yayını indir [pdf dosyası]

KIKIRDAK DOKU REJEERASYO SĐSTEMĐ (CaReS®)
KODROSĐT-KOLLAJE MS® BĐYOUYUMLULUK
Cartilage Regeneration System (CaReS®) Chondrocyte-Collagen MS® Biocompatibility
Çiğdem Kalın1, Selin Akpınar1, Sezen Bolat1, Z. Sera Konur1, H.Şebnem Küçük1
E-Posta: [email protected]
1
Ars Arthro Biyoteknoloji A.Ş., Bilkent Cyberplaza B Blok No:702 06800 Bilkent,Ankara,Türkiye
I. GĐRĐŞ
Özetçe: CaReS® hiyalin kıkardağın rejenerasyon
sürecini hızlandıran ve optimize eden patentli 3D
Kollajen Tip I matriksine dayanan yenilikçi bir
transplantasyon teknolojisidir. Bu çalışmada 30 hasta
üzerinde kolajen fenotip ifadelendirme ve biyomalzemekondrosit ilişkisini gözlemlemek amacıyla yapılan SEM
analizleri bulunmaktadır. Kolajen fenotip ifadelendirme
için sırasıyla kondsositlerden RA izolasyonu ve cDA
sentezi yapılır, PCR yöntemiyle uygun primerler
kullanılarak kolajen fenotip tayini için örnekler agaroz
jel elektroforezde yürütülerek tip ifadelendirilmesi
gerçekleştirilir. SEM analizi ise hücrelerin bulundukları
biyomalzeme ile uyumluluğunu göstermek ve yüzeysel
görüntülerini elde etmek amacıyla yapılmıştır.
Sonuçlara bakıldığında 30 hastada da Kolajen Tip II
ekspresyonu gözlenmiştir. Fakat 13 hastada sadece tip II,
17 hastada ise Tip I ve II ekspresyonu birlikte
saptanmıştır. SEM analizleri sonucunda kolajen
matrikse gömülü kondrosit hücrelerinin inkübasyonun
7.gününden itibaren kendi ECM sentezini yaptıkları ve
bulundukları
biyomalzemeye
tutunarak
entegre
oldukları gözlenmiştir.
Anahtar Sözcükler: Kıkırdak doku tamiri, kolajen fenotip,
SEM, matriks biyouyumluluk
Abstract: CaReS® is a transplantation technology based on
patented 3D Collagen type matrix, which quickens and optimises
the regeneration period of hyalin cartilage. In this study, there
exists collagen phenotype expression done on 30 patients and
SEM (Scanning Electron Microscopy) analysis to observe the
biomaterial-chondrocyte compatability. For the collagen
phenotype expression RA isolation and cDA synthesis from
chondrocytes are done, respectively; collagen phenotype
determination is done by using proper primers via PCR method
and the samples are run in agarose gel electrophoresis thus type
expression is achieved. SEM analysis is done to show the
biomaterial – cell biocompatibility and the surface appearance
of the matrix.
When examining the results, Collagen Type II expression is
observed on 30 patients. However, 13 patients exhibit just Type
II expression, 17 patients exhibit both Type I and Type II
expression. At the end of the SEM analysis, it is observed that
the cells embedded in collagen matrix sythesize their own ECM
since the 7th day of cultivation and they attach to the biomaterial
and integrate successfully.
Keywords: Cartilage tissue repair, collagen phenotye, SEM, matrix
biocompatibility
Doku mühendisliği ve rejeneratif tıp canlı hücrelerin
çeşitli yollarla çoğaltılmasını, bunların teşhis, test ya
da tedavi amaçlı uygulamalarda kullanılmasını kapsar.
Bu bilimdalı altında biyomalzemeler, hücreler,
biyomoleküller, mühendislik ve tasarım, tasarım
biyomekaniği ve doku mühendisliğini destekleyici
enformatik
gibi
konular
çalışılmaktadır.
Biyomalzemeler, canlı dokuyla ilişkiye girme
kapasitesi olan doğal ya da yapay malzemelerdir. Bu
maddeler, son yıllarda, tıp cihazları endüstrisine büyük
katkı sağlamıştır. Günümüzde biyomalzemeler
yalnızca anatomik yapıların yerine geçmekle
kalmayıp, aynı zamanda vücuttaki yenilenme yeteneği
olmayan doku ve organların doğal yenilenme
mekanizmasını da uyarırlar.
Kıkırdak hasarı bazen travmatik bazen bir başka
rahatsızlık neticesinde gelişir. Kıkırdak doku
organizmada rejenerasyon kabiliyeti en zayıf
dokulardan biridir. Bunun nedeni; eklem kıkırdağında
travmatik bir lezyon oluştuğunda organizma oluşan
hasarı fibröz kıkırdak dokusu ile onarmasıdır. Eklem
kıkırdak defektlerinde hiyalin kıkırdak yerine fibröz
kıkırdak gelişimi
bölgedeki defektin daha
kronikleşmesine ve ilerleyen dönemlerde artrozisle
sonuçlanmasına neden olmaktadır.
Mevcut tedavi metotlarının sınırlı etkileri nedeniyle
doku mühendisliği teknikleri kullanılarak kıkırdak
dokunun uygun rejenerasyonu için günümüzde in vitro
kondrosit üretimi üzerine çalışmalar ağırlık
kazanmıştır.
Son dekatta kıkırdak yaralanmasının tedavisine yeni
doku
mühendisliği
yöntemlerinin
girdiği
görülmektedir. Otolog kondrosit transplantasyonu
(OKT) yöntemi 1994 yılında ilk kez Brittberg ve
ark.[1] tarafından tanımlamıştır. Burada amaç kişinin
kendisinden alınan kırdak hücrelerinin doku
kültüründe çoğaltılarak yaralanan bölgeye geri
uygulanmasıdır. Peterson ve arkadaşları.[2] 2002
yılında yayınladıkları çalışmalarında OKT yi patella
veya
femoral
kondral
yaralanma
bölgesine
uyguladıklarını bildirmişlerdir. Adı geçen grup,
ortalama 7.4 yıl izledikleri 61 hastanın 50’sinde 2 yılın
sonunda başarılı sonuçlar elde etmişlerdir. Aynı
çalışmada, ikinci artroskopide elektromekanik
indentasyon probuyla muayenede normal kıkırdağın
%90’ına ulaşan mekanik sağlamlık gösterilmiştir. Aynı
grup, oniki biyopsi örneğinden sekizinde hiyalin
kıkırdağın varlığını destekleyen safranin-O ile
boyanma ve sekiz hiyalin kıkırdak biyopsisinden
üçünde ise pozitif tip 2 kollajen immünreaktivitesi
saptamıştır. Browne ve arkadaşları[3] 2005 yılında
yayımladıkları çok merkezli kohort bir OKT
çalışmasında beş yıllık izlemlerinde oldukça olumlu
sonuçlar bildirmişlerdir. Ortalama yaşın 39 ve defekt
boyutunun 4.9 cm2 olarak belirlendiği çalışmada
hastaların % 70’i daha önceden en az bir başarısız
cerrahi girişim geçirdiklerini bildirmiştir. Cincinnati
skorlamasına göre 87 hastada 2.6 puan ortalama
iyileşme saptanmıştır.
Tüm olumlu sonuçlarına karşın tek başına hücre
aktarımının başlıca sorunları (a) aktarılan hücrelelerin
sayısının fazlalığı, (b) cerrahi sonrası yaralanma
bölgesinde hücre sayısında hızla belirgin azalma, (c)
hücrelerin yaralı bölgede homojen olmayan dağılımı
ve (d) arzulanan normal kıkırdağın oluşumunun her
olguda gözlenmemesi gelmektedir. Bu nedenle
günümüzde bireyden alınan kıkırdak hücrelerinin
aktarımının tek başına değil de yapay bir ağ (matriks)
içinde yaralı bölgeye uygulandığı teknikler öne
çıkmaktadır. Bu yöntemle OKT’nin dezavantajları
aşılarak daha az hücre ile bunların yaralı bölgede
homojen dağılımı sağlanarak dengeli kıkırdak onarımı
sağlanabilineceği bildirilmektedir.
Seçilen hücre ve taşıyıcı yapay ağ doku
mühendisliğinde önemlidir. Uygun hücre ile uygun
ağın
birlikte
kullanımı
sistemin
temelini
oluşturmaktadır. Evrensel boyutta ticari olarak bulunan
kıkırdak doku mühendisliği ürünleri incelendiğinde
tümünün otolog hücre kullandığı ancak kullanılan
yapay ağlar arasında farklar olduğu görülür. Yapay
ağlar için uygulandığı doku ile uyumlu, dayanıklı,
kullanılan hücrelerle uyumlu ve üremelerine olanak
sağlayan gözenekli malzemeleri tanımlamak gerekir.
Polimer malzemeler, hücreler ile kaynaşarak mekanik
anlamda dayanıklı yapılar oluşturmaları nedeniyle
yaygın olarak ağ amacıyla kullanılır. Polimerin fibröz
ağ, gözenekli sünger/köpük ve hidrojel gibi çok çeşidi
bulunur. Polikarbolakton, polietilen glikol ve doğal
kollajenler (kollajen ve hyaluronik asit) çalışmalarda
ağ malzemesi olarak sıklıkla tercih edilir[4].
Şekil 1: Kıkırdak Hücre Kültürü ve Đmplantasyon
Bir başka çalışmada ise Gigante ve arkadaşları yer
almış ve çalışmalarında kollajen membrana implante
edilmiş hücrelerin dağılımlarının, uygulanabilirliğinin
ve
fenotip
ekspresyonunun
değerlendirilmesi
amaçlamışlardır.12 hasta üzerinde yapılan bu
çalışmada da MACI yöntemi uygulanmış her
membrandaki kalan bölge kolorimetrik, histokimyasal
ve ultrayapısal analizlerle değerlendirilmiştir. Tüm
örneklerde çok sayıda hücrenin homojen bir şekilde
dağıldığı görülmüştür. Bu hücrelerde farklılaşmış
hyalin kondrositlerini ifade etmektedir. Bu sonuçlara
göre Cherubino ve ark. yaptığı çalışmaya paralel
olarak MACI yöntemi kıkırdak hasarının tamirinde
klinikte
rahatlıkla
kullanılabilecek
faydalar
sağlamaktadır. [5].
CaReS® hiyalin kıkardağın rejenerasyon sürecini
hızlandıran 3D Kollajen Tip I matriksine dayanan
yenilikçi bir transplantasyon teknolojisidir. Patentli rat
kuyruklarından elde edilen 3D-Hücre-Kollajen Tip IMatriks; yüksek derecede kontrol edilebilir hücre
aktivite ve fonksiyonelliği ile Kolajen Tip II sentez
için hemen hemen doğal bir ortam sunar.
II. MATERYALLER ve YÖTEMLER
Kondrosit Đzolasyonu
Hastadan artroskopi yöntemiyle alınan kıkırdak
biyopsisi önce mekanik sindirime tabi tutulur. Sonra
1,25U/mL kollajenaz NB6 (Serva, Heidelberg,
Germany) serum içermeyen DMEM Ham’s F12
(Bioconcept, Allschwil, Switzerland) ile 10x seyreltme
yapılarak (son enzimatik aktivite 0,125U/mL)
parçalanan biyopsi parçaları inkübatörde 37°C,
%5CO2,%95rH koşullarında 20±4 saat inkübe edilir.
Kondrositlerin Biyomalzemeye Entegrasyonu
Elde edilen hücreler, hastanın serumundan hazırlanan
10% otolog medya ile 480xg 10dakika döndürülerek 2
kez yıkanır. Pelette bulunan hücreler öncelikle otolog
olarak hazırlanan jel nötralizasyon solüsyonunda
pH=7,8 [10x DMEM Ham’s F12 (Bioconcept,
Allschwil,Switzerland), Hepes (Sigma,Canada,USA),
%7,5NaHCO3 (Biocencept, Allschwil,Switzerland)]
çözülür ve kolajen matriks(Arthro Kinetics, Krems,
Austria) ile birleştirilerek 20dk 37°C’de beklenerek
jelleşme sağlanır. Jelleşme sağlandıktan sonra 6
kuyucuklu tabakta bulunan kıkırdak transplantların
üstüne 3mL otolog medya eklenir ve 37°C, %5CO2,
%95rH koşullarında kültivasyona bırakılır. Her 3-4
günde bir otolog medya tazelenir.
RA Đzolasyonu
Kültivasyonun 8. ve 10.günleri arası kolajen fenotip
ekspresyonu tayini için örnekleme yapılır. Test
edilecek jel 1.25U/mL kolejenaz solüsyonu
(Serva,Heidelberg,Germany) içerisinde, jel tamamen
çözünene kadar 37°C’de inkübe edilir. Đnkübasyon
sonunda bir miktar hücre ayırılarak hücre sayımı ve
canlılık testi yapılır. Kalan kısım RNA izolasyonu için
santrifuj edilir.
RNA izolasyonu RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden,
Germany) kullanılarak gerçekleştirilir. Santrifuj
edilmiş hücre süspansiyonundan pellet ayrılarak hücre
sayım sonucuna göre belirtilen miktarda RLT tampon
çözeltisine konur.
Hücre Sayısı
< 5 x 106
5 x 106-1 x 107
RLT Tampon Çözeltisi(µL)
350
600
Tablo 1
Pelet homojenize edilir. %70’lik etanol eklenerek
pipetleme yapılarak RNeasy kolonuna yerleştirilir ve
13000rpm’de santrifuj edilir. Supernatan atılarak
RW1 tampon çözeltisi RNeasy kolonuna eklenir ve
13000rpm’de tekrar santrifuj edilir. Santrifuj sonunda
supernatan ve toplama tüpü atılır ve yeni bir RNeasy
kolonu kullanılarak üzerine RPE tampon çözeltisi
eklenerek santrifuj edilir. Supernatan atılarak yeniden
RPE tampon çözeltisi eklenerek RNeasy Silica Jel
Membranın kuruması için santrifuj edilir. Bu işlemden
sonra RNeasy kolonu, supernatanın temas kolona
temas etmemesi sağlanarak toplama tüpünden
dikkatlice ayrılır. RNA izolasyonu için RNeasy kolonu
başka bir toplama tüpüne aktarılarak üzerine RNase
içermeyen su eklenir ve 13000rpm’de santrifuj edilir.
Đşlem sonunda 7µL eluent RNA miktarının
belirlenmesi için ayrılır. RNA solüsyonu ultra saf su
ile seyreltilerek 260nm’de ölçüm yapılır. 260 nm’de
RNA miktarı [µg/mL]= OD değeri x 20 x 40 µg/mL
formülü ile belirlenir.
cDA Sentezi
DNA sentezi için First Strand cDNA Sentez Kiti
(Roche, Basel, Switzerland) kullanılır. 2µL RNA
solüsyonu üzerine 16.4µL PCR water ve 4µL OligodT eklenir. Karışım 5dakika 68°C’de konvansiyanel
PCR cihazında inkübe edilir ve 10dakika 4°C’de
konvansiyanel PCR cihazında soğutulur. PCR
Tüplerinde her örnek için birer birim Master-Mix
hazırlanır:
Bileşen
Miktar (µL)
10 x Reaksiyon Buffer
4
dNTPs
MgCl2 (25mM)
RNase-inhibitör
4
8
2
Revers transkriptaz
1.6
Sıcaklık
Süre(Dk)
Oligo-dT’nin yapışması
25°C
10
Revers Transkripsiyon
42°C
60
Revers Transkriptazın
Đnaktive olması
99°C
5
4°C
Tablo 3
5
Soğuma
Polimeraz Zincir Reaksiyonu
Kolajen Tip I, II ve Betamikroglobulin için aşağıdaki
solüsyon ayrı ayrı hazırlanır.
Bileşen
PCR Master-Mix
PCR Water
Đleri primer (10 µM)
Geri primer (10µM)
Miktar (µL)
25
20
2
2
Tablo 4
94 °C
60 sn
54 °C
30 sn
72 °C
90 sn
Tablo 5
Master mix hazırlandıktan sonra her 49 µL’şer
mastermikse 1’er µL cDNA eklenir. PCR
Thermocycler’da Tablo 5’teki gibi gerçekleştirilir. Bu
basamaklar 34 devir devam eder. Daha sonra 4°C 10
dakika soğuma evresi uygulanır. Örnekler % 1.5’luk
Agaroz jelde yürütülür.
Sonuçlar
β2-Mikroglobulin
300bp’de bantlar
Kolajen Tip I
600bp’de bantlar
Kolajen Tip II
500bp’de bantlar
SEM Analizi
Kültive edilen konrositlerin içinde bulunan kolajen
matriks
3
saat
2,5%
gluteraldehit/PBS
(Sigma,Canada,USA) içinde fiksasyona tabi tutulur.
Daha sonrasında PBS ile 2 kez yıkama yapılarak SEM
örnek hazırlama için 72 saat kurumaya bırakılmıştır.
Kuruma tamamlandıktan sonra SEM mikroskobuna
numuneler yerleştirilmiş ve görüntüleme yapılmıştır.
III. SOUÇLAR
Kolajen Fenotip Đfadelendirme
30 hasta üzerinde yapılan bu çalışmada 13 hastada
sadece Tip II, 17 hastada ise Tip I ve Tip II ifadesi
birlikte gözlenmiştir.
Tablo 2
Aşama
Her RNA-Oligo-dT karışımına 19.6 µL Master-Mix
eklenir ve örneklerin çoğalması Tablo 3’teki gibi
Thermocycler’da gerçekleştirilir.
Jel fotoğrafında da gözlendiği gibi Kol I 600bç, Kol II
500bç ve β2M(β mikroglobulin) 300bç’inde sinyal
vermektedir. Birer örnek teşkil etmesi açısından C07007 kodlu hastada Tip I ve Tip II bantları birlikte
sinyal vermiş, C07-008 numaralı hastada ise sadece
Tip II sentezi gerçekleşmiştir. β2M ifadesi PCR
marker olarak uygulanır ve yapılan PCR işleminin
başarılı olarak yapıldığının kanıtıdır.
SEM Analizi
ECM
kondrosit
Şekil 2: SEM görüntüsü ( Đnkübasyonun 8.günü) – 4000X
Kolajene
gömülü
kondrositler
inkübasyonun
8.gününde alınmış ve gluteraldehit ile fiske edilmiştir
daha sonrasında PBS ile yıkandıktan sonra 72 saat
kurumaya bırakılmıştır.
Kolajen fenotip ifadelendirilmesi dikkate alındığında
tüm uygulamalarda Kolajen Tip II sentezinin olduğu
PCR yöntemiyle saptanmıştır. Tip I Kolajen içerisine
gömülen kondrositlerin protein ekspresyonu, hücre
kültür periyodu boyunca Tip II’ye çevrilmektedir. Bu
anlamda kullanılan Tip I kolajen matriks içerisinde
çoğaltılan kondrositler, kendi karakterlerini koruyarak
Kolajen Tip II sentezi yapmışlar ve kendi ECM’lerini
sentezlemişlerdir. 13 hastada PCR yolu ile sadece
Kolajen Tip II sentezi, 17 hastada ise Kolajen Tip I ve
Tip II’nin birlikte bulunduğu gözlenmiştir. Bu da
kültivasyon süresince tip II sentezinin devam ettiğine
bir kanıt teşkil etmektedir. In vivo ortamda da
kondrositler kolajen matriks içerisinde kolajen Tip II
sentezi yapmaya devam edecek ve kıkırdak tamirinde
görev alacaklardır.
Kolajen fenotip ifadelendirmesine paralel olarak SEM
görüntüleri de elde edildiğinde bulunan sonuçların
birbirini desteklediği gözlenmiştir. Görüntülerden de
anlaşılacağı gibi gerek kondrositlerin kolajen fibril
senteziyle biyomalzemeye entegrasyonu gerekse
birbirlerine tutunumları başarılıdır.
Kolajen fenotip ifadelendirmesi ve SEM analizi
dikkate alındığında kullanılan jel formundaki kolajen
matriks(Collagen MS) ile kondrositlerin birbiriyle
biyouyumlu olduğu saptanmıştır.
TEŞEKKÜR
SEM analizi çalışmalarındaki yardımlarından dolayı
Doç. Dr. Petek Korkusuz’a (Hacettepe Üniversitesi Histoloji ve Embriyoloji) teşekkürü borç biliriz.
KAYAKLAR
Şekil 3: SEM görüntüsü ( Đnkübasyonun 8.günü) – 2000X
SEM görüntülerinden de gözlendiği gibi inkübasyonun
8.gününden itibaren kondrositler kendi ECM’lerini
sentezleyerek hem birbirlerine hem de gömülü
oldukları 3D kolajen matriks fibrillerine başarıyla
tutunmuşlar ve sayısal anlamda artış göstermişlerdir.
IV. TARTIŞMA
Kondrosit transplantasyon yönteminde eklemin yük
taşımayan bölgelerinden cerrahi girişim ile hiyalin
kıkırdak örnekleri alınmakta, laboratuar ortamında
kondrositler matriksten ayrılmakta, in-vitro olarak
çoğaltılmakta ve farklı taşıyıcı ortamlara (matrix)
yerleştirilerek eklem içine enjekte edilmekte ya da
doğrudan lezyonlu bölgeye yerleştirilmektedir. Bu
kondrositlerin içerisinde implante edildikleri matriks
malzemesini tip II kollajene dönüştürmesi veya tip II
kollajeni sentezleyerek kaybolan kıkırdak matriksini
yerine koyması beklenmektedir.
[1] Brittberg M, Lindahl A, Nilsson A,
Ohlsson C,
Isaksson O, Peterson L.Treatment of deep cartilage
defects in the knee with autologous chondrocyte
transplantation. N Engl J Med. 1994 Oct6;
6;331(14):889-95.
[2] Peterson L, Brittberg M, Kiviranta I, Akerlund EL,
Lindahl A. Autologous chondrocyte transplantation.
Biomechanics and long-term durability. Am J Sports
Med. 2002;30:2-12.)
[3] Browne JE, Anderson AF, Arciero R, Mandelbaum B,
Moseley JB Jr, Micheli LJ, Fu F, Erggelet C.
Clinical outcome of autologous chondrocyte
implantation at 5 years in US subjects. Clin Orthop
Relat Res. 2005;436:237-245.
[4] Stock UA; Vacanti JP. Tissue engineering: Current state
and prospects ANNUAL REVIEW OF MEDICINE
2001 52: 443-451
[5] Gigante et.al.,Membrane-seeded autologous
chondrocytes: cell viability and characterization at
surgery , Knee Surgery, Sports Traumatology,
Arthroscopy, 2007, 15:1: 88-92