2012-2 - Veteriner Kontrol Enstitüsü Müdürlükleri

Transkript

I
ISSN 1016-3573
ETLİK VETERİNER KONTROL MERKEZ
ARAŞTIRMA ENSTİTÜSÜ MÜDÜRLÜĞÜ
ANKARA
Test
AB-0048-T
ETLİK VETERİNER
MİKROBİYOLOJİ
DERGİSİ
JOURNAL OF ETLIK VETERINARY MICROBIOLOGY
ANKARA – TURKEY
Cilt/Volume 23 ♦ Sayı/Number 2 ♦ 2012
II
III
Etlik Veteriner Mikrobiyoloji Dergisi
Cilt/Volume 23 ♦ Sayı/Number 2 ♦ 2012
Journal of Etlik Veterinary Microbiology
Yılda iki kez yayımlanır / Published two times per year
ISSN 1016-3573
Sahibi
Etlik Veteriner Kontrol Merkez Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü Adına
Uzm.Vet.Hek. Kadir Kaya
Enstitü Müdürü V.
Editörler Kurulu / Editorial Board
Adres / Address
Etlik Veteriner Kontrol Merkez Araştırma Enstitüsü
Baş Editör / Editor-in Chief
06020 Etlik – Ankara / TÜRKİYE
Uzm.Vet.Hek. Kadir Kaya
Tel : 90 (312) 326 00 90 (10 hat)
Faks : 90 (312) 321 17 55
Editör Yardımcıları / Co-Editors *
Dr. Erhan Akçay
URL : http://www.etlikvet.gov.tr/tr/page.asp?id=54
Uzm.Vet.Hek. Yıldız Ayaz
E-posta : [email protected]
Dr. Asiye Dakman
Dr. Arife Ertürk
Dr. Uğur Küçükayan
Dr. Yavuz Ulusoy
Dr. Armağan Erdem Ütük
Uzm.Vet.Hek. M. Kadri Yavuz
IV
Hakem Listesi/ Reviewers List*
Prof.Dr. Yeşim Sağ Açıkel
Hacettepe Üniversitesi, Kimya Mühendisliği Bölümü
Prof.Dr. Mehmet Akan
Ankara Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Mikrobiyoloji Anabilim Dalı
Prof.Dr. Tarık Haluk Çelik
Ankara Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Gıda Hijyeni ve Teknolojisi Bölümü
Doç.Dr. Alper Çiftçi
Ondokuz Mayıs Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Mikrobiyoloji Anabilim Dalı
Doç.Dr. Muammer Göncüoğlu
Ankara Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Gıda Hijyeni ve Teknolojisi Bölümü
Doç.Dr. Murat Karahan
Cumhuriyet Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Mikrobiyoloji Anabilim Dalı
Prof.Dr. Oktay Keskin
Harran Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Mikrobiyoloji Anabilim Dalı
Doç.Dr. Yahya Kuyucuoğlu
Afyon Kocatepe Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Mikrobiyoloji Anabilim Dalı
Doç.Dr. Gülsüm Öksüztepe
Fırat Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Gıda Hijyeni ve Teknolojisi Bölümü
Doç.Dr. Süheyla Türkyılmaz
Adnan Menderes Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Mikrobiyoloji Anabilim Dalı
Prof.Dr. Uçkun Sait Uçan
Selçuk Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Mikrobiyoloji Anabilim Dalı
Prof.Dr. Hakan Yardımcı
Ankara Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Mikrobiyoloji Anabilim Dalı
Prof.Dr. Murat Yıldırım
Kırıkkale Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Mikrobiyoloji Anabilim Dalı
* İsimler soyada göre alfabetik dizilmiştir ve bu sayıda görev alanlar yazılmıştır.
ULAKBİM Yaşam Bilimleri ve Türkiye Atıf Dizini veritabanları kapsamında bulunan “çift hakemli” bir
dergidir.
Copyright © Etlik Veteriner Mikrobiyoloji Dergisi 2012, Her hakkı saklıdır / All rights reserved
Basım Tarihi / Publishing Date: Aralık / December 2012, Baskı adedi / Circulation: 500
Tasarım ve Baskı / Printing
M
MEDİSAN
Medisan Yayinevi Ltd.Şti.
Çankırı Cad. 45 / 347 Ulus - Ankara, Türkiye
Tel : +90 312 311 24 26 – 311 00 57 [email protected]
V
İçindekiler / Contents
Araştırma Makaleleri / Research Articles Sayfa /Page
Erzurum yöresinde koyunlarda Clostridium perfringens toksin varlığının toksin nötralizasyon, ELISA ve lateks aglütinasyon test yöntemleri ile araştırılması
Investigation of Clostridium perfringens toxins in sheeps in the region of Erzurum by toxin neutralization,
ELISA and lateks agglütination tests
Şenay Seyitoğlu, Seyda Cengiz, Serap Kılıç Altun, Ömer Faruk Küçükkalem, İbrahim Sözdutmaz..........39
Phenotypic characteristics of Listonella anguillarum strains isolated from rainbow trout (Oncorhynchus mykiss, Walbaum) farms in Turkey
Türkiye’de gökkuşağı alabalığı çiftliklerinden izole edilen Listonella anguillarum suşlarının fenotipik özellikleri
Seçil Metin....................................................................................................................................................44
Et ürünlerinin histolojik muayenesi
Histological analysis of meat products
Yıldız Ayaz, Yusuf Ziya Kaplan, Naim Deniz Ayaz, Mihriban H. Aksoy....................................................49
Gökkuşağı alabalık filetolarının marinasyon süresinin ve sıcaklığının merkezi bileşke tasarımı ile
optimizasyonu
Optimization with central compozite design of rainbow trout fillets time of marination and temperature
Özlem Pelin Can, Mehtap Erşan...................................................................................................................57
Köpeklerin idrar örneklerinden Klebsiella pnemoniae identifikasyonu ve antibiyotik duyarlılıkları
The identification and antibiotic susceptibilities of Klebsiella pneumoniae from dog urine samples
Andaç Uzer Gülen, Şükrü Kırkan.................................................................................................................64
Derleme / Review
Staphylococcus aureus’larda metisilin direnci ve enfeksiyonlar
Methicillin resistance in Staphylococcus aureus and infections
Volkan Özavcı, Şükrü Kırkan.......................................................................................................................70
Antibiyotiklere alternatif olarak yumurta sarısı antikorları
Egg yolk antibodies as alternative to antibiotics
Timur Gülhan Banur Boynukara...................................................................................................................77
VI
Yazarlara Bilgi / Instructions for Authors
VII
Etlik Veteriner Mikrobiyoloji Dergisi Yayım Koşulları
1. Dergi, T.C. Gıda, Tarım ve Hayvancılık Bakanlığı, Etlik Veteriner Kontrol Merkez Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü’nün hakemli,
bilimsel yayın organı olup, yılda iki defa yayımlanır. Derginin kısaltılmış adı “Etlik Vet Mikrobiyol Derg” dir.
2. Etlik Veteriner Mikrobiyoloji Dergisi’nde veteriner hekimlik
alanında yapılan, başka bir yerde yayımlanmamış olan orijinal bilimsel araştırmalar, güncel derleme, gözlem, kısa bilimsel çalışmalar ve enstitüden haberler yayımlanır. Derleme şeklindeki yazılar;
orijinal olması, en son yenilikleri içermesi, klasik bilgilerin tekrarı
olmaması durumunda kabul edilir. Derlemeyi hazırlayan yazarın, o
konuda ulusal ya da uluslararası düzeyde orijinal yayın ve araştırmalar yapmış olması koşulu aranır.
3. Türkçe ve İngilizce olarak hazırlanacak metinler 12 punto Times
New Roman yazı karakterinde, düz metin olarak, çift aralıklı ve
kenarlarda 30 mm boşluk bırakılarak, A4 formundaki beyaz kağıda
yazılmalıdır. Yazıların tamamı, şekil ve tablolar dahil olmak üzere
orijinal bilimsel araştırmalarda 16, derlemelerde 10, gözlemlerde 6
ve kısa bilimsel çalışmalarda 4 sayfayı geçmemelidir.
4. Microsoft Word formatındaki metin ile en az 300 dpi çözünürlükteki
JPEG formatındaki resim/lerin tamamı etlikvetmikrobiyolderg@
gmail.com e-posta adresine gönderilmelidir.
5. Türkçe orijinal çalışmalar konu başlığı, yazar/yazarların adları,
adresleri, Türkçe özet ve anahtar sözcükler, İngilizce başlık, İngilizce özet ve anahtar sözcükler, giriş, materyal ve metot, bulgular,
tartışma ve sonuç, teşekkür ve kaynaklar sırası ile hazırlanmalıdır.
İngilizce orijinal çalışmalar konu başlığı, yazar/yazarların adları,
adresleri, İngilizce özet ve anahtar sözcükler, Türkçe başlık, Türkçe özet ve anahtar sözcükler, giriş, materyal ve metot, bulgular,
tartışma ve sonuç, teşekkür ve kaynaklar şeklinde hazırlanmalıdır.
Kısa bilimsel çalışmaların ve derlemelerin başlık ve özet bölümleri
orijinal çalışma formatında, bundan sonraki bölümleri ise, derlemelerde; giriş, metin ve kaynaklar şeklinde, kısa bilimsel çalışmalarda
ise bölümlendirme yapılmadan hazırlanmalıdır.
6. Orijinal çalışmalar ve gözlemler aşağıdaki sıraya göre düzenlenerek yazılmalıdır.
Başlık, kısa, konu hakkında bilgi verici olmalı ve küçük harflerle
yazılmalıdır.
Yazar(lar)ın, ad(lar)ı küçük, soyad(lar)ı büyük harflerle yazılmalı
ve unvan belirtilmemelidir.
Özet, Türkçe ve İngilizce olarak, tek paragraf halinde ve en fazla
500 sözcük olmalıdır.
Anahtar kelimeler, alfabetik sıraya göre yazılmalı ve 5 sözcüğü
geçmemelidir.
Giriş, konu ile ilgili kısa literatür bilgisi içermeli, son paragrafında
çalışmanın amacı vurgulanmalı ve iki sayfayı geçmemelidir.
Materyal ve Metot, ayrıntıya girmeden, anlaşılır biçimde yazılmalıdır. Başlıklar kalın, alt başlıklar italik yazı tipiyle belirtilmelidir.
Bulgular bölümünde veriler, tekrarlama yapmadan açık bir şekilde
belirtilmelidir. Tablo başlıkları tablonun üstünde, şekil başlıkları
ise şeklin altında belirtilmelidir.
Tartışma ve Sonuç bölümünde, araştırmanın sonucunda elde edilen bulgular, diğer araştırıcıların bulguları ile karşılaştırılmalı ve
literatüre olan katkısı kısaca belirtilmelidir.
Teşekkür bölümü, gerekli görülüyorsa kaynaklardan hemen önce
belirtilmelidir.
Kaynaklar bölümünde, kaynaklar listesi alfabetik ve kronolojik
olarak sıralanmalı ve numaralanmalıdır. Metin içerisindeki kaynak,
yazar soyadı yazılıp sıra numarası ile; cümle sonunda ise sadece
sıra numarası ile parantez içerisinde yazılmalıdır. Cümle sonunda
birden çok kaynak belirtilecek ise kaynak numaraları küçükten büyüğe doğru sıralanmalıdır. Metin içerisinde ikiden çok yazarlı kay-
nak kullanımlarında ilk yazarın soyadı yazılmalı diğer yazarlar ise
“ve ark.” (İngilizce metinlerde “et al.”) kısaltması ile belirtilmelidir. Dergi adlarının kısaltılmasında “Periodical Title Abbreviations:
By Abbreviation” son baskısı esas alınmalıdır. Kaynaklar listesinde
yazar(lar)ın aynı yıla ait birden fazla yayını varsa, yayın tarihinin
yanına “a” ve “b” şeklinde belirtilmelidir.
Kaynak yazımı ve sıralaması aşağıdaki gibi yapılmalıdır;
Süreli Yayın:
Dubey JP, Lindsay DS, Anderson ML, Davis SW, Shen SK,
(1992). Induced transplacental transmission of N. caninum in cattle. J Am Vet Med Ass. 201, 709-713.
Yazarlı Kitap:
Fleiss Jl, (1981). Statistical methods for rates and proportions.
Second edition. New York: John Willey and Sons, p.103.
Editörlü Kitap:
Balows A, Hausler WJ, Herramann Kl, eds., (1990). Manual of
Clinical Microbiology. Fifth edition. Washington DC: IRL Press,
p.37.
Editörlü Kitapta Bölüm:
Bahk J, Marth EH, (1990). Listeriosis and Listeria monocytogenes. Cliver DD. eds. Foodborne Disease. Academic press Inc,
San Diego. p.248-256.
Kongre Bildirileri:
Çetindağ M, (1994). Pronoprymna ventricosa, a new digenic
trematoda from the Alosa fallax in Turkey. Eighth International
Congress of Parasitology (ICOPA VIII), October, 10-14, İzmirTurkey.
Tezler:
Aksoy E, (1997). Sığır Vebası hastalığının histolojik ve immunoperoksidaz yöntemle tanısı üzerine çalışmalar. Doktora Tezi, AÜ
Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Ankara.
Anonim:
Anonim, (2009). Contagious equine metritis. Erişim adresi: http://
www.cfsph.iastate.edu/Factsheets/pdf, Erişim tarihi: 17.10.2009.
Peter AT (2009). Abortions in dairy cows. Erişim adresi: http://
www.wcds.afns.ualberta.ca.htm, Erişim tarihi: 14.11.2009.
Yazışma adresi, çok yazarlı çalışmalarda yazışma adresi olarak
yazarlardan sadece birinin adı/soyadı, adresi ve e-posta adresi çalışmanın sonunda belirtilmelidir.
7. Latince cins ve tür isimleri italik yazı tipi ile yazılmalıdır. Tüm
ölçüler SI (Systeme Internationale)’ye göre verilmelidir.
8. Dergide yayımlanmak üzere gönderilen makaleler tüm yazarlar
tarafından imzalanan “Yayın Hakkı Devri Sözleşmesi” ve başvuruya ilişkin bir dilekçe ile birlikte gönderilmelidir. Yayımlanması
uygun görülen çalışmalar, istendiğinde Yayım Komitesi’nin basıma
ilişkin kararı, yazar(lar)ına bildirilir.
9. Etlik Veteriner Mikrobiyoloji Dergisi’nde yayımlanacak olan,
hayvan deneylerine dayalı bilimsel çalışmalarda “Etik Kurul Onayı
Alınmıştır” ifadesi aranır.
10. Gönderilen yazıların basım düzeltmeleri orijinal metne göre yapıldığından, yazıların her türlü sorumluluğu yazarlara aittir.
11. Ürünlerin ticari adları ile karşılaştırılmalarına yönelik araştırmalar derginin ilgi kapsamı dışındadır.
12. Araştırmaya konu olan maddelerin ve ürünlerin ticari adları
kullanılmamalıdır.
13. Şayet varsa araştırmanın desteklendiği kurum adı ve proje numarası belirtilmelidir.
14. Dergiye gönderilen yazılar geliş tarihine göre yayımlanır.
15. Yayımlanmayan yazılar, yazarına iade edilmez.
VIII
Journal of Etlik Veterinary Microbiology Publication Conditions
1. The Journal is a refereed, scientific publication of Republic of
Turkey Ministry of Food, Agriculture and Livestock, Directorate of
Etlik Veterinary Control Central Research Institute and is published
two issues in a year. The abbreviation of the journal is “J Etlik Vet
Microbiol”.
2. In the Journal of Etlik Veterinary Microbiology, original research
articles, actual reviews, case reports, short communications on the
issue of veterinary medicine whose one part or whole have not been
published in any other place before, and news from the institute
are published. The review articles will be accepted only if they are
original, actual and not repeating the classical knowledge. The author of the review is asked to possess original publications or researches on the subject at national or international levels.
3. Manuscripts that will be prepared in Turkish and English should
be typed as a full text, on A4 paper with 12 pt, in Times New Roman typing character, double-spaced and with 30 mm space in both
sides of the paper. Manuscripts including figures and tables should
not exceed 16 pages for original research articles, 10 pages for reviews, 6 pages for case reports and 4 pages for short communications.
4. Manuscript written in Microsoft Word format and figures in
JPEG format at minimum 300 dpi resolution should be submitted
to [email protected]
5. Original research articles and case reports should include in following rank: title, name(s) of the author(s), their addresses, abstract
and key words in English, title, abstract and key words in Turkish,
introduction, material and method, findings, discussion and conclusion, acknowledgements and references. In short communications
and reviews, divisions except summaries should be omitted.
6. Original research articles and case reports should be arranged
and composed as in the following.
Title should be brief, explanatory and written in small caps.
Explanation(s) about the study should be written as footnotes.
Author(s) should be mentioned by their names and surnames; their
surnames should be written in capital letters and author(s) title
should not be mentioned.
Summary should be in Turkish and English, single paragraph and
composed of at most about 500 words.
Key Words should be written in alphabetical order and should not
exceed 5 words.
Introduction not exceeding two pages should include a short review of the literature related with the subject and in the end paragraph; the aim of the study should be mentioned.
Material and Method should be written in an essential and comprehensible manner without getting into details. Subtopics should
be mentioned first in bold and after in italic type.
Findings should be shortly explained and data should not be repeated within the text. Legends should be indicated at the top of
each table, whereas should be indicated at the bottom of each figure
and print. Vertical lines are not allowed in tables.
Discussion and Conclusion must include the evaluation and comparison of results with other researchers’ findings. The study’s
contributions to the existing literature should also be explained
briefly.
Acknowledgements must be indicated before references if necessary.
References should be listed alphabetically and chronologically by
numbers. In the body of text, reference must be shown by author’s
surname and list number or only by list number within parenthesis. If there is more than one reference that refers to the same issue, these should be arranged by smallest to biggest reference list
numbers at the end of sentence. If the reference is more than two
authors, the surname of the first author should be written and other
authors should be mentioned with the abbreviation of “et al.”. For
the abbreviation of journals, the latest edition of the “Periodical
Title Abbreviations: By Abbreviation” should be taken as basis. If
the author(s) have more than one publication within the same year,
besides the publication date, it should be mentioned as “a” and “b”
in the list of references.
The writing of the references and their alignment should be as in
the following examples.
For articles:
Dubey JP, Lindsay DS, Anderson ML, Davis SW, Shen SK,
(1992). Induced transplacental transmission of N. caninum in cattle. J Am Vet Med Ass. 201, 709-713.
For books:
Fleiss Jl, (1981). Statistical methods for rates and proportions.
Second edition. New York: John Willey and Sons, p.103.
For edited books:
Balows A, Hausler WJ, Herramann Kl, eds., (1990). Manual of
Clinical Microbiology. Fifth edition. Washington DC: IRL Press,
p.37.
For chapter in edited books:
Bahk J, Marth EH, (1990). Listeriosis and Listeria monocytogenes. Cliver DD. eds. Foodborne Disease. Academic press Inc,
San Diego. p.248-256.
For congress papers:
Çetindağ M, (1994). Pronoprymna ventricosa, a new digenic
trematoda from the Alosa fallax in Turkey. Eighth International
Congress of Parasitology (ICOPA VIII), October, 10-14, İzmirTurkey.
For dissertations:
Aksoy E, (1997). Sığır Vebası hastalığının histolojik ve İmmunoperoksidaz yöntemle tanısı üzerine çalışmalar. PhD Thesis, Ankara
University Institute of Health Sciences, Ankara.
Corresponding address, in multiple-author studies, as a correspondence address, only one of the authors’ name/surname, address
and e-mail should be mentioned at the end.
7. Genus and species names in Latin should be written in italic. All
measures should be given according to the SI (Systeme Internationale) units.
8. The articles that are sent to be published in the journal should be
sent with a covering letter and “Publication Rights Transfer Agreement” signed by all of the authors. The selected articles for the
publication, and if asked for, the decision of the editorial committee concerning the publication, are declared to the article’s author/
authors.
9. The wording of “Ethical Commission Permission is obtained”
should appear in scientific studies based on animal experiments,
which will be published in the Journal of Etlik Veterinary Microbiology.
10. As the edition of the sent articles are done in accordance with
the original text, all responsibility of the articles bear on the authors.
11. Researches that aim at comparisons of the products with their
commercial names are out of the journal’s theme scope.
12. The trademarks of materials and products that are subject of the
research should not be mentioned.
13. If the research is supported by a foundation, name of the foundation and project number must be mentioned.
14. The articles that are sent to the journal are published in line with
their coming date.
15. Unpublished papers are not returned to their author.
IX
Yayın Hakkı Devri Sözleşmesi
Etlik Veteriner Mikrobiyoloji Dergisi - Ankara
Aşağıda başlığı bulunan ve yazarları belirtilen makalenin tüm sorumluluğu Etlik Veteriner Mikrobiyoloji
Dergisi Yayın Komisyonu Başkanlığı’na ulaşıncaya kadar yazar/larına aittir.
Yayının adı: ......................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................................
Yazar/ların ad/ları: ...........................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................................
Aşağıda isim ve imzaları bulunan yazarlar; yayınlamak üzere gönderdikleri makalenin orijinal olduğunu,
daha önce başka bir dergiye yayınlanmak üzere gönderilmediğini ve kısmen ya da tamamen yayınlanmadığını, gerekli düzeltmelerle birlikte her türlü yayın hakkının, yazının yayımlanmasından sonra Etlik Veteriner Mikrobiyoloji Dergisi’ne devrettiklerini kabul ederler. Yayımlanmak üzere gönderilen bu makalenin
tüm sorumluluğunu da yazar/lar üstlenmektedir.
Yukarıdaki makalenin tüm hakları Etlik Veteriner Mikrobiyoloji Dergisi’ne devredilmiştir.
Yazar ad/ları
İmza
Tarih
..........................................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................................
Yazışma Adresi: ...............................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................................
Copyright Release
Journal of Etlik Veterinary Microbiology Ankara - TURKEY
The undersigned authors release Journal of Etlik Veterinary Microbiology from all responsibility concerning the manuscript entitled;
Title of paper: . .................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................................
Authors names: ................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................................
Upon its submission to the publishing commission of the Journal of Etlik Veterinary Microbiology.
The undersigned author/s warrant that the article is original, is not under consideration by another journal,
has not been previously published or that if has been published in whole or in part, any permission necessary to publish it in the above mentioned journal has been obtained and provided to the Journal of Etlik
Veterinary Microbiology. We sign for and accept responsibility for releasing this material.
Copyright to the above article is hereby transferred to the Journal of Etlik Veterinary Microbiology, effective upon acceptance for publication.
To be signed by all author/s
Authors names
Signature
Date
..........................................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................................
Correspondence Address: ................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................................
X
Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 23,
39-43, ve
2012
Araştırma
39
Seyitoğlu
ark.. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 23, 39-43,
2012Makalesi / Research Article
Erzurum yöresinde koyunlarda Clostridium perfringens toksin varlığının
toksin nötralizasyon, ELISA ve lateks aglütinasyon test yöntemleri ile
araştırılması
Şenay SEYİTOĞLU1, Seyda CENGİZ2, Serap KILIÇ ALTUN1, Ömer Faruk KÜÇÜKKALEM1,
İbrahim SÖZDUTMAZ1
1
Erzurum Veteriner Kontrol Enstitüsü, 2 Atatürk Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji AD, Erzurum
Geliş Tarihi / Received: 21.05.2012, Kabul Tarihi / Accepted: 10.12.2012
Özet: Bu çalışmada, Erzurum yöresinde bulunan enterotoksemi şüpheli 70 adet koyuna ait bağırsak içeriğinin ELISA,
toksin nötralizasyon ve lateks aglütinasyon testi (LAT) ile incelenerek; klostridial toksinlerin araştırılması ve tiplendirilmesi amaçlandı. Toksin testinde 25 (%35,7) örnekte C.perfringens yönünden pozitif sonuç alınırken, 45 (%64,3) adet
örnek negatif olarak değerlendirildi. Bu test sonuçlarına göre, 14 örnek C.perfringens tip C, 2 örnek C.perfringens tip
A, 9 örnek C.perfringens tip D olarak identifiye edildi. İncelenen örneklerin ELISA sonuçları değerlendirildiğinde 70
adet bağırsak içeriğinin 37 (%52,8) adeti C.perfringens yönünden pozitif bulunurken, 33 (%42,7) adet örnek negatif
bulundu. Yapılan ELISA tiplendirilmesinde 12 adet numunede alfa toksin (tip A), 7 adet örnekte alfa, beta, epsilon
toksin (tip B), 9 tanesinde alfa ve beta toksin (tip C) ve 9 adet örnek de alfa ve epsilon toksini (tip D) belirlendi. Lateks
aglütinasyon sonuçlarında ise 2 örnek alfa toksin yönünden pozitif sonuç verirken, 16 örnekte epsilon toksini belirlendi. Sonuç olarak Erzurum ilinde enterotoksemi kontrolünde aşılamaların kontrollü, yaygın bir şekilde yapılmasının ve
uygulanacak aşılarda başta tip A olmak üzere, tip C, tip D ile tip B’nin de bulundurulmasının gerekli olduğu belirlendi.
Anahtar sözcükler: Enterotoksemi, ELISA, lateks aglütinasyon, toksin nötralizasyon.
Investigation of Clostridium perfringens toxins in sheeps in the region of Erzurum by toxin
neutralization, ELISA and lateks agglütination tests
Summary: Investigation and typing of clostridial toxins after ELISA, serum neutralization and latex agglutination
tests (LAT) of intestinal contents from 70 enterotoxemia suspected sheeps in Erzurum region was aimed in this study.
According to toxin neutralization results; 25 (35,7 %) and 45 (64,3 %) of the samples were determined as positive and
negative, respectively. According to typing by toxin neutralization test; 14, 2 and 9 of the samples were typed as C, A and
D, respectively. Thirty-seven (52,8 %) of the samples were positive for C.perfringens in the ELISA results. According
to ELISA typing, 12 of the samples had alpha toxin (Type A), 7 of the samples had alpha, beta and gamma toxins (Type
B), 9 of the samples had alpha and beta toxins (Type C), and 9 of the samples had alpha and epsilon toxins (Type D).
According to latex agglutination test results, 2 of the samples had alpha and 16 of the samples had gamma toxins. As a
result, the control of the province of Erzurum enterotoxemia, vaccination should be controlled and widely. Vaccines to
be applied, especially in type A, type B, C and D must be present.
Key words: Enterotoxemia, ELISA, latex agglutination, toxin neutralization.
Giriş
Clostridium perfringens hareketsiz ve kapsüllü,
gram pozitif, çomak şekilli, spor oluşturan, evcil
hayvanlarda önemli enterik infeksiyonlara neden
olan bir bakteridir. C.perfringens’e bağlı enterotoksemiler C.perfringens’in değişik tipleri tarafından
oluşturulan, koyun, kuzu, buzağı ve diğer hayvanlarda toksemi ile karakterize infeksiyonlardır (1).
C.perfringens’in oluşturduğu toksinler fazla sayıdadır ve etkenin tiplendirilmesinde bu toksinler kulla-
nılır. Toksin tiplendirmesine göre C.perfingens tipleri A, B, C, D ve E olarak ayrılmıştır (1, 5, 11, 13,
15). C.perfringens tipleri değerlendirildiğinde; Tip
A en yaygın C.perfringens tipidir (11). Toksijenik
özellikleri ve patojenitesi oldukça değişkendir.
Yapısındaki alfa toksin, kimyasal olarak fosfolipaz
C yapısındadır. Lesitini fosforilkolin ve digliseride
hidrolize eder. Çoğu hücre membranı lesitin içerdiğinden dolayı alfa toksin yapısı ile yıkımlanır (10,
15).
Yazışma adresi / Correspondance: Seyda Cengiz, Atatürk Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, 25240,
Erzurum, Türkiye Eposta: [email protected]
40
Seyitoğlu ve ark.. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 23, 39-43, 2012
C.perfringens tip B, alfa, beta ve epsilon toksinleri üretir fakat beta toksin çoğunlukla temel
toksindir (12, 15). Hayvanlarda ani ölüm ile karakterize infeksiyonlara neden olan C.perfringens tip
C’de alfa toksin yanında beta toksin üretir. Beta toksin tripsin ve diğer proteolitik enzimler ile kolayca inaktif hale getirilebilir (15, 16). C.perfringens
tip D en iyi bilinen C.perfringens tipidir ve epsilon
toksin üretir. Epsilon toksin sindirim enzimlerine
karşı dirençlidir. Bağırsakta fazla miktarda üretilen
epsilon toksin, sistemik dolaşım ile absorbe olarak
organ ve dokularda kapiller geçirgenlik artışı meydana getirir (21, 23) Tip E’nin temel toksini Iota
toksindir. Toksin proteolitik enzimler ile aktive
olur. Bu toksin nekrotizan etkilidir ve kapillar permeabiliteyi arttırır (5,13,15,18). Daha önce yapılan
çalışmalarda C.perfringens infeksiyonlarının teşhisi ve tiplendirilmesinde toksin nötralizasyon testi,
ELISA, lateks aglütinasyon metotları (LAT), PCR
gibi çeşitli teknikler kullanılmış, hastalığın çıktığı
bölge ve bireysel predizpozisyon gibi faktörlere
bağlı olarak farklı sonuçlar elde edilmiştir.
Bu çalışmada enterotoksemi şüpheli 70 adet
koyuna ait bağırsak içeriğinde C.perfringens ve
klostridial toksin varlığının ELISA, toksin nötralizasyon ve lateks aglütinasyon testi ile araştırılması
ve karakterizasyonu amaçlandı.
lendirmesinde 12 adet numunede alfa toksin (tip A),
7 adet örnekte alfa, beta, epsilon toksin (tip B), 9
örnekte alfa ve beta toksin (tip C) ve 9 örnek de ise
alfa ve epsilon toksini (tip D) belirlendi (Tablo 1).
Toksin nötralizasyon testi sonuçlarına göre;
25 (%35,7) örnekte C.perfringens pozitif bulunurken, 45 (%64,3) adet örnek negatif bulundu. Toksin
nötralizasyon testi tiplendirmesine göre, 14 örnek
C.perfringens tip C, 2 örnek C.perfringens tip A ve
9 örnek de C.perfringens tip D olarak tiplendirildi.
(Tablo 1).
İncelenen örneklerin Lateks aglütinasyon sonuçlarında ise 2 örnek alfa toksin yönünden pozitif
sonuç verirken, 16 örnekte epsilon toksini belirlendi.
Tablo 1. ELISA ve Nötralizasyon test sonuçlarına
göre C.perfringens tipleri
C.perfringens
tipleri
ELISA test
sonuçları (%)
Nötralizasyon test
sonuçları (%)
A
12 (%32,4)
2 (%8)
B
7 (%18,9)
-
C
9 (%24,3)
14 (56)
D
9(%24,3)
9 (36)
Toplam
37 (%100)
25 (%100)
Materyal ve Metot
Tartışma ve Sonuç
Çalışmada, enterotoksemi şüphesiyle Erzurum
Veteriner Kontrol Enstitüsüne (EVKEM) getirilen
70 adet koyuna ait bağırsak örneği kullanıldı.
Enterotoksemiler C.perfringens’in farklı tipleri tarafından oluşturulan, toksemi ile seyreden infeksiyonlardır. C.perfringens’in oluşturduğu toksinlerin
tiplendirilmesi ile C.perfringens tipleri A, B, C, D
ve E olarak ayrılmıştır (1, 5 15). Tip A en yaygın
tip olup, sahip olduğu alfa toksin fosfolipaz C yapısındadır ve hücre membranını yıkımlama özelliği
bulunmaktadır (10, 15). C.perfringens tip B’nin temel toksini beta toksindir (12, 15). C.perfringens tip
C’nin de temel letal toksini beta toksin yapısındadır
(15, 16). C.perfringens tip D sindirim enzimlerine
dirençli olan epsilon toksini üretir. Tip E’nin temel
toksini Iota toksindir. Nekrotizan etkili olan bu toksin kapillar permeabiliteyi arttırır (5,15,18).
Bağırsak örnekleri aseptik koşullar altında alındıktan sonra ELISA için Bio-X Enterotoksemi Elisa
Kit, (Bio K 270), Lateks Aglütinasyon testleri için
Bio-X Diagnostics C.perfringens epsilon toksin
(Bio K176), C.perfringens alfa toksin (Bio K170)
test kitleri kullanıldı. Kit prosedürleri üretici firmanın direktifleri doğrultusunda uygulandı. Toksin
nötralizasyon testi için Koruma ve Kontrol Genel
Müdürlüğü Laboratuvar Metot Birliği tarafından
hazırlanan protokol uygulandı (9).
Bulgular
İncelenen örneklerin ELISA sonuçları değerlendirildiğinde, 70 adet bağırsak içeriğinin 37 (%52,8)
adeti C.perfringens yönünden pozitif bulunurken,
33 (%42,7) adet örnek negatif bulundu. ELISA tip-
C.perfringens pozitifliğinin ve toksin tiplerinin
belirlenmesi amacıyla kullanılan metotlar ile ilgili
çeşitli çalışmalar bulunmaktadır. Nötralizasyon testi
ile yapılan çalışmalarda, Uzal ve ark. (22) nötralizasyon testinin %62,7 oranında pozitiflik verdiğini
belirlemişlerdir. Idrissi ve Ward (4) nötralizasyon
testi ile 151 adet ani ölen koyunun 21 adedinde
C.perfringens tip C (beta toksin) saptarken, 39 adet
C.perfringens tip D (epsilon toksin) bulmuşlardır.
Özcan ve Gürçay (19) 132 örnekte yaptıkları bakteriyolojik muayenede 51 adet pozitifliğe (%38)
rastlamışlar, toksin nötralizasyon testi sonucunda 7
(%13) örnekte tip A, 16 (%31) örnekte tip C, 28 örnekte ise (%54) tip D saptamışlardır. Bu çalışmadaki toksin nötralizasyon testi sonuçları, araştırıcıların
bulguları ile karşılaştırıldığında C.perfringens oranı, Uzal ve ark. (22)’dan düşük bulunurken, Özcan
ve Gürçay (19) ile Idrissi ve Ward (4)’ın çalışmalarının sonuçlarına yakın bulunmuştur. Örneklerin
tiplendirilmesi yönünden, Özcan ve Gürçay (19) ile
Idrissi ve Ward (4)’ın tiplendirme bulgularına göre
tip C yüksek oranda bulunurken, tip D düşük oranda saptanmıştır. Tip A yönünden elde edilen sonuç
Özcan ve Gürçay (19)’dan düşük bulunurken hem
tip C hem de tip D’nin yaygın olarak bulunması
araştırıcıların bulgularını desteklemektedir.
ELISA, C.perfringens toksin varlığının ve tipinin belirlenmesi için kullanılan hızlı, basit, duyarlı ve spesifik bir testtir. Özellikle bağırsak içeriğinde bulunan çok az miktardaki toksin yapısını
saptayarak ve tiplendirerek sonuç verdiğinden dolayı enterotoksemi vakalarının ayrımını da sağlamaktadır (5,14,21). Gökçe ve ark. (3)’nın ELISA
ile yaptıkları çalışmada, 56 ishalli dışkı örneğinde
C.perfringens yönünden pozitif sonuç veren 32 adet
(%57) örnek belirlenirken, toksin tiplendirmesinde,
örneklerin 6’sı (%10,7) tip A, 7’si (%12,5) tip B, 9
tanesi (%16) tip C, 10 adedi (%17,8) de tip D olarak
bulunmuştur. Koç ve Gökçe (8) ELISA metodu ile
150 adet dışkıda 122 (%81,3) adet pozitiflik belirlemişlerdir. Araştırıcılar toksin tiplendirmesinde 61
(%40,6) adet tip A, 19 (%12,6) adet tip B, 28 adet
(%18,6) tip C ve 14 (%9,3) adet tip D bulmuşlardır. Islam ve ark. (5) ELISA metodunu kullanarak
%68,75 oranında tip D, %25 oranında tip B, %6,25
oranında tip C belirlemişler ancak tip A’ya rastlamamışlardır. Naylor ve ark. (14) ise yaptıkları çalışmada 158 örneğin 56 (%35,4)’sında C.perfringens
yönünden pozitiflik belirlemişlerdir. Tür düzeyinde
yaptıkları tiplendirmede 9 (%16) örnekte tip A, 4
(%7,1) örnekte tip B, bir (%1,7) adet örnekte tip C
ve 42 (%75) örnekte tip D pozitifliği elde etmişlerdir. Watson ve Scholes (23) yaptıkları çalışmada bir
buzağıda ELISA ile alfa ve epsilon toksin yönünden pozitifliğe rastlarken beta toksin yönünden negatiflik tespit etmişlerdir. Bu çalışmada elde edilen
41
ELISA bulguları C.perfringens pozitifliği yönünden
Gökçe ve ark (3)’nın bulgularına benzerlik gösterirken, Koç ve Gökçe (8)’nin bulgularından düşük,
Naylor ve ark. (14)’dan yüksek bulunmuştur.
C.perfringens toksin tiplerine bakıldığında ise
tip A bulgusu Gökçe ve ark (3)’nın bulguları ile
uyumluluk gösterirken, Koç ve Gökçe (8)’den düşük, Naylor ve ark. (14)’dan yüksek bulunmuştur.
Islam ve ark. (5)’nın ise tip A tiplendirmesi yapmamış olması ile bu araştırıcılar ile karşılaştırılamamıştır. Tip B yönünden bakıldığında ise Gökçe ve
ark. (8) ile Koç ve Gökçe (8)’nin çalışma bulguları
ile uyumlu bulunurken, Islam ve ark. (5)’nın çalışmasından düşük, Naylor ve ark. (14)’dan yüksek
bulunmuştur. Tip C bakımından Gökçe ve ark. (3)
ile Koç ve Gökçe (8)’den düşük bulunurken, Naylor
ve ark. (14) ile Islam ve ark. (5)’nın tip C bulgularından fazla bulunmuştur. Tip D değerlendirmesine
göre ise Koç ve Gökçe (8)’den yüksek bulunurken,
Gökçe ve ark (3), Naylor ve ark. (14), Islam ve ark.
(5)’dan düşük bulunmuştur.
ELISA ve toksin nötralizasyon test sonuçları
karşılaştırıldığında, Uzal ve ark. (21) C.perfringens
tip D’nin epsilon toksini için ELISA ve toksin
nötralizasyon test sonuçları arasında yüksek oranda
benzerlik bulmuş, her iki tekniğinde benzer nitelikte
ölçüm yaptığını belirtmişlerdir. Ancak ELISA metodunun daha kolay, duyarlı ve spesifik olarak sonuç
verdiğini bildirmişlerdir. Aynı araştırıcılar başka bir
çalışmada her iki metodu tekrar karşılaştırdıklarında ELISA testinin duyarlılığını toksin nötralizasyon
testine göre daha fazla bulmuşlar, ELISA ile 43 adet
örnek de pozitifliğe rastlarken toksin nötralizasyon
testi sonucunda örneklerin 30 tanesinde pozitifliğe rastlamışlardır (22). Idrissi ve Ward (4) toksin
nötralizasyon testi ile ELISA testi için yaptıkları
karşılaştırmada ELISA testinin sensivite ve spesifitesini toksin nötralizasyon testlerine göre daha fazla
bulmuşlardır. Araştırıcılar ELISA testinin uygulama
kolaylığı bakımından alternatif bir test olduğunu
belirterek, toksin nötralizasyon testinin özellikle
toksinin aktif-inaktif olma durumu, yıkımlanma
gibi pek çok durumdan etkilenebileceğini bildirmişlerdir. Rosskopf-Streicher ve ark. (20) da toksin nötralizasyon testlerine alternatif olarak ELISA
testlerinin kısa sürede hızlı sonuç vermesi ve manipülasyon kolaylığı bakımından tercih edilebileceğini bildirmişlerdir. Moller ve ark. (13) C.perfringens
ve toksinlerinin teşhisinde kullanılan toksin nötrali-
42
zasyon metodu ile ELISA yöntemini karşılaştırmışlardır. Araştırıcılar alfa toksin saptanmasında toksin
nötralizasyon testinin sınırlı derecede yeterli olduğunu belirtmiş, beta toksin saptanmasında ELISA
testinin iyi sonuç verdiğini bildirmişlerdir. Bu çalışmada kullanılan ELISA testi ve toksin nötralizasyon
bulguları karşılaştırıldığında ELISA ile 37 örnekte
pozitiflik saptanırken, toksin nötralizasyon testinde
25 adet örnekte pozitif sonuç alınmıştır. Bu çalışmada C.perfringens’in belirlenmesinde ELISA testinin
toksin nötralizasyon metoduna göre daha fazla sayıda pozitiflik verdiği görülmüştür.
Lateks aglütinasyon testi de C.perfringens toksin tiplerinin belirlenmesi için kullanılan bir metottur. Kadra ve ark. (6) C.perfringens için toksin
nötralizasyon ve lateks aglütinasyon testlerinin sonuçlarını karşılaştırmışlar, toksin nötralizasyon testi
ile tip A olarak belirledikleri 47 örneğin lateks aglütinasyon testinde 4 adet tip A pozitifliği verdiğini
belirlemişlerdir. Araştırıcılar 5 adet tip B örneği için
yaptıkları toksin nötralizasyon testinde örneklerin
tamamını pozitif bulurken lateks aglütinasyon sonucunu negatif bulmuşlar, 11 adet tip C için toksin
nötralizasyon testini pozitif belirlemişler, lateks
aglütinasyon sonucunu ise negatif olarak bildirmişlerdir. Yirmi bir adet tip D örneği için toksin nötralizasyon testini pozitif bulurken, lateks aglütinasyonunda 1 adet pozitiflik, 1 adet tip E örneğinin ise
hem toksin nötralizasyon hem de lateks aglütinasyonu için pozitiflik bulmuşlardır (6). Gökçe ve ark.
(2) ELISA ve lateks aglütinasyon testlerini kullanarak yaptıkları çalışmada ELISA ile 260 bağırsak
içeriğinin 220 tanesinde (%84,61), lateks aglütinasyonu ile 152’sinde (%58,46) C.perfringens toksinlerine rastlamışlardır. Bu örneklerin 40’ı (%15,8)
ELISA, 108’i ise (%41,3) lateks aglütinasyonu ile
negatif bulunmuştur. ELISA tiplendirmesinde 104’ü
(%47,27) A, 20’si (%9) B tipinde, 10’u (%4,54) C
tipinde ve 86’sı (%39,7) D tipinde bulunmuş, lateks
aglütinasyonu tiplendirmesinde ise 79’u (%51,97)
A tipinde, 15’i (%9,86) B tipinde, 7 ‘si (%4,60) C
tipinde, 51’i (%33,55) D tipinde tespit edilmiştir. İki
test içinde en yüksek pozitiflik tip A ve tip D olarak
belirlenmiştir. Enterotoksemi vakalarında, özellikle
ani ölüm meydana gelen koyunlarda teşhis amaçlı
sık kullanılan bir test olarak bildirilen lateks aglütinasyon testi ELISA ile karşılaştırıldığında hızlı ve
kolay olmasına karşın duyarlılığı ve spesifitesi az
olan bir test olarak belirlenmiştir (2). Lateks aglütinasyon testinde sonuçların yorumlanmasının bir
laboratuvar çalışanı tarafından yapılması, ELISA
testi sonucunun ise spektrofotometrik olarak verilmesi ELISA testinin duyarlılığını arttırmaktadır. Bu
çalışmada incelenen örneklerin lateks aglütinasyon
sonuçlarına bakıldığında; 2 örnekte alfa toksin, 16
örnekte epsilon toksin belirlendi. Elde edilen lateks aglütinasyon bulgularının toksin nötralizasyon
ve ELISA sonuçları ile karşılaştırıldığında daha az
sayıdaki örnekte pozitifliği belirlemesi bakımından
bu testin C.perfringens toksinlerinin tiplendirilmesinde sınırlı sonuç verdiğini ve ek tiplendirme metotlarına gereksinim olduğu sonuçları ile uyumlu
bulunmuştur.
Bölgede yapılan enterotoksemi çalışmaları değerlendirildiğinde Kars ilinde %3,5 ile %84 arasında değişen oranlarda C.perfringens infeksiyonlarına rastlanırken (2,3,8), Elazığ ilinde %31 ile %50
arasında infeksiyona rastlanılmıştır (7,19). Toksin
tiplendirilmesi değerlendirildiğinde Kars ilinde tip
A %18-47 arasında, tip B %9-30, tip C %4-69, tip
D %9-39 arasında bildirilirken, tip E ise belirlenememiştir. Elazığ ilinde C.perfringens toksin tipleri
değerlendirildiğinde tip A %13-95, tip C %15-31,
tip D %5-54 oranlarında bildirilirken tip B ve tip E
bildirimi yapılmamıştır.
Bu çalışma sonuçları örneklerdeki C. perfringens pozitifliği üzerinden değerlendirildiğinde
Kars ilindeki pozitif sonuçlar ile uyumlu, Elazığ
ilinde yapılan çalışmalardan yüksek bulunmuştur.
Tiplendirilen toksinler yönünden tip A bulguları Kars ilindeki çalışmalar ile benzer iken, Elazığ
ilinden düşüktür. Tip B için Kars ili ile uyumlu bulunmuş ancak Elazığ ilinde tip B bulunamadığı için
karşılaştırılamamıştır. Tip C bulguları Elazığ ili ile
uyumlu bulunurken Kars ilindeki bulgulardan düşük bulunmuş, tip D bulguları her iki il ile de benzer
bulunmuştur. Tip E ise bu çalışmada da belirlenememiştir. Bu bulgu diğer araştırıcıların sonuçları
ile paralel bulunmuştur. Erzurum iline yakın illerde
yapılan çalışmalar ile bu çalışma bölgede enterotokseminin yaygınlığını ve toksinlerinin tip dağılımı da
ortaya koymaktadır.
Bu çalışma ile Erzurum ilinde %52,8 oranı
ile enterotokseminin yaygın bir infeksiyon olduğu belirlendi. Tiplendirme yöntemleri bakımından
ELISA metodunun, toksin nötralizasyon ve lateks
aglütinasyon metotlarına göre daha fazla örnekte
pozitiflik verdiği görüldü. ELISA sonuçlarına göre
tip A’nın en yüksek düzeyde olduğu, bunu tip C ve
tip D’nin takip ettiği, daha az oranda da tip B’nin
bulunduğu tespit edildi. Bu sonuçlar diğer enterotoksemi çalışmaları ile karşılaştırıldığında, enterotoksemi vakalarının hayvan popülasyonu, merada
beslenme, aşılamalar, coğrafik durum ve iklim gibi
pek çok parametreden etkilendiğini göstermektedir.
Elde edilen bu sonuçlar ile Erzurum ilinde enterotoksemi kontrolünde aşılamaların kontrollü,
yaygın bir şekilde yapılmasının ve uygulanacak aşılarda başta tip A olmak üzere, tip C, tip D ile tip
B’nin de bulundurulmasının gerekli olduğu düşünülmektedir.
Teşekkür
Bu çalışma TC. Gıda, Tarım ve Hayvancılık
Bakanlığı Tarımsal Araştırmalar Genel Müdürlüğü
tarafından TAGEM/HS/09/01/02/148 nolu proje
olarak desteklenmiştir.
Kaynaklar
1. Akan M, (2006). Clostridium Hastalıkları. Aydın N,
Paracıkoğlu J. Eds. Veteriner Mikrobiyoloji (Bakteriyel
Hastalıklar). İlke Emek Yayınları, Ankara. p. 73-86.
2. Gökçe Hİ, Genç O, Sözmen M, Gökçe G, (2007).
Determination of Clostridium perfringens toxins types in
sheeps with suspected enterotoxemia in Kars province.
Turk. J. Vet. Anim. Sci. 31, 355-360.
3. Gökçe E, Ünver A, Erdoğan HM, (2010). İshalli neonatal
kuzularda enterik patojenlerin belirlenmesi. Kafkas Univ
Vet Fak Derg. 16, 717-722.
4. Idrissi AH, Ward GE, (1992). Evaluation of enzyme-linked
immunosorbent assay for diagnosis of Clostridium perfringens enterotoxemias. Vet Microbiol. 31, 389-396.
5. Islam KBMS, Rahman MS, Ershauzzaman M, Taimur
MJFA, Jang H, Song H, (2010). Detection of C.perfringens
and its toxinotypes by ELISA from enterotoxaemic goats in
Bangladesh. Korean J Vet Serv. 33, 37-44.
6. Kadra B, Guillou JP, Popoff M, Bourlioux P, (1999).
Typing of sheep clinical isolates and identification of enterotoxigenic C.perfringens strains by classical methods
and polymerase chain reaction (PCR). FEMS Immunol
Med Microbiol. 24, 259-66.
7. Kalender H, Ertas HB, Cetınkaya B, Muz A, Arslan N,
Kılıc A, (2005). Typing of isolates of Clostridium perfringens from healthy and diseased sheep by multiplex PCR.
Vet Med Czech. 50, 439-442.
8. Koç R, Gökçe Hİ, (2007). Determination of the toxins and
biotypes of C.perfringens in diarrhoeic calves in the Kars
district of Turkey. Turk J Vet Anim Sci. 31, 207-11.
43
9. Laboratuvar Metot Birliği. Koruma-Kontrol Genel
Müdürlüğü, Ankara. Erişim adresi: http://www.kkgm.gov.
tr/genel/birimfaal.html
10. McClane B, Strouse RJ, (1983). Rapid detection of
C.perfringens type A enterotoxin by Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay. J Clin Microbiol. 19, 112-115.
11. Miyakawa MEF, Uzal FA, (2005). Morphologic and physiologic changes induced by Clostridium perfringens type A
alfa toxin in the intestine of sheep. AJVR. 66, 251-255.
12. Miyakawa MEF, Fisher DJ, Poon R, Sayeed S, Adams
V, Rood J, McClane BA, Uzal FA, (2007). Both Epsilon
toxin and Beta toxin are important for the lethal properties
of C.perfringens type B isolates in the Mouse intravenous
injection model. Infect Immun. 75, 1443-1452.
13. Moller K, Ahrens P, (1996). Comparison of toxicity neutralization-ELISA and PCR tests for typing of Clostridium
perfringens and detection of the enterotoxin gene by PCR.
Anaerobe. 2, 103-110.
14. Naylor RD, Martin PK, Barker LT, (1997). Detection of
Clostridium perfringens alfa toksin by enzyme-linked immunosorbent assay. Res Vet Sci. 63, 101-112.
15. Niilo L, (1980). C.perfringens in animal disease: a review
of current knowledge. Can Vet J. 21, 141-148.
16. Niilo L, (1986). Experimental production of hemorragic
enterotoxemia by C.perfringens tip C in maturing lamb.
Can J Vet Res. 50, 32-35.
17. Niilo L, (1987). Toxigenic characteristics of C.perfringens
tip C in enterotoxemia in domestic animals. Can J Vet Res.
51, 224-228.
18. OIE (2004). Epsilon toxin of Clostridium perfringens.
Institute for International Cooperation in animal biologics.
Iowa State University.
19. Özcan C, Gürçay M, (2000). Elazığ ve çevresinde 19941998 yılları arasında küçük ruminantlarda enterotoksemi
ınsidensi. Turk J Vet Anim Sci. 24, 283-286.
20. Rosskopf-Streicher U, Volkers P, Werner E, (2003).
Control of Clostridium perfringens vaccines using an indirect competitive ELISA for the epsilon toxin component.
Pharmeuropa Bio. 2, 91-96.
21. Uzal FA, Niealsen K, Kelly WR, (1997). Detection of
Clostridium perfringens type D epsilon antitoxin in serum
of goats by competitive and indirect ELISA. Vet Microbiol.
51, 223-231.
22. Uzal FA, Kellay WR, Thomas R, Hornitzy M, Galea F,
(2003). Comparison of four techniques for the detection of
Clostridium perfringens type D epsilon toxin in intestinal
contents and other body fluids of sheep and goats. J Vet
Diagn Invest. 15, 94-99.
23. Watson PJ, Scholes SFE, (2009). Clostridium perfringens
type D epsilon intoxication in one day old calves. Vet Rec.
164, 816-818.
Etlik
Araştırma
Makalesi / Research Article
44 Vet Mikrobiyol Derg, 23, 44-48,
Metin2012
S. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 23, 44-48,
2012
Phenotypic characteristics of Listonella anguillarum strains isolated from
rainbow trout (Oncorhynchus mykiss, Walbaum) farms in Turkey
Seçil METİN
Süleyman Demirel University, Eğirdir Fisheries Faculty, İsparta, Turkey
Summary: In the present study, nine isolates of Listonella anguillarum were characterized isolated from epizootics at
five rainbow trout fresh water farms in Middle and Mediterranean region of Turkey. Infected rainbow trout exhibited
lethargy, dark skin, bilateral exophthalmos, spilling of scales, furuncles on the sides of the body, haemorrhage in the
skin, mouth, eyes, fins and anus. Necropsy findings included haemorrhage in the liver, adipose tissue and muscles,
pale kidney and liver, enlarged spleen, ascites in the body cavity, yellowish-bloody fluid in the stomach and intestine.
Samples for bacteriological examinations were collected from the kidney and liver by using sterile swabs; these samples
were streaked onto trypticase soy agar supplemented with 1% NaCl plates, and incubated at 25°C for 48 h. Nine bacterial isolates were obtained from sick fish. L.anguillarum isolates was identified by conventional methods and API 20
E. Phenotypic characteristics of the isolates were found as homogenous. All of L.anguillarum isolates were sensitive
to trimethoprim, tetracycline, oxytetracycline, enoxacin and resistance to flucloxacillin, sulfamethoxazole, amoxicillin
and ampicillin.
Key words: Listonella anguillarum, Oncorhynchus mykiss, phenotypic characteristics, rainbow trout, vibriosis.
Türkiye’de gökkuşağı alabalığı çiftliklerinden izole edilen Listonella anguillarum suşlarının
fenotipik özellikleri
Özet: Bu çalışmada Türkiye’de İç Anadolu ve Akdeniz bölgesinde bulunan 5 gökkuşağı alabalığı çiftliklerinde meydana gelen salgınlardan izole edilen 9 Listonella anguillarum izolatının fenotipik özellikleri belirlenmiştir. Enfekte
gökkuşağı alabalıklarında letarji, deri renginde koyulaşma, bilateral ekzoftalmus, pullarda dökülme, vücut yüzeyinde
furunkuller, deri, ağız, göz, yüzgeç ve anüste hemorajiler görülmüştür. İç bakıda asites, karaciğer, yağ doku ve kaslarda
hemoraji, karaciğer ve böbrekte solgunluk, dalakta genişleme, mide ve bağırsakta sarı renkli kanlı sıvı birikimi tespit
edilmiştir. Bakteriyolojik incelemeler için karaciğer ve böbrekten alınan örnekler, %1 NaCl ilave edilmiş Triptik Soy
Agara ekilmiş ve 25°C de 48 saat süre ile inkübe edilmiştir. L.anguillarum izolatları (n=9) geleneksel bakteriyolojik
yöntemler ve API 20 E kullanılarak identifiye edilmiştir. İzolatların fenotipik özelliklerinin homojen olduğutespit edilmiştir. Yapılan antibiyogram testinde tüm izolatların trimethoprim, tetrasiklin, oksitetrasiklin, enoksasin’e duyarlı ve
flukloksasillin, sülfamethakzol, amoksisillin ve ampisilline karşı dirençli oldukları belirlenmiştir.
Anahtar kelimeler: Fenotipik özellikler, gökkuşağı alabalığı, Listonella anguillarum, Oncorhynchus mykiss, vibriosis.
Introduction
Vibriosis is one of the most prevalent fish diseases
caused by several bacterial species belonging to the
genus Vibrio.
Bacteria species belong to Vibrio genus exist
normally in the microflora of intestine and skin of
healthy marine and freshwater fishes. However,
epizootics of vibriosis appear to the stressing conditions such as grading, transporting, malnutrition,
negative environmental status and unsuitable wa-
ter quality. Listonella anguillarum is the causative
agent of vibriosis isolated from marine fishes, mainly sea bream, sea bass (1, 3, 8, 12, 20). However,
vibriosis infections have been reported in salmonid
fish especially, rainbow trout in the past years (9, 11,
13, 14, 19). Recently, has reported that it also caused
important losses in rainbow trout (Oncorhynchus
mykiss) cultured in freshwater in Turkey (16, 17,
18).
The aim of present study was to determine the
phenotypic characteristics and antimicrobial sensi-
Yazışma adresi / Correspondance: Seçil Metin, Süleyman Demirel Üniversitesi Eğirdir Su Ürünleri Fakültesi, İsparta, Türkiye
Eposta: [email protected], [email protected]
Metin S. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 23, 44-48, 2012
tivity caused by L.anguillarum isolated from rainbow trout in different farms located in the Middle
and Mediterranean regions of Turkey.
Materials and Methods
Sampling: The outbreaks were occurred rainbow
trout (body weight 50-300 g) in five different fresh
water farms in the Middle and Mediterranean regions of Turkey. Samples came from 5 fish farms
during 2004-2005. The postmortem examinations of
external and internal disease signs were performed.
Isolation and identification of bacteria: For
bacterial isolation, samples were obtained from the
kidney and liver of 10 fish, streaked on trypticasesoy agar (TSA, Merck) supplemented with 1%
NaCl plates, and incubated at 25°C for 48 h. Single
colonies were restreaked on the same media to obtain pure isolates. Isolated colonies were identified
by physiological and biochemical characterization.
Routine tests were carried out for determination of
biochemical characteristics of the bacteria, as described previously (6, 7, 10).
A presumptive identification of the strain was
performed using the following tests: Gram staining,
motility, fermentative degradation of glucose with
O/F basal medium (Merck) supplemented with 1%
glucose, oxidase, catalase, production of indole, citrate utilization, hydrolysis of starch and gelatine,
Methyl red-Voges proskouer tests, production of
H2S, growth at peptone water with 0, 2, 7, 8 and
10% NaCl, growth in thiosulphate citrate bile salts
sucrose agar (TCBS), growth at Tryptic Soy Broth
at 4°C, 25°C, 37°C, inhibition by the vibriostatic
agent O/129 (2,4-diamino-6,7-di isopropylpteridine; Oxoid) and fermentation of carbohydrates
(glucose, arabinose, inositol, saccharose, maltose,
fructose, lactose, galactose, rhamnose, mannitol,
sorbitol, amygdalin, mellibiose). Additional test
were performed using API 20 E (bioMérieux) (2).
45
In all the tests, L.anguillarum ATCC 14181 was
used as a reference.
Antimicrobial sensitivity: Antimicrobial
tests were performed on the isolate at 25°C by using a disc diffusion assay on Mueller-Hinton agar
(Oxoid). CLSI standards were used for the evaluation of the results (5).
Results
Necropsy findings of moribund rainbow trout included haemorrhage in the liver, adipose tissue and
muscles, pale kidney and liver, ascites in the body
cavity, yellowish-bloody fluid in the stomach and
the intestine, enlarged spleen. The external signs
were lethargy, dark skin, exophthalmos, spilling of
scales, haemorrhage and furuncle in skin, haemorrhage in the eyes, the fins, the mouth and the anus
(Figure 1). The mortality changed from 25 to 30%
in the farms.
For isolation, samples taken from kidneys
and livers of sick fishes streaked onto tryptic soy
agar (TSA, Merck) supplemented with 1% NaCl.
Colonies on the TSA appear white, entire, smooth,
convex and 2-3 mm in diameter after 48 h growth
at 25°C. Isolates were found to be Gram negative,
straight or slightly curved rods, fermentative, motile, producing yellow colonies on TCBS Agar, positive for oxidase, catalase and hydrolysis of gelatine
and sensitive to 0/129 Vibriostat test (10 and 150
μg), positive for indol production, gas production
from saccharose and mannitol and negative for decarboxylation of lysine and ornithine (Table 1).
All L.anguillarum isolates were sensitive to
oxytetracycline, tetracycline, enoxacin and trimethoprim and resistant to sulfamethoxazole, amoxicillin, ampicillin and flucloxacillin. However, the
isolates showed different antimicrobial sensitivities
for trimethoprim+ sulfamethoxazole, doxycycline
and furazolidone (Table 2).
46
Table 1. The phenotypic characteristics of L.anguillarum strains
L.anguillarum strains
Charecteristics
A1
Growth in TCBS
+, Y
Gr staining
_
Motility
+
S.O
+
Catalase
+
O/F
F
O/129 (10µg)
S
O/129 (150µg)
S
Arginine dihydrolase
+
β galactosidase
+
Lysine decarboxylase
_
Ornithine decarboxylase
_
H2S
_
Urea
_
Hydroliyis of gelatine
+
Hydrolysis of starch
+
Production of indole
+
MR
+
VP
_
NO3 reduction
+
Growth:
in 0% NaCl
+
in 2% NaCl
+
in 7% NaCl
+
in 8% NaCl
_
in 10% NaCl
_
at 4°C
+
at 25°C
+
at 37°C
+
at 42°C
+
Utilization of citrate
+
Fermentation of carbohydrates
Glucose
+
Arabinose
+
Inositol
_
Saccharose
+
Maltose
+
Fructose
+
Lactose
_
Galactose
+
Rhamnose
_
Mannitol
+
Sorbitol
+
Amygdalin
_
Mellibiose
_
B1
+,Y
_
+
+
+
F
S
S
+
+
_
_
_
_
+
+
+
+
_
+
K1
+,Y
_
+
+
+
F
S
S
+
+
_
_
_
_
+
+
+
_
+
+
C1
+, Y
_
+
+
+
F
S
S
+
+
_
_
_
_
+
+
+
_
+
+
C2
+, Y
_
+
+
+
F
S
S
+
+
_
_
_
_
+
+
+
+
+
+
C3
+, Y
_
+
+
+
F
S
S
+
+
_
_
_
_
+
+
+
+
+
+
A4
+, Y
_
+
+
+
F
S
S
+
+
_
_
_
_
+
+
+
_
+
+
A6
+, Y
_
+
+
+
F
S
S
+
+
_
_
_
_
+
+
+
_
+
+
M1
+, Y
_
+
+
+
F
S
S
+
+
_
_
_
_
+
+
+
_
+
+
ATCC 14181
+, Y
_
+
+
+
F
S
S
+
+
_
_
_
_
+
+
+
_
+
+
+
+
+
_
_
+
+
+
+
+
+
+
+
_
_
+
+
+
+
+
+
+
+
_
_
+
+
+
+
+
+
+
+
_
_
+
+
+
+
+
+
+
+
_
_
+
+
+
+
+
+
+
+
_
_
+
+
+
+
+
+
+
+
_
_
+
+
+
+
+
+
+
+
_
_
+
+
+
+
+
+
+
_
_
_
+
+
+
+
+
+
+
_
+
+
+
_
+
_
+
+
_
+
+
_
+
+
+
_
+
_
+
+
_
+
+
_
+
+
+
_
+
_
+
+
_
+
+
_
+
+
+
_
+
_
+
+
_
+
+
_
+
+
+
_
+
_
+
+
_
+
_
_
+
+
+
_
+
_
+
+
_
+
_
_
+
+
+
_
+
_
+
+
_
+
+
_
+
+
+
_
+
_
+
+
_
+
_
_
+
+
+
_
+
_
+
+
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
(+): positive, (-): negative, (Y): Yellow; (F): fermantative; A, B, C, K, M codes refer to different farms: A, B, C, M in Mediterranean region, K in
Middle region
47
Figure 1. Rainbow trout naturally infected with L.angullarum. a) Furuncle, spilling of scales and hemorrhage on
the side of the body. b) Exophthalmos and hemorrhage in eye. c) Hyperemia and hemorrhage in adipose tissue. d)
Hemorrhage in the liver
Table 2. Antibiotics sensitivities of L.anguillarum strains
L.anguillarum strains
Antibiotics (µg/disc)
A1
B1
K1
C1
C2
C3
A4
A6
M1
Oxolinic Acid ( 2)
S
S
S
S
S
S
R
R
R
Amoxicillin (25)
R
R
R
R
R
R
R
R
R
Trımethoprim+Sulfamethoxazole (25)
S
S
S
S
S
S
R
R
R
Doxycycline (30)
S
S
S
S
S
S
R
S
R
Tetracycline (30)
S
S
S
S
S
S
S
S
S
Oxytetracycline (30)
S
S
S
S
S
S
S
S
S
Enoxacin (10)
S
S
S
S
S
S
S
S
S
Furazolidone (100)
S
I
S
I
S
S
S
S
S
Flucloxacillin (5)
R
R
R
R
R
R
R
R
R
Sulfamethoxazole (100)
R
R
R
R
R
R
R
R
R
Trimethoprim (5)
S
S
S
S
S
S
S
S
S
Ampicillin (10)
R
R
R
R
R
R
R
R
R
48
Discussion and Conclusion
Clinical findings during epizootics at five rainbow
trout fresh water farms in Middle and Mediterranean
region of Turkey were similar to those previously
described by Bullock (4), Timur and Korun (18),
Balebona et al. (3) and Tanrıkul (17).
The biochemical and culture characteristics
of L.anguillarum strains were found substantially similar in the present study. Tanrıkul (17) also
was reported same biochemical characteristics
L.anguillarum strains from different localities and
different times in rainbow trouts in Turkish farms.
However, different results were found among strains
in terms of MR-VP and fermentation of arabinose.
Myhr et al.(15) noted variable results for VP test in
L.anguillarum strains from salmonid fish (15).
All L.anguillarum isolates were sensitive to
oxytetracycline in the present study, while Tanrıkul
(17) was found variable results for oxytetracycline
sensitivitiy (17). All L.anguillarum isolates were
sensitive to oxytetracycline, tetracycline, enoxacin
and trimethoprim. However, Tanrıkul (17) reported
that all L.anguillarum isolates (n=12) were sensitive to amoxicillin, ampicillin, furazolidone, oxolinic acid (17).
In conclusion, the biochemical and culture
characteristics of L.anguillarum strains isolated
from rainbow trout in different farms located in
the Middle and Mediterranean regions of Turkey
were found substantially similar. In addition all
L.anguillarum isolates were sensitive to oxytetracycline, tetracycline, enoxacin and trimethoprim in
this study. Thus, this antibiotics have been used in
controlling vibriosis in rainbow trout.
References
1. Akaylı T, (2001). Diagnosis of Vibriosis by ELISA and methods in cultured sea bream (Sparus auratus, L 1758). Ph.D
Thesis, İstanbul Univ Fisheries Faculty, İstanbul.
2. Austin B, Austin DA, (2007). Bacterial Fish Pathogens:
Disease in Farmed and Wild Fish. 4 th ed. Praxis Publishing,
Chichester, p.594.
3. Balebona CM, Zorilla I, Morinigo MA, Borrege JJ,
(1998). Survey of bacterial pathologies affecting farmed
gilt head sea bream (Sparus aurata, L) in south western
Spain from 1990 to 1996. Aquacult. 166, 19-35.
4. Bullock GL, Sniesko SF, (1971). Bacterial Diseases of Fish.
Diseases of Fishes, book 2A, T.F.H., p. 56-80.
5. CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute), (2006).
Performance standards for antimicrobial susceptibility
testing.16th Informational Supplement.
6. Collins CH, Lyne PM, (1976). Microbiological Methods. 4
th ed. Butterworths, p.521.
7. Cowan ST, Steel KJ, (1970). Manual for the Identification
of Medical Bacteria. Cambrige at University Press, p.16.
8. Çağırgan H, (1993). An investigation on the diagnosis and
the treatment of cultured sea bass and sea bream. Ph. D
Thesis, Ege University Fisheries Faculty, İzmir.
9. Giorgetti G, Ceschia G, (1982). Vibriosis in rainbow trout,
Salmo gairdneri Richardson, in fresh water in north-eastern Italy. J Fish Dis. 5, 125-130.
10. Holt J, Krieg NR, Sneath PHA, Staley JI, Willians
ST,(1994). Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology.
9 th ed. Williams & Wilkins, p. 787.
11. Holt G, (1970). Vibriosis (Vibrio anguillarum) as an epizootic disease in rainbow trout (Salmo gairdneri). Acta Vet
Scand. 11, 600-603.
12. Korun J, (2006). A study on Listonella anguillarum infection occurred in cultured gilt-head sea bream (Sparus aurata L.). EU J Fish Aquat Sci. 23, 259-263.
13. Malnar L, Čož-Rakovac R, Hacmanjek M, Teskeredžić
Z, Teskeredžić E, Strunjak-Perović I, McLean E, Naglić
T, (1996). Vibriosis in rainbow trout cultured in the Krka
estuary, Croatia: occurrence and comments. Vet Med. 41,
77-81.
14. McCarthy DH, Stevenson, JP, Roberts MS, (1974).
Vibriosis in rainbow trout. J Wildlife Dis. 10, 10-17.
15. Myhr E, Larsen JL, Lillehaug A. Gudding R, Heum M,
Hastein T, (1991). Characterization of Vibrio anguillarum
and closely related species isolated from farmed fish in
Norway. Appl Environ Microbiol. 57, 2750-2757.
16. Tanrıkul T, Gültepe N, (2011). Mix Infections in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss Walbaum): Lactococcus
garvieae and Vibrio anguillarum O1. J Anim Vet Adv. 10,
1019-1023.
17. Tanrıkul T, (2007). Vibriosis as an epizootic disease of
rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) in Turkey. Pakistan
J Biolog Sci. 10, 1733-1737.
18. Timur G, Korun J, (2004). First outbreak of vibriosis in
farmed rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) in Turkey.
Istanbul Univ J Aquat Sci. 18, 1-9.
19. Ross AJ, Martin JE, Bressler V, (1968). Vibrio anguillarum from an epizootic in rainbow trout (Salmo gairdneri) in
the U.S.A. Bull Off Int Epizoot. 69. 1139-1148.
20. Zorrilla I, Arijo S, Chabrillon M, Diaz P, MartinezManzanares E, Balebona M, Moriňigo MA, (2003).
Vibrio species isolated from diseased farmed sole, Solea
senegalensis (Kaup) and evaluation of the potential virulence role of their extracellular products. J Fish Dis. 26,
103-108.
Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 23,Ayaz
49-56,
Araştırma
49
ve 2012
ark. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 23, 49-56,
2012 Makalesi / Research Article
Et ürünlerinin histolojik muayenesi
Yıldız AYAZ1, Yusuf Ziya KAPLAN1, Naim Deniz AYAZ2, Mihriban H. AKSOY1
1
2
Etlik Veteriner Kontrol Merkez Araştırma Enstitüsü, Gıda Kontrol Laboratuvarı, Ankara
Kırıkkale Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Gıda Hijyeni ve Teknolojisi Anabilim Dalı, Kırıkkale
Özet: Bu çalışmada, 2011 ile 2012 yıllarında Veteriner Kontrol Merkez Araştırma Enstitüsü Gıda Kontrol Laboratuarına
gönderilen 842 et ürününün (salam, sosis, sucuk ve ısı işlemi görmüş sucuk) bileşiminde doku ve iç organ varlığının
histolojik muayene ile belirlenmesi amaçlanmıştır. Yapılan histolojik analizler neticesinde 2011 yılında incelenen 393
örneğin 45’inde (%11,5), 2012 yılında 449 örneğin 66’sında (%14,7) başta kıkırdak doku ve deriye ait epitel doku olmak üzere iç organlara ait hücresel yapılar tespit edilmiş olup toplam 842 örnekten 111’inin (%13,2) ulusal standartlara
uygun olmadığı belirlenmiştir.
Anahtar kelimeler: Doku, et ürünü, histolojik muayene, iç organ.
Histological analysis of meat products
Summary: The aim of this study was to detect tissue and internal organs in 842 meat products (salami, sausage and
heat-treated sucuk) that were send to Veterinary Control Central Research Institute Food Control Laboratory in 2011 and
2012 by histological analyze. According to the histological analysis in 2011, 45 (11.5%) of the 393 samples and in 2012,
66 (14.7%) of the 449 samples, cartilage tissue, skin epithelial tissue and various internal organ cells were detected. In
the study, 111 (13,2 %) out of 842 meat products were not appropriate to national standards.
Key words: Edible offal, histologic analysis, meat product, tissue.
Giriş
Türk Gıda Kodeksi (TGK) Et Ürünleri Tebliğinde et
ürünleri, “Taze Et, Hazırlanmış Et ve Hazırlanmış
Et Karışımları Tebliği kapsamındaki ürünler dışında; sadece soğutma veya dondurma işleminden
geçen etlerden hazırlanan, kesit yüzeyleri taze etin
karakteristik özelliklerini göstermeyecek şekilde işlemden geçen ürünler” olarak tanımlanmıştır.
Tebliğde ürün özellikleri belirlenirken “Et ürünleri karkas etinden veya sakatattan hazırlanır, karkas
etinden hazırlanan et ürünlerine sakatat katılamaz.
Sakatattan hazırlanan et ürünlerine ise karkas eti katılabilir” ifadesi kullanılmıştır (2).
Bu durumda etiketinde “sakatattan yapılmıştır”
ifadesi olmayan fakat histolojik muayenesinde sakatat tespit edilen (3), ayrıca etin yenilemeyen kısımları olarak tanımlanan dokuları tespit edilen et
ürünleri TGK Et Ürünleri Tebliğine aykırı olarak
kabul edilmektedir.
Maliyeti düşürmek amacıyla et ürünlerinde (salam, sucuk, sosis vb) etlerin tendo, ligament, lenf
yumrusu, büyük kan damarları vb temizlenmeden
kullanılması ürünün kalitesini olumsuz etkilemektedir. Bu nedenle et ürünlerinde kas dışında doku
ve organların kullanımının belirlenmesi tüketicinin
aldatılmasının önlenmesi, halk sağlığının korunması ve üreticiler arası haksız rekabetin önlenmesi açısından büyük önem taşımaktadır. Histoloji bilimi,
et ürünlerinin hayvansal doku bazında bileşiminin
tespitinde kullanılan en eski bilimdir (10). Et ürünlerinin etiketleme tebliğine uygunluğunun belirlenmesi ve tüketici haklarının korunması açısından
Hematoksilen Eozin boyama tekniğiyle yapılan histolojik analizlerin et ürünlerine karıştırılan hayvansal dokuların tespitinde güvenle kullanılabileceği
belirtilmiştir (5).
Bu çalışmada, 2011 ile 2012 yıllarında Etlik
Veteriner Kontrol Merkez Araştırma Enstitüsü Gıda
Kontrol Laboratuvarına gönderilen 842 et ürününün
(salam, sosis sucuk ve ısı işlemi görmüş sucuk) bileşiminde yabancı doku ve iç organ varlığının histolojik muayene ile belirlenmesi amaçlanmıştır.
Yazışma adresi / Correspondance: Yıldız Ayaz, Etlik Veteriner Kontrol Merkez Araştırma Enstitüsü, Gıda Kontrol Laboratuarı,
Ankara, Türkiye Eposta: [email protected]
50
Ayaz ve ark. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 23, 49-56, 2012
Materyal ve Metot
Materyal: Çalışmada Etlik Veteriner Kontrol
Merkez Araştırma Enstitüsü’ne 2011 yılında gönderilen 393, 2012 yılında gönderilen 449 olmak üzere
toplam 842 salam, sosis, sucuk ve ısıl işlem görmüş
sucuk materyal olarak kullanılmıştır. Ayrıca, örneklere ait preparatlar ile karşılaştırmalı çalışma yapmak amacıyla çeşitli doku ve organ kıymaları ile
sığır eti kıyması karışımından hazırlanan mikroskobik preparatlar kontrol olarak kullanılmıştır.
Kontrol karışımların oluşturulması: Bu
amaçla sığır kıymasına tek tek akciğer kıyması,
karaciğer kıy-ması, böbrek kıyması, lenf yumrusu
kıyması, dalak kıyması, tavuk derisi kıyması katarak 6 tip organ ve doku katılmış kıyma hamuru elde
edilerek bu karışımlardan preparatlar hazırlanmıştır.
Örneklerin hazırlanması: Numunelerden
yüzeyi 1-3 ve derinliği 5 mm olan parçalar kesilip,
tespit, takip, parafine gömme, boyama aşamalarından geçirilmiştir. Numune parçaları öncelikle doku
takip kasetlerine yerleştirilmiş ve %10’luk formalin
çözeltisinde 12 ila 24 saat tespit edilmek üzere bırakılmıştır. Tespit edilen örnekler, akan çeşme suyu
altında 6-8 saat yıkanarak formolden arındırılmıştır. Yarı kapalı doku takip cihazı ile yaklaşık 18 saat
süren dehidrasyon, şeffaflaştırma, parafine emdirme
aşamalarından geçirilmiştir. Bu işlem 10 basamaktan oluşmakta olup sırasıyla 1) %70’lik alkolde 2
saat, 2) %90’lık alkolde 2 saat, 3) %100’lük alkolde
1 saat, 4) %100’lük alkolde 2 saat, 5) %100’lük alkolde 2 saat, 6) ksilende 1 saat, 7) ksilende 1,5 saat,
8) ksilende 1,5 saat, 9) parafinde 2 saat ve son olarak 10) parafinde 3 saat muamele işlemleri uygulanmıştır. Daha sonra örnekler doku gömme cihazına
alınarak dokular blok haline getirilmiş ve mikrotom
cihazında bloklardan 4-6 mikron kalınlığında kesitler alınmış ve kurumaya bırakılmıştır.
Deparafinizasyon rehidrasyon: Kesitler ksilende deparafinize edilmiştir. Bu amaçla kesitlerin
%100 etanolde hidrasyonu takiben sırasıyla %90,
%80, %70 ve %50’lik etanolden geçirilmiştir. Daha
sonra kesitler distile suya alınarak rehidrasyon işlemi tamamlanmıştır. Bu işlemlerin hepsi hematoksilen-eozin boyama cihazında yapılmıştır.
Hematoksilen-eozin boyama: Bu amaçla preparatlar instant hematoksilende (Shandfon Cat. No:
9990107) 10 dakika boyanmıştır. Çeşme suyu ile
çalkalanarak fazla boyadan arındırılan preparatlar
%0,25 HCl ve %50’lik alkolde deklore edilmiştir.
Amonyaklı suda kesitler mor renk alıncaya kadar
20-25 dakika bekletilmiş, daha sonra Instant Eosin
Alcoholic (Shandon Cat No:1900140) ile 1 dakika
boyanmıştır. Preparatlar, dehidrasyon için sırasıyla
%50, %70, %80, %90, %96, %100’lük etil alkolden
geçirilmiştir. Bu işlemi takiben preparatlar ksilende 10-15 dakika bekletilerek şeffaflaştırılmıştır. Bu
işlemler tam otomatik hematoksilen-eozin boyama
cihazında yapılmıştır. Boyanması tamamlanmış
doku kesitleri üzerine ksilen bazlı yapıştırıcı damlatılarak lamel ile kapatılmıştır.
Bulgular
Deneysel çalışma için akciğer kıyması katılarak
hazırlanan sığır eti kıymasının histolojik muayenesinde akciğere ait alveoller ve interalveoler septum
yapıları dağılmış ve kaybolmuştur. Yalnızca bronşiol yapıların varlığı ortada yıldız şeklinde lümeni
etrafında kübik, prizmatik bronşiol epiteli olarak
görülmüştür (Şekil 1 ve 2).
Karaciğer katılarak hazırlanan sığır eti kıymasında, karaciğerin normal lopcuk yapısının bozulduğu, hepatositlerden oluşan yoğun hücresel alanlar
görülmüştür (Şekil 3 ve 4).
Dalak katılarak yapılan sığır eti kıymasında dalağa ait follüküler yapılar belirgin olmayıp bütünlüğü bozulmuş, beyaz ve kırmızı pulpaya ait hücrelerin karışımı şeklinde tespit edilmiştir. Bağ dokusu
ve düz kaslardan meydana gelen trabekül yapıları
belirgin olarak görülmüştür (Şekil 5 ve 6).
Böbrek kıyması katılan sığır eti kıymasında,
böbreğe ait glomerular ve tubular yapılar belirgin
olarak görülmüştür. Tubulusları oluşturan kübik
prizmatik hücreler izlenebilmiştir (Şekil 7 ve 8).
Lenf yumrusu kıyması katılan sığır eti kıymasında lenfoid folliküller görülmüştür (Şekil 9-11).
Tavuk derisi katılarak hazırlanan sığır eti kıymasının kesitlerinde epidermis tabakasında çok
katlı yassı epitele ait katmanlar görülmüş, dermis
katında bağdoku, bez yapıları ve düz kaslar tespit
edilmiştir (Şekil 12 ve 13).
İç organlara ait olan düz kaslar mekik şeklinde
görülmüş olup, hücre çekirdeği oval veya uzun olup
hücrenin merkezindedir.
Kalp kasının histolojik görüntüsünde çizgili
yapı ve hücre çekirdeğinin sentralde oluşu karakteristiktir. Preparatlarda enine, boyuna ve verev çizgili demetler halinde görülmüştür.
51
İskelet kaslarındaki enine çizgili yapı görüntüsünü korumuştur. İskelet kaslarında çekirdek periferdedir (Şekil 14 ve 15).
Şekil 4. Isıl işlem görmüş karaciğer dokusu, (H-E. X400).
Şekil 1. Isıl işlem görmemiş akciğer dokusu, (H-E.
X400).
Şekil 5. Isıl işlem görmemiş dalak dokusu, (H-E. X200).
Şekil 2. Isıl işlem görmüş akciğer dokusu, (H-E. X400).
Şekil 6. Isıl işlem görmüş dalak dokusu, (H-E. X200).
Şekil 3. Isıl işlem görmemiş karaciğer dokusu, (H-E.
X400).
52
Şekil 7. Isıl işlem görmemiş böbrek dokusu (H-E. X400).
Şekil 10. Lenf düğümü, et ürünü (salam), (H-E. X200).
Şekil 8. Isıl işlem görmüş böbrek dokusu (H-E. X400).
Şekil 11. Glandula, tükrük bezi, salam numunesi, (H-E.
X200).
Şekil 9. Lenf düğümü, (H-E. X200).
Şekil 12. Çok katlı yassı epitelyum, kıyma, (H-E. X400).
53
Kıkırdak dokunun mikroskobik görüntüsü:
Kondrositlerin görünümü karakteristiktir (Şek. 16-17).
Şekil 13. Çok katlı yassı epitelyum, sosis numunesi, (HE. X400).
Şekil 14. Çizgili kas dokusu, ısıl işlem görmemiş, (H-E.
X200).
Şekil 15. Çizgili kas dokusu, ısıl işlem görmüş, (H-E.
X200).
Şekil 16. Kıkırdak dokusu, sosis numunesi, (H-E. X400).
Şekil 17. Kıkırdak dokusu, salam numunesi, (H-E. X200).
Kemik dokunun mikroskobik görüntüsü:
Osteositler, periost ve havers kanalları ile belirgindir (Şekil 18 ve 19).
Şekil 18. Kemik dokusu, salam numunesi, (H-E. X400).
54
Şekil 19. Kemik dokusu, salam numunesi, (H-E. X200).
Baharatın
mikroskobik
görüntüsü:
Baharatlar bitkisel kökenli olmaları nedeniyle hücre
zarları çift katlıdır. Çift katlı hücre zarı mikroskopta
çok rahatlıkla ayırt edilebilmektedir (Şekil 20- 27).
Şekil 22. Sucuk numunesi, normal görüntüsü, (H-E.
X200).
Şekil 23. Salam numunesi, normal görüntüsü, (H-E.
X200).
Şekil 20. Sucuk numunesi, baharat, (H-E. X400).
Şekil 21. Sucuk numunesi, çeşitli baharatlar, (H-E.
X400).
Şekil 24. Sosis numunesi, normal görüntüsü, (H-E.
X200).
55
Çalışmada, 2011 yılı içinde laboratuara histolojik analiz için gönderilen salam, sosis ve sucuk
olmak üzere 393 numunenin 45’inin MSB ilgili
Teknik Şartnamelerine uygun olmadığı belirlenmiştir. Yapılan muayene sonucunda, çeşitli markalara
ait 113 salam örneğinin 10’ununda (%8,8), 126 sosis örneğinin 13’ünde (%10,3) ve 142 sucuk örneğinin 18’inde (%12,7) başta kıkırdak doku ve deriye
ait epitel doku olmak üzere iç organlara ait hücresel
yapılar tespit edilmiştir.
Şekil 25. Hamburger köfte numunesi, (H-E. X200).
Yine 2012 yılı içinde analiz edilen etiketinde
%100 sığır etinden imal edildikleri belirtilen 449
salam, sosis ve sucuk örneklerinin 66’sının histolojik yönden uygun olmadığı ortaya konmuştur. Buna
göre, 133 salam örneğinin 20’sinde (%15,0), 133
sosis örneğinin 18’inde (%13,5) ve 151 sucuk örneğinin 15’inde (%9,9) kıkırdak doku, kemik doku, iç
organlara ait yapılar ve sindirim sistemine ait epitel
dokular tespit edilmiştir.
Şekil 26. Kıyma numunesi, kıkırdak kemik dokusu (H-E.
X200).
Şekil 27. Hamburger köfte numunesi, böbrek dokusu,
(H-E. X400).
Salam, sucuk, sosis, jambon, çeşitli köfteler gibi et
ürünleri TGK’de de belirtildiği gibi ana maddesi
sadece soğutma veya dondurma işleminden geçen
etlerden hazırlanan ürünlerdir. Bu ürünlerde, ilgili
mevzuat ile katılmasına izin verilen maddeler dışında herhangi bir maddenin bulunması yasaklanmıştır. Et ürünlerine aroma ve lezzet kazandırmak
üzere ürün çeşidine göre çeşitli baharatlar, fıstık, dil
katılabilmektedir. Bunun dışında deri, iç organlar,
etin yenilemeyen kısımlarının katılması tebliğlerle
engellenmiştir. Ancak Et Ürünleri Tebliği’nde ısı
işlemi gören et ürünlerine mekanik olarak ayrılmış
et katılabileceği belirtilmiştir. Mekanik olarak ayrılmış kanatlı eti; “Kanatlı karkası, karkas parçası veya
etli kemiklerden, çiğ kanatlı etinin kas lifi yapısında
kayba veya değişikliğe yol açan mekanik bir işlem
ile ayrılması sonucu elde edilen ürünü, kanatlı karkası; “Tekniğine uygun olarak kesilmiş, kanı akıtılmış, tüyleri yolunmuş, böbrek hariç olmak üzere iç
organları çıkartılmış kanatlı hayvan gövdesi olarak
tanımlanmıştır (Anon, 2007). Bu durumda kanatlı
MAE kullanılarak veya sığır etine katılarak hazırlanan ısı işlemi görmüş et ürünlerinde (salam, sosis,
ısı işlemi görmüş sucuk vb) kanatlı böbreği kalıntılarının bulunması olağan bir durumdur. Ancak bu
durum et ürünlerinde histolojik muayeneler hükümleri ile çelişmektedir. 5 Aralık 2012 tarihli ve 28488
56
sayılı Resmî Gazetede yayınlanan 2012/74 no’lu Et
Ürünleri Tebliği ile et ürünlerinde MAE kullanımı
yasaklanarak bu çelişki düzenlenmiştir. Aynı tebliğde kırmızı et ile hazırlanan et ürünlerine kanatlı
eti katılması da yasaklanmıştır. Yaptığımız çalışmada ürün etiketlerinde, ürün “%100 sığır eti” olarak
belirtildiğinden bulunan iç organlara ait yapılar,
kıkırdak doku, deri kalıntıları tavuk eti katımından
kaynaklanan tavuk MAE kapsamında sayılamaz.
Ancak ürünler ”%100 sığır etinden yapılmıştır”
olarak etiketlenmesine karşın 122 örnekte yapılan
et türü muayenesinde tavuk eti saptanan 7 üründe
bulunan iç organ kalıntılarının saptanması ürünlere
MAE tavuk katıldığını düşündürmektedir.
Yapılan literatür taramasında Türkiye’de et
ürünlerinin histolojik analizi ile ilgili sınırlı sayıda çalışmaya ulaşılmıştır. Ankara’da Satılan
Kıymaların Histolojik Analizleri çalışmasında, örneklerin hiç birinde iç organ ve yabancı dokuya
rastlanılmamıştır (7). Kahramanmaraş’ta yapılan
bir başka çalışmada, piyasadan toplanan 50 sucuk
ve 16 sosis örneklerinin sırasıyla %24,0’ından ve
%31,2’sinden kemik ve kıkırdak doku tespit edilmiştir (6). Torun (9), et ürünlerinde histolojik muayene bulgularına yer verdiği Et Ürünleri Muayene
Atlası’nı yayınlamıştır. Geçmiş yıllarda yapılan
çalışmalar bu çalışmanın bulguları ile karşılaştırıldığında et ürünlerine standartlarda yer almayan
hayvansal dokuların karıştırılması suretiyle yapılan
hilelerin, hayvansal üretimin artması, gıda üretiminde teknolojinin gelişmesi ve artan rekabet koşulları
gibi faktörlerle birlikte arttığı görülmektedir.
Dünyada, Hematoksilen Eozin boyama tekniğiyle et ürünlerinin histolojik analiziyle ilgili güncel çalışmalar mevcuttur. Botka-Petrak ve ark. (4),
hematoksilen eozin boyama ile mekanik olarak
ayrılmış kanatlı etlerinin histolojik analizinde kas
dokusunun yanı sıra kıkırdak, kemik, lenfoid ve
yağ dokuların tespit edilebildiğini belirtmişlerdir.
Italya’da, etli mantının Hematoksilen Eozin boyaması ile yapılan histolojik analizi sonucunda ürünlere sinir, orta büyüklükte damar, yağ, üst sindirim
sistemi, kıkırdak ve bezsel dokular karıştırıldığı ortaya konmuştur (5). Bir başka çalışmada ise, yine
aynı yöntemle, ısı işlemi görmüş et ürünlerinden
meme, lenf, tükürük bezi, rumen ve deri dokuları
tespit edilmiştir (8).
Sonuç olarak, et ürünlerine kas dokusu haricinde diğer hayvansal dokuların karıştırıldığı görülmüş olup bu dokuların et ürünlerinin histolojik
analiziyle güvenilir olarak tespit edilebildiği ortaya
konmuştur. Bu bağlamda, gıdaların mevzuata ve
standartlara uygunluğunun belirlenmesi, ayrıca tüketicinin korunması ve üreticiler arası haksız rekabetin önlenmesi açısından et ürünlerinin histolojik
analizlerinin devlet otoritesi tarafından düzenli olarak yaptırılması gerekmektedir.
Teşekkür
Laboratuarımız çalışmalarında et ürünlerinde histolojik muayeneler için örneklerden preparatlarımızı
hazırlayan ve katkı sağlayan patoloji laboratuarı
şefi Sayın Dr. Yavuz ULUSOY ve Biyolog Murat
ŞAHBAZ’a teşekkür ederiz.
Kaynaklar
1. Anon, (2007). Türk Gıda Kodeksi, Mekanik Olarak Ayrılmış
Kanatlı Eti Tebliği. Tebliğ no: 2007/34. Resmi Gazete:
03.08.2007-26602.
2. Anon, (2009). Türk Gıda Kodeksi, Et Ürünleri Tebliği. Tebliğ
no: 2000/4. Resmi Gazete: 06.02.2009-27133.
3. Anon, (2012). Türk Gıda Kodeksi, Etiketleme Yönetmeliği.
Resmi Gazete: 11.02.2012-28201.
4. Botka-Petrak K, Hraste A, Lucić H, Gottstein Ž, Đuras
Gomerčić M, Jakšić S, Petrak T, (2011). Histological and
chemical characteristics of mechanically deboned meat of
broiler chickens. Vet Arhiv. 81, 273-283.
5. Chisleni G, Stella S, Radaelli E, Mattiello S, Scanziani
E, (2010). Quantitative evaluation of tortellini meat filling
by histology and image analysis. Int J Food Sci Tech. 45,
265-270.
6. Erdoğrul ÖT, (2002). Kahramanmaraş’ta satılan sucuk ve
sosislerin histolojik yapılarının incelenmesi. KSÜ Fen Müh
Derg. 5, 9-13.
7. Kaymaz Ş, Çelik H, Yurtyeri A, Kamber U, Yargül B,
(1989). Ankara’da satılan hazır çiğ kıymalarda kas doku,
bağ doku, iç organ ve yenmeyen dokuların saptanması.
Ankara Üniv Vet Fak Derg. 36, 40-52.
8. Rezaian M, Rokni N, (2003). Histological study of heated meat products in Mazandaran province. The 11.
International Symposium of the World Association of
Veterinary Laboratory Diagnosticans and OIE Seminar on
Biotechnology. November, p.9-13,18.
9. Torun A, (2007). Histolojik Et Ürünleri Muayene Atlası.
Palme Yayınları. Ankara.
10. Tremlová B, Štarha P, (2003). Histometric evaluation of
meat products-Determination of area and comparison of
results obtained by histology and chemistry. Czech J Food
Sci. 21, 101-106.
Etlik Vet Mikrobiyol Derg, Can
23, 57-63,
2012M. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 23, Araştırma
57
ÖP, Erşan
57-63, 2012Makalesi / Research Article
Gökkuşağı alabalık filetolarının marinasyon süresinin ve sıcaklığının merkezi
bileşke tasarımı ile optimizasyonu
Özlem Pelin CAN1, Mehtap ERŞAN2
Cumhuriyet Üniversitesi, Mühendislik fakültesi, Gıda Mühendisliği Bölümü, Sivas
Cumhuriyet Üniversitesi, Mühendislik fakültesi, Kimya Mühendisliği Bölümü, Sivas
1
2
Özet: Bu çalışma, farklı süre ve sıcaklık derecelerinde marine edilen gökkuşağı alabalığı filetolarında, yüzey cevap metodu ile duyusal kriterler esas alınarak optimum noktayı belirlemek amacıyla yapılmıştır. Dizayn ile belirlenen optimum
marinasyonda bekleme süresi ve sıcaklığı sırasıyla 11.96 gün ve 5.26°C olarak belirlenmiştir. Optimum konsantrasyon
ve sürenin belirlendiği bu çalışmada filetoların muhafaza süresinin 98 gün olduğu tespit edilmiştir.
Anahtar kelimeler: Alabalık, cevap yüzey yöntemi, marinasyon süresi, marinasyon sıcaklığı.
Optimization with central compozite design of rainbow trout fillets time of marination and
temperature
Summary: This study was conducted with the purpose of determining with response surface method the optimum
points of rainbow trout fillets marinated different time and temperature in terms of sensory criteria. The marination time
and temperature determined by the design were found as 11.96 day and 5.26°C, respectively. In this study during which
optimum concentration and period was determined, the preservation period of fillets was found as 90 days.
Key words: Marination time, marination temperature, rainbow trout, response surface methodology.
Giriş
Balıketi kolay bozulabilen gıdalar arasında yer almaktadır. Balık etinin uzun süre bozulmadan muhafaza edebilmek için birçok farklı metot geliştirilmiştir. Marinasyon işlemi bunlardan bir tanesidir.
Marinasyon işlemi, balıketinin asetik asit ve tuz
çözeltisinde ısıl işlem uygulanmaksızın olgunlaştırılması (11) olarak bilinmektedir. Asetik asit ve tuz
ile marinasyon sadece balık etinin depolama periyodunu uzatmakla kalmayıp aynı zamanda lezzetini de arttırmaktadır. Marinasyon işlemindeki genel
amaç, fileto halindeki balığı yumuşatmak aynı zamanda karakteristik tat ve kas yapısını geliştirmektir. Bu amaçla marinasyon solüsyonu (%5-10 asetik
asit ve %10-15 tuz) içerisine konulan balık etlerinin
proteinleri koagüle olmakta ve kalan küçük kemik
parçaları da yumuşamaktadır (14). Hazırlanan marinasyon solüsyonu içerisindeki asetik asit ve tuz
miktarı sabit olmayıp balık türüne göre değişiklik
gösterebilmektedir. Tuz ve asetik asit balık etine
aynı yönde ve birlikte etki etmekle birlikte karşılıklı
olarak birbirini engelleyen ve zıt kutuplu maddelerdir. Tuz materyale sertlik vermesine karşın, asetik
asit yumuşaklık vermektedir (27). Olgunlaştırma
işleminde, balık doku suyundaki tuz ve sirke ile
çözeltinin tuz ve sirke oranı eşitleninceye kadar,
balık dokusundaki tuz ve sirke geçişi devam eder.
Bu geçiş sıcaklığa bağlıdır ve süratle gerçekleşerek, iki gün içinde tamamlanır (4, 6). Marinasyon
işlemi esnasında tuz ve asetik asit balıketi içerisine
yayılarak proteinleri denatüre eder ve pH değerini
düşürerek lizozomal katepsinlerin aktivitesiyle tipik
tat oluşumu sağlanmaktadır (6). Ayrıca marinasyonda bekleme süresi de yine değişiklik arz etmektedir. Marinasyon solüsyonunda bekleme süresi balık
doku suyundaki tuz ve asetik asit konsantrasyonu
ile çözeltideki tuz ve asetik asit konsantrasyonu
eşitleninceye kadar devam etmektedir (4). Marine
edilmiş ürünlerde pH 4.5’i geçmemelidir. pH 4.5’in
altında bütün gıda zehirlenmesi ve bozulma yapan
bakterilerin çoğunun gelişimi önlenebilmektedir
(14). Marinasyon işlemi yapılırken, marinasyonda
Yazışma adresi / Correspondance: Ö. Pelin Can, Cumhuriyet Üniversitesi Mühendislik Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü,
58119 Kampüs, Sivas, Türkiye E-posta: [email protected]
58
Can ÖP, Erşan M. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 23, 57-63, 2012
bekleme süresi ve işlemin gerçekleştirileceği sıcaklık derecesinin yapılan çalışmalarda farklı olduğu
görülmüştür (10, 21). Yapılan çalışmalarda marinasyon işleminin tamamlanmasında duyusal kriterlerin
ön planda olduğu dikkat çekmiştir. Farklı deney koşulları için elde edilen optimum değerleri bulmak
önemli bir problemdir. Bu problemi en aza indirmek
için geliştirilmiş olan metot, Cevap Yüzey Yöntemi
(CYY) olarak bilinmektedir. CYY tasarlanmış deneylerle elde edilmiş verilere uydurulan polinamlar
yardımıyla tasarım yapmayı sağlar. CYY yeni ürünün formülasyonunda var olan tasarımın iyileştirilmesinde süreç tasarımında. süreçin geliştirilmesinde ve iyileştirilmesinde yaygın olarak kullanılır
(23). CYY’ de, karmaşık sistemlerin modellenmesi
için genelde ikinci dereceden polinomlar kullanılsa
da daha yüksek dereceden polinomların da kullanılması mümkündür. CYY’ de iki bağımsız değişkeni
cevap değişkenlerine bağlayan modeli elde etmek
için yaygın olarak merkezi birleşik tasarım (Merkezi
Bileşke Tasarımı, MBT) kullanılmaktadır. Buradan
yola çıkarak, MBT ile marinasyon süre ve sıcaklık
derecesini optimize ederek optimum bir nokta belirlemek ve bu noktadaki marine ürünün uygunluğunu
araştırmak amaçlanmıştır.
Materyal ve Metot
Materyal: Çalışmada materyal olarak yaklaşık
300-350 g ağırlığındaki yeni avlamış gökkuşağı
alabalığı kullanıldı. Sivas Balık Pazarı’ndan temin
edilen balıklar, laboratuara getirilip iç organ, baş
ve kuyruklarından ayrılıp, kalınlık ve boyutlarının
da bir örnek olmasına dikkat edilerek yaklaşık 50 g
ağırlığında fileto elde edildi. Çalışma 10 gün arayla üç defa tekrar edildi. Çalışmada asetik asit (%99
saflıkta, Merck) ve NaCl (Merck) kullanıldı.
Metot: Alabalık filetolarının marinasyonu
için %8 asetik asit, %4 tuz içeren ve fileto: solüsyon oranı 1:2 olacak şekilde marinasyon solüsyonu
hazırlandı. Filetolar kan ve mukoza artıklarından
arındırılmak için yıkandı ve daha sonra süzdürüldü.
Çalışma üç aşamada gerçekleştirildi. İlk aşamada
filetolar marinasyonda bekleme süresi (7, 9 ve 12
gün) ve depolama sıcaklığına (2, 4 ve 6°C) göre 9
farklı gruba(A: 2°C’ de 7 gün, B: 4°C’ de 7 gün,
C:6°C’ de 7 gün, D: 2°C’ de 9 gün, E: 4°C’ de 9 gün,
F: 6°C’ de 9 gün, G: 2°C’ de 12 gün, H: 4°C’ de 12
gün ve I: 6°C’ de 12 gün) ayrıldı. Deneysel örnek-
ler hazırlanırken bütün örneklerin aynı anda analize
alınmasını sağlamak amacıyla (marinasyon işleminin üç grup için aynı anda tamamlanması açısından)
ilk olarak 12 gün marinasyonda bekleyecek gruba
ait örnekler oluşturuldu. Deneysel örnekler, marinasyon süresi sonunda duyusal (gevreklik, koku,
renk, lezzet ve genel beğeni düzeyi) açıdan incelendi. İkinci aşamada, CYY ile marinasyonda bekleme
süresinin ve depolama sıcaklığının aynı anda verdiği optimum şartlar belirlenmesi için modelleme yapıldı. Modelin ön gördüğü 5 farklı noktalarda (4°C’
de 5.96 gün, 6.83°C’ de 9.5 gün, 4°C’ de 9.5 gün,
1.17°C’ de 9.5 gün ve 4°C’ de 13.04 gün) deneysel
grup oluşturuldu ve bu filetoların duyusal (gevreklik, lezzet ve genel beğeni düzeyi) analizleri yapıldı.
Deneysel gruplar oluşturulurken pratikte kullanımı
kolaylaştırmak amacıyla 4°C’ de 5.96 gün olan grup
4°C’ de 6 gün, 1.17°C’ de 9.5 gün olan grup 2°C’
de 9.5 gün, 4°C’ de 13.04 gün olan grup 4°C’ de 13
gün, 6.83°C’ de 9.5 gün olan grup ise 7°C’ de 9.5
gün olarak değiştirildi. Çalışmanın üçüncü aşamasında ise, modele göre optimum olan (marinasyonda bekleme süresi ve depolama sıcaklığı) noktaya
göre deneysel grup oluşturuldu. Bu gruba ait filetolar bu süre sonunda aerobik olarak paketlendi ve
+4°C’ de depolanarak muhafazanın 0., 15., 30., 45.,
60., 75. ve 90. günlerinde mikrobiyolojik, kimyasal
ve duyusal açıdan incelendi.
Mikrobiyolojik analizler: Mikrobiyolojik analizler için, 25 g numune steril şartlar altında tartıldı
ve üzerine 225 ml steril %0.1’lik peptonlu sudan ilave edilerek homojen hale getirildi. Böylece örneğin
10-1 (1/10)’luk dilüsyonu hazırlandı. Bu dilüsyondan aynı seyrelticiyi kullanmak suretiyle örneğin
10-6’ya kadar diğer seyreltileri yapıldı. Örneklerin
her seyreltisinden birer ml kullanılarak iki seri halinde plak dökme metoduyla ekimleri gerçekleştirildi ve inkübasyon süreleri sonunda 30-300 koloni
içeren plaklar değerlendirildi (13). Örneklerdeki
toplam mezofilik aerob bakteri (TMAB) sayımı için
Plate Count Agar (PCA, Merck, 37±1°C’de 2 gün)
besi yeri kullanıldı. Toplam psikrofilik bakteri sayımı için Plate Count Agar (PCA, Merck, 7±1°C’de
7 gün) besi yeri kullanıldı. Enterobakterilerin (EB)
sayımı için Violet Red Bile Glucose Agar (VRBGA,
30±1°C, 2 gün) kullanıldı (besi yeri çift kat dökülmüştür). Örneklerdeki maya ve küf sayımı için Rose
Bengal Chloramphenicol Agar (25±1°C, 5 gün) besi
yeri kullanıldı (13).
Kimyasal analizler: Örneklerdeki pH değerleri, pH metre (Crison, Basic 20) ile tespit edildi (2).
Örneklerdeki toplam uçucu bazik azot (TVB-N)
miktarları Varlık ve ark.’ nın (27) bildirdiği yönteme
göre, tiyobarbitürik asit sayısı tespiti ise Tarladgis
ve ark.’ nın (26) belirlediği yönteme göre tespit edildi.
Duyusal analizler: Deneyimli 7 panelist tarafından 1-5 arası puan (1 çok kötü, 2 kötü, 3 normal,
4 iyi ve 5 çok iyi) verilerek örnekler renk, koku,
tekstür ve genel beğeni düzeyi (GBD) açısından değerlendirildi (16).
İstatistiksel analizler: Bu araştırmada, verilerin değerlendirilmesinde varyans analizi (ANOVA)
testinden yararlanıldı. İstatistiki analizlerde 0.05’lik
önem düzeyi (P<0.05) dikkate alındı. Bütün analizler SPSS®12 bilgisayar istatistik programından yararlanıldı (20). İki girdi değişkeni için cevap fonksiyonlarının optimum olduğu noktaları bulmak için
MBT kullanılmıştır. MBT için bağımsız değişkenler
kübik yüzeyde gösterilerek, kodlu faktörler cinsinden bağımsız değişkenlerin en düşük ve en yüksek
değerleri -1 ve 1, merkez noktası ise 0 olarak ifade
edilmiştir. Küpün merkez boyunca ekseninden eşit
uzaklıktaki farklı noktalar ise -1.414 ya da 1.414
olarak kodlanmıştır (23). Böylece modelin öngördüğü deneyler yapılarak cevap fonksiyonlarına bağımsız değişkenlerin etkisi incelenmiş ve bağımsız
değişkenleri bağımlı değişkenlere gerçek ya da
kodlu değişkenler cinsinden bağlayan eşitlikler elde
edilmiştir (Eşitlik 1).
Y = β0 + β1X1+ β2 X2+ β 11 X211 +β 22 X222 +β 12
X12 (Eşitlik 1)
Eşitlikte Y cevap fonksiyonunun ölçülen değerini, β0 sabit terimi, β1 ve β2 lineer sabitleri, β11 ve β12
quadratik sabitleri, X1 ve X2 ise bağımsız değişkenlerin değerlerini göstermektedir.
Bulgular
Birinci aşamadaki deneysel örneklere ait bulgular: Çalışmanın birinci aşamasında marinasyon
solüsyonunda bekleme süresi ve depolama sıcaklığı
göz önünde bulundurularak 9 farklı deneysel grup
oluşturulmuş ve bu gruplara ait duyusal analiz bulguları tablo 1’ de verilmiştir.
59
Tablo 1. Deneysel örneklere ait duyusal analiz bulguları.
Gruplar
Kriterler
Gevreklik
Koku Renk
Lezzet
GBD
A
3
3.6
2.4
2.6
2.8
B
3.2
3.4
2.8
2.4
2.8
C
3.6
3.4
2.8
2.8
3
D
3.4
3.8
3
3
3.2
E
3.2
4
3.2
3.2
3.2
F
3.8
3.8
3
3
3.6
G
4.2
4
4
4.4
4.4
H
4.6
4.2
4.8
4.6
4.6
I
4.8
4
4.8
4.6
4.8
Experimental dizayn ve analiz bulguları:
Çalışmanın ikinci aşamasında CYY kullanılarak
modele göre belirlenen gevreklik, lezzet ve genel
beğeni düzeyine ait duyusal analiz bulguları Tablo
2’ de verilmiştir. Bağımsız değişkenler olan sıcaklık
(2-6°C) ve zaman (7-12) gün aralığında değiştirilmiştir. Modelde Y1 gevreklik değerini, Y2 lezzet,
Y3 genel beğeni düzeyini, gerçek / kodlu bağımsız
değişkenler olan X1/ x1 marinasyon süresi (gün) ve
X2/ x2 marinasyon sıcaklık değerini (°C) ifade etmektedir.
Tablo 2. İki bağımsız değişken için uygulanan MBT bulguları
Bağımsız Değişkenler
Değişkenler
Deney numarası
X1/x1
X2/x2
Y1 Y2 Y3
1
5.96/-1.414
4.00/0
3.0 2.0 2.6
2
9.50/0
3
9.50/0
4
12.00/1
5
9.50/0
6
13.04/1.414
4.00/0
4.4 4.4 4.6
7
9.50/0
4.00/0
3.0 3.2 3.2
8
9.50/0
4.00/0
3.0 3.2 3.2
9
7.00/-1
6.00/1
3.6 2.8 3.0
10
12.00/1
2.00/-1
4.2 4.4 4.4
11
7.00/-1
2.00/-1
3.0 2.6 2.8
12
9.50/0
4.00/0
3.2 3.2 3.2
13
9.50/0
4.00/0
3.2 3.2 3.2
6.83/1.414 3.4 3.2 3.6
4.00/0
3.0 3.2 3.2
6.00/1
4.8 4.6 4.8
1.17/-1.414 3.2 3.0 3.0
Y1 gevreklik değeri, Y2 lezzet, Y3 genel beğeni düzeyi, gerçek / kodlu
bağımsız değişkenler X1/ x1 marinasyon süresi (gün), X2/ x2 marinasyon
sıcaklık değeri (°C).
60
Yapılan dizayn sonuçlarında gevreklik, lezzet
ve genel beğeni düzeyinin, sıcaklık ve zamana bağlı
olarak değişimi quadratik modele uygun bulunmuştur. Bu uyum R2 değerlerinin yüksek olması ve 1’e
yaklaşması ile anlaşılmaktadır. Bu değer deneysel
ve model değerlerinin arasındaki genel uyumu gösterir. R2 değerleri gevreklik, lezzet ve genel beğeni
düzeyi için 0.9902, 0.9864 ve 0.9554 olarak bulunmuştur. Prediction R2 (R2Pred) ise tahmini model ve
deney arasındaki noktasal uyumu göstermektedir.
R2Pred değerleri gevreklik, lezzet ve genel beğeni düzeyi için 0.9445, 0.9760, 0.7256 olarak bulunmuştur. Değişken sayısı ve cevap değişkenleri arasındaki uyumu gösteren R2adj değerleri gevreklik, lezzet
ve genel beğeni düzeyi için sırasıyla 0.9833. 0.9766
ve 0.9230 olarak bulunmuştur. Modelin başarısı
aynı zamanda sinyal gürültü oranının 4’ ten büyük
olması ile ifade edilir. Gevreklik, lezzet ve genel
beğeni düzeyi için sinyal gürültü oranları 32.877,
32.587 ve 16.307 olarak bulunmuştur. Modelle elde
edilen eşitlikler arasındaki uyumsuzluk ise önemsiz bulunmuştur. Modelin doğruluğunu göstermek
için hesaplanan F değeri (142.02. 101.34. 29.97) ve
çok küçük çıktığında anlamlı olan probobolity (P <
0.005) değerleri model uyumu açısından iyidir.
Gevreklik değerleri, lezzet ve genel beğeni düzeylerinin, marinasyon süresi ve marinasyon sıcak-
lık miktarı ile değişimi quadratik modele uyan eşitliklerle ifade edilmiş ve gerçek değerleri cinsinden
verilmiştir (Eşitlik 2, 3, 4).
Y 1= 7 . 5 1 - 1 . 0 3 X 1- 0 . 4 4 X 2+ 0 . 0 2 X 1X 20.062X12+0.048X22 (Eşitlik 2)
Y2=1.34-0.01X1-0.04X2 -5.10-30.02X1X2+0.01
92X12+0.018X22 (Eşitlik 3)
Y3=5.38-0.68X1-0.33X2 +1.10-2X1X2 +0.05X12+
0.004X22 (Eşitlik 4)
Elde edilen eşitliklerde görüldüğü gibi, aynalı
sazan filetolarının gevreklik değerleri, lezzet ve genel beğeni düzeyleri, marinasyon süresi ve marinasyon sıcaklık değeri ile birinci ve ikinci dereceden
etkilenmektedir. Ayrıca zaman ve sıcaklık birlikte
etkilemektedir.
Elde edilen eşitlikler ve modelin deney sonuçları ile uyumuna bağlı olarak ANOVA testi ile CYY
kullanılarak bağımsız değişkenler için en iyi marinasyon koşulları biberiye yağı miktarı 11.96 gün ve
filetoların marinasyonda bekleme süresi ise 5.26 oC
olarak bulunmuştur. Bu noktadaki gevreklik değerleri, lezzet ve genel beğeni düzeyleri ise sırasıyla
4.4, 4.2 ve 4.4 olarak bulunmuştur. CYY ile elde
edilen gevreklik, lezzet ve genel beğeni düzeylerinin marinasyon süresi ve sıcaklığı ile değişimi üç
boyutlu olarak gösterilmiştir (Şekil 1).
Şekil 1. Cevap yüzey yöntemi ile gevreklik, lezzet ve genel beğeni düzeylerinin üç boyutlu gösterimi.
Grafiklerden gevreklik ve genel beğeni düzeyinin sıcaklık ve marinasyon süresine bağlı olarak
yavaş bir artış gösterdiği, lezzet düzeyinin ise dik
çıkan eğrilerden hızlı bir artış gösterdiği anlaşılmaktadır.
Üçüncü aşamadaki deneysel örneklere ait
bulgular: Çalışmanın üçüncü aşamasında, dizayn
ile belirlenen optimum noktadaki değerlere ait deneysel bir grup oluşturulmuştur. Dizayna göre belirlenen optimum noktalar marinasyonda bekleme
süresi 11.96 gün ve depolama sıcaklığı 5.26°C olup,
yine pratik kullanımı kolaylaştırmak amacıyla süre
12 gün, sıcaklık ise 5.5°C olarak değerlendirilmiş
ve deneysel örnekler bu şartlarda marine edilmiştir.
Bu gruba ait mikrobiyolojik analiz bulguları Tablo
3’ te, kimyasal analiz bulguları Tablo 4’ de duyusal
analiz bulguları Tablo 5’ de verilmiştir. Deneysel örneklerde muhafaza periyodu boyunca Enterobakteri
sayısı ve maya- küf sayısı tespit edilebilir limitin (<
1.0 log10 kob/g) altında bulunmuştur.
Tablo 3. Deneysel Örneklere Ait Mikrobiyolojik Analiz
Bulguları.
Muhafaza süresi (gün)
Mikroorganizma
(log10 kob/g)
0
15
30
45
60
75
90
TMAB
3.2c 3.8c 4.6b 5.2b 5.9b 6.7a 7.1a
PB
2.8b 3.1b 3.9a 3.6ab 4.4a 5.3a 4.9a
a, b: Aynı satırda farklı harflerle belirtilen ortalamalar arası fark önemlidir (P < 0.05). n: 3.
Tablo 4. Deneysel Örneklere Ait Kimyasal Analiz
Bulguları.
Analiz
0
15
30
45
60
75
90
TVB-N
12.8b 13.6b 14.8b 24.2a 26.8a 24.8a 26.8a
mg/100g
TBA mg
1.14b 1.11b 1.26b 1.83ab 2.1a 2.73a 2.8a
MDA/kg
pH
4.08a 4.11a 4.15a 4.19 a 4.10a 4.16a 4.2a
a, b: Aynı satırda farklı harflerle belirtilen ortalamalar arası fark önemlidir (P < 0.05). n: 3.
Tablo 5. Deneysel Örneklere Ait Duyusal Analiz
Bulguları.
Kriterler
0
Gevreklik 4.4
a
15
30
45
60
75
90
4.6
4.2
4.2
4
4.2
a
4a
3b
3.2b
3b
4.2 a 3.2b
3b
2.8b
3.2b
3b
3.6ab 3.4b
3.2b
a
a
a
Koku
4a
4a
4.2a 3.8ab
Renk
4a
3.8a
4a
Lezzet
4.2a
4a
3.6a
3.8a
GBD
4.4a
4a
4a
4a
a
3b
a, b: Aynı satırda farklı harflerle belirtilen ortalamalar arası fark önemlidir (P < 0.05). n:3.
61
Marinasyon işleminin sonlandırılmasında balıketinin pH değeri ve duyusal özellikleri dikkate alındığı
bilinmektedir (14). Alabalık marinatında olgunlaşma süresinin belirlenmesi için yapılan bir araştırmada ortalama olgunlaşma süresinin pH değeri dikkate alınarak, 26 saat olduğu rapor edilmiştir (11).
Dokuzlu (6) yapmış olduğu bir çalışmada farklı asit
ve tuz konsantrasyonunda marine edilen balıketinin olgunlaşma süresini organoleptik özelliklere
göre belirlediğini bildirmiştir. Mevcut çalışmada
ise deneysel örneklere ait duyusal kriterler esas alınarak deneysel gruplar arasında CYY kullanılarak
optimum bir noktanın belirlenmesi amaçlanmıştır.
İşlenmiş balıklar için duyusal analizler genellikle
tazeliği belirlemede yeterli olup, duyusal analiz metodunda görünüm, koku, tat ve yumuşaklık-sertlik
dereceleri insan duyuları yardımıyla değerlendirilmekte ve söz konusu duyusal özellikler kalite kontrolde önem taşımaktadır (18). Bütün bunlar göz
önünde bulundurularak optimum noktanın belirlenmesinde duyusal kriterler kullanılmıştır.
Mevcut çalışmada marinasyon işlemi için üç
farklı sıcaklık derecesi (2, 4 ve 6°C) ve depolama
süresi (7, 9 ve 12 gün) seçilmiştir. Gökoğlu ve ark.
(10), sardalya balıklarını +4°C’ de 24 saat, Kılınç
ve Çaklı (15), yine sardalya balıklarını +4°C’ de 22
gün marine ettiklerini bildirmişlerdir. Hamsi balıklarının marine edildiği başka bir çalışmada marinasyon işlemi +4°C’ de 24 saat süre ile yapıldığı rapor
edilmiştir (21). Mevcut çalışmanın ilk aşamasında
6°C’ de 12 gün marine edilen örneklerde duyusal
özellik bakımından daha yüksek puanlar aldığı görülmüş bu durumun ise marinasyon solüsyonu ile
balıketi arasındaki tuz ve asit geçişinin sıcaklığa
bağlı olarak değişmesinden kaynaklandığı düşünülmektedir (4, 6). Deneysel örneklerin marinasyonu
için belirlenen sıcaklık derecesi en yüksek olarak
6°C olarak seçilmiştir. Sıcaklığın artması marinasyon süresini kısaltmaktadır fakat bakterilerin amin
üretimini büyük ölçüde etkilemektedir (5).
Deneysel çalışmalarda en iyi deney koşullarının tespit edilmesi için CYY ve MBT yöntemlerini kullanmak mümkündür. Shan (24); aynalı sazan
balığı filetolarının H2O2 ile dekontaminasyonunda
CYY ve MBT yöntemi ile H2O2 konsantrasyonunu
optimize etmiştir. Dündar (7); köfte örneklerinin
62
muhafaza süresini uzatmak amacıyla yapmış oldukları çalışmada koruyucu madde miktarını ve pişirme
süresini CYY ve MBT yöntemi kullanarak optimize
ettiklerini bildirmiştir. Gibis (12); soğan, sarımsak
ve limon suyu konsantrasyonlarını CYY ile dizayn
ederek, elde ettiği optimum noktalarda köfteleri
marine etmiş ve deneysel örneklerdeki heterosiklik
aromatik amin miktarlarını araştırmıştır. Anihouvi
ve ark. (1); fermente balık yapımında, fermantasyon süresi, tuz oranı ve olgunlaşma süresini içeren
fermantasyon koşullarını CYY ile modellediklerini
bildirmişlerdir. Lee ve ark. (17); muz suyunun ekstraksiyonla elde edilmesine yönelik yaptığı çalışmada farklı sıcaklık (35-95°C) ve sürelerde (30-120
dk) en iyi ekstraksiyon koşullarının bulunması için
MBT kullanmıştır. 95°C ve 120 dakikada optimum
verimi elde etmiştir. Dundar ve ark. (7) ise beş faktörlü MBT yaparak NaCl (%0-2), yağ (%10-30),
askorbik asit (0-600 ppm), pişirme sıcaklığı (150230°C) ve pişirme süresi (5-15 dk) gibi parametrelerin fizikokimyasal özellikler üzerine etkisini incelemiştir.
Optimum koşullara ait noktalarda oluşturulan
deneysel örnekler TMAB, PB, EB ve maya-küf
açısından incelenmiştir. Araştırmamızda muhafaza
süresinde EB, maya ve küfe rastlanmamıştır. Fuselli
ve ark. (9); yaptığı çalışmada soğuk marine edilmiş
hamside depolama sonunda Enterobakteri, maya
ve küfe rastlamadıklarını bildirmişlerdir. Cadun ve
ark. (3)’nın marine ettikleri çimçim karideslerinin
ve Kılınç ve Çaklı (15)’nın sardalyeden elde ettikleri marinatların raf ömrünün belirlenmesi üzerine
yaptıkları çalışmalarda 6 ay boyunca maya ve küf
üremesinin görülmediğini rapor etmişlerdir. Benzer
şekilde Olgunoğlu (19), tarafından marine edilmiş
ve 7 ay süre ile depolanmış hamside maya- küf
görülmediği bildirilmiştir. Söz konusu bu sonuçlar
çalışmamızda elde edilen bulguları desteklemektedir. Özoğul ve ark. (22)’ nın deneysel olarak oluşturdukları marinatların bakteriyolojik değerlendirilmesi için yaptıkları araştırmada, TAMB sayısının 3
ayın sonunda 4 log kob/g, depolamanın sonunda ise
3 log kob/g değerinin altında kaldığını bildirmişlerdir. Cadun ve ark. (3)’nın 40 gün süre ile depoladıkları çimçim karides marinatında TAMB sayısını
antimikrobiyal ajan eklenmemiş marinatlarda 4.03
log kob/g olarak bildirmişlerdir. Fuselli ve ark. (9)
soğuk marine edilmiş hamside yaptıkları çalışmada marinasyonun tamamlandığı safhada TMAB ve
PB rastlamadıklarını bildirmişlerdir. Kılınç ve Çaklı
(15)’nın sardalyeden elde ettikleri marinatların raf
ömrünü belirlemek için yaptıkları çalışmalarında,
6 aylık depolamanın sonunda pastörizasyon işlemi uygulanmamış grupta TAMB sayısını 6.36 log
kob/g olarak bildirmişlerdir. Aynı araştırıcılar PB
sayısını ise sayılamayacak düzeyin altında olarak
bildirmişlerdir ki, bu sonuç çalışmamızdaki değerlerle örtüşmemektedir. Dokuzlu (6), yaptığı çalışmada %2 asetik asit ve %12 tuz solüsyonunda muhafaza süresi sonunda TVB-N değeri 26.8 mg/100
g olarak belirlenmiştir. Tarım Bakanlığı tarafından
hazırlanan Su Ürünleri Yönetmeliğine göre; 20 mg
Azot/100g’a kadar uygun, 20-28 mg Azot/100g’a
arası kabul edilebilir, 28 mg Azot/100g’dan yukarı
kabul edilemez şeklinde bildirilmiştir (25). Varlık
ve ark.(28) tarafından yapılan bir çalışmada; +4 ±
1°C’ de depolanan marine hamsi köftesinde 150.
günde TVB-N değerinin 10.35 mg/100g olarak rapor edilmiştir. Dokuzlu (9)’nun hamsi marinatları
üzerine yaptığı çalışmada; TVB-N değerini depolamanın ilk 6 ayı 9.8 mg/100g olarak sabit kaldığını 7.
ayda 1.2 mg/100g, 8. ayda 14 mg/100g olarak rapor
etmiştir. Araştırma sonucunda elde edilen TBA değerleri arasında yapılan istatistiksel karşılaştırmada
depolama süresine bağlı artışın önemli olduğu saptanmıştır (P < 0.05). Erdem ve ark.(8) tarafından
yapılan çalışmada; marine edilen istavrit balığını
+4°C’ depolamışlar ve başlangıçtaki TBA değerlerinin çalışmamızdaki değerlere benzerlik göstermesine karşın 90. gün sonunda 4.09 mg MA/kg olarak
bildirmişlerdir. Araştırma sonucunda elde edilen pH
değerleri arasında yapılan istatistiksel karşılaştırmada depolama süresine bağlı değişimlerin önemli
olmadığı saptanmıştır (P > 0.05). Dokuzlu (9), + 4 ±
1°C’ de depoladığı hamsi marinatlarında pH değerini depolamanın başlangıcında 3.87 tespit etmiş depolama sırasında gösterdiği değişimlerin ardından
depolama sonunda 3.98 olarak bildirmiştir.
Sonuç olarak, CYY ile belirlenen optimum
noktadaki marine edilmiş filetolarda muhafaza süresi 90 gün olarak belirlenmiştir. Marinasyon tekniği
kullanılarak balıketinin muhafaza süresini uzatmak
çok eski zamanlardan beri kullanılan bir yöntemdir. Marinasyon işleminin sonlandırılması duyusal
olarak değerlendirilmekte ve araştırmacılara göre
değişiklik arz etmektedir. Buradan yola çıkarak,
deneysel grupları aza indirgemek için kullanılan
CYY yöntemi kullanılarak, daha hızlı sonuca ulaşmak böylece zaman ve iş gücünden tasarruf etmek
amaçlanmıştır.
Kaynaklar
1. Anihouvi VB, Saalia F, Sakyi-Dawson E, Ayernor GS,
Hounhouigan JD, (2011). Response surface methodology
for optimizing the fermentation conditions during the processing of cassava fish (Pseudotolithus sp) into Lanhouin.
IJEST. 3, 7085-7095.
2. Association Official Analytical Chemists, (1990). Official
Methods of Analysisof the Association of Official Analytical
Chemists. 15th edition. Washington.
3. Cadun A, (2002). Çimçim karidesten (Parapenaus longirostris, Lucas,1846) marinat yapımı ve kalitesi üzerine bir
çalışma. Yüksek Lisans Tezi, EÜ Fen Bilimleri Enstitüsü.
4. Çelik U, (2004). Marine edilmiş akivades (Tapes decussatus L., 1758)’in kimyasal kompozisyonu ve duyusal analizi.
Ege Üniv Su Ürün Dergi. 21, 219-221.
5. Çolak H, Aksu H, (2002). Gıdalarda biyojenik aminlerin
varlığı ve amin oluşumunu etkileyen faktörler. YYÜ Vet
Fak Derg. 13, 35-40.
6. Dokuzlu C, (1996). Marinat hamsi üretimi sırasında kullanılan asit-tuz oranlarının ürünün mikrobiyolojik ve organoleptik kalitesi üzerine etkileri ve raf ömrünün belirlenmesi.
Doktora Tezi, UÜ Sağlık Bilimleri Enstitüsü.
7. Dündar A, Sarıçoban C, Yılmaz MT, (2012). Response
surface optimization of effects of some processing variables
on carcinogenic/mutagenic heterocyclic aromatic amine
(HAA) content in cooked patties. Meat Science. 91, 325333.
8. Erdem ME, Bilgin S, Çağlak E, (2005). Tuzlama ve marinasyon yöntemleri ile işlenmiş istavrit balığının (Trachurus
mediterraneus) muhafazası sırasındaki kalite değişimleri.
OMÜ Zir Fak Dergisi. 20,(3), 1-6.
9. Fuselli R, Casales MR, Fritz R, Yeannes ML, (1996).
Isolation and characterization of microorganism associated with marinated anchovy (engraulis anchoita). J Aquat
Food Prod Tech. 7, (3), 29-38.
10. Gökoğlu N, Cengiz E, Yerlikaya P, (2004). Determination
of the shelf life of marinated sardine (Sardina pilchardus)
stored at 4°C. Food Control. 15, 1-4.
11. Gün H, Gökoglu N, Varlık C, (1994). Alabalık
(Onchorynchus Mykiss, W., 1792) marinatında olgunlaşma
süresinin belirlenmesi. İÜ Su Ürünleri Dergisi. 1-2, 137144.
12. Gibis M, (2007). Effect of oil marinades with garlic, onion,
and lemon juice on the formation of heterocyclic aromatic
amines in fried beef patties. J Agric Food Chem. 55, 1024010247.
13. Harrigan WF, (1998). Laboratory Methods in Food
Microbiology. 3rd edition. London: Academic Press.
14. Kılınç B, Çaklı Ş, (2000). Marinat teknolojisi. EÜ Su
Ürünleri Dergisi. 21, 153-156.
63
15. Kılınç B, Çaklı Ş, (2005). Determination of the shelf life
of sardine (Sardina pilchardus) marinades in tomato sauce
stored at 4°C. Food Control. 16 , 639-644.
16. Kurtcan Ü, Gönül M, (1987). Gıdaların duyusal değerlendirilmesinde puanlama metodu. Ege Univ Müh Fak Derg.
5, 137-146.
17. Lee WC, Yusof S, Hamid BS, (2006). Optimizing conditions for hot water extraction of banana juice using response surface methodology (RSM). J Food Eng. 75, 473479.
18. Olafsdottir G, Nesvadba P, Natale CD, Careche M,
Oehlenschlager J, Tryggvadottır SV, Schurıng R,
Kroeger M, Heia K, Esaiassen M, Macagnano A,
Jørgensen BM, (2004). Multisensor for fish quality determination. Trends Food Sci Tech. 15, 86-93.
19. Olgunoğlu İA, (2010). Hamsi (Engraulis encrasicolus)
marinasyon prosesinde tehlike analizleri ve kritik kontrol
noktalarının belirlenmesi. GTED. 5, 36-48.
20. Özdamar K, (2001). SPSS İle bioistatistik. Kaan Kitapevi.
Eskişehir.
21. Özden Ö, (2005). Changes in amino aacid and fatty acid
composition during shelf-life of marinated fish. J Sci Food
Agr. 85, 2015-2020.
22. Özoğul Y, Özyurt G, Özoğul F Kuley E, Polat A, (2005).
Freshness assessment of Europen eel (Anguilla anguilla)
by sensory, chemical and microbiological methods. Food
Chemistry. 92, 745-751.
23. Rastogi NK, Rashimi KR, (1999). Optimisation of enzymatic liquefaction of mango pulp by response surface methodology. Eur Food Res Technol. 209, 57-62.
24. Shan H, Gorczyca E, Kasapıs S, Lopata A, (2010).
Optimization of hydrogen-peroxide washing of common
carp kamaboko using response surface methodology. LWT
- Food Science and Technology. 43, 765-770.
25. Su Ürünleri Kalite Kontrol El Kitabı, (2000). T.C.
Tarım ve Köyişleri Bakanlığı Koruma ve Kontrol Genel
Müdürlüğü. p. 229.
26. Tarladgis BG, Watts BM, Younnathan MT, Dugan LR,
(1960). A distillation method for the quantative determination of malonaldehyde in rancid foods. J Am Oil Chem Soc.
37, 44-48.
27. Varlık C, Uğur M, Gökoğlu N, Gün H, (1993). Su
Ürünlerinde Kalite Kontrol İlke ve Yöntemleri. Gıda
Teknolojisi Derneği. Ayrıntı Matbaası, İstanbul.
28. Varlık C, Erkan N, Metin S, Baygar T, Özden Ö, (2000).
Marine balık köftesinin raf ömrünün belirlenmesi. Türk J
Vet Anim Sci. 24, 593-597.
Etlik
23, 64-69,
2012 Ş. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 23,Araştırma
Makalesi / Research Article
64 Vet Mikrobiyol Derg,Gülen
AU, Kırkan
64-69, 2012
Köpeklerin idrar örneklerinden Klebsiella pnemoniae identifikasyonu ve
antibiyotik duyarlılıkları
Andaç UZER GÜLEN, Şükrü KIRKAN
Adnan Menderes Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Aydın
Özet: Araştırmamızda İzmir ili ve çevresindeki üriner sistem hastalığına yakalanmış 200 adet sahipli köpekten idrar
örnekleri alınmış ve bu örneklerden bakteriyel etkenlerin izolasyon ve identifikasyonları yapılmış, etkenlerin antibiyotik duyarlılıkları belirlenmiştir. Araştırma sonucu izole edilen mikroorganizmalar Klebsiella pneumoniae (%11.5),
Staphylococcus aureus (%10.5), Corynebacterium spp. (%7.5), Koagulaz Negatif Stafilokok’lar (%5.5), Streptococcus
spp. (%7), Enterococcus spp. (%2), Escherichia coli (%1.5), Proteus vulgaris (%1.5), Bacillus spp. (%1), Pasteurella
ureae (%1), Candida albicans (%1), Pasteurella pneumoniae (%0.5), Plesiomonas shigelloides (%0.5), Neisseria spp.
(%0.5), Flavobacterium spp. (%0.5) olarak belirlenmiştir. 96 adet idrar örneğinde (%48) bakteriyolojik üreme tespit edilememiştir. Araştırmada incelenen Klebsiella pneumoniae izolatları Gentamisin’e %52.2 oranında duyarlı bulunurken,
Sulbaktam-Ampisilin’e %87 oranında, Kanamisin’e ise %52.2 oranında direnç geliştiği tespit edilmiştir.
Anahtar kelimeler: Antibiyotik duyarlılığı, bakteri, identifikasyon, Klebsiella pneumoniae, köpek.
The identification and antibiotic susceptibilities of Klebsiella pneumoniae from dog urine
samples
Summary: In this study, a total of 200 urine specimen were collected from owned dogs with urinary system infection
in the region of Izmir province and bacterial isolation, identification and antibiotic susceptibility were detected. The
microorganisms isolated from these urine samples are Klebsiella pneumoniae (11.5%), Staphylococcus aureus (10.5%),
Corynebacterium spp. (7.5%), Coagulase Negative Staphylococci (5.5%), Streptococcus spp. (7%), Enterococcus spp.
(2%) Escherichia coli (1.5%) Proteus vulgaris (1.5%) Bacillus spp. (1%), Pasteurella ureae (1%), Candida albicans
(1%), Pasteurella pneumoniae (0.5%), Plesiomonas shigelloides (0.5%), Neisseria spp. (0.5%), Flavobacterium spp.
(0.5 %), respectively. No bacterial growth from out of 96 (48%) specimen was detected. While the isolates examined in
this study was found susceptible to Gentamicin in the ratio of 52.2%, the isolates were also found resistant to SulbactamAmpicillin in the ratio of 87%, and resistant to Kanamicine acid in the ratio of 52.2%.
Keywords: Antibiotic susceptibility, bacteria, dog, identification, Klebsiella pneumoniae.
Giriş
Klebsiella türleri geniş alanda enfeksiyonlara neden
olan oportunistik patojenlerdir. ABD ve Avrupa’da
tüm nozokomiyal bakteriyel enfeksiyonların %8’ini
oluştururlar. En sık olarak, Klebsiella türleri üriner
sistem enfeksiyonları, pnömoni, bakteremi, neonatal sepsis ve yara enfeksiyonlarına neden olan
ajanlar olarak izole edilmektedir. Bu enfeksiyonlardaki en önemli mikroorganizma K.pneumoniae’dır
ve onu K.oxytoca takip eder. Bu türlerin neden olduğu hastalıklara karşılık, K.ozaenae ve
K.rhinoscleromatis’den dolayı olan enfeksiyonlar
belirli vücut kısımlarıyla sınırlıdır ve çoğunlukla insanda burun mukozasına yerleşir. K.ozaenae, ozena
denen bir atrofik rinit sebebidir fakat bu organiz-
madan kaynaklanan diğer sporadik enfeksiyonlar
da bilinmektedir. K.rhinoscleromatis, rinosklerom
olarak adlandırılan, çeşitli ülkelerde endemik olan,
burnun kronik granülomatöz enfeksiyonun etiyolojik ajanıdır. K.planticola ve K.terrigena başlangıçta klinik belirti vermediği ve su, bitki ve toprakla
sınırlandığı düşünülse de, klinik örneklerde ortaya
çıktığı gösterilmiştir. K.planticola insan enfeksiyonlarından Klebsiella türleri arasında %3,5-20 sıklığında izole edilmiştir (24).
Klebsiella pneumoniae fakültatif anaerob, gram
negatif bir bakteridir. Klebsiella, nadiren enterik
hastalıklara neden olan minör intestinal kommensal
bir organizmadır. Bu bakteri sığırlarda mastitis, kısraklarda metritis, buzağılarda septisemi, köpeklerde
Yazışma adresi / Correspondance: Şükrü KIRKAN, Adnan Menderes Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı,
09016 Işıklı, Aydın, Türkiye Eposta: [email protected]
Gülen AU, Kırkan Ş. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 23, 64-69, 2012
pnömoni ve üriner sistem infeksiyonları, taylarda
pnömoni ve septisemi ve çocuklarda poliartritis
sorunlarına neden olan bir oportunistik patojendir.
Buna ek olarak Klebsiella, çoklu antibiyotiklere
karşı direnç kazanabilir ve hospitalize insanlar ile
hayvanlarda nozokomiyal yaralar ve üriner sistem
infeksiyonlarının önemli bir sebebidir (21).
Bakteriyel üriner sistem enfeksiyonları (ÜSE)
köpeklerde en önemli klinik problemlerdendir ve yaşamlarının bir döneminde, tüm köpeklerin %14’ünde
meydana gelir (15, 16). Üriner sistem enfeksiyonlarına en sık sebep olan bakteriler Escherichia coli,
Proteus, Staphyloccus, Steptococcus, Klebsiella,
Enterobacter ve Pseudomonas türleridir (9). Bu
bakteriyel ÜSE’ları sıklıkla canine ürolitiyazisi ile
birlikte ortaya çıkar ve izole edilen bakteri, ürolitiyazis göstermeyip üriner sistemi enfeksiyonu olan
hastalarda bulunanlardakilerle benzerdir. Bakteriyel
ÜSE’nun rolü, ürolit tipi ile değişir. Özellikle
Staphylococcus intermedius ve Proteus türleri gibi
üreaz üreten bakterilerin neden olduğu bakteriyel
ÜSE, strüvit (magnezyum amonyum fosfat) ürolitlerin başlangıç, gelişme ve tekrar meydana gelmesinde önemli bir predispoze faktördür (18). Oysa
kalsiyum oksalat, sistin, ürat veya silis gibi metabolik ürolitli hastalarda bakteriyel ÜSE sıklıkla
sekonder olarak ortaya çıkan bir komplikasyondur
(12, 27). Bununla birlikte, üriner sistemdeki kalsiyum oksalat ve diğer steril ürolitler, ÜSE sırasında
üreaz üreten veya üretmeyen bakteriler ile enfekte
hale gelebilirler (23, 26).
Ürolit içindeki bakteri muhtemelen, mevcut
urolitin yapısını temsil eder (19, 20). Canine ürolitiyazis durumunda, idrar kültürü ile bulunamayan
ÜSE’nu tespit etmek için, (aerobik bakteriyel kültürü elde etmek için) ürolitlerin olduğu kadar idrar kesesinin de mukozal biyopsisinin, sistotomi sırasında
aseptik olarak yapılması önerilmektedir (6, 22, 28,
29). Bu bakteriyel ÜSE’ları ürolitlerle aynı ya da
daha şiddetli problemlere yol açabilmektedir (2,
25). Bu nedenle, bakteriyel ÜSE’nu tam olarak eradike etmek için, antimikrobiyel duyarlılık testlerini
yapmak ve bakteriyi identifiye etmek çok önemlidir.
Bu araştırma ile köpek idrar örneklerinden
Klebsiella pneumoniae identifikasyonunun yapılması ve izole edilen suşların antibiyotik duyarlılıklarının belirlenmesi hedeflenmiştir.
65
Materyal ve Metot
Örnekler
İzmir ili ve çevresinde bulunan sahipli köpeklerden tekniğine uygun olarak alınan 200 adet idrar
örneği Adnan Menderes Üniversitesi Veteriner
Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Rutin Teşhis
Laboratuvarına soğuk zincirde getirilmiştir. İdrar
örneklerinin ekimleri laboratuvara getirildikten
sonra bekletilmeden yapılmıştır.
Antibiyotik diskleri
Antibiyotik direncinin belirlenmesinde Sulbaktam
Ampisilin (SAM; 10 μg), Oksitetrasiklin (OT; 30
μg), Gentamisin (CN; 10 μg), Kanamisin (C; 5
μg), Sulfometoksazol-Trimetoprim (SXT; 30 μg),
Danofloksasin (DFX; 30 μg) disklerinden yararlanılmıştır.
Örneklerden patojen etken izolasyonu
İdrar örneklerinin %7 koyun kanı ilaveli kanlı agarlara ve MacConkey agarlara direkt idrar ve tortudan
olmak üzere ekimleri yapıldı. Besiyerleri 37°C’de
24 saat aerobik olarak inkube edildi (13). İzolasyon
besiyerinde üreyen mikroorganizmaların morfolojileri, pigment ve hemoliz özellikleri ve Gram boyama özellikleri incelenerek, şüpheli kolonilerin
biyokimyasal özelliklerine göre identifikasyonları
yapıldı.
Şüpheli kolonilerin kanlı agarlara pasajları yapılarak saf kültürleri elde edildi. Saf kültürlere katalaz, koagulaz ve oksidaz testleri uygulandı. Bu testler sonucunda Gram pozitif olanların identifikasyonları yapıldı. Ayrıca Gram negatif kolonilerden
Lassen’in üçlü tüp besiyerlerine ekimleri yapıldı.
Indol, ornitin dekarboksilaz, Metil red testleri negatif, lisin dekarboksilaz, Voges proskauer testleri
pozitif ve 10°C’de üreme göstermeyen koloniler
Klebsiella pneumoniae olarak identifiye edildi.
Lassen üçlü tüp besiyerleri 37°C’de 24 saat inkube
edildi. İnkubasyondan sonra tüpler değerlendirildi
ve Gram negatif suşların identifikasyonları gerçekleştirildi (7, 8, 13, 14).
Bulgular
Bu tez çalışması ile köpeklerde görülen ve üriner
sistem infeksiyonlarında klinik belirti saptanan hay-
66
vanlardan Klebsiella pneumoniae ve diğer bakteri
türleri izole ve identifiye edilmiştir. Araştırmamızda
İzmir ili ve çevresinde bulunan sahipli köpeklerden
toplanan 200 adet idrar örneğinden aerobik ekimler
yapılmıştır. Yapılan ekimler sonucunda toplam 104
(%52) örnekten etken izolasyonu gerçekleştirilmiştir. Yapılan ekimler sonucu üreme gösteren örneklerden identifiye edilen etkenler Tablo 1’de gösterilmektedir.
Tablo 1. İdrar örneklerinden izole edilen mikroorganizmalar
İzole Edilen Etiyolojik Etken
İncelenen Örnek Sayısı
(n: 100)
spp. (%0.5), Flavobacterium spp. (%0.5) olarak
identifiye edildi. 96 adet idrar örneğinde (%48) bakteriyolojik üreme tespit edilememiştir.
Araştırmamızda
incelenen
23
adet
Klebsiella pneumoniae suşunun 7 (%30.4)’si
Danofloksasin’e duyarlı, 8 (%34.8)’i Kanamisin’e
duyarlı, 12 (%52.2)’si Gentamisin’e duyarlı, 2 (%8.7)’si Sulbaktam-Ampisilin’e duyarlı, 8 (%34.8)’i Oksitetrasiklin’e duyarlı, 8
(%34.8)’i Sulfometoksazol-Trimetoprim’e duyarlı olarak saptanmıştır. Ayrıca 11 (%47.8) adet suş
Danofloksasin’e, 12 (%52.2) adet suş Kanamisin’e,
4 (%17.4) adet suş Gentamisin’e, 20 (%87) adet
suş Sulbaktam-Ampisilin’e, 12 (%52.2) adet
suş Oksitetrasilklin’e, 15 (%65.2) adet suş ise
Sulfometoksazol-Trimetoprim’e dirençli olarak
saptanmıştır. Antibiyotiklerin inhibisyon zon sınırları Tablo 2’de gösterilmektedir.
İzolatlar
İzolasyon
yüzdesi (%)
Klebsiella pneumoniae
23
11.5
Staphylococcus aureus
21
10.5
Corynebacterium spp.
15
7.5
Koagulaz Negatif Stafilokok
11
5.5
Tablo 2. Kullanılan antibiyotiklerin etki derecelerine
göre inhibisyon zon sınırları (4)
Streptococcus spp.
14
7
AntibiyotiklerDirençli (R) Az Duyarlı (I) Duyarlı (S)
Enterococcus spp.
4
2
DFX
≤ 17
18-20
≥ 22
Escherichia coli
3
1.5
C
≤ 20
-
≥ 21
Proteus vulgaris
3
1.5
CN
≤ 12
13–14
≥ 15
Bacillus spp.
2
1
SAM
≤ 21
22–29
≥ 30
Pasteurella ureae
2
1
OT
≤ 14
15–20
≥ 21
Candida albicans
2
1
SXT
≤ 15
16 – 18
≥ 19
Pasteurella pneumoniae
1
0.5
Plesiomonas shigelloides
1
0.5
Neisseria spp.
1
0.5
Flavobacterium spp.
1
0.5
Bakteriyel üreme olmayan
96
48
Toplam
200
100
Tablo 1’de görüldüğü gibi toplam incelenen
200 adet idrar örneğinden izole edilen mikroorganizmalar sırasıyla Klebsiella pneumoniae (%11.5),
Staphylococcus aureus (%10.5), Corynebacterium
spp. (%7.5), Koagulaz Negatif Stafilokok’lar
(%5.5), Streptococcus spp. (%7), Enterococcus
spp. (%2) Escherichia coli (%1.5) Proteus vulgaris
(%1.5) Bacillus spp. (%1), Pasteurella ureae (%1),
Candida albicans (%1), Pasteurella pneumoniae
(%0.5), Plesiomonas shigelloides (%0.5), Neisseria
DFX: Danofloksasin, K: Kanamisin, CN: Gentamisin, SAM:
Sulbaktam-Ampisilin, OT: Oksitetrasiklin, SXT: SulfametaksazolTrimetoprim
Tartışma ve sonuç
E.coli, Staphylococcus spp., Proteus spp., Klebsiella
spp., ve Enterococcus spp., köpeklerde idrar yolu
infeksiyonlarında en sık izole edilen mikroorganizmalardır. Prevalans açısından yapılan çalışmalarda
Klebsiella spp. ve E.coli türlerinin yoğunluğu daha
fazla görülmektedir. Bizim çalışmamızda da en sık
izole edilen bakteri Klebsilella pneumoniae olarak
saptanmıştır. Diğer bakteriyel etkenlere ek olarak
bir adet Candida albicans izolatının saptanması,
uterusta şekillenmesi muhtemel olan mikotik bir infeksiyonu akla getirmektedir. Barrak ve arkadaşları
(1) köpek ve kedilerde görülen üriner sistem infeksiyonları hakkında yaptıkları bir çalışmada köpeklerde çiftleşme sonucu uterusta mikotik infeksiyon-
ların gelişebileceğini ve bu infeksiyonların genitoüriner bölgede yayılabileceğini belirtmişlerdir.
Ülkemizde, Günay ve arkadaşlarının köpeklerde farklı siklus evrelerindeki bakteriyel vaginal floranın incelenmesi üzerine yaptıkları bir araştırmada
(6), değişik ırklardan 53 adet dişi köpek materyal
olarak kullanılmıştır. Çeşitli ırklardan 53 adet köpekten alınan vaginal svaplardan 48 (%90.5)’inden
56 adet etken izole edilmiştir. Bunların 9’u E.coli
(%16), 9’u Candida spp. (%16), 6’sı Citrobacter
diversus (%10.7), 5’i. Citrobacter freundii (%8.9),
4’ü Klebsiella oxytoca (%7.1), 4’ü Klebsiella
pneumoniae (%7.1), 3’ü S.aureus (%5.3), 3’ü
S.intermedius (%5.3), 3’ü Bacillus spp. (%5.3),
2’si. S.saprophyticus (%3.5), 2’si Streptococcus
agalactiae (%3.5), 2’si Micrococcus spp. (%3.5),
2’si Citrobacter amalonaticus (%3.5) ve 2’si
Enterobacter agglomerans (%3.5) olarak izole ve
identifiye edilmiştir. Klebsiella pneumoniae’nin
%7.1 oranında izole edilmesi dikkat çekicidir.
Kırşan ve arkadaşlarının yaptıkları bir çalışmada (11), sağlıklı dişi köpeklerin uterus ve vaginasından alınan örneklerin bakteriyolojik olarak incelenmesi sonucunda Staphylococcus spp., Streptococcus
spp., E.coli, Klebsiella spp., Pseudomonas spp.,
Micrococcus spp., Proteus spp., Pasteurella spp.,
Corynebacterium spp. ve Bacillus spp. izole etmişlerdir. Vaginal örneklerden izole edilen mikroorganizmalar arasında Staphylococcus spp. (%30.90),
Streptococcus spp. (%29.08), E.coli (%25.45) ve
Pasteurella spp. (%18.18), uterus örneklerinde ise
Streptococcus spp. (%41.29) ve E.coli (%23.91) en
sık izole edilen mikroorganizmalar oldu. Klebsiella
spp. %1.81 oranında izole edilmiştir.
Araştırmamızda incelenen 200 adet idrar örneğinden izole edilen mikroorganizmalar sırasıyla Klebsiella pneumoniae (%11.5),
Staphylococcus aureus (%10.5), Corynebacterium
spp. (%7.5), Koagulaz Negatif Stafilokok’lar
(%5.5), Streptococcus spp. (%7), Enterococcus
spp. (%2) Escherichia coli (%1.5) Proteus vulgaris
(%1.5) Bacillus spp. (%1), Pasteurella ureae (%1),
Candida albicans (%1), Pasteurella pneumoniae
(%0.5), Plesiomonas shigelloides (%0.5), Neisseria
spp. (%0.5), Flavobacterium spp. (%0.5) olarak
identifiye edildi. 96 adet idrar örneğinde (%48) bakteriyolojik üreme tespit edilememiştir.
Enterik Gram-negatif bakterilerde, beta-laktamaz sentezi en önemli antibiyotik direnç meka-
67
nizmasıdır. Geniş spektrumlu beta-laktam (GSBL)
antibiyotiklerin yaygın kullanımı, GSBL gibi daha
geniş spektrumlu betalaktamazların ortaya çıkması
ile sonuçlanmıştır (17). Uzun süre cerrahi kliniklerde manipülasyona maruz kalan, invaziv girişim
uygulanan veya açık yarası bulunan, genel durumu bozuk hastalardan izole edilen GSBL enzimleri
özellikle Klebsiella türleri ve E.coli suşlarında yaygındır (21).
Ulutürk ve ark. (28), idrar yolu enfeksiyonlu
hastalardan izole ettikleri K.pneumoniae suslarının
hemen hemen tümünün ampicilline direnç gösterdigini saptamıslardır. Finkelstein ve ark. (5), üriner
sistem enfeksiyonlarından izole ettikleri Klebsiella
spp. suslarının ampicillin direncini %93 olarak ortaya koymuslardır. Gram negatif bakteriler ile yaptıkları çalısmada Klebsiella türlerinin ampicillin direncini %91 oranında belirlenmiştir. Kim ve ark. (12),
ESBL pozitif K.pneumoniae suslarının Ampicillin
direncini %97.7, olarak saptarken, Borer ve ark.
(3), ESBL üreten Enterobacteriaceae familyası üyesi bakterilerin ampicillin direncini %100 olarak bulmuslardır.
Araştırmamızda
incelenen
23
adet
Klebsiella pneumoniae suşunun 7 (%30.4)’si
Danofloksasin’e duyarlı, 8 (%34.8)’i Kanamisin’e
duyarlı, 12 (%52.2)’si Gentamisin’e duyarlı, 2 (%8.7)’si Sulbaktam-Ampisilin’e duyarlı, 8
(%34.8)’i Oksitetrasiklin’e duyarlı, 8 (%34.8)’i
Sulfometoksazol-Trimetoprim’e duyarlı olarak saptanmıştır.
Karbasizaed ve ark. (10), 66 nazokomiyal enfeksiyona neden olan koliformlardan Klebsiella
pneumoniae’nin chloramphenicole direncini %30
olarak bulmuslardır. Küçükates ve Kocazeybek
(15), nazokomiyal solunum sistemi enfeksiyonlu
hastalardan elde ettikleri Klebsiella spp. suslarının chloramphenicol direncini %59.4 olarak belirlemislerdir. Manchanda ve ark. (18), çesitli klinik
örneklerden izole ettikleri K.pneumoniae suslarının
chloramphenicole direnç oranını %49.6 tespit etmislerdir.
Finkelstein ve ark. (5), üriner sistemden izole
edilen Klebsiella suslarında Gentamisin direncini
%10 olarak tespit etmislerdir.
Borer ve ark. (3), Güney İsrail’de
Enterobacteriaceae familyası üyesi bakterilerde
yaptıkları arastırmada; ESBL üreten bakterilerin
68
%66.6’sının gentamicine, %23.3’ünün amikacine
dirençli oldugunu gözlerken, ESBL üretmeyen susların gentamicin direncini %2,7 ve amikacin direncini ise çok düsük düzeyde (%0.9) bulmuslardır.
Küçükateş ve Kocazeybek (15), K.pneumoniae
suşlarının Gentamisin direncini %71.9 olarak tespit
etmislerdir.
Araştırmamızda, İzmir ili ve çevresinde
bulunan sahipli köpeklerden 23 (%11.5) adet
Klebsiella pneumoniae türü identifiye edilmiştir.
Araştırmamızın %48 oranında bakteriyel üremenin
görülmemesi, köpeklerde üriner sistem hastalıklarında ilk başvurulan preperatların antibiyotikler olduğunu göstermektedir. Elde edilen sonuçlar doğrultusunda, rutin teşhis metotları ile köpeklerde üriner sistem hastalıklarına yol açabilecek bakteriyel
etkenlerin kolay ve uygun bir şekilde saptanabileceği ortaya çıkarılmıştır. Bu çalışma sonucunda en etkili antibiyotiğin Gentamisin olduğu ve Kanamisin,
Sulbaktam-Ampisilin ve Oksitetrasiklin gibi antibiyotiklere de direnç gelişimi olduğu sonucuna ulaşılmıştır.
Sonuç olarak bu tez çalışması, köpeklerde üriner sistem infeksiyonlarında hasta profilini ortaya
çıkarması, ilaç seçimi ve kullanımı hakkında bir
rehber olabilir. Ülkemizde köpeklerde görülen üriner sistem infeksiyonlarıının tanısı ve daha sağlıklı
veriler elde edilebilmesi için, çalışmaların yaygınlaştırılması ve devam ettirilmesi önerilir.
Teşekkür
Bu çalışma, “Köpeklerin İdrar Örneklerinden
Klebsiella
pneumoinae
İdentifikasyonu
ve
Antibiyotik Duyarlılıkları” adlı ve SAE 09001
kodlu proje olarak Adnan Menderes Üniversitesi
Bilimsel Araştırma Projeleri tarafından desteklenerek gerçekleştirilmiştir. Araştırma için ADÜHADYEK’ten 124-HEK/2008/058 sayılı yazı ile
Etik Kurul Onayı alınmıştır.
Kaynaklar
1. Barrak M, Shelly L, (2003). Candida spp. urinary tract
ınfections in 13 dogs and seven cats: predisposing factors
treatment, and outcome. J Am Anim Hosp Assoc. 39, 263270.
2. Bartges JW, Osborne CA, Lulich JP, Kruger JM,
Sanderson SL, Koehler LA, Ulrich LK, (1999). Canine
urate urolithiasis: etiopathogenesis, diagnosis and management. Vet Clin N Am-Small. 29, 161-183.
3. Borer A, Gilod J, Menashe G, Peled N, Riesenberg K,
Schlaeffert F, (2002). Extended-spectrum lactamase
procuding Enterobacteriaceae strains in community-acquired bacteremia in Southern Israel. Med Sci Monit. 8,
44-47.
4. Clinical and Laboratory Standards Institute (2007).
The CLSI Standard for Susceptibility Testing. American
National Standards Intstitute, United States of America.
5. Finkelstein R, Kassis E, Reinhertz G, Gorenstein S,
Herman P, (1998). Community-acquired urinary tract infection in adults: a hospital viewpoint. J Hosp Infect. 38,
193-202.
6. Günay Ü, Günay A, Ülgen M, Özel AE, (2004). Köpeklerde
farklı siklus evrelerindeki vaginal bakteriyel floranın incelenmesi. Uludag Univ J Fac Vet Med. 23, 15-19.
7. Hamaide AJ, Martinez SA, Hauptman J, Walker RD,
(1998). Prospective comparison of four sampling methods
(cystocentesis, bladder mucosal swab, bladder mucosal
biopsy and urolith culture) to identify urinary tract infections in dogs with urolithiasis. J American Animal Hospital
Association. 34, 423-430.
8. Holt JG, Krieg NR, Sneath PHA, Staley JT and Williams
ST, (1994). Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology.
Ninth Edition. Williams & Wilkins, Baltimore, Maryland,
USA, p. 243-244.
9. Jarvinen AK, (2002). Treatment of urinary tract infections
in the dog, Suomen-Elainlaakarilehti. 108, 421-425.
10. Karbasizaed V, Badami N, Emtiazi G, (2003).
Antimicrobial, heavy metal resisteance and plasmid profile
of coliforms isolated from nosocomial infections in a hospital in Isfahan, Iran. African J Biotech. 2, 379-383.
11. Kırşan İ, Akan M, Şenünver A, (2000). Sağlıklı dişi köpeklerin genital kanalında bakteriyel flora üzerinde araştırmalar. İÜ Vet Fak Derg. 26, 235-241.
12. Kim J, Lim YM, Rheem I, Lee Y, Lee JC, Seol SY, (2005).
CTX-M and SHV-12-lactamases are the most common extendedspectrum enzymes in clinical isolates of Escherichia
coli and Klebsiella pneumoniae collected from 3 university
hospitals within Korea. FEMS Microbiol. Letters. 245, 9398.
13. Klausner JS, Osborne CA, (1979). Urinary tract infection
and urolithiasis. Vet Clin N Am-Small. 9, 701-711.
14. Koneman EW, Allen SD, Janda WM, Schreckenberger
PC, Winn WC, (1997). Color Atlas and Textbook of
Diagnostic Microbiology. Lippincott, New York, Fifth
Edition, pp: 171-241, 253-309, 539-566, 651-688.
15. Küçükates E, Kocazeybek B, (2002). High resistance rate
aganist 15 different antibiotics in aerobic gram-negative
bacteria isolates of cardiology intensive care unit patients.
Indian J Med Microbiol. 20, 208-210.
16. Ling GV, (1984). Therapeutic strategies involving antimicrobial treatment of the canine urinary tract. J Am Anim
Hosp Assoc. 185, 1162–1164.
17. Livermore DM, (1995). β-lactamases in laboratory and
clinical resistance. Clin Microb Rev. 8, 557-584.
18. Manchanda V, Singh NP, Goyal R, Kumar A, Thukral
SS, (2005). Phenotypic characteristics of clinical isolates
of Klebsiella pneumoniae & evaluation of avaliable phenotypic tecniques for detection of extended spectrum betalactamase. Indian J Med Res. 122, 330-337.
19. Osborne CA, Lulich JP, Polzin DJ, Allen TA, Kruger
JM, Bartges JW, Koehler LA, Ulrich LK, Bird KA,
Swanson LL, (1999). Medical dissolution and prevention
of canine struvite urolithiasis: twenty years of experience.
Vet Clin N Am-Small. 29, 73-111.
20. Osborne CA, Lulich JP, Unger LK, Bartges JW, Felice
LJ, (1993). Canine and feline urolithiasis: relationship of
etiopathogenesis with treatment and prevention. Bojrab
MJ. eds. Disease Mechanisms in Small Animal Surgery.
Lea and Febiger, Philadelphia. p. 476-478.
21. Philippon A, Arlet G, Lagrange PH, (1994). Origin and
impact of plasmid mediated extended-spectrum beta-lactamases. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 13(Suppl 1), 17-29.
22. Robert DE, McClain HM, Hansen DS, Currin P,
Howerth EW, (2000). An Outbreak of Klebsiella pneumoniae infection in dogs with severe enteritis and septicemia. J Vet Diagn Invest, 12, 168-173.
69
23. Ruby AL, Ling GV, (1986). Bacterial culture of uroliths:
techniques and interpretation of results. Vet Clin N AmSmall. 16, 325-331.
24. Shortliffe LD, Spigelman SS, (1986). Infectionstones.
Urol Clin North Am. 13, 717-726.
25. Stock I, Wiedemann B, (2001). Natural antibiotic susceptibility of Klebsiella pneumoniae, K. oxytoca, K. planticola, K. ornithinolytica and K. terrigena strains. J Med
Microbiol. 50, 396-406.
26. Stone EA, Barsanti JA, (1992). Abnormal urine output and
voiding. Stone EA, Barsanti JA. eds. Urological Surgery of
the Dog and Cat. Lea and Febiger, Philadelphia. p.11-15.
27. Thompson RB, Stamey TA, (1973). Bacteriology of infected stones. Urology, 2, 627-633.
28. Ulutürk R, Soysal HF, Boztas Z, Ünlüer E, Toktaş G,
Gürbüz C, (2000). Multirezistan Klebsiella pneumoniae
susunun neden oldugu hastane infeksiyonu. Klimik Derg.
13, 91-93.
29. Waldron DR, (1993). Urinary bladder. Slatter D, Saunders
WB. eds. Textbook of Small Animal Surgery. Saunders
Company, Philadelphia. p.1458-1462.
Etlik
23, 70-76,
2012 Ş. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 23, 70-76, 2012
70 Vet Mikrobiyol Derg,Özavcı
V, Kırkan
Derleme / Review
Staphylococcus aureus’larda metisilin direnci ve enfeksiyonlar
Volkan ÖZAVCI, Şükrü KIRKAN
Adnan Menderes Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Aydın
Özet: Staphylocococus aureus, normal insan ve hayvan florasının bir bölümünü oluşturan gram pozitif bir bakteridir.
Staphylococcus aureus izolatlarının en önemli habitatı insanlarda burun mukozası ve hayvanlarda deridir. S.aureus hayvanlarda mastitis, artritis, otitis, epidermitis ve üriner sistem enfeksiyonları gibi enfeksiyonlara neden olurken insanlarda hastane enfeksiyonları, gıda zehirlenmeleri, osteomyelitis, poliartritis, endokarditis, toksik şok sendromu, folikülitis,
konjunktivitis, idrar yolları enfeksiyonları, pnömoni, haşlanmış deri sendromu (Scalded Skin Syndrome- SSS) gibi çok
sayıda enfeksiyona neden olmaktadırlar. Hemen herkes hayatları süresince S.aureus enfeksiyonlarının bazı tiplerine sahip olmaktadırlar. Stafilokok enfeksiyonlarının tedavisinde stafilokok türleri arasındaki antibiyotiklere direnç yaygınlığı
önemli bir sorundur. Yeni antibiyotiklerin klinik kullanıma girmesinden kısa bir süre sonra mikroorganizmanın direnç
kazandığı, bununla birlikte penisilinin çok yaygın kullanılmasının sonucunda penisilini parçalayan stafilokok suşlarının
ortaya çıktığı da bilinmektedir. Metisilin-dirençli Staphylococcus aureus (MRSA) tüm dünyada hastane enfeksiyonlarından en sık izole edilen “Çoğul antibiyotik Dirençli” mikroorganizmadır. MRSA izolatlarında çoklu direnç gün geçtikçe artmaktadır. Otuz yıldan daha uzun süre MRSA tedavisinde kullanılan vankomisine de bu günlerde direnç gelişmiştir.
Derlememizde türlere göre MRSA epidemiyolojileri, MRSA virulens mekanizmaları, metisilin direnç mekanizmaları ve
MRSA suşlarının tiplendirilmeleri hakkında bilgiler verilecektir.
Anahtar kelimeler: Metisilin direnci, moleküler tiplendirme, Staphylococcus aureus, virulens faktörleri.
Methicillin resistance in Staphylococcus aureus and infections
Summary: Staphylococcus aureus is a kind of gram positive bacteria, which builds a part of normal human and animal
flora. The most important life space of S.aureus is human nasal mucosa and animal skin. S.aureus causes some infections
like mastitis, arthritis, otitis, epidermitis and urinary system infections on animals. On the other hand, it causes many
infections such as hospital infections, food poisoning, osteomyelitis, polyarthritis, endocarditis, Toxic Shock Syndrome
(TSS), folliculitis, conjunctivitis, urinary infections, pneumonia, Scalded Skin Syndrome (SSS). Nearly everyone hosts
some types of S.aureus infections throughout their lifespan. In the cure of Staphylococcus infections, resistance of antibiotics extence among Staphylococcus strains is an important problem. After a short period of starting to clinical use of
new antibiotics, this microorganism gained resistance and because of the fact that peniciline is used widely too much, it
is known that Staphylococcus strains, which can break peniciline, occured. Methicillin Resisted Staphylococcus aureus
(MRSA) is mostly isolated from hospital infections “Multiple Resistant Antibiotic” microorganism in the whole world.
Multiple resistence of MRSA isolates increases day by day. Even vancomycin which has been used in the cure of MRSA
for more than 30 years gained resistance currently, too. In our composition, MRSA epidemiology, Sequencing of MRSA
virulence mechanisms, methicillin resistant mechanisms and MRSA strains are going to be informed according to their
species.
Key words: Methicillin resistance, molecular typing, Staphylococcus aureus, virulence factors.
Giriş
S.aureus insan ve hayvanlar için önemli bir patojendir ve hem insan da hem de hayvanda deri hastalıklarından ve bakteriyemiden sorumlu olmaktadır. Stafilokoklarda penisilin direnci 1940’lı yılların
ortalarında artmış, 1950’li yıllarda penisilinin yanı
sıra tetrasiklin, eritromisin ve streptomisin gibi diğer antibiyotiklere de direnç gelişimi gözlenmiştir.
Staphylococcus aureus izolatlarının en önemli ha-
bitatı insanlarda burun mukozası ve hayvanlarda
deri olmaktadır. Hayvanlarda mastitis, artritis, otitis, epidermitis ve üriner sistem enfeksiyonları gibi
enfeksiyonlara neden olurken insanlarda hastane
enfeksiyonları, gıda zehirlenmeleri, osteomyelitis,
poliartritis, endokarditis, toksik şok sendromu, folikülitis, konjunktivitis, idrar yolları enfeksiyonları,
pnömoni, haşlanmış deri sendromu (Scalded Skin
Syndrome- SSS) gibi çok sayıda enfeksiyona neden
olmaktadırlar (27, 39, 40).
Yazışma adresi / Correspondance: Şükrü KIRKAN, Adnan Menderes Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı,
09016 Işıklı, Aydın, Türkiye Eposta: [email protected]
Özavcı V, Kırkan Ş. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 23, 70-76, 2012
Dirençli bakteriler arasında en patojen olanı 2005 yılında Amerika Birleşik Devletleri’nde
19000 insanın ölümüne neden olan MRSA türüdür.
MRSA bu ölümcül özelliğini kısmen de olsa karotenoidler adıyla bilinen ve MRSA’nın bağışıklık
sistemimize karşı koymak amacıyla yararlandığı bir
tür kimyasala borçludur. Metisilin 1950 yılında ilk
olarak insanlarda penisilin-dirençli stafilokokal enfeksiyonların tedavisinde kullanılmaya başlanması ile tanındı. 1970’de methisilin dirençli S.aureus
ABD ve diğer mevcut hastanelerde ciddi sporadik
problem olarak ortaya çıkmıştır. 1990 yılında ise
nazokomiyal hastalık olarak tüm dünyada ciddi bir
hastalık boyutuna gelmiştir (3).
71
sağlıklı köpek tüylerinde kolayca kolonize olabilen
bir etkendir (9).
2. Atlarda MRSA epidemiyolojisi
MRSA epidemiyolojisi
Bir yaş altı atlarda endemik olarak MRSA taşıyıcılığı bulunabilmekte ve bu hayvanların ülke içi ya da
ülkeler arası sevkiyatlarında rezervuar olması kaygı
verici olarak ifade edilmektedir. Kanada Veteriner
Araştırma Hastanesi at kliniklerinde üç yılı kapsayan bir çalışma başlatılmış; 2002 yılında 17, 2003
de 10 ve 2004 de 36 atta MRSA kolonizasyonu tespit edilmiştir. At izolatı olan CMRSA’ların (Kanada
Epidemik MRSA) moleküler tiplendirilmesine
yönelik farklı bir çalışmada ise 79 MRSA’nin 75.i
tiplendirilmiş bunlardan 72 sinin CMRSA-5/SCC
mecA-IV. Tip olduğu ve bu türün toplum kökenli
MRSA tipleri arasında yer aldığı bildirilmiştir (42).
İnsanlarda MRSA epidemiyolojisi
3. Domuzlarda MRSA epidemiyolojisi
MRSA Staphylococcus aureus suşları iki grupta incelenebilir: Hastahane ile İlişkili MRSA (HospitalAssociated MRSA, HCA-MRSA) suşları ve
Toplumdan Edinilen MRSA (Community-acquired
MRSA, CA-MRSA) suşları. HCA-MRSA cerrahi
veya cerrahi dışı yaraları olanları ya da kateterize hastaları etkiler. CA-MRSA, HCA-MRSA’dan
daha az sayıda antibiyotiğe dirençlidir. Bazı CAMRSA suşları deri ve yumuşak doku enfeksiyonlarına neden olabilen ve “Panton-Valentine Lökosidin
“(PVL) olarak bilinen bir toksin de taşıyabilir. PVL
pozitif CA-MRSA büyük ölçekli topluluklarda kolaylıkla bulaşabilir. MRSA izolatı eğer SCCmec
tip IV.geni içeriyorsa ve filogenetik olarak hastane
kaynaklı, MRSA klonal soy ile bilinen bir bağlantısı
yoksa toplumsal kaynaklı MRSA olarak nitelendirilir. SCCmec geni V. allotip’i tanımlanmış ayrıca
toplum kaynaklı MRSA ile ilintili bulunmuştur (6,
20).
Hollanda’da 9 farklı domuz kesimhanesinde 540
sağlıklı domuzun burun mukozasından kesim öncesi sürüntü numunesi alınmış ve örneklerin 209’unda
(%39)’unda MRSA tespit etmişlerdir (33).
Hayvanlarda MRSA epidemiyolojisi
Hayvan orjinli S.aureus ve Koagülaz Negatif
Stafilokoklarda (KNS; S.intermedius, S.felis,
S.schleiferi, S.simulans, S.sciuri, S.hominis,
S.xylosus, S.haemolyticus, S.epidermidis ve
S.saprophyticus) mecA geni ve metisilin dirençliliği
belirlenmiştir (13, 24).
1. Kedi ve köpeklerde MRSA epidemiyolojisi
Çoğu araştırma göstermiştir ki köpeklerden ve kedilerden izole edilen en yaygın koagülaz-pozitif
stafilakok türü S.intermedius’tur (28, 32). S.aureus
4. Büyük ve küçükbaş hayvanlarda MRSA epidemiyolojisi
1997-2004 tarihlerinde Kore’de 153 farklı çiftlikte,
3047 mastitisli inek sütünden 835 S.aureus ve 763
koagülaz-negatif stafilokok (KNS) izole edilmiştir.
Bu izolatların metisilin dirençliliği araştırıldığında
21 (%2,5) S.aureus ve 19 (%2,4) KNS’de dirençlilik tespit edilmiştir. 2001 yılında Macaristan’da
yapılan antibiyotik dirençliliğine yönelik bir araştırmada, hayvanlarda ve hayvansal ürünlerde hiçbir
vakada mecA-pozitif stafilokok izole edilememiş
ancak 2004 de devam eden bu çalışmada, sığır sürülerinden 5 MRSA izolasyonu yapılmıştır (22).
Portekiz’de, subklinik mastitisli ineklerden izole
edilen 9 S.epidermidis suşunda metisilin dirençliliği
belirlenmiştir (34). Ülkemizde ise sığırlarda yapılan
bir çalışmada, mastitisli süt örneklerinden 2 MRSA
ve 1 MRKNS suşu izole edilmiştir (25).
MRSA virulans mekanizması
Kollajen bağlayan protein ve fibronektin bağlayan
protein yapıları, S.aureus’un virülansını etkileyen
faktörlerdir (36). S.aureus’un salgıladığı protein-A,
Ig G nin Fc kısmına bağlanarak kompleman sistemini bloke eder ve nötrofilleri parçalayan lökosidin
adlı maddeyi de salgılar. Ayrıca S.aureus, inflamas-
72
yonu tetikleyerek hem PG-E2 üzerinden T lenfositlerinin çoğalmasını engeller, hem de ortama gelen
nötrofillerin ve monositlerin içine girerek yaşamına bu şekilde devam edebilir. Makrofajların içinde
mikroorganizmaların yok edildiği fagolizozom yapılarına değil daha korunaklı olan makropinozom
yapılarının içine girer. Başka bir değişle içinde yaşayabileceği konak hücrelerini, inflamasyon oluşturup
önce kendi üzerine çeker daha sonra içlerine girerek
kendini vücudun savunma mekanizmalarından korur. Bu şekilde kronik enfeksiyonların da temelini
atmış olmaktadır. Her organizmada yüzey moleküllerini kodlayan birer gen yapısı vardır (ica, cna,
map genleri) ve mikroorganizmaların her birinde
farklı olabilen bu gen yapıları virülansı tayin eden
en önemli faktörlerdendir. Bir başka deyişle enfeksiyondan sorumlu olan mikroorganizmanın genetik koduna göre tedaviden elde edeceğimiz başarı
da değişmektedir. Farklı mutantlar farklı tedavilere
farklı yanıtlar verecektir. Örneğin S.epidermidis’in
ica gen mutasyonu sonrası virülansı azalır ve daha
kolay eradike edilebilen enfeksiyonlar oluşturur.
Ayrıca stafilokokların yüzeyinde Yapışkan Matriks
Moleküllerini Tanıyan Mikrobik Yüzey Bileşenleri
(microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules, (MSCRAMM) denen bir grup
protein, bu sümüksü yapısı ile sıkı bir bağlantı kurar
ve glikokaliks (biofilm) oluşur. Bu bağlantıda teikoik asit yapısının da rolü büyüktür (18). Biyofilm
tabakasının ana maddesi N-asetil glukozamindir ve
iki farklı polisakkarit yapısı oluşturur. Tip 2 polisakkarit yapısı hücreler arası agregasyondan sorumlu
olup diğer ismi polisakkarit interselüler adezindir
(PIA). Bu yapı, hidrofilik yüzeylere fizikokimyasal başlarla tutunma özelliğine sahip olan komponenttir. Stafilokok enfeksiyonlarında adı geçen bu
moleküllerin bilinmesi, tedavide yeni modaliteler
geliştirilmesi açısından önemlidir. Çünkü bu yapılar pürifiye edilmiş halleri ile canlılara injekte
edildiği zaman koruyucu bağışıklık sağlayabilirler
(Stafilokok aşısı) (31).
Stafilokoklarda metisilin direnç
mekanizmaları
Penisilin bağlayıcı protein (pbp2a) sentezi
nedeniyle oluşan direnç
MRSA suşlarında metisiline hassas stafilokok
(MSS) suşlarından farklı olarak ek bir PBP vardır ve PBP2a olarak adlandırılmaktadır. PBP2a, 2
kb’lik DNA segmentine lokalize bir gen olan mecA
geni tarafından kodlanmaktadır ve beta-laktam antibiyotiklere afinitesi diğer PBP’lerden daha düşüktür. mecA geni regülasyonunu sağlayan mecI
(represör gen) ve mecRI (sinyal dönüştürücü gen)
genleriyle beraber stafilokokal kaset kromozomu
(staphylococcal cassette chromosome-SCC) ismi
verilen genetik yapının üzerinde taşınır. mecRI ve
mecI’nın plazmid aracılı stafilokokal beta-laktamaz
geni olan blaZ’nin ekspresyonunda rolü olan blaR1
ve blaI ile protein sekans homolojisi yüksektir. Bu
da mecA’nın regülatör genlerini, blaZ sisteminden
aldığını düşündürmektedir (17, 41). SCC; Stafilokok
türleri arasında genetik madde alışverişine aracılık
eden hareketli bir elemandır (8, 15, 17). SCCmec,
mec gen kompleksi (mecA ve regüle edici genler) ve
ccr kompleksinden oluşmuştur. mec gen kompleksi
metisilin direncinden sorumludur (15, 21). SCCmec
kasetinde ikinci ana genetik yapı olan ccr gen kompleksi kasetin bakteriyel genoma integrasyonu ve eksizyonundan sorumludur. Bunlar invertaz/rezolvaz
ailesinden ccrA ,ccrB ve yeni tanımlanan ccrC olmak üzere üç farklı rekombinaz kodlayan genlerdir
(15, 44). Günümüze kadar SCCmec’in 5 farklı tipi
tanımlanmıştır. Tip I, tip II ve tip III Ito ve ark. (19)
tarafından, tip IV Ma ve ark. (29) tarafından ve tip V
yine Ito ve ark. (20) tarafından tarif edilmiştir.
SCCmec Tip I; Sınıf B mec gen kompleksi ve
tip I ccr gen kompleksinden oluşmaktadır. Metisilin
ve ağır metaller dışındaki ilaçlara karşı direnç geni
taşımamaktadır (19).
SCCmec Tip II; Sınıf A mec gen kompleksi ve
tip II ccr kompleksinden oluşmaktadır. Sınıf B mec
klindamisin ve streptogramin B’ye karşı dirençten,
pUB110 ise aminoglikozidlere karşı dirençten sorumludur (19).
SCCmec Tip III; Sınıf A mec gen kompleksi ve tip III ccr gen kompleksinden oluşmaktadır.
ΨTn554 kadmiyuma karşı dirençten, pT181 tetrasiklin ve civaya karşı dirençten sorumludur (19).
SCCmec Tip IV; Sınıf B mec gen kompleksi
ve tip 2 ccr gen kompleksinden oluşmaktadır. Bu
yapı küçük olup mecA dışında direnç geni taşımaz
(29, 44). SCCmec Tip V ; Sınıf C mec gen kompleksi ile ccrC içermektedir. Sadece metisilin direnci
kodlayan genlere sahiptir (20, 44). SCCmec tiplerinden, Tip I, II ve III genellikle hastane kökenli,
Tip IV ve V ise toplum kökenli MRSA izolatlarında
bulunmaktadır (12).
Stafilokoklarda metisilin direnci fenotipik olarak iki farklı biçimde karşımıza çıkabilmektedir:
a- Homojen direnç: Bakteri kolonisini oluşturan tüm bakteriler mecA genini taşırlar ve hepsinde
mecA geni fonksiyoneldir (8, 14, 41).
b- Heterojen direnç: Klinik uygulamada daha
sık görülen ancak tespiti güç olan direnç türüdür.
Bu direnç türünde, mecA geni taşımalarına rağmen,
104 yada 108 bakteriden birinde direncin olması
durumu görülmektedir (4, 6, 31).
Yüksek miktarda beta laktamaz salgılanmasıyla
oluşan direnç
Tüm beta-laktam antibiyotiklere karşı gelişen direncin temel nedeni kromozomal mecA geninin kodladığı PBP2a olarak adlandırılan yeni bir PBP’dir.
PBP’lerdeki bu değişiklik tüm betalaktamlara çapraz dirençten sorumludur. PBP’nin beta-laktam antibiyotiklerine afinitesi diğer PBP’lerden daha düşüktür (41).
PBP’lerde beta laktam antibiyotik afinitesinde
azalma ile oluşan direnç
Son yıllarda mecA geni taşımadıkları halde metisiline dirençli stafilokoklar incelendiğinde, bu
bakterilerin mevcut PBP’lerinin beta laktam antibiyotiklere düşük afinite gösterdikleri saptanmıştır.
Ayrıca mecA negatif olmasına rağmen oksasilin
MİK değerleri 8-16 mg/L civarında olan suşlar bulunabilmektedir. Bunların bir kısmı beta-laktamazın aşırı üretiminden [Borderline resistant S.aureus
(BORSA)], bir kısmı da var olan PBP’lerdeki
(özellikle PBP2 ve PBP4) nokta mutasyonlarından
[Moderately resistant S.aureus (MODSA)] veya
PBP4’ün (düşük molekül ağırlıklı PBP) aşırı sentezinden kaynaklanabilir (35, 41).
Metisilin direncini etkileyen internal faktörler
1. Belirli uzunluktaki glikan zincirleri
PBP2a, PBP2’nin transglikozilaz aktivitesine bağımlıdır. Beta laktamlar yüksek molekül ağırlıklı
PBP’lerin transpeptidaz “domain’ini inhibe ederken, transglikozilaz “domain’ine bir etki göstermezler (39).
2. Normal peptid konfigürasyonu için gerekli
kök peptidler
UDP-N-asetil tripeptid sentatazı kodlayan gen olan
murE (femF)’nin inaktivasyonu sonucunda da me-
73
tisilin direncinde azalma olur. Nedeni hücre duvarı
öncülleri havuzundaki UDP-bağlı muramil pentapeptidlerin azalması ve UDP-bağlı muramil dipeptidlerin birikmesidir (41).
3. Intakt olmak için gerekli pentaglisin çapraz
köprüleri
Glikan zincirlerini birbirine bağlayan pentaglisin
çapraz köprülerinin yapımından femA, femB ve
femX sorumludur. FemX birinci glisini, femA ikinci ve üçüncü glisinleri ve femB de dördüncü ve beşinci glisinleri köprüye sokar (41).
4. Metisilin direncini etkileyen eksternal faktörler
Tuz konsantrasyonu, pH, ozmolarite ve ortam ısısı
metisilin direncini etkileyen eksternal faktörlerdendir (41).
MRSA suşlarının tiplendirilmesi
Pulsed-field jel elektroforezi (PFGE)
Pulsed-field jel elektroforezis (PFGE), S.aureus ve
diğer birçok patojen bakterilerin genetik farklılıklarını araştırmak için moleküler epidemiyolojide
kullanılan önemli bir genetik tiplendirme metodudur. Sıvı veya katı besiyerinde üretilen bakteriler,
düşük erime ısılı agaroza karıştırılıp küçük kalıplar
içine dökülmektedir. Agaroz içine karıştırılan bakteri hücreleri, deterjan ve enzim yardımıyla parçalanarak (in situ-lysis) DNA izolasyonu yapılmaktadır. Liziz işlemini takiben agaroz kalıpları iyice
yıkanarak veya diyalize edilerek protein ve karbon
hidrat gibi kontaminantların uzaklaştırılması sağlanır. Büyük olan kromozomal DNA agaroz jel içinde
tutulu kalır. Agaroz içindeki bakteriyel DNA, nispeten az sayıda ve büyük parçalar oluşturan bir restriksiyon enzimi (RE) ile kesime uğratılmaktadır (in
situ-digestion). Restriksiyon endonükleaz enzimleri
ile genomun kesilmesinden sonra agaroz jel elektroforez yöntemi ile ayırma işlemi gerçekleştirilir.
Meydana gelen fragmentlerin konvansiyonel elektroforez sistemlerle ayrılması çok zordur. PFGE
sistemlerinde bu fragmentleri ayırmak mümkün
olabilmektedir. Sistemlerde başlangıç vuruşları kısadır ve elektroforez devam ettiği sürece artar. Bant
paternleri bir görüntüleme sistemi aracılığı ile değerlendirilir. Counter clamped homogenous electric
field electrophoresis (CHEF), PFGE’nin dünyada
en yaygın kullanılan modelidir (4).
74
SCCmec tiplendirme
Son 10 yıl içinde, metisilin direncinin, metisiline
duyarlı S.aureus (MSSA) suşlarının “Stafilokokal
kaset kromozom (Staphylococcal Cassette
Chromosome)” mec (SCCmec) adlı genetik elemanı
edinmeleri ile geliştiği ortaya çıkarılmıştır. Gerçekte
SCC’ler, stafilokok türleri arasında bir genetik aktarım aracı olan genomik bir adadır. SCCmec ise,
metisilin direnci taşıyan özel bir SCC tipidir (23).
Günümüze kadar sekiz farklı SCCmec tipi tanımlanmıştır. Tip I, Tip II, Tip III, Tip IV, Tip V, Tip VI,
Tip VII ve Tip VIII SSCmec, sırasıyla sınıf B mec
ve tip 1 ccr, sınıf A mec ve tip 2 ccr, sınıf A mec ve
tip 3 ccr, sınıf B mec ve tip 2 ccr, sınıf C2 mec ve tip
5 ccr, sınıf B mec ve tip 4 ccr, sınıf C1 mec ve tip 5
ccr, sınıf A mec ve tip 4 ccr gen komplekslerinden
oluşmaktadır (10).
Multilokus dizi tiplendirme (multilocus sequence
typing, MLST)
MLST, temel metabolik fonksiyonu kodlayan “housekeeping” genlerdeki değişikliğin DNA dizi analizi ile gösterilmesidir. Yedi “ housekeeping ” genin
yaklaşık 450-500 baz çiftlik fragmentlerinin dizi
analizi çıkarılmaktadır. Hedef gene ait her bir lokus
için, her farklı dizilim farklı bir allel numarası ile
gösterilmekte ve böylece suşa ait bir allelik profil
tanımlanmaktadır. MLST çok fazla avantaja sahip
olmasına rağmen çesitli zorluklara da sahiptir. Bu
zorlukların basında 7 allel üzerinde çok düsük hata
oranına sahip dizi analizi yapma zorunluluğu gelmektedir. Çoğu laboratuar için bunları sağlayabilmek oldukça pahalı ve zaman alan bir süreçtir (1,
30).
MRSA suşlarının tiplendirilmesinde PFGE,
yüksek frekanslı restriksiyon endonükleaz enzimleri tarafından çoğaltılan kromozomal DNA kıyaslaması için imkan sağlamaktadır (43). Teorik olarak
her bakteri PFGE ile tiplendirilebilir ve elde edilen
sonuçlar tekrarlanabilir özelliktedir (2).
Günümüzde FIGE (field-inversion gel electrophoresis) ve CHEF (contour-clamped homogenous electric field) gibi PFGE’i içeren birçok teknik
MRSA suşlarının tiplendirilmesinde kullanılmaktadır. FIGE daha basit ve daha ucuz bir tekniktir ve
0.1’den 200 Kb. arasındaki fragmentlerin ayrımı
için en iyi yöntem olarak görülmektedir. Bu sistemde forward ve reverse yönler arasında elektriksel
alan basitçe arttırılmakta ve başlangıç elektriksel
uyarım, reverse uyarım müddetince üç kez tekrarlanmaktadır. CHEF, 3Mb ve üzeri fragment seperasyonu için en iyi yöntemdir ve 120o açıda üniform
elektrik alanı oluşturmak için hekzagonal elektrot
düzeni içermektedir. Bu yolla, fragmentler düz bir
hat üzerinde küçük oranlarda sapmayla ya da hiç
sapma göstermeden hareket etmektedirler (5).
Multilokus sekans tiplendirme tekniği (MLST)
seçici olarak boyanabilen proteinlerin elektroforezisini kapsayan fenotipik tiplendirme tekniği olan
Multilokus enzim elektroforezis (MLEE) tekniğinden türetilmiştir. Staphylococcus aureus için kullanılan MLST tekniği, Enright ve ark.’larının kullandığı PFGE ile onaylanmıştır (11).
Moleküler tiplendirme teknikleri, MRSA epidemilerinin tanısında önemli bir yer tutmaktadır ve
MRSA salgınlarında özellikle tercih edilen yöntemler olmalıdırlar.
Spa dizi tiplendirme
Sonuç
Spa Dizi Tiplendirme yöntemi, Protein A geninin
kısa tekrar bölgesi [short sequnce repeat (SSR)]
veya polimorfik X bölgesinin dizi analizine dayanmaktadır (26, 38). Polimorfik X bölgesi değişken
24 baz çiftlik tekrarları içermektedir ve C terminal
hücre duvarı bağlanma dizisinin kodladığı bölgeye yerleşmektedir (37). SSR bölgesinin çeşitliliği,
tekrarlayan dizilerin duplikasyonu ve delesyonu ile
ortaya çıkmaktadır (7). spa SSR bölgesinin dizi analizi, MLST yöntemindeki birçok avantajın kombinasyonudur. Fakat spa tiplemesinin tek lokusu içermesinden beri hastane salgın araştırmalarında daha
hızlı ve pratik olmuştur (16).
İnsan ve hayvan sağlığında önemli bir patojen olarak yerini alan MRSA hem insan da hem de hayvan
da deri hastalıklarından ve hayati tehlike oluşturan
bakteriyemiden sorumlu olmaktadır. Stafilokok enfeksiyonlarının tedavisinde stafilokok türleri arasındaki direnç yaygınlığı önemli bir sorundur. Yeni
antibiyotiklerin klinik kullanıma girmesinden kısa
bir süre sonra mikroorganizmanın direnç kazandığı bununla birlikte penisilinin çok yaygın kullanılmasının sonucunda penisilini parçalayan stafilokok
suşlarının ortaya çıktığı da bilinmektedir. Bu durum
MRSA enfeksiyonların tedavisinde antibiyotik seçiminin direnç durumuna göre belirlenmesinin öne-
mini ortaya koymaktadır. Hastalıkların teşhisinde
antibiyogram testlerinin uygulanması, moleküler
bazlı tiplendirme metotlarının kullanılması, doğru
ve etkili ilaç seçimi, direnç artışının önlenmesi ve
tedavi şansının yüksek tutulması bakımından oldukça fayda sağlamaktadır.
Kaynaklar
1. Aanensen DM, Spratt BG, (2005). The multilocus sequence
typing network: mlst.net. Nucleic Acids. Res. 33: 728-733.
2. Arbeit RD, (1999). Laboratory procedures for the epidemiologic analysis of microorganisms. In: Murray PM, Baron EJ,
Pfaller MA, Tenover FC, Yolken RH. eds. Manual of clinical
microbiology. Washington. ASM Press.
3. Ayliffe GA, (1997). The progressive intercontinental spread
of methicillin resistant Staphylococcus aureus. Clin Infect Dis.
24, 74-79.
4. Birren Bruce, Lai Eric, (1993). Pulsed Field Gel
Electrophoresis: A practical guide. San Diego, California:
Academic Press Inc.
5. Birren BW, Lai E, (1993). Pulsed field gel electrophoresis:
a practical guide. San Diego. Academic Press.
6. Boyle Vavra S, Ereshefsky B, Wang CC, (2005). Successful
multiresistant community associated methicillin-resistant
Staphylococcus aureus lineage from Taipei, Taiwan, that carries either the novel staphylococcal chromosome cassette mec
(SCCmec) type V-T or SCCmec type IV. J Clin Microbiol. 43,
4719-4730.
7. Brigido MDM, Barardi CR, Bonjardin CA, (1991).
Nucleotide sequence of a variant Protein A of Staphylococcus
aureus suggests molecular heterogeneity among strains. J
Basic Microbiol. 31, 337-345.
8. Chambers HF, (1997). Methicillin resistance in staphylococci: molecular and bio chemical basis and clinical implications. Clin Microbiol Rev. 10,781-91.
9. Cox HU, Newman SS, Roy AF, (1984). Species of
Staphylococcus isolated from animals infections. Cornell
Veterinarian. 74, 124-135.
10. Deurenberg RH, Vink C, Kalenic S, Friedrich AW,
Bruggeman CA, Stobberingh EE, (2007). The molecular
evolution of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Clin
Microbiol Infect. 13, 222-235.
11. Enright MC, Day NP, Davies CE, Peacock SC, Spratt
BG, (2000). Multilocus sequence typing for characterization of methicillinresistant and methicillin-susceptible
clones of Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol. 38,
1008-1015.
12. François P, Renzi G, Pittet D, (2004). A novel multiplex
real-time PCR assay for rapid typing of major staphylococ-
75
cal cassette chromosome mec elements. J Clin Microbiol.
42, 3309-3312.
13. Gortel K, Campbell KL, Kakoma I, (1999). Methicillin
resistance among staphylococci isolated from dogs. Am J
Vet Res. 60, 1526-1530.
14. Gür D, Topçu AW, Söyletir G, (2008). Bakterilerde antibiyotiklere karşı direnç infeksiyon hastalıkları ve mikrobiyolojisi. İstanbul Nobel Tıp Kitapevleri, s. 243-257.
15. Hanssen AM, Ericson Sollid JU, (2006). SCCmec in
staphylococci: genes on the move. FEMS Immunol Med
Microbiol. 46, 8-20.
16. Harmsen D, Claus H, Witte W, (2003). Typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in a university hospital
setting by using novel software for spa repeat determination and database management. J Clin Microbiol. 41, 54425448.
17. Hiramatsu K, K Okuma, X X Ma, (2002). New trends in
Staphylococcus aureus infections: glycopeptide resistance
in hospital and methicillin resistance in the community.
Curr Opin Infect Dis. 15, 407-413.
18. Hussain FM, Boyle-Vavra S, Daum RS, (2001).
Communitiy-acquired methicillin-resistant Staphylococcus
aureus colonization in healty children attending an outpatient pediatric clinic. Pediatr Infect Dis J. 20,763-767.
19. Ito T, Katayama Y, Asada K, (2001). Structural comparison of three types of staphylococcal cassette chromosome
mec integrated in the chromosome in methicillin-resistant
Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 45,
1323-1336.
20. Ito T, Ma XX, Takeuchi F, (2004). Novel type V staphylococcal cassette chromosome mec driven by a novel cassette chromosome recombinase, ccrC. Antimicrobc Agents
Chemother. 48, 2637-2651.
21. Ito T, Okuma K, Ma XX, (2003). Insights on antibiotic resistance of Staphylococcus aureus from its whole genome:
genomic island SCC. Drug Resist Update. 6, 41-52.
22. Kaszanyitzky EJ, Janosi S, Egyed Z, (2003). Antibiotic
resistance of staphylococci from humans, food and different animal species according to data of the Hungarian
resistance monitoring system in 2001. Acta Vet Hung. 51,
451-64.
23. Katayama Y, Ito T, Hiramatsu K, (2000). A new class of
genetic element, Staphylococcus cassette chromosome mec,
encodes methicillin resistance in Staphylococcus aureus.
Antimicrob Agents Chemother. 44, 1549-1555.
24. Kawano J, Shimizu A, Saitoh Y, (1996). Isolation of methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci from
chickens. J Clin Microbiol. 34, 2072-2077.
25. Kireçci E, Çolak A, (2002). Kuru dönem başlangıcında subklinik mastitisli ineklerden izole edilen stafilokok suşlarında metisilin direnci. Kafkas Üniv Vet Fak Derg. 8, 98-100.
26. Kurt D Reed, Mary E Stemper, Sanjay K Shukla, (2007).
Pulsed-field gel electrophoresis of MRSA in methicillinresistant Staphylococcus aureus (MRSA) protocols ebook
MRSA protocol. Yinduo Ji. 321,59-70.
27. Leonard FC, Markey BK, (2007). Meticillin-resistant
Staphylococcus aureus in animals: a review. Vet. J.
doi:10.1016/ j.tvjl.2006.11.008.
76
28. Lilenbaum W, Nunes EL, Azeredo MA, (1998).
Prevalence and antimicrobial susceptibility of staphylococci isolated from the skin surface of clinically normal cats.
Lett Appl Microbiol. 27, 224-28.
29. Ma XX, Ito T, Tiensasitorn C, (2002). Novel type of staphylococcal cassette chromosome mec identified in community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus
strains. Antimicrob Agents Chemother. 46, 1147-1152.
30. Maiden MC, Bygraves JA, Feil E, Morelli G, Russell
JE, Urwin R, Zhang Q, Zhou J, Zurth K, Caugant DA,
Feavers IM, Achtman M, Spratt BG, (1998). Multilocus
sequence typing: a portable approach to the identification of
clones within populations of pathogenic microorganisms.
Proc Natl Acad Sci USA. 95, 3140-3145.
31. Maira-Litran T, Kropec A, Goldmann D, Pier GB,
(2004). Biologic properties and vaccine potential of the
staphylococcal poly N-acetyl glucosamine surface polysaccharide. Vaccine. 22, 872-879.
32. Medleau L, Long RE, Brown J, (1986). Frequency and
antimicrobial susceptibility of Staphylococcus species isolated from canine pyodermas. Am J Vet Res. 47, 229– 231.
33. Neeling AJ, Van Den Broek MJ, Spalburg EC, van
Santen-Verheuvel MG, Dam-Deisz WDC, Boshuizen
HC, van de Giessen AW, van Duijkeren E, Huijsdens
XW, (2007). High prevalence of Methicillin resistant
Staphylococcus aureus in pigs. Vet Microbiol. 22, 366-372.
34. Nunes SF, Bexiga R, Cavaco LM, (2007). Technial Note:
Antimicrobial Susceptibility of Portuguese Isolates of
Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis in
Subclinical Bovine Mastitis. J Dairy Sci. 90, 3242-46.
35. Peacock SJ, (2005). Staphylococcus. Topley & Wilson’s
Microbiology and Microbial Infections. 10th Ed. Hodder
Arnold, London, United Kingdom, p. 771-832.
36. Ryden C, Yacoub AI, Maxe I, (1989). Specific binding of
bone sialoprotein to Staphylococcus aureus isolated from
patients with osteomyelitis. Eur J Biochem. 184, 331-336.
37. Schneewind O, Model P, Fischetti VA, (1992). Sorting of
Protein A to the staphylococcal cell wall. Cell. 70, 267-281.
38. Shopsin B, Gomez M, Montgomery SO, (1999).
Evaluation of protein A gene polymorphic region DNA
sequencing for typing of Staphylococcus aureus strains. J
Clin Microbiol. 37, 3556-63.
39. Soll DR, Lockhart SR, Pujol C, (2003). Laboratory procedures for the epidemiological analysis of microorganism.
Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Pfaller MA, Yolken
RH. Eds. In Manual of Clinical Microbiology. ASM press,
Washington. p.139-161.
40. Ugur A, Ceylan Ö, (2003). Occurrence of resistance to
antibiotics, metals, in clinical strains of Staphylococcus
aureus spp. Arch Medical Res. 34, 130-136.
41. Ünal S, Ulusoy S, Usluer G, (2004). Staphylococcus aureus Direnç mekanizmaları. Önemli gram pozitif bakteri
enfeksiyonları. Ankara Bilimsel Tıp Yayınevi. s.23-38.
42. Weese JS, Archambault M, Willey BM, Dick H,
Hearn P, Kreiswirth BN, (2005). Methicillin-resistant
Staphylococcus aureus in Horses and Horse Personnel,
2000-2002. Emerg Infect Dis. 11, 430-435.
43. Weller TMA, (2000). Methicillin-resistant Staphylococcus
aureus typing methods: wich should be the international
standard? J Hosp Infect. 44, 160-172.
44. Zhang K, McClure JA, Elsayed S, (2005). Novel multiplex PCR assay for characterization and concomitant subtyping of staphylococcal cassette choromosome mec types
I to V in methicillinresistant Staphylococcus aureus. J Clin
Microbiol. 43, 5026-5033.
Etlik Vet Mikrobiyol Derg,
23, 77-83,
2012 B. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 23, 77-83, 2012
Gülhan
T, Boynukara
Derleme / Review
77
Antibiyotiklere alternatif olarak yumurta sarısı antikorları
Timur GÜLHAN1 Banur BOYNUKARA2
1
Ondokuz Mayıs Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Samsun
2
Yüzüncü Yıl Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Van
Özet: Kanatlı hayvan yetiştiriciliğinde antibiyotikler büyüme faktörü, koruyucu ve tedavi edici olarak uzun zamandır
yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Ancak zaman içerisinde çoğu antibiyotiğe karşı direnç gelişmesi, alternatif tedavi
yöntemlerine olan ilgiyi arttırmıştır. Bu derlemede yumurta sarısı antikorlarının kanatlı hayvan yetiştiriciliğinde, bazı
hastalıklara karşı, antibiyotiklere alternatif olarak kullanılabilirliği ile ilgili güncel bilgiler özetlenmiştir.
Anahtar kelimeler: Yumurta sarısı antikorları, antibiyotik, kanatlı, tedavi
Egg yolk antibodies as alternative to antibiotics
Summary: Antibiotics, for many years, extensively have been used in poultry industry for growth promotion, prophylactic and therapeutic. However, resistance evolution to most of antibiotics from time to time was increased interesting
of alternative treatment methods. In this review, the recent data concerning usability as alternative to antibiotics, for
some diseases, in poultry industry of egg yolk antibodies are summarized.
Key words: Egg yolk antibodies, antibiotic, poultry, treatment
Giriş
Antibiyotikler kanatlı endüstrisinde büyüme faktörü, hastalıklardan korunma ve tedavi amacıyla
yıllardır kullanılmaktadır. Araştırma ve uygulama
denemeleri, bu uygulamanın hayvanların üretim
performansı ve sağlık durumlarında önemli gelişmelere neden olduğunu göstermiştir. Bu maddelerin
kanatlı diyetlerinden kaldırılması önemli değişikliklere sebep olmaktadır. Diğer taraftan, kanatlı diyetlerine antibiyotiklerin katılması ekonomik olanaklara bağlıdır. Ticari broyler tavuklarında büyüme
faktörü olarak kullanılan antibiyotiklerin ekonomik
olmadığı gösterilmiştir. Büyüme faktörü antibiyotikleri kullanarak sağlanan kilo artışının antibiyotik
fiyatlarını dengelemeye yetmediği sonucuna varılmıştır (5).
Çoğu antibiyotik aynı zamanda insan hekimliğinde hastalıkların tedavisinde kullanılmaktadır.
Mikrobiyolojik ve klinik veriler, tedavi edilmesi güç
hastalıklara neden olan dirençli bakterilerin hayvanlardan insanlara geçebileceğini göstermektedir. Bu
durum hayvan yemlerinde antibiyotik kullanımına
son verme ya da sınırlama yönünde kanatlı sektörüne baskı oluşturmakta ve farklı alternatif arayışlara
zorlamaktadır. Avrupa Birliği Ocak 2006’dan itibaren tedavi edici dozun altındaki tüm antibiyotiklerin
kullanımını yasaklamış olmasına rağmen, birçok
ülkede antibiyotik kullanımı yaygın olarak devam
etmektedir (27).
Ticari kanatlı yetiştiriciliğinde alternatif denemelerin adaptasyonu için multifaktöriyel yaklaşımlara gereksinim olduğu açıktır. Deneysel koşullar
atında gözlenen bir alternatifin yararlı etkilerinin
çiftlik seviyesinde tekrar edilemediği görülebilmektedir. Antibiyotiklere alternatif bir uygulama kanatlı
üretim performansı ve sağlığına sürdürülebilir yararlı etkiye sahip olmalı, hem kanatlı hem de insanlar için emniyetli olmalı, uygulanması ve saklanması kolay olmalı, önemli kazançlar sağlamalıdır.
Antibiyotiklere dirençli bakteriler ve antibiyotiklere
cevap vermeyen patojenleri tedavi etme amacıyla
yumurta sarısı antikorları bir alternatif olarak kullanılmaya başlanmıştır (4). Bu derlemede yumurta
sarısı antikorlarının özellikleri ve bazı hastalıklarda
kullanım alanları hakkındaki bilgiler özetlenmiştir.
Yumurta sarısı antikorlarının uygulanması:
Bakterilerdeki antibiyotik dirençliliğinden dolayı
yaygın olarak kullanılan antibiyotiklerin daha az
Yazışma adresi / Correspondance: Timur Gülhan, Ondokuz Mayıs Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Mikrobiyoloji Anabilim Dalı
55139, Samsun, Türkiye Eposta: [email protected]
78
Gülhan T, Boynukara B. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 23, 77-83, 2012
etkiye sahip olduğu bilinen bir gerçektir. Spesifik
antikorlarla oral immunoterapi son 25 yıldır laboratuar ve klinik çalışmalarda amaçlanan bir stratejidir. Spesifik patojenleri, özellikle enterik mikroorganizmaları, nötralize etmek için yumurta sarısı
antikorları ile besleme antibiyotiklere bir alternatif
olarak görülmektedir. Antikor elde etmek amacıyla
tavuklara immun yanıtı arttıran partiküler antijenler
uygulanmaktadır. Normal olarak bu antikorlar daha
sonra yumurta sarısına transfer olmaktadır. Booster
immunizasyon (ikinci enjeksiyon), tavuklardan yumurta sarısına antikorların sürekli geçişini sağlamak için genellikle daha sonraki zamanlarda yapılmaktadır. Bu antikorlar yumurta sarısından ekstrakte edilmekte ve hayvanlara direkt olarak veya yemle
birlikte verilmektedir (4, 27).
Yumurta sarısı antikorları son zamanlarda ticari
olarak üretilmektedir. Bu antikorların oral yolla uygulanması, insan, domuz, buzağı, balık ve tavşanlarda viral ve bakteriyel enterik infeksiyonların önlenmesindeki başarısı değişkenlik göstermektedir.
Yumurta sarısı antikorları enterik patojenlere bağlanarak, hareketsizleştirerek, üremesini ve kolonizasyonunu engelleyerek etkili olmaktadır (2).
Yumurta sarısı antikorlarının özellikleri:
Tavuklarda üç immunoglubulin sınıfının (IgA, IgM
ve IgY) olduğu bilinmektedir. Tavuk IgG’si, birçok
yönden memeli IgG’sinden farklı olduğu için IgY
olarak isimlendirilmiştir. IgY, tavuklarda başlıca
serum immunoglobulinidir ve embriyoya yumurta
sarısı ile taşınmaktadır. Yumurta sarısı bu yüzden
yüksek konsantrasyonlarda IgY içermektedir. Diğer
Ig sınıfları, yumurta sarısında önemsiz miktarlarda
bulunmaktadır. Yumurtadaki immunoglobulinlerin
varlığı pasif bağışıklık denemeleriyle gösterilebilmektedir (3).
Tavuk yumurtalarında yumurta sarısındaki IgY
miktarı yaklaşık 20-25 mg/ml civarındadır. Bir tavuk yılda ortalama 300 yumurta üretir ve bir yumurta sarısının miktarı yaklaşık olarak 15 ml’dir.
Böylece, bir tavuktan yumurta vasıtasıyla yıllık 100
g’a yakın antikor sağlanmaktadır. Yumurta sarısındaki IgY konsantrasyonu antikorların ticari üretimi
için önemli bir parametredir. IgY yoğunluğu farklı hatlarda ve bireysel olarak değişebilmektedir.
Yüksek verimli hatların seçilmesi ve hatlar arasında
genetik iyileştirmeler IgY üretimini artırılabilmektedir. Yumurta sarısı antikorları uzun süre stabil
kalabilmektedir. 4°C’de 5-10 yıl antikor aktivitesin-
de önemli bir kayba yol açmadan stoklanabileceği
gösterilmiştir. Antikorların aktiviteleri oda ısısında
6 ay, 37°C’de 1 ay boyunca muhafaza edilebilmektedir (14).
Uygulamanda
karşılaşılan
zorluklar:
Tavuklar, memelilerle karşılaştırıldığında oldukça
ekonomik antikor üretirler. Bunun nedeni, antikorlar invazif olmayan bir şekilde sağlanabildiği ve
yüksek seviyelerde üretildiği içindir. Yumurta sarısı
kökenli antikorlar memeli antikorlarından daha fazla biyokimyasal avantajlara sahiptirler. Hayvanlarda
patojen spesifik yumurta sarısı antikorlarının yararlı
etkileri 20 yıldan fazladır bilinmesine rağmen, bu
antikorların kanatlılara deneysel uygulama sonuçları her zaman tutarlı değildir. Diğer bir ilginç nokta,
tavuklarda yumurta sarısı antikorlarının uygulamasının muhtemel yararlı etkileri ile ilgili çalışmaların
miktarı diğer hayvan türlerindeki çalışmalarla karşılaştırıldığında oldukça düşüktür. Ticari kanatlılarda
antikorların oral uygulamasının hala pek çok engelleri vardır. Tüm yeni ürünlerde olduğu gibi, ticari işletmelerde yumurta sarısı antikorlarının kullanılmasına izin vermek uzun zaman almaktadır. Yumurta
sarısı antikorlarının zor elde edilmeleri nedeniyle,
elde edilmesi ve uygulanabilirliği daha kolay olan
diğer alternatifler üzerinde durulmaktadır. Büyük
miktarlarda kaliteli antikor üretiminin maliyeti oldukça yüksektir (4).
Yumurta sarısındaki antikorların biyolojik aktivitesi üzerinde durulması gereken önemli bir konudur. Bir kanatlının spesifik bakteriyel veya viral
antijenlere karşı immun yanıtı her denemeden sonra
değişkenlik göstermektedir. Bir tavuktan veya bir
gruptaki (aynı veya farklı sürülerdeki) tavuklardan
elde edilen yumurta sarıları birleştirilip IgY ekstrakte edilmektedir. Antijenik uyarıma karşı bireysel
veya sürü immun yanıtından hangisinin daha iyi olduğu net değildir. Yumurta sarısındaki IgY seviyeleri, uygulama hataları ve çevresel stresörlere bağlı
olarak çok değişkenlik göstermektedir (27).
Bir diğer önemli konu, bu bileşimlerin kanatlılara verildiğinde gastrointestinal sistemdeki stabilitesidir. Oral olarak uygulanan antikorlar, diğer protein molekülleri gibi, mide asidik pH’sının denatürasyonuna ve proteazların dejenerasyonuna duyarlıdır. Ancak, önerilen dozun bir kısmının gastrointestinal sistem infeksiyonlarına karşı bazı immunolojik
aktivitelere sahip olduğu gösterilmiştir. Barsakların
proksimal kısmından distal kısmına doğru antikor
aktivitesinde bir azalma olmakla birlikte, antikorlar
sekumda tespit edilebilir oranda bulunmaktadır. Bu
durum, intestinal sistemin daha alt kısımlarındaki
spesifik patojenlerin kolonizasyonunu önlemek için
yumurta sarısı antikorlarının etkinliğini etkileyebilmektedir. Gastrointestinal sistemdeki lokal olarak
dağılan immunoreaktif antikor fraksiyonunu arttırmak için IgY’nin proteaz dirençli oral dozaj formu
geliştirilebilir (4).
Kanatlı besinlerine antikorları tam yumurta
sarısı tozu formunda eklemek en pratik yol olarak
görülmektedir. Yumurta sarısı antikorlarının ısıya
dayalı besin işleme tekniklerine tolerans gösterip
gösteremeyeceği bilinmemektedir. Bununla birlikte, bileşimindeki denatürasyonu minimum düzeye
indirmek için, antikorlar işlemden sonra besinlere
sprey şeklinde uygulanabilir. Antikorların spesifikliği de önemlidir. Kanatlılar hayvanlar çok sayıda
infeksiyöz etkenle karşı karşıya kalmaktadır. Bu
nedenle, yaygın hastalık oluşturan mikroorganizmalara etkili bir karışım üretilirse, yumurta sarısı
antikorlarından daha fazla yararlanılabilecektir.
Böylece, yumurta sarısı antikorlarının ticari formları daha geniş kullanım alanı bulacaktır (5).
Yumurta sarısı antikorlarının veya diğer alternatiflerin antibiyotiklerle sorunsuz bir şekilde
yer değiştirebileceğini düşünmek oldukça güçtür.
Alternatif uygulamaların pek çoğu kanatlı endüstrisine son 15-20 yıldır girmiştir. Ancak uygulama
ve etkinlikleri konusunda pek çok cevaplanamayan
soru vardır. Antibiyotiklerin yerine tek bir alternatifin uygun olmadığı görülmektedir. Kanatlı endüstrisinde hastalıkların önlenmesi veya kontrolü çeşitli
stratejileri içermektedir. Geleneksel olarak antibiyotiklerin kullanımı kontrol yönüyle öneme sahiptir, ancak uygulanabilir alternatifler gün geçtikçe
artmaktadır. Uygun koruma-kontrol stratejilerinin
kullanımı ve katı biyogüvenlik önlemleri kanatlı
hayvan hastalıklarının önüne geçilmesinde en etkili
yöntem olarak bilinmektedir (2).
IgY’lerin koruyucu amaçlı kullanıldığı bazı kanatlı hastalıkları
Escherichia coli infeksiyonları: Escherichia coli
infeksiyonları dünya kanatlı endüstrisinde önemli
kayıplardan sorumludur. Etken kanatlıların sindirim
sistemi florasında normal olarak bulunmasına rağmen, toksijenik suşlar hem lokalize hem de sistemik
infeksiyonlara neden olmaktadır. Antibiyotikler,
kanatlı endüstrisinde E.coli ile ilgili problemlerin
79
kontrolünde her zaman en etkili tercih olarak görülmektedir. Bununla birlikte, kanatlı işletmelerinden
izole edilen suşlar bir ya da birden fazla antibiyotiğe
direnç gösterebilmektedir (15).
Belirli E.coli antijenlerine karşı immunize edilmiş tavuklardan elde edilen yumurta sarısı antikorlarının broyler tavuklarda deneysel solunum sistemi
infeksiyonları ve patojen kanatlı suşları tarafından
oluşturulan septisemilere karşı koruyucu etkileri incelenmiştir. Broyler damızlıklardan 7 grup seçilerek
her biri E.coli antijenleri ile aşılanmıştır. Aşılanmış
broyler damızlıklardan elde edilen yumurtalardan
sağlanan yumurta sarısı antikorları intramüsküler
olarak 11 günlük broyler civcivlere injekte edilmiş,
civcivler 3 gün sonra hava kesesi yoluyla E.coli ile
infekte edilmiştir. Ölüm oranı kaydedilmiş, canlı kalanlar uygulamadan 1 hafta sonra öldürülerek
makroskobik lezyonlar açısından incelenmiştir.
Sonuçlar pasif antikorların E.coli infeksiyonuna
karşı koruyucu olduğunu göstermiştir (8).
İn vitro çalışmalar yumurta sarısı antikorlarının E.coli O157:H7’nin üremesine inhibitör etkiye
sahip olduğunu göstermiştir. E.coli O157:H7’nin
üremesine yumurta sarısı antikorlarının inhibitör etkilerini belirlemeye yönelik bir çalışmada, bu suşa
karşı yumurta sarısı antikorlarının yüksek bağlanma
kapasitesine sahip olduğu belirlenmiştir. Yumurta
sarısı antikorlarının antibakteriyel fonksiyonu E.coli
O157:H7’nin yüzey kompenentleri ile bu antikorların interaksiyonu sonucuna şekillenmektedir (9).
Broyler civcivlerde yemlere farklı seviyelerde spesifik IgY ilavesinin büyüme performansında
artış ve E.coli O78:K80’nin intestinal kolonizasyonunda azalmaya neden olduğu ortaya konulmuştur
(13).
Kampilobakter
infeksiyonları:
Campylobacter jejuni, ticari broyler, hindi ve yumurtacı sürülerde yaygın olarak bulunmaktadır.
Ticari kanatlı işletmelerinde antibiyotiklere dirençli
kampilobakter türlerinin izolasyonu gıda güvenliği
bakımından önem arz etmektedir (9). Tavuklarda
kampilobakter kolonizasyonunu önlemek amacıyla
hijyenik ve biyogüvenlik önlemler, içme sularına
organik asit ilavesi, bitki kökenli yem katkıları, bakteriyofaj uygulaması, aşılama, pasif immunizasyon,
prebiotik/probiotik ile yarışmacı dışlama ve bakteriyosin uygulaması gibi yöntemler kullanılmaktadır
(7).
80
Civcivlerde kampilobakter kolonizasyonunun
maternal kökenli antikorlarla önlenebileceği deneysel çalışmalarla gösterilmiştir. Yumurtacı tavuklarda yapılan bir çalışmada (19), tavuklar C.jejuni ile
aşılanmış ve yumurtalar toplanmıştır. Yumurta sarıları birleştirilmiş, besin içerisinde karıştırılarak oral
kullanıma hazırlanmıştır. Patojen spesifik yumurta
sarısı antikorlarının, C.jejuni’nin rat epitelyum hücreleri ve domuz mucinine tutunmasının önlenmesindeki in vitro yetenekleri gözlenmiştir. Takip eden
bir araştırmada (26), yumurtadan yeni çıkmış broyler civcivleri C.jejuni ile deneysel olarak infekte
edilmiş, yumurta sarısı antikorları besin içerisinde
oral olarak uygulanmıştır. Ölçülebilir in vitro yumurta sarısı antikor aktivitesine rağmen, civcivlerde
C.jejuni’nin intestinal kolonizasyonunda önemli bir
azalma saptanamamıştır. Yumurta sarısı antikorları,
C.jejuni infeksiyonlarının azaltılmasında koruyucu
yöntem olarak değerlendirilmekle birlikte, etkinliklerinin teyidi amacıyla daha fazla çalışmaya gereksinim olduğu sonucuna varılmıştır.
Benzer bir çalışmada (20), C.jejuni ile infekte
tavuklarda koruyucu ve tedavi edici amaçla bağışık
tavuklardan sağlanan yumurta sarısı antikorlarını
incelenmiştir. Koruyucu amaçla yapılan denemede,
bu antikorların deneme boyunca fekal C.jejuni miktarında önemli azalmaya (%99) neden olduğu tespit
edilmiştir. Tedavi denemesinde, infeksiyondan sonra verilen antikorların sağaltıcı etkisi gösterilmiştir,
ancak koruyucu uygulama ile karşılaştırıldığında
düşük oranda (%80-95) azalma saptanmıştır.
Salmonella infeksiyonları: Salmonella türleri
kanatlı hayvanlarda akut ve kronik hastalıklardan
sorumludur. İnfekte kanatlıların, etkenin insanlara
gıda zinciri ile bulaşmasında önemli rezervuar olduğu bilinmektedir. Kanatlı çiftliklerinden izole edilen
Salmonella türlerinde antibiyotiklere çoğul dirençlilik dünya çapında yaygınlaşmaktadır (2).
Salmonella türlerinin intestinal kolonizasyonun
azaltılmasında yumurta sarısı antikorlarının etkinliği çeşitli çalışmalarda ele alınmıştır. Tavuk yumurta
sarısı antikorlarının (IgY) Salmonella Enteritidis
(SE) veya Salmonella Typhimurium’a karşı bağlanarak bakteri üremesini engellediği invitro olarak
gösterilmiştir. Mikroskobik incelemede, IgY’nin
Salmonella yüzeyinde yapısal değişiklikler oluşturduğu görülmüştür. Bu bulgu, IgY’nin Salmonella
yüzey moleküllerine bağlanabildiğini, bu kompenentlerde fonksiyonel bozukluklara yol açtığını ve
bakteri üremesini engellediğini göstermiştir (11).
Besin katkısı olarak antikor içeren tüm yumurta
tozunun kullanımı, yumurtaların Salmonella kontaminasyon oranlarını azalmaya bir alternatif olabileceği vurgulanmıştır. SE spesifik antikorlarını içeren
tam yumurta tozunun oral uygulaması ile yumurta
kontaminasyonunun azaltılabileceği ifade edilmiştir
(2).
Lactobacillus spp., organik asitler, çoğul probiyotikler ve antikor içeren yumurta tozu gibi farklı besin katkılarının barsak kolonizasyonunun ve
serotip SE faj tip 13a ile infekte civcivlerde organ
invasyonunun önlenmesindeki etkileri bir çalışmada (24) değerlendirilmiştir. Kontrollerle karşılaştırıldığında, uygulama yapılanların hiçbirinde barsak
kolonizasyonunun veya organ invasyonunun önlenemediği görülmüştür. 6 haftalık deneme periyodu
süresince tüm uygulamalarda barsak kolonizasyonu
ve organ infeksiyonu saptanmıştır. Diğer uygulamalarla karşılaştırıldığında % 5 yumurta tozu içeren
besinle beslenenlerde önemli değişiklikler görülmesine rağmen, söz konusu araştırmada kullanılan
katkı maddelerinin hiç birinin SE infeksiyonunun
önlenmesi ile ilişkili tek başına yeterli bir önlem olmayacağı sonucuna varılmıştır.
SE spesifik IgY’lerin oral yolla infekte edilen
broyler civcivlerde etkenin kolonizasyonunun engellenmesi amacıyla yapılan bir araştırmada, ticari
Leghorn tavuklar tüm hücre SE antijeni ile hiperimmunize edilmiştir. Anti-Salmonela antikorları
yumurta sarısında (IgY) ve kan serumunda (IgG)
ELISA ile araştırılmıştır. Araştırma sonucunda,
farklı yollarla uygulanan IgY’nin Salmonella kolonizasyonunu ve fekal saçılmasını azalttığı görülmüş, bu antikorların probiyotiklerle kombine edilerek kullanılabileceği vurgulanmıştır (18).
Nekrotik enteritis: Clostridium perfringens
tarafından oluşturulan nekrotik enteritis, kanatlı
yetiştiriciliği yapılan dünyanın çoğu bölgesinde rapor edilmektedir. Bakterinin oluşturduğu toksinler,
hastalık için karakteristik olan intestinal mukozal
nekrozisten sorumludur. Hastalık, kanatlı yemlerine
antibiyotikler katılarak kontrol edilmektedir, ancak
antibiyotiklerin rasyondan kaldırılması hastalıktan
korunma stratejilerinin etkinliğini etkileyebilmektedir (23).
Broyler tavukların intestinal sisteminde
C.perfringens kolonizasyonunu azalmak için spesifik yumurta sarısı antikorlarının kullanımı çok
yaygın değildir. Nekrotik enteritise karşı maternal
antikorların koruyucu düzeyinin incelendiği bir
araştırmada (12), tavuklar C.perfringens tip A ve tip
C’den hazırlanan toksiod alüminyum hidroksit adjuvantlı aşılarla aşılanmıştır. Aşılama sonucunda etkenin α-toksinine karşı güçlü bir immun yanıt elde
edilmiş ve spesifik antikorların yumurta sarısına
transfer edildiği gösterilmiştir. Deneme grubundaki
hayvanlarda nekrotik enteritis ile ilgili spesifik enterik ve hepatik lezyonlarda önemli oranda azalma
saptanmıştır. Her iki toksin tipine karşı yüksek düzeylerde maternal antikor oluşturulmasıyla, kanatlı
hayvanlarda nekrotik enteritisin kontrolünde immunoproflaksinin bir alternatif olabileceğine dikkat
çekilmiştir.
Clostridium perfringens tip A alfa toksininden
hazırlanan toksoid aşının maternal bağışıklıktaki
etkisinin araştırıldığı bir çalışmada (3) 11.234 tavuk intramusküler yolla aşılanmıştır. Aşının güvenli olduğu, yan etkisinin olmadığı ve herhangi
bir sistemik infeksiyona yol açmadığı saptanmıştır.
Aşılanan hayvanlarda önemli oranda anti-alfa toksin
antikoru belirlenmiş ve yeterli miktarda yumurta sarısına geçtiği görülmüştür. Maternal antikora sahip
civcivlere ait yumurtalar kuluçkalanmış ve kontrol
grubu ile karşılaştırıldığında nekrotik enteritise ait
belirtiler görülmemiş ve mortalitede önemli düşüş
belirlenmiştir. Kontrol grubu hayvanlardan etken
izole edilirken, maternal antikorlu grupta izolasyon
yapılamamıştır. Böylece, ticari bir aşı ile gerçekleştirilen çalışmada nekrotik enteritis kaynaklı ölümlerin ve kayıpların önlenmesinde yumurta sarısı antikorlarının etkili olduğu sonucuna varılmıştır.
Newcastle hastalığı (ND): ND, duyarlı ticari
kanatlılarda farklı hastalık formları oluşturabilen
viral bir hastalıktır. Hastalık, dünyanın farklı kesimlerindeki pek çok ülkede endemik olarak seyretmekte ve kanatlı endüstrisinde ciddi ekonomik
kayıplara neden olmaktadır. Aşılama, hastalığın endemik görüldüğü bölgelerde korunmada en önemli
yöntemdir, ancak her zaman başarılı olmadığı için
aşılanmış sürülerde infeksiyon şekillenebilmektedir. Ticari bir işletmede ND salgını çıktığında, antibiyotikler sekonder bakteriyel infeksiyon olasılığını
azaltmak için kullanılmaktadır (27).
Yumurta sarısı antikorlarının ND’ye karşı tavukların pasif immunizasyonunda kullanılabileceği
belirlenmiştir. Bir broyler anaç işletmesinde gerçekleştirilen çalışmada, hayvanlar ND’ye karşı inaktif
81
bir aşı ile subkutan yolla aşılanmıştır. Aşılanmış tavuklarda ve yumurtalarında uzun süreli antikor titresi elde edilmiştir. Herts 33 virüsü ile gerçekleştirilen deneysel infeksiyonlarda maternal antikorların
1, 2, 3 ve 4. haftalarda sırasıyla %86, %73, %54
ve %44 oranlarında koruyucu olduğu saptanmıştır. Broyler sürülerde pasif immunizasyonun düşük
riskli bölgelerde uygulanabilir olduğu sonucuna varılmıştır (22). Benzer araştırmalarda, ND’ye karşı
yüksek seviyeli antikorları içeren yumurta sarısının
deri altı uygulamasını takiben 4 haftalık çalışma
periyodunda kuşların %80’inde koruma sağladığını
gösterilmiştir (21,25)
İnfeksiyöz bursal hastalık (IBD, Gumboro):
IBD, genç kanatlıların akut, oldukça bulaşıcı ve
birincil olarak lenfoid dokuları etkileyen viral bir
hastalığıdır. Tavukların immunizasyonu, IBD’nin
kontrolünde kullanılan en önemli yöntemdir.
Hastalığın ekonomik boyutu genellikle immunsüpresyonla sonuçlanan subklinik formda daha önemlidir. İmmunsüpresyon, aşılamanın başarısız olmasına ve diğer viral, paraziter ve E.coli gibi bakteri
infeksiyonlarına duyarlılığa neden olmaktadır. IBD
ile infekte sürülerde antibiyotiklerin kullanılması
sekonder bakteriyel infeksiyonların önlenmesinde
en uygun yaklaşımdır (1).
Yumurta sarısının IBD’nin kontrolünde antikor kaynağı olarak uygulanabilirliği gösterilmiştir.
IBD’ye karşı saf yumurta sarısı antikorlarının yumurta içi inokulasyonu maternal antikorların şekillenmesi amacıyla denenmiştir. Yoğunlaştırılmış yumurta sarısı antikorları 7 günlük SPF yumurtalara
intra vitellin olarak inokule edilmiştir. Kuluçka yeteneğinde negatif etkiler görülmekle birlikte, iki seri
SPF civcivde oldukça yüksek virülent IBD virüsüne
karşı pasif bağışıklık oluşturulmuştur (6).
Hiperimmunize tavuklardan sağlanan yumurta sarısının ticari yumurtacı işletmelerde IBD’nin
kontrolünde kullanılabileceği bildirilmiştir (14).
Araştırıcılar, yumurtacı tavukları IBD aşısı ile aşılanmış, yumurtaları günlük olarak toplanmış ve yumurta sarısı antikorları purifiye edilmiştir. Antikor
titresi yumurta sarısında, serumdan daha yüksek
bulunmuştur. IBD ile infekte yumurtlayan tavuklara
daha sonra bu antikorlar enjekte edilmiş ve kontrol
grubuyla karşılaştırıldığında %92 oranında iyileşme
görülmüştür. Çalışma sonuçları, purifiye antikorların IBD ile infekte kuşları tedavi etmek için terapotik ajan olarak kullanılabileceğini göstermiştir.
82
Benzer bir çalışmada (16), 18 günlük broyler
embriyosu IBDV’nin rekombinant attenüe aşısı ile
in ovo olarak aşılanmıştır. Aşının kuluçkalama sürecine ve SPF civcivlerde canlılık üzerine olumsuz
bir etkisinin olmadığı belirlenmiştir. Tüm aşılı grupların hastalığa karşı korunduğu ve yüksek dozlarda
virüsün verilmesine karşı bursa Fabricius’ta değişiklik şekillenmediği saptanmıştır.
Broyler civcivlerde IBDV infeksiyonundan korunmada, IgY ve aşıların karşılaştırılması amacıyla
yapılan bir çalışmada (1) iki uygulamanın birbirine
üstünlüğünün belirlenemediği sonucuna varılmıştır.
Ancak, birlikte uygulandıklarında daha fazla korunma sağlanabileceği ifade edilmiştir.
Diğer infeksiyonlar: Spesifik infeksiyöz ajanlarla immunize edilen tavuklardan sağlanan yumurta
sarısı antikorlarının patojen etkenlerce oluşturulan
hastalıklara karşı koruyucu etkiye sahip olduğu pek
çok çalışma ile gösterilmiştir. Bu antikorlar, farklı
patojenlere karşı eş zamanlı immunize edilen tavuklardan elde edilirse bu patojenlere karşı koruyucu
etkili olabilmektedir. Tavuklar 26 farklı bakteri karışımına karşı immunize edilmiş ve yumurtalardan
toplanan antikorların Pseudomonas aeruginosa,
S.enteritidis ve S.aureus’a karşı koruyucu etkileri
incelenmiştir. Çoğul bakteri antijenleri ile immunize edilen tavuklardan sağlanan yumurta sarısı antikorlarının çoğul bakteriyel antijenlerin üremesi,
toksin üretimi ve intestinal epitelyum hücrelerine
yapışmasına karşı koruduğu gösterilmiştir (10).
Tavuklarda yumurta sarısı antikorlarının, avian
influenza (AI) nedenli ölümleri azalttığı ve virüsün yayılmasını engellediği de ortaya konulmuştur.
Araştırma sonucunda, yumurta kökenli spesifik antikorların kanatlı hayvanlarda AI salgınlarının önüne geçilmesinde kullanılabileceği ve epidemiyolojik yönden öneme sahip olduğu vurgulanmıştır (17).
Sonuç
Bu makalede, yumurta sarısı antikorlarının bazı kanatlı hayvan hastalıklarında koruyucu amaçlı kullanımına ilişkin bazı literatür bilgileri özetlenmiştir.
1. Yumurta sarısı antikorlarının pek çok hastalıkta koruyucu amaçla kullanılabilirliği yapılan çalışmalarla gösterilmiştir.
2. Bununla birlikte, antikorların oral yolla uygulamasında ve ticari olarak üretilmesinde çeşitli
zorluklar bulunmaktadır.
3. Hâlihazırda, yumurta sarısı antikorlarının
maliyeti yüksektir. Bu nedenle, henüz pratikte antibiyotiklerle yer değiştirebilecek düzeylerde uygulama alanı bulamamıştır.
4. Daha kapsamlı araştırmalarla ve yumurta
sarısı antikorlarının uygun maliyette üretilmesiyle
gelecekte antibiyotiklere bir alternatif olarak kullanıma sunulabileceği görülmektedir.
Kaynaklar
1. Abd El-Ghany WA, (2011). Comparison between immunoglobulins IgY and vaccine for prevention of infectious bursal disease in chickens. Glob Vet. 6, 16-24.
2. Biswas D, Herrera P, Fang L, Marquardt RR, Ricke SC,
(2010). Cross-reactivity of anti-Salmonella egg-yolk antibodies to Salmonella serovars. J Environ Sci Health Part
B. 45, 790-795.
3. Crouch CF, Withanage GSK, de Haas V, Etore F, Francis
MJ, (2010). Safety and efficacy of a maternal vaccine for
the passive protection of broiler chicks against necrotic enteritis. Avian Pathol. 39, 489- 497.
4. Da Silva WD, Tambourgi DV, (2010). IgY: A promising antibody for use in immunodiagnostic and in immunotherapy.
Vet Immun Immunopathol. 135, 173-180.
5. Dibner JJ, Richards JD, (2005). Antibiotic growth promoters in agriculture: History and mode of action. Poultry Sci.
84, 634-643.
6. Eterradossi N, Toquin D, Abbassi H, Rivallan G, Cotte
JP, Guittet M, (1997). Passive protection of specific pathogen free chicks against infectious bursal disease by in-ovo
injection of semi-purified egg-yolk antiviral immunoglobulins. J Vet Med B. 44, 371-383.
7. Hermans D, van Deun K, Messens W, Martel A, van
Immerseel F, Haesebrouck F, Rasschaert G, Heyndrick
M, Pasmans F, (2011). Campylobacter control in poultry by current intervention measures ineffective: urgent
need for intensiﬁed fundamental research. Vet Microbiol.
(Article in Press), doi:10.1016/j.vetmic.2011.03.010.
8. Kariyawasam S, Wilkie BN, Gyles CL, (2004). Resistance
of broiler chickens to Escherichia coli respiratory tract infection induced by passively transferred egg-yolk antibodies. Vet Microbiol. 98, 273-284.
9. Kassaify ZG, Mine Y, (2004). Nonimmunized egg yolk powder can suppress the colonization of Salmonella typhimurium, Escherichia coli O157:H7, and Campylobacter jejuni
in laying hens. Poultry Sci. 83, 1497-1506.
10. Konishi SY, Shibata K, Yun SS, Kudo YH, Yamaguchi
K, Kumagai S, (1996). Immune functions of immunoglobulin Y isolated from egg yolk of hens immunized with various
infectious bacteria. Biosci Biotech Biochem. 60, 886-888.
11. Lee EN, Sunwoo HH, Menninen K, Sim JS, (2002). In
vitro studies of chicken egg yolk antibody (IgY) against
Salmonella enteritidis and Salmonella typhimurium.
Poultry Sci. 81, 632-641.
12. Lovland A, Kaldhusdal M, Redhead K, Skjerve E,
Lillehaug A, (2004). Maternal vaccination against subclinical necrotic enteritis in broilers. Avian Pathol. 33, 83-92.
13. Mahdavi AH, Rahmani HR, Nili N, Samie AH,
Soleimanian-Zad S, Jahanian R, (2010). Effects of dietary egg yolk antibody powder on growth performance,
intestinal Escherichia coli colonization, and immunocompetence of challenged broiler chicks. Poultry Sci. 89, 484494.
14. Malik MW, Ayub N, Qureshi IZ, (2006). Passive immunization using purified Ig Ys against infectious bursal disease
chickens in Pakistan. J Vet Sci. 7, 43-46.
15. Mellata M, Ameiss K, Mo H, Curtiss R, (2010).
Characterization of the contribution to virulence of three
large plasmids of avian pathogenic Escherichia coli X7122
(O78:K80:H9). Infect Immun. 78, 1528-1541.
16. Moura L, Vakharia V, Liu M, Song H, (2007). In ovo
vaccine against infectious bursal disease. Int J Poult Sci.
6, 770-775.
17. Rahimi S, Salehifar E, Ghorashi SA, Grimes JL, Torshizi
MAK, (2007). The effect of egg-derived antibody on prevention of avian influenza subtype H9N2 in layer chicken.
Int J Poult Sci. 6, 207-210.
18. Rahimi S, Shiraz ZM, Salehi TZ, Torshizi MAK, Grimes
JL, (2007). Prevention of Salmonella infection in poultry by
specific egg-derived antibody. Int J Poult Sci. 6, 230-235.
19. Rice BE, Rollins DM, Mallinson ET, Carr L, Joseph SW,
(1997). Campylobacter jejuni in broiler chickens: colonization and humoral immunity following oral vaccination and
experimental infection. Vaccine. 15, 1922-1932.
83
20. Tsubokura K, Berndtson E, Bogstedt A, Kaijser B,
Kim M, Ozeki M, Hammerstrom L, (1997). Oral administration of antibodies as prophylaxis and therapy
in Campylobacter jejuni-infected chickens. Clin Exp
Immunol. 108, 451-455.
21. Umino Y, Kohama T, Sato TA, Sugiura A, (1990).
Protective effect of monoclonal antibodies to Newcastle
disease virus in passive immunization. J Gen Virol. 71,
1199-1203.
22. Van Eck JH, (1990). Protection of broilers against
Newcastle disease by hyperimmunisation of the dams. The
Veterinary Quarterly. 12, 139-145.
23. Van Immerseel F, Rood JI, Moore RJ, Titball RW,
(2009). Rethinking our understanding of the pathogenesis
of necrotic enteritis in chickens. Trends in Microbiol. 17,
32-36.
24. Vicente JL, Rodriguez AT, Higgins SE, Pixley C, Tellez
G, Donoghue AM, Hargis BM, (2008). Effect of a selected
Lactobacillus spp.-ased probiotic on Salmonella enterica
serovar enteritidis-nfected broiler chicks. Avian Dis. 52,
143-146.
25. Wambura PN, (2011). Formulation of novel nano-en capsulated Newcastle disease vaccine tablets for vaccination
of village chickens. Trop Anim Health Prod. 43, 165-169.
26. Widders PR, Thomas LM, Long KA, Tokhi MA,
Panaccio M, Apos E, (1998). The specificity of antibody in
chickens immunized to reduce intestinal colonization with
Campylobacter jejuni. Vet Microbiol. 64, 39-50.
27. Yegani M, Korver D, (2007). Are egg yolk antibodies an
alternative to antibiotics? World Poultry. 23, 22-25.
84

2012-2 - Veteriner Kontrol Enstitüsü Müdürlükleri

Transkript

Benzer belgeler

clostrıdıum dıffıcıle toksin a, b

Corynebacterium ve Diğer Coryneform Bakteriler Coryneform

Cilt/Volume 22 Sayı/Number 1 2011 2011_1

Etlik-c24s1 - Veteriner Kontrol Enstitüsü Müdürlükleri

Volume 25 Number 1 2014 - Veteriner Kontrol Enstitüsü

21 Number: 1 2010 2010_1

22 Number: 2 2011 2011_2

Cook Book Kahvaltı Menüsü - Sheraton İstanbul Ataköy

lezzetlerimiz

Eylül - Keskinoğlu

23 Number: 1 2012 2012.1

Sevgili Tüp Bebek Adayları, Tüp bebek ve ICSI

POTTERS AVINEST Broiler Damızlık Çift Katlı Otomatik Folluk

Oturum Programı

Volume 25 Number 2 2015 - Veteriner Kontrol Enstitüsü

staphylococcus aureus`larda metisilin direncinin tespitinde oksasilin

Alfa Amanitinin Su ve Metanoldeki Termostabilitesi