunu izleyin.
oCheck® DNA İzolasyon Kiti ile DNA izolasyonu için 250 µl numune çözeltisi kullanılmalıdır.
Papill
• oCheck® Toplama Kiti (Greiner Bio-One; Kat. No. 465 070)
• PreservCyt® toplama ortamında kullanılarak toplanan insan rahim boynu semar numuneleri
(Hologic, Bedford, MA, ABD)
doğrudan işlenebilir.
STM
•
toplama ortamında (BD, Franklin Lakes, NJ, ABD) toplanan rahim boynu numuneleri kullanım
öncesi yıkanmalıdır: 250 µl numuneyi 11.000 g'de 5 dakika süreyle santrifüj edin ve pelleti
250 µl distile suda resüspanse edin. Daha sonra 250 µl oCheck® DNA İzolasyon Kiti ile işlenebilir.
TM
STM
• STMTM toplama ortamında (Qiagen, Hilden, Almanya) toplanan rahim boynu numuneleri
seyreltilmelidir: 100 µl numune kullanın ve 150 µl distile su ekleyin. 250 µl seyreltilmiş numune
oCheck® DNA İzolasyon Kiti ile işlenebilir.
Genel olarak rahim boynu smear numunesi çok konsantre görünüyorsa ve zaten agrege olmuşsa,
DNA izolasyonuna başlamadan önce numunenin seyreltilmesi ve homojenize edilmesi gerekir!
Çok seyreltilmiş ve gözle görünür hücreleri göstermeyen rahim boynu smear numuneleri, DNA
izolasyonu için daha fazla hücre verimi elde etmek amacıyla konsantre edilmelidir: 1000 µl numuneyi
11.000 g'de 5 dakika süreyle santrifüj edin ve pelleti 250 µl distile suda resüspanse edin. Daha sonra
250 µl oCheck®DNA İzolasyon Kiti ile işlenebilir.
!
Bu konsantrasyon adımı yalnızca PapilloCheck® Toplama Kiti ile, PreservCyt® toplama ortamında veya
SurepathTM toplama ortamında toplanan rahim boynu smear numuneleri için uygundur. STMTM toplama
ortamı kullanılmışsa, santrifüj yoluyla konsantrasyon elde edilmesi mümkün değildir.
20
8.2
Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR)
PCR, son derece küçük DNA miktarlarını tespit edebilen çok hassas bir yöntemdir. Reaksiyon
kontaminasyonunu önlemek için özel önlemlere uyulmalıdır (bkz. Bölüm 7). HotStarTaq® Polimeraz
ve Ursail-N-Glikosilaz gerekir ancak PapilloCheck® high-risk test kiti ile birlikte verilmez ve ayrı
olarak satın alınmalıdır (bkz. Bölüm 2).
!
PapilloCheck® high-risk test kiti Qiagen tarafından üretilen HotStarTaq® Polimeraz ve Fermentas tarafından
üretilen Urasil-N-Glikosilaz kullanılarak (Bölüm 2'de yer alan sipariş verme bilgilerine bakınız) valide
edilmiştir. Belirlenen performansı elde etmek için bu enzimlerin kullanılması zorunludur.
8.2.1
Termal döngüleyici kurulumu
PapilloCheck® high-risk test kiti aşağıdaki termal döngüleyicilerle valide edilmiştir:
• GeneAmp® PCR sistem 9700 (Uygulamalı Biyosistemler)
• Veriti™ 96-Kuyucuklu Termal Döngüleyici (Uygulamalı Biyosistemler).
!
Belirlenen performansın elde edilmesi için yukarıda belirtilen termal döngüleyicilerden birinin kullanılması
kesinlikle şarttır.
PapilloCheck® high-risk PCR'nin termal döngüleyici programı Tablo 2'de özetlenmektedir.
Tablo 2: PapilloCheck® high-risk PCR'nin termal döngüleyici programı
Süre
Sıcaklık °C
Döngü sayısı
20 dk.
37 ºC
1
15 dk
95 ºC
1
30 sn.
25 sn.
45 sn.
95 ºC
55 ºC
72 ºC
40
30 sn.
45 sn.
95 ºC
72 ºC
15
Tutun
10 °C
Ayrıca her termal döngüleyici için aşağıdaki işlem parametreleri ayarlanmalıdır. Bu parametrelerin
nasıl ayarlanması gerektiğinin açıklaması için ilgili termal döngüleyicinin Kullanım Kılavuzuna bakınız.
GeneAmp® PCR sistem 9700 (Uygulamalı Biyosistemler)
Reaksiyon hacmini 26 µl'ye, rampa hızını “9600”e ayarlayın ve 103 °C kapak sıcaklığını kullanın.
Veriti™ 96-Kuyucuklu Termal Döngüleyici (Uygulamalı Biyosistemler)
PapilloCheck® high-risk PCR programına girmek için Veriti™ 96-Kuyucuklu Termal Döngüleyicinin
Dönüştürme Yöntemi aracını kullanın ve “9600 Emülasyon Modu”nu seçin. Reaksiyon hacmini 26
µl'ye ve kapak sıcaklığını 103 °C'ye ayarlayın.
21
8.2.2
Urasil-N-Glikosilaz (UNG) uygulaması
PapilloCheck® high-risk PCR MasterMix, PapilloCheck® high-risk PCR sırasında amplifikasyon
ürünlerine dahil edilen dUTP içerir ve PCR ürünlerini UNG ile bozunmaya duyarlı hale getirir. UNG,
PCR ürününü deoksiuridilat kalıntısının dahil edildiği bölgelerde ayırır. Ayrık PCR ürünleri sonraki bir
reaksiyonda amplifiye edilmez. Bu nedenle UNG uygulaması, önceki PCR kontaminasyonlarından
taşınma kontaminasyonunu gidermek için kullanılabilir.
➠➠ PCR kalitesinde suda Urasil-N-Glikosilazı 1:200 seyreltin. Her PapilloCheck® high-risk PCR
reaksiyon kurulumu için yeni bir UNG seyreltmesi kullanın (bkz. Bölüm 8.2.3). Seyreltilmiş UNG'yi
yeniden kullanmayın.
➠➠ 2 saniye süresince vorteks uygulayarak ve sonrasında aşağı bükerek veya yukarı ve aşağı doğru
birçok kez pipetleyerek UNG seyreltmeyi karıştırın.
Urasil-N-Glikosilaz orijinal konsantrasyonu 1 U/µl'dir. Sonuç olarak, seyreltmenin konsantrasyonu
0,005 U/µl'dir.
!
PapilloCheck® high-risk test kiti Fermentas tarafından üretilen Urasil-N-Glikosilaz kullanılarak valide
edilmiştir (bkz. Bölüm 2). Belirlenen performansı elde etmek için bu enzimin kullanılması zorunludur.
➠➠ Bu seyreltmeden 1 µl her bir PapilloCheck® high-risk PCR reaksiyonuna ekleyin (bkz. Bölüm 8.2.3,
Tablo 3).
Bu miktar, PCR taşınma kontaminasyonunu gidermek için yeterlidir. PCR performansı üzerinde
olumsuz bir etkisi olabileceğinden ve PapilloCheck® high-risk hassasiyetinin azalması ile
sonuçlanabileceğinden daha yüksek konsantre edilmiş UNG solüsyonu kullanmayın.
Genel olarak UNG uygulaması için PCR reaksiyon karışımı 37 °C'de 20 dakika süreyle inkübe
edilir. Daha sonra, UNG 95 °C'de 15 dakika süreyle ek inkübasyon adımı ile etkisizleştirilir. Bu iki
adım PapilloCheck® high-risk PCR'ye zaten dahil edilmiştir ve termal döngüleyici programının ilk
iki adımına karşılık gelir (bkz. Tablo 2). İkinci adımda (95 °C'de 15 dakika) Urasil-N-Glikosilaz'ın
etkisizleştirilmesi ve HotStarTaq® Polimeraz etkinleştirmesi gerçekleşir.
!
PapilloCheck® high-risk PCR'nin dahil edilen UNG sistemi yalnızca önceki PCR reaksiyonlarından PCR
ürünleri ile taşınma kontaminasyonlarını giderir. Numune hazırlama, DNA izolasyonu veya PCR şablon
ekleme sırasında meydana gelenler gibi diğer kontaminasyonlar giderilemez. Bu nedenle Bölüm 7'de
tanımlanan kontaminasyonunun önlenmesi için talimatların ve özel önlemlerin izlenmesi hala gereklidir.
78
PapilloCheck® high-risk ürününü satın aldığınızda ürünle birlikte ABD Patent Numaraları 5,035,996; 5,683,896;
5,945,313; 6,287,823 ve 6,518,026 altında sınırlı bir lisans ve ilgili yabancı patentler gelir.
6
Longo, M.C., et al., Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions,
Gene, 93, 125-128, 1990.
5
22
8.2.3
PCR reaksiyon kurulumu
HotStarTaq® Polimeraz ve Urasil-N-Glikosilaz hariç olmak üzere PapilloCheck® high-risk PCR
MasterMix, PCR reaksiyonu gerçekleştirmek için gerekli olan tüm bileşenleri zaten içermektedir
(PCR tamponu, MgCl2, dNTP'ler, primerler, PCR kontrol şablonu).
!
PapilloCheck® high-risk test kiti Qiagen tarafından üretilen HotStarTaq® Polimeraz kullanılarak valide
edilmiştir (bkz. Bölüm 2). Belirlenen performansı elde etmek için bu enzimin kullanılması zorunludur.
Reaksiyon karışımının kurulumu, reaksiyon kontaminasyonunu önlemek için en uygun bir biçimde
PCR ocağı gibi korunan bir ortamda gerçekleştirilir.
➠➠ Reaksiyon karışımını (PapilloCheck® high-risk PCR MasterMix, HotStarTaq® Polimeraz ve
Urasil-N-Glikosilaz'dan oluşur) Tablo 3'te belirtildiği gibi gerekli PCR miktarı için hazırlayın.
Çoklu numuneleri analizi etmek için reaksiyon karışımı bir seri halinde hazırlanmalıdır (tüm analizler
için gerekli olan miktarda). Pipetleme sırasında hacim varyasyonlarını düzenlemek için reaksiyonların
sayısının her çip için (n) 1 arttırılması (=n+1) önerilir, örn: 12 numunenin test edilmesi gerekiyorsa 13
amplifikasyon reaksiyonu için bir reaksiyon karşımı hazırlayın (bkz. Tablo 3). Bir çipin reaksiyonları
için her zaman bir MasterMix flakonu kullanın.
!
PapilloCheck® high-risk PCR MasterMix'in her serisi için bir negatif kontrolün dahil edilmesi önerilir. Negatif
kontrol olarak uygun DNA izolasyon kitinin DNA elüsyon tamponu veya PCR kalitesinde su kullanılabilir.
➠➠ 2 saniye süresince vorteks uygulayarak ve sonrasında aşağı bükerek veya yukarı ve aşağı doğru
birçok kez pipetleyerek reaksiyon karışımını iyice karıştırın.
➠➠ Her bir PCR reaksiyonu için reaksiyon karışımının 21 µl'sini pipetleyerek 0,2 ml'lik, ince duvarlı
PCR reaksiyon tüpüne alikuotlara bölün.
Şablon DNA'yı reaksiyon karışımının kurulumundan ayrı bir çalışma alanına ekleyin (bkz. Bölüm 7.2).
➠➠ Her bir PCR reaksiyonuna 5 µl DNA ekstraktı ekleyin ve 2 saniye süreyle vorteks uygulayarak ve
sonrasında aşağı bükerek veya birçok kez yukarı ve aşağı doğru pipetleyerek karıştırın. Bir PCR
reaksiyonunun toplam hacmi 26 µl'dir.
➠➠ Reaksiyon tüplerini termal döngüleyiciye yerleştirin ve Bölüm 8.2.1'de tanımlanan termal
döngüleyiciyi kullanarak PCR reaksiyonunu başlatın (Tablo 2).
!
PCR tamamlandıktan sonra amplifikasyon ürünleri hibridizasyon için hemen kullanılmalı veya bir hafta
süreyle -20 °C'de saklanmalıdır.
23
Tablo 3: PapilloCheck® high-risk PCR reaksiyonunun kurulumu
1 reaksiyon
13 reaksiyon
(1 çip)
26 reaksiyon
(2 çip)
39 reaksiyon
(3 çip)
52 reaksiyon
(4 çip)
PCR MasterMix
19,8 µl
257,4 µl
514,8 µl
772,2 µl
1029,6 µl
HotStarTaq® Polimeraz
(5 U/µl)
0,2 µl
2,6 µl
5,2 µl
7,8 µl
10,4 µl
Urasil-N-Glikosilaz
(1:200 seyreltme,
0,005 U/µl)
1 µl
13µl
26 µl
39 µl
52 µl
Numune DNA eklenmeden
önce
toplam hacim
21 µl
273 µl
546 µl
819 µl
1092 µl
Rahim boynu
numunesinden DNA
ekstraktı (DNA şablonu)
5 µl
Reaksiyon başına toplam
hacim
26 µl
24
8.3
Hibridizasyon ve yıkama
8.3.1
Hazırlama ve kurulum
Hibridizasyon oda sıcaklığında gerçekleştirilmelidir (20-25 °C). Hibridizasyon ve yıkama adımlarının
gerekli hazırlıklarına hibridizasyon prosedürünü başlatmadan en az 30 dakika önce başlayın.
➠➠ Hibridizasyon ve yıkama tamponlarında potansiyel çökeltileri çözmek için bunları 30 dakika
süreyle oda sıcaklığına (20-25 °C) maruz bırakın ve kullanım öncesinde iyice karıştırın.
PapilloCheck® high-risk test kitinin 4-8 °C'de saklanması Hibridizasyon Tamponunda ve Tampon
B'de SDS çökeltisi ile sonuçlanabilir. Solüsyonların oda sıcaklığına dengelenmesini bekleyin ve
daha sonra tüpe vorteks uygulayın veya çökeltiler çözülene kadar şişeyi karıştırın.
➠➠ oCheck® Hibridizasyon Odasını Hazırlayın: Hibridizasyon Odasına yeni bir nemli kağıt havlu
yerleştirin ve neme doygun bir ortam oluşturmak için kapağı kapatın.
Çip üzerindeki kullanılmış hibridizasyon karışımının küçük hacminin buharlaşmasını önlemek için
hibridizasyonun neme doygun bir ortamda gerçekleştirilmesi gerekir. Greiner Bio-One tarafından
PapilloCheck® high-risk analizi için özel bir Hibridizasyon Odası sunulmaktadır (bkz. Bölüm 2).
➠➠ Gereken miktarda PapilloCheck® high-risk çiplerini hazırlanan Hibridizasyon Odasında en az 10
dakika süreyle oda sıcaklığında (20-25 °C) inkübe edin.
!
Hibridizasyon Odasının manyetik slide tutucusu iki ucun yalnızca birinde bir mıknatıs içerir. Dörtten az
PapilloCheck® high-risk çipinin paralel olarak hibridize edilmesinin gerekmesi durumunda slide tutucuyu
mıknatısın karşı tarafından PapilloCheck® high-risk çipleri ile doldurmaya dikkat edin. Aksi takdirde
PapilloCheck® high-risk çipleri yıkama prosedürü sırasında sıvı ile kaplanmaz.
➠➠ Yıkama solüsyonları I, II ve III'ü aşağıdaki talimatlara uygun olarak hazırlayın.
Yıkama solüsyonları I, II ve III'ün hazırlanması:
➠➠ Yıkama solüsyonu karışımını Tablo 4'te gösterildiği gibi analiz edilmekte olan PapilloCheck®
high-risk çipleri sayısı için uygun olan yıkama solüsyonları I, II ve III için hazırlayın.
➠➠ Yıkama solüsyonu karışımının üç eşit hacmini üç ayrı oCheck® Yıkama Teknelerine alikuotlar
halinde bölün ve yıkama solüsyonu I, II ve III olarak etiketleyin. Her bir oCheck® Yıkama Teknesi,
4 çipe kadar gerekli olan yıkama solüsyonunun doğru miktarını gösteren yerleşik bir terazi
içermektedir. Tampon miktarını kontrol etmek için lütfen bu teraziyi kullanın.
➠➠ Yıkama solüsyonu II'yi kullanmadan önce sıcaklık kontrollü bir su banyosunda en az 20 dakika
süreyle 50 °C'ye önceden ısıtın. Su banyosunun dolum seviyesinin yıkama solüsyonu II'nin
dolum seviyesine eşit olmasını sağlayın.
25
Tablo 4: Yıkama solüsyonu karışımının hazırlanması
Bu tabloda özetlenen hacimler belirtilen sayıdaki PapilloCheck® high-risk çipleri için üç yıkama adımı (yıkama çözücüleri
I, II ve III) için de yeterlidir.
PapilloCheck® high-risk çiplerinin sayısı
Bileşenler
1
2
3
4
Distile veya deiyonize su
140 ml
280 ml
420 ml
560 ml
Tampon A
14 ml
28 ml
42 ml
56 ml
Tampon B
1,75 ml
3,5 ml
5,25 ml
7 ml
155,75 ml
311,50 ml
467,25 ml
623 ml
Toplam hacim
!
Muhtemelen PapilloCheck® high-risk sonuçlarına engel olacak yıkanmış PCR ürünlerinin birikmesine yol
açacağından yıkama solüsyonlarını kesinlikle yeniden kullanmayın. Her miktar tayini için yeni yıkama
solüsyonu kullanın.
Hazırlanan yıkama solüsyonu karışımı oda sıcaklığında bir hafta süreyle saklanabilir. SDS çökeltisi meydana
gelip gelmediğini kontrol edin. Çökelti meydana gelmişse, çökelti çözülene kadar yıkama solüsyonu karışımını
ısıtın ve tekrar oda sıcaklığına dengeleyin. Daha sonra bir sonraki hibridizasyon deneyi için hazırlanın.
26
8.3.2
Hibridizasyon
Hibridizasyon oda sıcaklığında gerçekleştirilmelidir (20-25 °C). PapilloCheck® high-risk PCR
reaksiyonunun PCR ürünlerini PapilloCheck® high-risk çipine hibridize etmeye yönelik başlıca
çalışma adımları Şekil 5'te gösterilmektedir.
➠➠ PCR ürünlerini kullanmadan önce karıştırın. Kısa süreliğine aşağı doğru bükün.
PCR ürünleri hibridizasyona kadar -20 °C'de saklanmışsa PCR ürünlerini karıştırmadan önce çözün
ve daha sonra belirtilen şekilde ilerleyin.
➠➠ Hibridizasyon Tamponuna kullanmadan önce vorteks uygulayın. Kısa süreliğine aşağı doğru
bükün.
➠➠ 30 µl PapilloCheck® high-risk Hibridizasyon Tamponunu 8x PCR şeridin yeni reaksiyon tüpünde
5 µl PCR ürünü ile vorteks uygulayarak veya birkaç kez yukarı ve aşağı doğru pipetleyerek
karıştırın.
➠➠ Kısa süreliğine aşağı doğru bükün.
➠➠ 25 µl hibridizasyon karışımını, çok kanallı bir pipetin altı kanalını kullanarak her bir çip kuyucuğuna
aktarın. Hava kabarcığı oluşmasını önleyin!
8 kanallı multipipet ve 8x PCR şeridi kullanılarak altı numunenin paralel bir şekilde işlenmesi önerilir
(bkz. Şekil 5). Bu kullanım etkinliğini, hızını arttırır ve böylece buharlaşma riskini azaltır. Bir seferde
birden fazla slaytın işlenmesi gerekiyorsa multipipet kullanımı, doğru hibridizasyon süresinin elde
edilmesi için zorunludur.
Mümkün olursa bir çipin 12 kuyucuğunu hibridize edin. 12'den daha az numunenin işlenmesi
durumunda kullanılmamış kuyucukları boş bırakın. İşlenmiş bir çipte kullanılmamış kuyucuklar
gelecek numuneler için kullanılamaz.
!
Hibridizasyon karışımının dökülmesini önlemek için çipi dikkatli bir şekilde kullanın. Dökülme numunelerin
çapraz kontaminasyonuna ve hatalı pozitif sonuçlara neden olabilir.
Çipi, karanlık, neme doygun bir ortamda, hazırlanmış bir Hibridizasyon Odası içinde oda sıcaklığında
(20-25 °C) tam olarak 15 dakika süreyle inkübe edin. Hibridizasyon sırasında Hibridizasyon Odasını
hareket ettirmemeye dikkat edin.
!
İnkübasyon zamanını veya hibridizasyon reaksiyonunun sıcaklığını kesinlikle değiştirmeyin, bu floresan
sinyal yoğunluğunun kaybolmasına veya spesifik olmayan floresanda artışa neden olabilir.
Hibridize edilen çipleri doğrudan güneş ışığına maruz bırakmayın.
27
➠➠
➠➠
Hibridizasyon Odasında neme doygun bir
ortam hazırlayın.
Gereken miktarda PapilloCheck® high-risk
çiplerini hazırlanan Hibridizasyon Odasında
oda sıcaklığında (20-25 °C) inkübe edin
(bkz. Bölüm 8.3.1).
➠➠
30 µl PapilloCheck® high-risk Hibridizasyon
Tamponunu PCR şeridin 0.2 ml reaksiyon
tüpünde 5 µl PCR ürünü ile inkübe edin. İyice
karıştırın.
➠➠
25 µl hibridizasyon karışımını PapilloCheck®
high-risk çipinin her bir kuyucuğuna çok
kanallı bir pipet kullanarak aktarın
➠➠
Hibridizasyon Odasını kapatın ve PapilloCheck®
high-risk çipini tam olarak 15 dakika süreyle oda
sıcaklığında inkübe edin (20-25 °C).
Şekil 5: Hibridizasyon prosedürünün çalışma adımları
28
8.3.3
Yıkama ve kurutma
Greiner Bio-One tarafından tedarik edilen özel ekipman dört PapilloCheck® high-risk çipinin paralel
yıkanmasını sağlar (bkz. Bölüm 2). PapilloCheck® high-risk çiplerinin işlenmesi için gerekli olan ek
ekipmanlar üç adet oCheck® Yıkama Teknesi ve Hibridizasyon Odasının manyetik slide tutucusu
kolundan oluşmaktadır.
Farklı çalışma adımları Şekil 6'da gösterilmektedir.
➠➠ Hibridize edilen slaytları içeren manyetik slide tutucuyu Hibridizasyon Odasından dikkatli bir
şekilde çıkarın.
➠➠ Slide'ları içeren slide tutucuyu doğrudan yıkama solüsyonu I'i içeren oCheck® Yıkama Teknesine
bırakın. Manyetik tarafın ön tarafa baktığından emin olun.
➠➠ oCheck® Kolunu slide tutucusuna takın ve üç yıkama adımının ilkine başlayın.
➠➠ Çipi oda sıcaklığında (20-25 °C) yıkama solüsyonu I içinde 10 saniye süreyle hızlı bir şekilde
yukarı ve aşağı hareket ettirerek yıkayın. Diziler daima yıkama solüsyonu ile kaplı bir şekilde
kalmalıdır.
➠➠ Çipi yıkama solüsyonu II içinde 60 saniye süreyle 50 °C'de slide tutucuyu yukarı kuvvetlice
hareket ettirerek yıkayın.
➠➠ Çipi oda sıcaklığında (20-25 °C) yıkama solüsyonu III içinde 10 saniye süreyle hızlı bir
şekilde yukarı ve aşağı hareket ettirerek yıkayın.
➠➠ Santrifüj ile, çip yüzeyinden tüm sıvıları hemen giderin. Mikrodiziler için özel bir mikrosantrifüj
kullanılırsa 1 dakika süreyle santrifüj edin. 50 ml'lik tüpler için geçerli olan bir santrifüjün
kullanılması durumunda her yıkanan PapilloCheck® high-risk çipini 50 ml'lik bir tüpe yerleştirin
ve oda sıcaklığında 3 dakika süreyle 500 g'de santrifüj edin.
PapilloCheck® high-risk çipi artık tarama için hazırdır ve hemen taranmalıdır. oCheck® Yıkama
Teknelerinin temizlenmesi için tamamlanan her yıkama ve kurutma işleminden sonra birkaç durulayın.
29
Birinci yıkama adımı
➠➠
➠➠
➠➠
➠➠
Manyetik slide tutucuyu Hibridizasyon
Odasından dikkatli bir şekilde çıkartın.
Slide tutucuyu oCheck® Yıkama Teknesine
yıkama solüsyonu I ile hızlı bir şekilde bırakın
oCheck® Kolunu takın
PapilloCheck® high-risk çipini (çiplerini) yıkama
solüsyonu I'de oda sıcaklığındaslide tutucuyu
yukarı ve aşağı hareket ettirerek 10 saniye
süresince yıkayın
İkinci yıkama adımı
➠➠
PapilloCheck® high-risk çipini (çiplerini)
yıkama solüsyonu II'de bir su banyosunda
50 °Csıcaklıkta slide tutucuyu yukarı ve
aşağı hareket ettirerek 60 saniye süresince
yıkayın
Üçüncü yıkama adımı
➠➠
PapilloCheck® high-risk çipini (çiplerini)
yıkama solüsyonu III'te oda sıcaklığında slide
tutucuyu yukarı ve aşağı hareket ettirerek
10 saniye süresince yıkayın
veya
Kurutma
➠➠
PapilloCheck® high-risk çiplerinin yüzeyindeki
tüm sıvıları santrifüj ile hemen giderin
3 dakika
500 g
1 tabi tutun
maks. hız
Şekil 6: Yıkama prosedürünün çalışma adımları
PapilloCheck® high-risk çipinin CheckScannerTM ve the CheckReportTM Yazılımı ile analizinden önce farklı yıkama
prosedürleri ve kurutma prosedürü.
30
8.4
PapilloCheck® high-risk çipinin taraması ve değerlendirmesi
PapilloCheck® high-risk çipini (çiplerini) CheckScannerTM'e yerleştirin ve CheckReportTMYazılımının
Kullanıcı Kılavuzunda tanımlandığı gibi taramaya devam edin.
CheckScannerTM ve CheckReportTMYazılımının kurulumu ile ilgili daha ayrıntılı bilgi ve bilgisayar
sistem gereksinimleri için lütfen CheckScannerTM ve CheckReportTMYazılımının Kullanım Kılavuzuna
başvurun.
CheckReportTMYazılımını kullanarak verileri analiz ederken bilgisayarınızda kurulu olan
CheckReportTMYazılımı versiyonunun, halihazırda kullanılan PapilloCheck® high-risk kitinde belirtilen
versiyonla eşleştiğinden emin olun. Versiyonlar eşleşmiyorsa CheckReportTMYazılımını güncelleyin.
Son Yazılımın versiyonu Greiner Bio-One internet sitesinden indirilebilir:
www.gbo.com/bioscience/biochips_download
31
9. sorUN giDerMe
Çip taraması sırasında aşağıdaki hata mesajlarından birinin oluşması veya PapilloCheck® high-risk
analizinin spesifik çip üstü kontrollerine bağlı olarak başarısız olması durumunda aşağıda belirtildiği
şekilde ilerleyin. PapilloCheck® high-risk ürününü kullanırken herhangi bir sorunuz olması veya
herhangi bir güçlükle karşılaşmanız durumunda lütfen yerel Greiner Bio-One distribütörünüz ile
hr-HPV DNA-Chip
iletişime geçin.
sorUN ve sebebi
Açıklamalar ve öneriler
hATA MesAJI,,BArkoD okUNAMADI“
hasarlı barkod
Barkodu hasar açısından kontrol edin. Uygun pencere görüldüğünde
barkodu manüel olarak girin.
Çip doğru bir şekilde yüklenmedi
Çip oryantasyonunu kontrol edin ve çipi doğru oryantasyonda tarayın.
4°
8°
IVD
hATA MesAJI „eksik NokTALAr“, BAskI
koNTroLÜ BAŞArIsIZ oLDU VeYA
orYANTAsYoN koNTroLÜ BAŞArIsIZ
oLDU
Çip üzerinde toz
PCR ürününün (ürünlerinin) hibridizasyonunu başka bir çip üzerinde tekrar edin.
Çip üzerine sıvı transferi sırasında hava
kabarcıkları oluşumu
PCR ürününün (ürünlerinin) hibridizasyonunu başka bir çip üzerinde tekrar edin.
Hava kabarcığı oluşumunu engellemek için dikkatli bir şekilde pipetleyin.
hiBriDiZAsYoN koNTroLÜ BAŞArIsIZ
oLDU
hatalı yıkama solüsyonu II sıcaklığı
ikinci yıkama adımı 50 °C'de gerçekleştirilmelidir. Yıkama solüsyonu
II'nin 50 °C'ye ısıtılmasını sağlayın.
hatalı su banyosu sıcaklığı
ikinci yıkama adımı 50 °C'de gerçekleştirilmelidir. Su banyosunun
sıcaklığını kontrol edin. Su banyosunun 50 °C sıcaklığa ayarlanmasını
sağlayın. Gerekirse, bir termometre kullanarak sıcaklığı onaylayın.
hibridizasyon karışımının hatalı
hazırlanması
Hibridizasyon karışımının hazırlanmasını tekrar edin ve PCR ürünlerini
başka çip üzerinde hibridize edin.
Xn
reF 505 060
Tel: +49 (0) 7022 948-0 • Faks +49 (0) 7022 948-514
revizyon: BQ-065-01
Ağustos 2011
32
sorUN ve sebebi
Açıklamalar ve öneriler
4°
8°
IVD
PCr koNTroLÜ BAŞArIsIZ
hotstarTaq® DNA Polimerazı
MasterMix'e eklenmedi
PapilloCheck® high-risk analizini, PCR reaksiyonunun hazırlanması ile
başlayarak tekrar edin.
Uygun işlemeyen hotstarTaq® DNA
Polimerazının MasterMix'e eklenmesi
seyreltilmemiş Urasil-N-glikosilaz'ın
MasterMix'e eklenmesi
reaksiyon karışımının yetersiz
karışımı
PapilloCheck® high-risk analizini, PCR reaksiyonu ile başlayarak tekrar
edin. Reaksiyon karışımını iyice karıştırmaya dikkat edin.
PCr inhibitörleri numune mevcuttur
DNA izolasyonunu ve PapilloCheck® high-risk analizini tekrar edin.
hibridizasyon, PCr ürünü
eklenmeden gerçekleştirilmiştir
Hibridizasyonu tekrar edin.
hibridizasyon karışımının yetersiz
karışımı
Hibridizasyonu tekrar edin.
Termal döngüleyicide sorunlar
Termal döngüleyicinin performansını ve termal döngüleyicinin doğru
programlanıp programlanmadığını kontrol edin (PCR adımları, ısı
rampası, hacim).
Dikkat: Termal döngüleyici GeneAmp® PCR Sistemi 9700 (Uygulamalı
Biyosistemler) veya Veriti™ 96-Kuyucuklu Termal Döngüleyiciyi
hr-HPV DNA-Chip
(Uygulamalı Biyosistemler) PapilloCheck® high-risk ile kullanın.
NUMUNe koNTroLÜ BAŞArIsIZ oLDU
Numune DNA'sı PCr reaksiyonuna
eklenmedi
®
PapilloCheck® high-risk analizini PCR reaksiyonu ile başlayarak tekrar
edin.
DNA hazırlama başarısız oldu
DNA izolasyonunu tekrar edin.
Yeterli numune materyali yok
Başarısız numune toplama. Örnek çok açık. Örneği Bölüm 9.1'deki
açıklamaya uygun olarak konsantre edin ve DNA izolasyonunu veya
numune toplamayı tekrar edin.
PCr Ve/VeYA NUMUNe koNTroLLeri
BAŞArIsIZ oLMADI ANCAk 0 sNr
DeĞeri gÖrÜNTÜLeNiYor
Bu sonuç, CheckReportTMYazılımının numunede tanımlanmış eşiğin
üzerinde sinyali olan en az bir HPV türünü tespit etmesi durumunda
geçerli olarak değerlendirilir. Numune ve/veya PCR kontrolü, PCR
sırasındaki rekabet nedeniyle daha sonra floresan sinyallerinin düşük
olduğunu veya olmadığını gösterebilir.
10. TekNik YArDIM
Xn
reF 505 060
Greiner Bio-One, moleküler biyoloji ve oCheck® ürünlerinde kapsamlı uygulama ve teori deneyimi
Yalnızca
laboratuar
personeli
tarafından
edinmiş
uzman profesyonel
bilim adamlarından
oluşan
bir Teknik
Servis Departmanına sahiptir.revizyon:
oCheck® BQ-065-01
in-vitro
tanılarda
kullanılması
ürünleriyle
ilgili
herhangi
bir sorunuziçindir
veya sorununuz olduğunda, lütfen yerel Greiner Ağustos
Bio-One 2011
distribütörünüze başvurmaktan çekinmeyin.
Tel: +49 (0) 7022 948-0 • Faks +49 (0) 7022 948-514
33
11. PAPilloCheCk® hIgh-rIsk PerForMANs ÖZeLLikLeri
PapilloCheck® high-risk (Cat. No. 505 060) 14 yüksek riskli HPV türünün genotiplenmesinde kullanılan
mikrodizi tabanlı bir tanı kitidir. Greiner Bio-One PapilloCheck® (Cat. No. 465 060) tarafından
kullanılan aynı teknoloji ve kilit bileşenlerden faydalanır ve PapilloCheck® high-risk tarafından tespit
edilebilen 14 yüksek riskli HPV tipi de dahil olmak üzere 24 HPV tipinin genotiplemesinde kullanılan
hr-HPV DNA-Chip
bir tanı kitidir. PapilloCheck® ile karşılaştırıldığında, PapilloCheck® high-risk test kiti, indirgenmiş
düzene sahip bir mikrodizi slide kullanır. PapilloCheck® high-risk çip yüzeyine damlatılan prob seti,
PapilloCheck® prob setinin bir alt setidir.
11.1
PapilloCheck® high-risk'in analitik performansı
11.1.1 Analitik hassasiyet
Belirleme sınırı (lOD) PapilloCheck® high-risk tarafından hedef alınan E1 bölgesini içeren her
tespit edilebilir HPV türü için referans plazmidleri kullanılarak belirlenmiştir. lOD'lar Tablo 8'de
özetlenmektedir.
4°
8°
IVD
Tablo 8: Tespit edilebilir hPV türlerinin belirleme sınırları
hPV genotipi
kopyalar /
reaksiyon
pg/ml**
hPV 16
50*
0.086
hPV 18
300*
0.516
hPV 31
300*
0.522
hPV 33
300*
0.519
hPV 35
750*
hPV 39
30*
0.052
hPV 45
50*
0.087
hPV 51
30*
0.051
hPV 52
100*
0.174
hPV 56
30*
0.052
hPV 58
150*
0.255
hPV 59
50*
0.087
hPV 66
100*
0.171
®
1.29
servikal numunelerde
16, 18, 31,
33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 insan
30*
0.052
Xn
hPV 68
* Her bir HPV referans plazmidinin valide edilen konsantrasyonu 2 bağımsız seyreltme serisinde hazırlanmıştır ve test
505 060 3 tekrarında ölçülmüştür (örn: konsantrasyon başına toplam 6 tekrar). Ayrıca her test 10 ng
edilenreF
konsantrasyonun
insan DNA'sı içermekteydi. Valide edilmiş verilerde bir değişiklik olması durumunda belirli plazmidin konsantrasyonları
arttırılmış
veya azaltılmıştır
ve tekrar
test edilmiştir
(2 bağımsız
seyreltme serisinden 6 tekrar). Tespit
sınırı 6 tekrarın
Yalnızca
profesyonel
laboratuar
personeli
tarafından
revizyon:
BQ-065-01
pozitif olduğu durumda en düşük konsantrasyondu.
kullanılması
** DNA in-vitro
hazırlamatanılarda
dikkate alınmadan
doğrudaniçindir
analiz edilmiştir. Miktar plazmidde bulunan HPV-DNA ile ilgilidir.Ağustos 2011
Tel: +49 (0) 7022 948-0 • Faks +49 (0) 7022 948-514
34
11.1.2 Analitik özgüllük – hPV türleri
listelenen HPV türlerinin referans plazmidleri 2,12 x 106 kopya/PCR reaksiyonu ile test edilmiştir.
HPV 6b, HPV 11, HPV 13, HPV 16, HPV 18, HPV 26, HPV 30, HPV 31, HPV 33, HPV 34, HPV 35,
HPV 39, HPV 40, HPV 42, HPV 43, HPV 44, HPV 45, HPV 51, HPV 52, HPV 53, HPV 54, HPV 55,
r - H P71,
V DN
A - C h73,
ip
HPV 56, HPV 58, HPV 59, HPV 61, HPV 66, HPV 67, HPV 68, HPV 69, HPV 70, hHPV
HPV
HPV 74, HPV 81, HPV 82, HPV 84, HPV 85, HPV 91.
Çapraz hibridizasyon tespit edilmedi
11.1.3 Analitik özgüllük – hPV dışı organizmalar
4°
8°
IVD
Aşağıdaki HPV dışı organizmalar PapilloCheck® high-risk ile test edilmiştir (5-10 ng genomik DNA).
Pozitif sinyal tespit edilmemiştir.
Acinetobacter baumannii, Acinetobacter calcoaceticus, Acinetobacter lwoffii, Actinobacillus actinomycetemcomitans
Serovar c, Actinomyces odontolyticus, Actinomyces viscosus, Bacillus subtilis, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium
breve, Campylobacter concisus, Campylobacter gracilis, Campylobacter rectus, Candida albicans, Capnocytophaga
gingivalis, Capnocytophaga ochracea, Capnocytophaga sputigena, Citrobacter amalonaticus, Citrobacter freundii, Citrobacter
freundii, Citrobacter koseri, Citrobacter koseri, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Eikenella corrodens, Enterobacter
aerogenes, Enterobacter cloacae, Enterobacter sakazakii, Enterococcus durans, Enterococcus faecali, Enterococcus
faecium, Escherichia coli, Eubacterium nodatum , Fusobacterium nucleatum, Gardnerella vaginalis, Hafnia alvei, Kingella
denitrificans, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Lactobacillus casei, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus gasseri,
Lactobacillus iners, Lactobacillus rhamnosus,Lactobacillus vaginalis, Mogibacterium timidum, Morganella morganii,
Mycoplama hominis, Mycoplasma buccale, Mycoplasma faucium, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma genitalium,
Mycoplasma orale, Mycoplasma pirum, Mycoplasma salivrium, Mycoplosma pneumoniae, Neisseria elongata, Neisseria
gonorrhoeae, Peptoniphilus asaccharolyticus, Peptostreptococcus anaerobius, Peptostreptococcus micros, Porphyromonas
gingivalis, Prevotella intermedia, Prevotella nigrescens, Proteus hauseri, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Proteus
vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Serratia
marcescens, Staphylococcus aureus ssp. aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus
®Streptococcus agalactiae, Streptococcus constellatus, Streptococcus criceti,
saprophyticus, Stenotrophomonas maltophilia,
Streptococcus cristatus, Streptococcus gordonii, Streptococcus intermedius, Streptococcus mitis, Streptococcus mutans,
Streptococcus oralis, Streptococcus parasanguinis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus
salivarius, Streptococcus sanguinis, Streptococcus sobrinus, Tannerella forsythensis (önceki: Bacteroides forsythus),
Treponema denticola, Ureaplasma uralyticum, Veillonella parvula.
Xn
reF 505 060
Tel: +49 (0) 7022 948-0 • Faks +49 (0) 7022 948-514
revizyon: BQ-065-01
Ağustos 2011
35
11.2
Tekrarlanabilirlik
Test tekrarlanabilirliğinin değerlendirilmesi için her biri üç farklı HPV referans şablonunun yanı sıra
insan genomik DNA'sı içeren beş numune PapilloCheck® high-risk ile analiz edilmiştir. Numunelerde
bulunan farklı HPV hedeflerinin kopya numaralarının yanı sıra insan DNA arka planı değiştirilmiştir
(bkz. Tablo 9). PapilloCheck® high-risk ile beş bağımsız kopyada her numune analiz edilmiştir.
hr-HPV DNA-Chip
Kopyalar, üç gün içinde aynı teknisyen tarafından test edilmiştir.
4°
8°
IVD
Tablo 9: Numunelerin tekrarlanabilirlik testleri için bileşimi
Numune kimliği
hPV türü
Şablon DNA miktarı
numune 1
HPV 16
HPV 18
HPV 31
insan genomik DNA'sı
180 kopya
1.500 kopya
1.400 kopya
1 ng
3
10
30
numune 2
HPV 16
HPV 18
HPV 31
180 kopya
1.500 kopya
1.400 kopya
5 ng
3
10
30
numune 3
HPV 16
HPV 18
HPV 45
1.800 kopya
450 kopya
300 kopya
5 ng
30
3
10
numune 4
HPV 16
HPV 18
HPV 45
10.000 kopya
5.000 kopya
20.000 kopya
2,5 ng
-
HPV 18
HPV 31
HPV 45
4.500 kopya
500 kopya
90 kopya
2,5 ng
30
10
3
numune 5
x-kat tespit sınırı
Beş numune ve tekrarlanan her analiz için doğru üç HPV türü tespit edilmiştir ve analiz dahil edilmeyen
tür için negatif çıkmıştır. Böylece 75 tek test sonucunun 75'i (5 numune x 5 kopya x kullanılan 4 farklı
HPV şablonu) doğru çıkmıştır.
Xn
reF 505 060
Tel: +49 (0) 7022 948-0 • Faks +49 (0) 7022 948-514
revizyon: BQ-065-01
Ağustos 2011
36
11.3
Yeniden Üretilebilirlik
PapilloCheck® high-risk test kitinin yeniden üretilebilirliği, HPV konsantrasyonları belirleme sınırına
takın 22 klinik numune (bkz. Tablo 10) kullanılarak tespit edilmiştir. Saptama, aynı numune materyali
ile, farklı personel tarafından ve farklı laboratuvarlarda farklı aletler ile aynı yöntem kullanılarak
gerçekleştirilmiştir. Tek veya çift enfeksiyonlarda aynı HPV türleri tespit edilmiş ise veya sırasıyla
hr-HPV DNA-Chip
üç veya dört türünde çoklu enfeksiyon halinde iki veya üç aynı HPV türleri tespit edilmişse
sonuçlar
pozitif numuneler açısından uyumlu olarak değerlendirilmiştir.
4°
8°
IVD
Tablo 10: Yeniden üretilebilirlik testlerinin sonuçları
Numune No.
sonuç Laboratuvar 1
sonuç Laboratuvar 2
Uyum
1
HPV 33
HPV 33
+
2
HPV 35
HPV 35
+
3
negatif
negatif
+
4
HPV 45
HPV 45
+
5
HPV 51, HPV 52
HPV 51, HPV 52
+
6
HPV 51, HPV 56
HPV 51, HPV 56
+
7
HPV 16, HPV 39, HPV 68
HPV 16, HPV 39, HPV 68
+
8
HPV 39, HPV 68
HPV 39, HPV 68
+
9
HPV 16
HPV 16
+
10
negatif
negatif
+
11
HPV 56
HPV 56,
+
12
negatif
negatif
+
13
HPV 18, HPV 56
HPV 18, HPV 56
+
14
HPV 51
HPV 51
+
15
HPV 58
HPV 58, HPV 68
+
16
negatif
negatif
+
17
HPV 16
HPV 16
+
18
HPV 16
HPV 16
+
19
HPV 45
HPV 45
+
21
HPV 58
HPV 58
+
22
HPV31
HPV 31
+
20
HPV
16
+
papillomavirüs
tiplerinin
genotiplemesine
yönelik tanıHPV
kiti16
Xn
reF 505 060
revizyon: BQ-065-01
Tüm klinik
numuneler
için
uyumlu
sonuçlar
elde
edilmiştir.
Çoklu
enfekte
numune
15'te (HPV
68) 2011
Ağustos
laboratuvar 2 tarafından tespit edilen ek tür sinyalleri tanımlanan eşiğin biraz üzerinde olduğundan,
uyumsuz sonuç sorunsuz olarak sınıflandırılmıştır.
Tel: +49 (0) 7022 948-0 • Faks +49 (0) 7022 948-514
37
11.4
Dayanıklılık
PapilloCheck® high-risk test sisteminin dayanıklılığını değerlendirmek için aşağıdaki parametrelerin
sistem değişiklikleri değerlendirilmiştir:
• Hibridizasyon sıcaklığı
hr-HPV DNA-Chip
• Hibridizasyon süresi
• Yıkama sıcaklığı
• Yıkama süresi
Tüm testler yüksek şablon konsantrasyonları ile 3 kez gerçekleştirilmiştir (1 ng HPV referans plazmid
veya numune başına yaklaşık 200 x 106 kopya). Parametre değerlerinin dayanıklı HPV tespitinin
mümkün olduğu aralıkları Tablo 11'de özetlenmiştir.
Tablo 11: PapilloCheck® high-risk Dayanıklılığı
Parametre
Aralık
IVD
hibridizasyon sıcaklığı
hibridizasyon süresi
20-25 ºC'de inkübe
edilmesiyle
13-17 dakikadan
48-52 °C'de inkübe
edilmesiyle
Yıkama sıcaklığı
1. yıkama adımı
10-15 saniye
2. yıkama adımı
60-75 saniye
Yıkama süresi
4°
8°
3. yıkama adımı
10-15 saniye
Xn
reF 505 060
Tel: +49 (0) 7022 948-0 • Faks +49 (0) 7022 948-514
revizyon: BQ-065-01
Ağustos 2011
38
PapilloCheck® high-risk'in klinik Performansı
11.5
Greiner Bio-One PapilloCheck® miktar tayininin klinik hassasiyet ve özgüllük açısından klinik
performansını belirlemek için PapilloCheck® ve GP5+/6+-PCR EIA miktar tayini kullanılarak bir
karşılaştırma çalışması gerçekleştirilmiştir.7 Bu çalışma için normal sitolojili 40 yaş üzeri 1.437
kadından (ortalama yaş, 49 yaş, yaş aralığı 40 ila 60) ve histolojik olarak onaylanmış CIN3+
r-HPV DNA-Chip
lezyonlarına sahip (vaka grubu) 192 kadından (ortalama yaş, 34 yaş; yaş aralığı , 30hila
60) numuneler
analiz edilmiştir. Bu çalışmada kullanılan tüm numuneler POBASCAM popülasyon tabanlı randomize
kontrollü uygulama çalışmasının müdahale grubundaki kadınlardan başlangıç turu sırasında orijinal
olarak toplanmıştır.8
PapilloCheck® analizi GP5+/6+-PCR-EIA ve yeni PapilloCheck® high-risk ile hedeflenen
14 hrHPV türü ile sınırlandıktan sonra, PapilloCheck® %95,8 ≥ CIN3 klinik hassasiyete
(184/192; %95 CI 92,8-98,8) ve %96,7 ≥ CIN2 klinik özgüllüğe (%95 CI 95,7-97,7)
sahip olmuştur. Bu rakamların karşılaştırıldığında sırasıyla % 96,4 (185/192; % 95 CI: 93,9-98,9) ve
% 97,7 (% 95 CI: 96,9-98,5) olduğu görülmüştür, GP5+6+-PCR-EIA için (bkz. Tablo 5 ve 6).
Tablo 5: PapilloCheck® (PapilloCheck® high-risk tarafından hedeflenen 14 hrhPV türü) ve gP5+/6+ PCreIA
sonuçlarının karşılaştırılması kontroller ve vakalar için örneklendirilmiştir.
PapilloCheck®
(14 hr hPV türü)
4°
8°
IVD
kontroller
Vakalar
gP5+/6+-PCr/eIA
-
Toplam
+
-
+
toplam
1.386 (% 96,5)
4 (% 0,3)
1.390 (% 96,7)
18 (% 1,3)
29 (% 2,0)
1.404 (% 97,7)
36 (% 2,3)
47 (% 3,3)
1.437
+
®
toplam
4 (% 2,1)
4 (% 2,1)
8 (% 4,2)
3 (% 1,6)
181 (% 94,3)
7 (%3,6)
185 (% 96,4)
184 (% 95,8)
192
Tablo 6: PapilloCheck® klinik hassasiyeti ve özgüllüğü ve gP5+/6+-PCr-eIA (14 hr hPV türünden birinin veya daha
fazlasının hPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 veya 68 sonuçları).
14 hrhPV
PapilloCheck®
gP5+/6+
≥ CIN3 için klinik
hassasiyet
% 95,8
% 96,4
≥ CIN2 için klinik
Özgüllük
% 96,7
% 97,7
reF 505 060
Xn
7
8
revizyon: BQ-065-01
Ağustos 2011
Comparison of the clinical performance of PapilloCheck® human papillomavirus detection with that of the GP5+/6+PCR-enzyme immunoassay in population-based cervical screening. Hesselink AT, Heideman DA, Berkhof J, Topal F, Pol
RP, Meijer CJ, Snijders PJ. J Clin Microbiol. 2010 Mar;48(3):797-801. Epub 2009 Dec 30.
Bulkmans, N. W., l. Rozendaal, P. J. Snijders, F. J. Voorhorst, A. J. Boeke, G. R. Zandwijken, F. J. van Kemenade, R.
greinerM.
Bio-one
H. Verheijen, K. Groningen,
E. Boon,gmbh
H. J. Keuning, M. van Ballegooijen, A. J. van den Brule, and C. J. Meijer. 2004.
Maybachstr. 2randomized
• 72636 Frickenhausen
Almanya
POBASCAM, a population-based
controlled trial• for
implementation of high-risk HPV testing in cervical
Tel: +49 and
(0) 7022
948-0
+49women.
(0) 7022
screening: design, methods
baseline
data•ofFaks
44,102
Int. 948-514
J. Cancer 110:94–101.
39
12. PapilloCheck® high-risk KISA PROTOKOL
12.1 Oda 2: PCR - Reaksiyon karışımının kurulumu
➠➠
➠➠
PCR kalitesinde suda Urasil-N-Glikosilaz'ı 1:200 oranında seyreltin
➠➠
PCR reaksiyonlarının gereken miktarı için reaksiyon karışımını hazırlayın
PCR
Oda 2
K
I
O
R
T
UNG seyreltmesini dikkatli bir şekilde karıştırın
1
13
reaksiyon reaksiyon
(1 çip)
26
reactions
(2 çip)
39
reactions
(3 çip)
52
reactions
(4 çip)
PapilloCheck®
high-risk
PCR MasterMix
19,8 µl
257,4 µl
514,8 µl
772,2 µl
1029,6 µl
HotStar Taq®
Polimeraz
(5 U/µl)
0,2 µl
2,6 µl
5,2 µl
7,8 µl
10,4 µl
Urasil-NGlikosilaz (1:200
seyreltme,
0,005 U/µl)
1 µl
13µl
26 µl
39 µl
52 µl
Numune DNA
eklenmeden önce
toplam hacim
21 µl
273 µl
546 µl
819 µl
1092 µl
➠➠
Reaksiyon karışımını dikkatli bir şekilde karıştırın
➠➠
Reaksiyon karışımını alikuotlara bölün: her PCR reaksiyonu için 21 µl reaksiyon
karışımı PCR şeridinin 0,2 ml PCR reaksiyon tüpüne ekleyin
P
R
O
T
O
K
O
L
40
PCR
12.2 Oda 2: PCR - DNA şablonu ekleme /
PCR reaksiyonu
Oda 2
➠➠
➠➠
Her PCR reaksiyonu için5 µl DNA şablonunu ekleyin
➠➠
PCR reaksiyonunu hazırlanana termal döngüleyici programı ile başlatın
K
I
O
R
T
İyice karıştırın
Süre
Sıcaklık °C
Döngü sayısı
20 dk.
37 °C
1
15 dk.
95 °C
1
30 sn.
25 sn.
45 sn.
95 °C
55 °C
72 °C
40
30 sn.
45 sn.
95 °C
72 °C
15
Tutun
10 °C
P
R
O
T
O
K
O
L
41
Hibridizasyon ve Yıkama
12.3 Oda 3: Hibridizasyon - Hazırlama /
Hibridizasyon reaksiyonu
!
➠➠
➠➠
Oda 3
Hibridizasyondan en az 30 dakika önce hazırlıklara başlayın.
K
I
O
R
T
Hibridizasyon ve yıkama tamponlarında potansiyel çökeltileri çözün ve iyice karıştırın
Analiz edilecek PapilloCheck® high-risk çipi miktarı için yıkama solüsyonu
hazırlayın.
PapilloCheck® high-risk çiplerinin sayısı
Bileşenler
1
2
3
4
Distile/deiyonize su
140 ml
280 ml
420 ml
560 ml
PapilloCheck® high-risk Tampon A
14 ml
28 ml
42 ml
56 ml
PapilloCheck® high-risk Tampon B
1,75 ml
3,5 ml
5,25 ml
7 ml
155,75 ml
311,50 ml
467,25 ml
623 ml
Toplam hacim
➠➠
➠➠
Yıkama solüsyonu karışımını üç oCheck® Yıkama Teknesine alikuotlara bölün
➠➠
Analiz edilecek PapilloCheck® high-risk çiplerini oda sıcaklığında hazırlanan
Hibridizasyon Odasında inkübe edin
Yıkama solüsyonu II'yi 50 °C'deki su banyosunda önceden ısıtın
➠➠
➠➠
➠➠
PCR ürünlerini karıştırın ve kısa süreliğine aşağı doğru bükün
➠➠
İyice karıştırın ve kısa süreliğine aşağı doğru bükün
➠➠
➠➠
➠➠
P
R
O
T
O
K
O
L
Hibridizasyon Tamponunu karıştırın ve kısa süreliğine aşağı doğru bükün
30 µl PapilloCheck® high-risk Hibridizasyon Tamponunu 5 µl PCR ürünü ile
karıştırın
25 µl hibridizasyon karışımını PapilloCheck® high-risk çipinin her bir kuyucuğuna
çok kanallı bir pipet kullanarak aktarın
Hava kabarcığı oluşmasını önleyin
PapilloCheck® high-risk çipini tam olarak 15 dakika süreyle oda sıcaklığında
inkübe edin (20-25 °C)
42
Hibridizasyon ve Yıkama
12.4 Oda 3: Yıkama ve kurutma /
Tarama ve değerlendirme
➠➠
➠➠
➠➠
➠➠
K
I
O
R
T
Manyetik slide tutucuyu Hibridizasyon Odasından çıkarın
Slide tutucuyu oCheck® Yıkama Teknesine yıkama solüsyonu I ile bırakın
oCheck® Kolunu takın
PapilloCheck® high-risk çipini (çiplerini) yıkama solüsyonu I'de oda sıcaklığında
10 saniye süreliğine yıkayın
➠➠
PapilloCheck® high-risk çipini (çiplerini) önceden ısıtılmış yıkama solüsyonu II'de
su banyosunda 50 °C'de 60 saniye süresince yıkayın
➠➠
PapilloCheck® high-risk çipini (çiplerini) yıkama solüsyonu III'de oda
sıcaklığında 10 saniye süreliğine yıkayın
➠➠
Oda 3
P
R
O
T
O
K
O
L
PapilloCheck® high-risk çip yüzeyindeki tüm sıvıları santrifüj ile giderin
3 dakika veya 1 tabi tutun
500 g
maks. hız
➠➠
➠➠
➠➠
PapilloCheck® high-risk çipini (çiplerini) with the CheckScannerTM ile tarayın
Tarama ve analizi CheckReportTMYazılımı Kullanıcı Kılavuzunda belirtildiği gibi
gerçekleştirin
Rapor oluşturun
43

PapilloCheck - Greiner Bio-One

Transkript

Benzer belgeler

hoşgeldin ya şehri ramazan!

bgx serısı standart

30-32 OME - Birlik Rulman

fiyat listesi - Birlik Rulman

kodu: 3989792 mutasyon tarama kiti (foxl